Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic Tạo véctơ tái tổ hợp Nội dung Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp Trang 3 Khái niệm chung ADN tái tổ hợp đợc thực hiện nh thế nào?. Tác
Đại học quốc gia hà nội Khoa y duoc CễNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP Dinh Doan Long @VNU-SMP Néi dung Khái niệm chung ADN tái tổ hợp đuợc thực nhu nào? Tách chiết tinh axit nucleic Tạo véctơ tái tổ hợp Các loại enzym sử dụng ADN tái tổ hợp Dinh Doan Long @VNU-SMP Nội dung Khái niệm chung ADN tái tổ hợp đợc thực nh nào? Tách chiết tinh axit nucleic Tạo véctơ tái tổ hợp Các loại enzym sử dụng ADN tái tổ hợp Dinh Doan Long @VNU-SMP Kh¸i niƯm chung ADN t¸i tỉ hợp (recombinant DNA) đợc dùng để phân tử ADN đợc tạo từ hai hay nhiều phân đoạn ADN xuÊt xø tõ c¸c nguån gèc kh¸c Trong thực tế, công nghệ ADN tái tổ hợp đuợc dùng đồng nghĩa với thuật ngữ tách dòng ph©n tư (molecular/DNA cloning), hay kü tht di trun (genetic engineering) Khái niệm chung Mục đích Phân lập gen từ hỗn hợp nhiều gen tế bào, để phân tích nghiên cứu gen riêng lẻ Nhân dòng gen đà đợc phân lập lên số lợng lớn, để đáp ứng đủ cho nhu cầu nghiên cứu Khả tạo gen/tổ hợp gen Vật liệu tách dòng gen ADN mARN (sư dơng kü tht RT-PCR) Dinh Doan Long @VNU-SMP Néi dung Kh¸i niƯm chung ADN tái tổ hợp đuợc thực nhu nào? Tách chiết tinh axit nucleic Tạo véctơ tái tổ hợp Các loại enzym sử dụng ADN tái tổ hợp Dinh Doan Long @VNU-SMP ADN tái tổ hợp thực nh nào? Các bớc thực ADn tái tổ hợp Chọn nguồn gen cần tách dòng chứa trình tự quan tâm Chuẩn bị ADN ngoại lai có đầu 3, phù hợp Chọn lọc véctơ phù hợp Cải biến đầu 5của véctơ phân tử ADN ngoại lai Nối phân tử ADN véctơ ADN ngoại lai Đa véctơ tái tổ hợp vào tế bào chủ nhân lên Sàng lọc để chọn dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp Xác định đặc tính dòng, sử dụng dòng cho mục đích nghiên cứu khác Dinh Doan Long @VNU-SMP Néi dung Kh¸i niƯm chung ADN tái tổ hợp đợc thực nh nào? Tách chiết tinh axit nucleic Tạo véctơ tái tổ hợp Các loại enzym sử dụng ADN tái tổ hợp Dinh Doan Long @VNU-SMP Tách chiết tinh axit nucleic Một số nguyên tắc Tách chiết ADN Các dung môi hữu làm nớc, thay đổi môi trờng điện môi kết tủa phân tử nh protein & ADN, phân tử protein bị ảnh hởng rõ Độ pH thờng trung tính kiềm (7,0 8,5) Phenol, chloroform, isoamylalcohol thờng đợc dùng để kết tđa protein (vd Chloroform/isoamylalcohol 24/1) Mét sè hỵp chÊt chống oxy hóa nh 2-mercapthoethanol, DTT (dithiothreito), 8-hydroxyquinoline làm giảm nguy gây biến tính axit nucleic SDS làm vỡ màng tế bào Các dung môi alcohol (vd EtOH, MeOH, 2-propanol) đợc dùng để kết tủa axit nucleic Các muối (vd acetate) trung hòa điện tích làm giảm khả hòa tan axit nucleic To kết tña -20oC / 0oC (1/2h – 24h) 10