Tổng quan về công nghệ ADN tái tổ hợp

Đến nay đó cú nhiều quy trỡnh tạo và nhõn dũng ADN tỏi tổ hợp được phỏt triển gồm nhiều bước kỹ thuật khỏc nhau, nhưng tựu chung, cú thể chia cỏc bước này thành ba giai đoạn chớnh: i Phõ

TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP ĐINH ĐỒN LONG Bộ mơn Y Dược học Cơ sở, Khoa Y Dược, ĐHQGHN Lĩnh vực di truyền học phân tử có nhiều bước tiến nhanh chóng kể từ năm 1972 sau Paul Berg cộng D.A Jackson R.H Symons công bố thành công việc tạo phân tử ADN tái tổ hợp nhân tạo kết ghép nối ADN có nguồn gốc từ hai loại virut khác - SV40 (gây bệnh khỉ) phagơ  (lây nhiễm vi khuẩn E coli) Thành công mở đường cho nhiều nghiên cứu sau nhằm tạo phân tử ADN tái tổ hợp khác nhân dòng (tạo nhiều sao) phân tử tái tổ hợp Về thuật ngữ, phân tử ADN tái tổ hợp dùng để phân tử ADN tạo từ hai hay nhiều phân đoạn ADN có nguồn gốc khác Nhân dịng (hay nhân bản) trình tạo lượng lớn phân tử (hoặc phân đoạn) ADN đặc thù, chẳng hạn phân tử ADN chứa gen định Những phân tử ADN sau dùng thao tác di truyền nhằm mục đích khác nhau, lập đồ di truyền, giải trình tự, gây tạo đột biến hay biến nạp gen vào tế bào Việc dùng nguyên lý ADN tái tổ hợp để thao tác gen nhằm mục đích phân tích di truyền để phát triển sản phẩm hay cho ứng dụng khác gọi chung kỹ thuật di truyền Nhờ thành công việc tạo phân tử ADN tái tổ hợp đầu tiên, nhóm nghiên cứu Paul Berg trao Giải thưởng Nobel Hóa học năm 1980 Mục tiêu chương giới thiệu số nguyên lý ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp I NHÂN DÒNG ADN Các phân tử ADN tái tổ hợp tạo nhằm phục vụ nhiều ứng dụng khác Chẳng hạn, để nghiên cứu gen mã hóa protein người, cần xác định trình tự đồng thời tìm hiểu cách mà điều hòa biểu Đối với hầu hết gen, tế bào người chứa hai sao, việc phân tích trực tiếp gen thường khơng thực số ban đầu Trong đó, quy trình nhân dịng phân tử cho phép gen nhân lên thành số lớn (hầu không hạn chế) phục vụ cho mục đích phân tích thao tác nhằm biến đổi di truyền Những biến đổi di truyền bao gồm từ thay đổi nhỏ, thay vài nucleotit biến đổi lớn làm thêm vào đoạn lớn gồm nhiều gen Một ứng dụng đặc trưng công nghệ ADN tái tổ hợp khả tạo gen sản phẩm gen mà trước chưa có tự nhiên.Việc cài gen biến đổi di truyền vào vectơ biểu phù hợp giúp tạo sản phẩm gen vốn trước chưa tồn làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp cao mức bình thường Đến có nhiều quy trình tạo nhân dòng ADN tái tổ hợp phát triển gồm nhiều bước kỹ thuật khác nhau, tựu chung, chia bước thành ba giai đoạn chính: i) Phân lập ADN từ thể định, ii) Phân cắt ADN thành phân đoạn enzym giới hạn, cài (gắn) phân đoạn riêng rẽ vào vectơ nhân dòng (còn gọi thể truyền nhân dòng; phân tử ADN nhân tạo có khả chép tế bào chủ, ví dụ tế bào vi khuẩn) để tạo nên vectơ tái tổ hợp, iii) Chuyển (biến nạp) vectơ tổ hợp vào tế bào chủ, chẳng hạn E coli; lúc này, phân đoạn ADN cài vào vectơ nhân dịng với q trình sinh sản tế bào chủ Các phân tử ADN tái tổ hợp truyền cho tất hệ tế bào con, từ tạo nên quần thể tế bào mang phân đoạn ADN nhân dòng giống gọi dòng ADN Các bước quy trình tạo ADN tái tổ hợp gồm có: 1) Chọn nguồn cung cấp ADN (cũng ARN) cần nhân dịng chứa trình tự nucleotit quan tâm Phân tử ADN thu từ bước (nếu từ ARN thường qua phiên mã ngược) gọi ADN ngoại lai hay ADN cài 2) Chuẩn bị phân tử ADN cài có kích thước (chiều dài) thích hợp, đồng thời có trình tự cấu trúc đầu 5’ 3’ phù hợp cho việc gắn vào vectơ 3) Chọn vectơ nhân dòng phù hợp chuẩn bị vectơ để tiếp nhận ADN ngoại lai sử dụng enzym giới hạn cho vị trí cài ADN ngoại lai không làm khả chép (tái bản) vectơ 4) Cải biến thêm (nếu cần) đầu 3’ 5’ phân tử ADN ngoại lai vectơ để hai phân tử có đầu sẵn sàng cho ghép nối với 5) Nối ADN vectơ với ADN ngoại lai điều kiện invitro để tạo nên phân tử vectơ tái tổ hợp nhờ sử dụng enzym ligase thích hợp 6) Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ để nhân lên thành nhiều (bước nhân dòng) 7) Sàng lọc quần thể tế bào biến nạp để chọn dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp mang đoạn ADN ngoại lai quan tâm, phân lập nhân chúng lên thành dịng tế bào riêng biệt 8) Xác định đặc tính dòng sử dụng chúng cho mục đích nghiên cứu và/hoặc ứng dụng chúng thực tiễn Dưới đề cập đến số yếu tố liên quan đến bước nêu 1.1 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH CÁC AXIT NUCLEIC 1.1.1 Quy trình tinh axit nucleic a) Loại protein nhờ dung môi hữu Phương pháp phổ biến để loại protein lẫn dung dịch axit nucleic dùng dung mơi hữu (Hình 1) Thơng thường, dung dịch axit nucleic protein hịa tan nước bổ sung lượng phù hợp dung mơi hữu cơ, ví dụ phenol chloroform Việc bổ sung dung môi hữu làm thay đổi thành phần điện môi, làm nước kết tụ đại phân tử Tuy vậy, thay đổi thường ảnh hưởng tới protein rõ rệt so với axit nucleic Vì vậy, điều kiện phù hợp, phần lớn protein kết tủa axit nucleic dạng hòa tan Sự kết tụ protein tạo nên lớp trắng đục hai pha nước dung môi hữu cơ, axit nucleic dạng hòa tan pha nước Lúc này, cần dùng pipet hút pha nước, loại bỏ protein lẫn hỗn hợp ADN vµ ARN pha n-íc Bổ sung dung mơi ADN, ARN vµ protein pha n-íc Lắc mạnh Phenol + Chloroform Ly tâm Protein lín kÕt tơ pha; Protein nhỏ tan dung môi hữu c¬ Hình Dùng dung mơi hữu để loại protein khỏi dịch chiết ADN ARN Độ pH phù hợp cho tách chiết axit nucleic trung tính kiềm (pH = 7,0 - 8,5) Trong khoảng pH này, axit nucleic tích điện âm ưa nước, chúng hòa tan mạnh nước Ở pH cao (pH kiềm) ARN có xu hướng bị thủy phân; pH thấp (pH axit), khả hòa tan nước axit nucleic giảm Tuy vậy, dựa vào đặc điểm này, muốn tinh axit nucleic có phân tử lượng nhỏ, người ta dùng pH axit Lúc này, ADN phân tử lượng lớn kết tủa protein, ADN ARN nhỏ tan nước Dung môi hữu dùng phổ biến để kết tủa protein phenol thường trộn chloroform để tạo nên hỗn hợp dung môi gây kết tủa protein mạnh (hiệu so với chúng dùng riêng rẽ) Tỷ lệ thể tích trộn hai dung môi thường 1:1 4:1 Ngồi ra, chloroform bổ sung thêm isoamyalcohol với tỷ lệ 24:1 Việc bổ sung lượng nhỏ isoamylalcohol giúp phân tách hai pha nước dung môi hữu rõ ràng hơn, nhờ việc hút pha nước pipet dễ thực không bị lẫn với dung môi hữu Một vấn đề dùng phenol dễ bị oxy hóa thành hợp chất quinone (màu hồng) Các hợp chất quinone tạo nên gốc tự làm biến tính axit nucleic Để tránh phenol bị oxy hóa, dung dịch phenol cần bảo quản nhiệt độ thấp, gói kín để tránh ánh sáng, bổ sung số chất chống oxy hóa 2-mercapthoethanol, DTT (dithiothreito) 8-hydroxy-quinoline Một ưu điểm 8-hydroxy-quinoline chất tạo cho pha dung mơi hữu có màu vàng sáng, dễ phân biệt với pha nước bước kết tủa protein Ngoài ra, chất tẩy SDS (sodium dodecyl sulfate) có tác dụng làm vỡ màng tế bào, phân giải thành phần lipid, đồng thời làm tăng cường biến tính kết tủa protein, bổ sung vào hỗn hợp tách chiết tinh axit nucleic Quy trình tinh axit nucleic dung môi hữu thường tiến hành với ly tâm Ly tâm giúp phân tách pha dung môi nhanh hơn, gia tăng tốc độ kết tụ protein hai pha nước dung mơi hữu Một số quy trình tách chiết axit nucleic bổ sung thêm chất làm tăng hiệu suất kết tủa protein Trong quy trình tinh axit nucleic bản, sau ly tâm pha nước thường pha dung môi hữu Nhưng số trường hợp, để thu axit nucleic có phân tử lượng lớn có độ nhớt cao khó hút pipet pha nước trên, người ta tăng nồng độ muối pha nước; lúc này, phân lớp nước dung môi hữu đổi chiều, nghĩa pha nước việc dùng pipet hút phần dung môi hữu phía giúp loại bỏ thành phần protein Phần dịch lại chứa hỗn hợp axit nucleic dùng cho bước tinh b) Làm kết tủa ADN ARN Các phương pháp gây kết tủa ADN ARN nhằm mục đích tinh đặc axit nucleic Bước thường liên quan đến việc bổ sung muối (như natri acetate) làm trung hịa điện tích âm axit nucleic, làm giảm khả hòa tan chúng; sau việc bổ sung alcohol (như ethanol hay isopropanol) để tiếp tục làm giảm khả hòa tan axit nucleic tới điểm kết tủa Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất kết tủa axit nucleic nồng độ loại muối sử dụng, nồng độ loại hợp chất nhóm alcohol, nhiệt độ thời gian gây kết tủa Kích thước axit nucleic ảnh hưởng đến hiệu suất kết tủa Thường phân tử axit nucleic có kích thước khoảng 50 - 100.000 nucleotit có hiệu suất kết tủa gần Các phân tử nhỏ (< 50 nucleotit) kết tủa nồng độ muối alcohol cao, phân tử lớn đạt hiệu suất kết tủa tương đương nồng độ muối alcohol thấp Các muối dùng để trung hòa điện tích axit nucleic muối chloride (Cl-) K+ Na+, muối có xu hướng kết tủa axit nucleic dung mơi alcohol Vì vậy, để tách chiết axit nucleic muối dùng phổ biến muối acetate, nhờ chúng có khả hịa tan dung môi alcohol tốt Nồng độ muối acetate dùng bước kết tủa axit nucleic khoảng 0,3 M (trước bổ sung alcohol) Các dung môi alcohol thường dùng để kết tủa axit nucleic ethanol isopropanol Khi sử dụng ethanol, người ta thường hịa lỗng tỷ lệ 2:1 (với nước) để gây kết tủa ADN, 2,2:1 để gây kết tủa ARN Khi dùng isopropanol, tỷ lệ pha loãng thường - 1,5 : Các axit nucleic thường gây kết tủa 4oC khoảng 30 phút Tuy vậy, số thí nghiệm, thời gian gây kết tủa kéo dài (chẳng hạn qua đêm) thực nhiệt độ thấp (-20oC) c) Các phương pháp bổ sung làm cô đặc axit nucleic Trong nhiều trường hợp, axit nucleic cần cô đặc thêm để tiến hành cho mục đích thí nghiệm khác Sau số phương pháp: + Kết tủa: việc làm kết tủa axit nucleic sau pha lỗng dung dịch tích nhỏ làm tăng nồng độ axit nucleic Đây phương pháp đơn giản, an tồn làm biến tính axit nucleic + Bay hơi: dung dịch chứa axit nucleic cô đặc việc làm bay dung môi Phương pháp bay thực máy cô ADN hay máy cô lạnh chân không Nguyên tắc hoạt động máy cô ADN dùng phận gia nhiệt làm bay dung môi (và hợp chất có phân tử lượng nhỏ) với trình ly lâm, giữ thành phần axit nucleic dung dịch (để bay hơi, ống ly tâm mở nắp nắp đục lỗ) Trong phương pháp cô lạnh chân không, nhiệt độ thấp giữ mẫu dạng đông lạnh, nhờ thiết bị gia nhiệt giảm nhiệt tuần hoàn buồng chân không làm dung môi “thăng hoa” mẫu cô đặc + Lọc: phương pháp lọc qua màng giúp cô đặc nhanh axit nucleic Người ta thiết kế lọc lúc đầu ly tâm không cho axit nucleic qua mà cho nước phân tử nhỏ qua Sau việc rửa màng với dung mơi thích hợp thể tích nhỏ hơn, axit nucleic “rửa trơi” khỏi màng tạo thành dung dịch có nồng độ axit nucleic cao + Chiết suất với dung môi hữu cơ: Một phương pháp nhanh đơn giản dùng hỗn hợp nước butanol Quy trình giống quy trình gây kết tủa protein Nhưng đây, nước bị butanol hấp thụ phần, nên thể tích pha nước giảm nồng độ axit nucleic tăng lên Quy trình chiết xuất lặp lại nhiều lần thu nồng độ axit nucleic cao mong muốn + Các phương pháp khác: Một số phương pháp khác kể đến thẩm tách, chiết xuất từ gel điện di sắc ký lực Trong phương pháp sắc ký lực, axit nucleic ban đầu cho chạy qua cột lực lưu lại cột, sau rửa trơi nước với thể tích nhỏ Thành phần cột lực silica hydroxyapatite Tuy nhiên, thực tế thể tích dung môi cần dùng để thu hồi axit nucleic thường lớn, nên phương pháp thường dùng đề tinh axit nucleic để làm cô đặc thành phần dịch chiết d) Tinh axit nucleic Như nêu trên, phân tử axit nucleic sau chiết xuất tinh tiếp cách gây kết tủa nhiều lần, sắc ký lực hay số phương pháp khác Một phương pháp thông dụng kết hợp sắc ký lực ly tâm Bước ly tâm giúp cho việc phân tách thu hồi sản phẩm sắc ký nhanh Nguyên tắc sở để thiết kế kít chiết xuất tinh ADN ARN có mặt phổ biến thị trường (như kit hãng Qiagen – Đức, v.v…) 1.1.2 Tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn Dưới ví dụ quy trình tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn: Bước - nuôi vi khuẩn: để thu sinh khối, tạo môi trường nuôi cấy có điều kiện nhiệt độ, pH thành phần dinh dưỡng phù hợp Sau thu lấy tế bào, ly tâm lạnh (thường 4oC) với tốc độ khoảng 4000 vịng / phút để thu tế bào Thơng thường từ lít dịch ni cấy thu lấy khoảng 10 ml cặn vi khuẩn Bước - phá màng tế bào vi khuẩn: có nhiều cách, đơng khơ cặn vi khuẩn, nghiền với SDS SDS có tác dụng làm vỡ màng tế bào, phân tách thành phần lipid giải phóng ADN Có thể nghiền cặn vi khuẩn dung dịch đệm chứa EDTA (Ethylendiamine tetraacetic acid); EDTA có xu hướng hấp thu ion kim loại nặng, bao gồm Mg2+, gây ức chế hoạt tính enzym phân giải ADN (ADNase) ARN (ARNase) Cũng phá màng tế bào vi khuẩn việc ủ với enzym lysozym nhiệt độ phù hợp Bước - loại bỏ protein tế bào vi khuẩn: dịch nghiền tế bào vi khuẩn ủ với enzym protease K nhiệt độ 37oC - giờ, thêm vào hỗn hợp phenol chloroform (1 : v/v), lắc nhẹ, ly tâm để thu kết tủa protein Bước - kết tủa thu ADN: Dùng 4/10 thể tích ethanol (100%) lạnh với 1/10 thể tích NaCOOH (3 M) 5/10 dung dịch đệm chiết ADN, ủ với ARNase để thủy phân ARN, ủ -20oC - để tủa ADN Ly tâm lạnh tốc độ 12.000 14.000 vòng / phút 15 phút để thu tủa ADN ADN sau rửa ethanol 70 % Để tủa khô tự nhiên máy ADN, hịa tan ADN nước siêu Mẫu đem bảo quản nhiệt độ âm sâu dùng - tháng Đối với loại vi sinh vật, quy trình cải tiến với nồng độ thành phần, bước tiến hành thời giai ủ biến đổi cho phù hợp 1.1.3 Tách chiết ADN từ mô, tế bào động vật thực vật Các bước tiến hành giống tách chiết ADN vi khuẩn, nhiều trường hợp tế bào động, thực vật phải nuôi cấy không cần nuôi cấy Tùy mẫu sinh phẩm, tóc, lơng, trứng, máu, v.v… dùng quy trình tách chiết với điều kiện hóa chất, dung mơi cải tiến cho phù hợp 1.1.4 Tách chiết tinh ARN Để tách chiết ARN, người ta thường chiết xuất axit nucleic tổng số nêu Sau đó, tùy theo đặc điểm cấu trúc loại ARN, kỹ thuật tách chiết ARN khác sử dụng Dịch chiết sau làm protein ủ với ADNase để thủy phân ADN, gây tủa để tách chiết ARN tổng số Đối với mARN sinh vật nhân chuẩn, phương pháp tinh phổ biến phương pháp sắc ký lực cột oligo(dT)-cellulose Dựa vào cấu trúc phân tử mARN thường có poly(A), người ta thiết kế cột lực mang hạt có cấu trúc polyoligo(dT) Dung dịch chứa mARN có hàm lượng muối cao trung hịa điện tích mARN trình tự poly(A) phân tử tạo liên kết bổ sung với trình tự polyoligo(dT) cột sắc ký lưu lại Sau đó, việc bổ sung dung dịch có nồng độ muối thấp (hoặc đơn giản nước siêu sạch) giúp rửa trơi thu hồi mARN lúc có mức độ tinh cao Ngoài phương pháp sắc ký lực cột oligo(dT), phân tử mARN tinh phương pháp “hấp phụ từ tính” Theo phương pháp này, hỗn hợp ARN tổng số ủ với biotin-poly(dT) mơi trường có hàm lượng muối cao để tạo phân tử lai trình tự poly(A) poly(dT) Sau việc bổ sung streptavidin gắn với phân tử mang từ tính, chúng “từ tính hóa” phân tử mARN thơng qua cấu trúc biotin-poly(dT), cho dung dịch hỗn hợp ARN chảy qua ống có từ tính phân tử mARN giữ lại Sau đó, việc rửa với dung dịch có nồng độ muối thấp (hoặc nước), ta thu mARN có độ tinh cao (mặc dù lẫn lượng nhỏ steptavidin) Nguyên lý sở thiết kế nhiều kit tinh mARN thương phẩm (như PolyA Tract hãng Promega) 1.1.5 Các phương pháp định tính định lượng axit nucleic a) Phương pháp quang phổ Các cấu trúc vòng thơm (purin pyrimidin) nucleotit cấu tạo nên ADN ARN làm cho phân tử có cường độ hấp thụ tia tử ngoại cực đại bước sóng 260 nm (chính xác bước sóng 257 nm, tương ứng với tia UV) Khi tia UV chiếu qua dung dịch axit nucleic, mức hấp thụ (viết tắt A260 hay OD260) tương quan với nồng độ axit nucleic Tính chất nguyên lý việc dùng quang phổ (giá trị A260) để ước tính nồng độ ADN ARN có dung dịch Nếu dung dịch chứa nucleotit đơn lẻ, nucleotit hịa tan khắp dung dịch, nên cường độ hấp thụ chúng lớn chúng phân tử ADN ARN Sở dĩ cường độ hấp thụ tia UV chủ yếu vòng purin pyrimidin khung đường-phosphate Trong phân tử ADN sợi kép, vòng purin pyrimidin bị “chắn” khung đường-phosphate chúng chồng lấp lên nhau, nên cường độ hấp thụ giảm Các phân tử ARN ADN có cấu trúc mạch đơn với số vùng sợi kép có mức hấp thụ trung bình Nồng độ ADN ARN dung dịch thường qui đổi từ số A260 theo công thức: A260 dung dịch ADN sợi kép (dsADN) = 50 g A260 dung dịch ADN mạch đơn (ssADN)/ARN = 40 g A260 dung dịch dNTP/oligonucleotit (nucleotit đơn) = 33 g Khi tính nồng độ ADN, cần lưu ý đến hệ số pha loãng dịch chiết Từ ta có cơng thức tính (đối với trường hợp áp dụng cho ADN sợi kép) là: CADN (g/ml) = A260  50  (độ pha loãng) Ví dụ: dịch chiết ADN tổng số (giả thiết gồm hầu hết dsADN) pha loãng 20 lần, đo quang phổ thu A260 0,7 Dịch chiết ADN có nồng độ là: 0,7  50  20  70 g/ml Để kiểm tra độ tinh dung dịch axit nucleic, người ta thường đồng thời đo giá trị quang phổ hấp thụ bước sóng 280 nm, phổ hấp thụ cực đại protein (điều chủ yếu cấu trúc vòng thơm tryptophan) Độ tinh dịch chiết xác định qua tỉ số A260/A280 Dịch chiết chứa ADN tinh có tỉ số A260/A280 xấp xỉ 1,8 Nếu lẫn protein, tỉ số thường thấp 1,8 Nếu lẫn ARN, tỉ số lớn 1,8 Dịch chiết chứa ARN tinh có tỉ số A260/A280 xấp xỉ 2,0 Phương pháp điện di Việc phân tích mức độ tinh định lượng ADN thực với phương pháp điện di Do phân tử ADN pH trung tính tích điện âm, trường điện di, di chuyển từ cực âm sang cực dương Có nhiều phương pháp điện di khác dùng nghiên cứu ADN, phổ biến điện di gel agrose điện di gel polyacrylamide bổ sung SDS (viết tắt SDS-PAGE) 1.2 CÁC ENZYM DÙNG TRONG CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP Bước để tạo phân tử ADN tái tổ hợp “cắt” đoạn ADN đích mong muốn “gắn” vào phân tử ADN khác (thường vectơ hay gọi thể truyền) Chẳng hạn như, để nhân dòng gen mong muốn, cần xác định vị trí gen tách khỏi hệ gen, tạo cADN gen xuất phát từ mARN Q trình phân lập gen cần thực xác, nghĩa khơng làm hay bổ sung thêm nucleotit vào trình tự gen (nếu khơng mục đích nghiên cứu khác) Sở dĩ kỹ thuật ADN tái tổ hợp thực nhờ ADN dù có nguồn gốc sinh vật có thành phần cấu tạo giống Chúng trình tự deoxyribonucleotit nối với qua liên kết phosphodieste, với hầu hết sinh vật (chỉ trừ số virut), ADN có cấu trúc sợi kép Do vậy, việc “cắt” “nối” đoạn ADN thực chất xúc tác hình thành liên kết phosphodieste deoxyribonucleotit thuộc phân tử ADN khác Về lý thuyết, q trình ghép nối thực phương pháp vật lý, hóa học hay chế enzym Tuy nhiên, phương pháp vật lý hóa học thường khơng hiệu cần ghép nối trình tự nucleotit đặc thù Trong đó, phản ứng ghép nối nhờ enzym có tính đặc hiệu trình tự nucleotit cao diễn nhanh nên dùng phổ biến Đến có hàng ngàn enzym tìm thấy sử dụng cơng nghệ ADN tái tổ hợp Dựa vào chức enzym này, người ta chia chúng thành số nhóm sau: - Các enzym làm đứt gãy liên kết phosphodieste, gồm: enzym endonuclease (ví dụ: enzym giới hạn, DNase I, Mung Bean nuclease, RNaseH, RNase T1, RNase U2,…), loại enzym exonuclease (ví dụ: exonuclease III, exonuclease VII), số enzym vừa có hoạt tính endonuclease vừa có hoạt tính exonuclease (ví dụ: nuclease Bal 31, N crassa nuclease, nucleaza S1, …) - Các enzym nối khung đường-phosphate Ví dụ: E coli ligase, T4 ADN ligase, T4 ARN ligase,… - Các enzym tổng hợp liên kết phosphodieste Ví dụ: ADN polymerase I, T4 ADN polymerase, T7 ADN polymerase, ARN polymerase, enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase), Poly(A) polymerase, Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), polynucleotit phosphorylase, … - Các enzym gắn thêm loại gốc phosphate từ axit nucleic Ví dụ: T4 polynucleotit kinase, alkaline phosphatase, tobacco acid pyrophosphatase, … - Các enzym protein bảo vệ, đóng gói, giãn xoắn ADN Ví dụ: ADN methylase, protein liên kết mạch đơn (RecA, SSB …), topoisomerase I II, … Nhìn chung, enzym thuộc nhóm có chức chung tên gọi chúng, enzym lại có thuộc tính đặc thù nên chúng lựa chọn dùng cho mục đích thí nghiệm khác Trong phạm vi này, nêu ví dụ số enzym nhóm (là enzym viết nghiêng trên) Trong số enzym này, enzym giới hạn (restriction endonuclease) có vai trị quan trọng thiếu hầu hết nghiên cứu liên quan đến công nghệ ADN tái tổ hợp 1.2.1 Các enzym giới hạn Các enzym giới hạn enzym làm đứt gãy liên kết phosphodieste phân tử ADN Các enzym không “cắt” nucleotit đầu tận ADN (các enzym cắt đầu tận gọi exonuclease) Điểm nhận biết phân tử ADN enzym giới hạn thường trình tự đặc hiệu phổ biến gồm từ - cặp bazơ nitơ (bp) gọi trình tự nhận biết hay vị trí giới hạn Các enzym giới hạn chia làm số lớp, lớp nêu Bảng Chúng ta đề cập đến nhóm enzym giới hạn lớp II chúng nhóm dùng phổ biến với vai trò “chiếc kéo phân tử” để cắt trình tự ADN mong muốn Bảng Thuộc tính lớp enzym giới hạn (restriction endonuclease) Lớp Đặc điểm hoạt tính enzym I Enzym đa chức nuclease methylase; đa tiểu phần kích thước lớn (> 400.000 dalton) Có chức endonuclease methylase riêng rẽ Enzym đa chức nuclease methylase; đa tiểu phần (khối lượng 250.000 dalton) II III a Yếu tố đồng hoạt động ATP 2+ Mg SAM 2+ Mg ATP a 2+ Mg b SAM Đặc điểm phản ứng chất Cắt phân tử ADN sợi kép cách vị trí giới hạn  4000 - 7000 bp Thường cắt đối xứng phân tử ADN sợi kép vị trí giới hạn Có vị trí giới hạn gồm bp, cắt cách vị trí khoảng 10 - 27 bp phía đầu 3’ b khơng thiết yếu có tác dụng làm tăng hoạt tính, SAM = S – adenosylmethionine a) Các thuộc tính chung enzym giới hạn Phần lớn enzym giới hạn tìm thấy tự nhiên vi khuẩn, có enzym giới hạn tìm thấy tảo lục Chlorella Ở vi khuẩn, enzym giới hạn bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi lây nhiễm virut cách cắt (làm giới hạn) phân tử ADN virut xâm nhập vào tế bào Vi khuẩn biến đổi vị trí giới hạn ADN thân chế methyl hóa (gắn gốc –CH3; cịn gọi hoạt tính methylase), nhờ ADN vi khuẩn không bị tác động enzym giới hạn thân sinh Các enzym giới hạn phát Werner Arber, Daniel Nathans Hamilton O Smith năm 1962 - 1968, nhà khoa học trao giải thưởng Nobel Sinh lý học vào năm 1978 Từ đến có 1000 enzym giới hạn khác tìm thấy liên quan đến 120 trình tự giới hạn đặc thù Các enzym giới hạn đặt tên theo lồi sinh vật mà tìm Thường người ta sử dụng hệ thống chữ Chữ thứ đại diện cho tên chi, chữ thứ đại diện cho tên loài Theo quy ước, chữ viết nghiêng gạch chân, theo sau số la mã Đôi khi, số chữ bổ sung để nhấn mạnh cho chủng vi khuẩn từ enzym giới hạn tìm thấy Ví dụ, EcoRI tìm thấy từ chủng E coli RY13, cịn HindIII tìm thấy từ chủng Haemophilus influenza Rd Tên enzym giới hạn đọc theo cách viết tắt, ví dụ: BamHI đọc “Bam-hát-một”, EcoRI đọc “Êkô-rờ-một”, HindIII đọc “Hin-đê-ba” Phần lớn vị trí giới hạn có trình tự lặp lại đảo chiều (cịn gọi đối xứng qua tâm; xem ví dụ Bảng 2); nghĩa là, đọc theo chiều (hoặc 5’→3’ 3’→5’) trình tự nucleotit hai mạch giống Ví dụ, vị trí giới hạn EcoRI là: 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Bảng Đặc điểm số enzym giới hạn dùng phổ biến Enzym có trình tự nhận biết bp Enzym có trình tự nhận biết bp Enzym có trình tự nhận biết bp Enzym có trình tự nhận biết khơng đối xứng Tên enzym Cách phát âm Nguồn gốc enzym BamHI “Bam-hát-một” BglII “Bagel-hai” EcoRI “Êcô-rờ-một” E coli RY13 HaeII “Hay-hai” Haemophilus aeypticus HindIII “Hin-đê-ba” Haemophilus influenzae Rd PstI “Pesti-một” Providencia stuartii SalI “Sal-một” Streptomyces albus SmaI “Sma-một” Serratia marcescens HpaII “Hêpa-hai” Haemophilus parainfluenzae AluI “Alu-một” Sau3A “Sâu-ba-A” Staphylococcus aureus 3A NotI “Not-một” Nocardia otitidiscaviarum BstXI “Besti-x-một” Bacillus amyloliquefaciens H Bacillus globigi Arthobacter luteus Bacillus stearothermophilus Trình tự nhận biết (vị trí giới hạn) 5'-G^G A T C C-3' 3'-C C T A G^G-5' 5'-A^G A T C T-3' 3'-T C T A G^A-5' 5'-G^A A T T C-3' 3'-C T T A A^G-5' 5'-R G C G C^Y-3' 3'-Y^C G C G R-5' 5'-A^A G C T T-3' 3'-T T C G A^A-5' 5'-C T G C A^G-3' 3'-G^A C G T C-5' 5'-G^T C G A C-3' 3'-C A G C T^G-5' 5'-C C C^G G G-3' 3'-G G G^C C C-5' 5'-C^C G G-3' 3'-G G C^C-5' 5'-A G^C T-3' 3'-T C^G A-5' 5'-^G A T C -3' 3'- C T A G^-5' 5'-G C^G G C C G C-3' 3'-C G C C G G^C G-5' 5'-C C A N N N N N^N T G G-3' 3'-G G T N^N N N N N A C C-5' Ghi chú: A = adenin, G = guanin, C = cytosin, T = thymin, R = purin (A/G), Y = pyrimidin (T/C), N = nucleotit Đi polyA Hình 10 minh họa mARN bước quy trình tổng hợp cADN nhờ phản ứng Gắn mồi oligo(dT) phiên mã ngược từ mARN việc sử dụng enzym reverse transcriptase, RNase H, ADN Reverse transcriptase + loại dNTP; tạo phân tử lai cADN/mARN polymerase I ADN ligase mARN Vậy, sau tạo ra, ADN cADN nhân dòng vào mARN bị thủy phân RNase H vectơ nào? Hình minh họa cách nhân dòng cADN Các đoạn ARN chưa bị phân sử dụng đoạn nối giới hủy làm mồi hạn (gọi tắt đoạn nối) Đoạn tổng hợp ADN ADN polymerase I nối thường đoạn ADN ADN pol I tổng sợi kép ngắn (8 – 12 bp) chứa hợp mạch ADN đồng thời vị trí giới hạn; ví dụ loại bỏ mồi ARN Hình EcoRI Cả phân ADN ligase tử cADN đoạn nối ban đầu ADN ligase nối có cấu trúc đầu tù Chúng đoạn ADN nối với nhờ T4 ADN với ligase Đầu dính sau tạo cách cắt cADN (đã Phân tử cADN gắn với đoạn nối) enzym sợi kép EcoRI Lúc cADN sẵn sàng đề cài vào vectơ có đầu Hình 10 Tổng hợp cADN từ mARN nhờ enzym phiên mã ngược, RNase H, ADN polymerase I ADN ligase dính phù hợp với (chẳng hạn cắt EcoRI), biến nạp vào E coli Một khó khăn sử dụng đoạn nối đơi trình tự mã hóa cADN có vị trí giới hạn enzym dùng để cắt đoạn nối Để khắc phục điều này, có giải pháp sử dụng trực tiếp đoạn tiếp hợp bổ sung Ví dụ, để tạo đoạn tiếp hợp bổ sung có trình tự giống với đầu dính tạo BamHI, bổ sung đồng thời hai đoạn mạch đơn 5’-GATCCAGAC-3’ 5’-GTCTG-3’ để chúng bắt cặp hình thành nên đoạn tiếp hợp bổ sung có trình tự 5’-GATCCAGAC-3’ GTCTG-5’ T4 ADN ligase nối đầu tù đoạn tiếp hợp với đầu tù cADN, đồng thời tạo đầu dính lệch đầu 5’ với trình tự GATC Đầu dính gắn vào vectơ xử lý sẵn với BamHI trước biến nạp vào tế bào chủ Trong nhiều trường hợp, phân tử cADN đầu tù nhân dịng trực tiếp vào vectơ xử lý enzym có cách cắt tạo đầu tù, ví dụ SmaI (xem Bảng 2) III SÀNG LỌC THƯ VIỆN ADN Mục đích sàng lọc thư viện ADN để tìm dịng tế bào mang gen (đoạn ADN) quan tâm nghiên cứu 3.1 SÀNG LỌC THƯ VIỆN cADN Có nhiều cách để tìm dịng cADN mong muốn Một cách dựa tương tác đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, gọi phương pháp kết tủa miễn dịch (Hình 11) Theo cách này, cADN nhân dòng vectơ biểu cài vào promoter tín hiệu kết thúc phiên mã Trong tế bào chủ, cADN phiên mã thành mARN, dịch mã thành protein Mỗi dòng tế bào thư viện cADN mang cADN đặc thù nên protein chung tế bào chủ, cịn biểu protein đặc thù với cADN Dịng tế bào tổng hợp nên protein liên kết đặc hiệu với kháng thể đánh dấu (chẳng hạn đồng vị phóng xạ) xác định dịng mang cADN cần tìm (dịng tương ứng với điểm màu sẫm ảnh phóng xạ tự chụp bước Hình 11) Mỗi dịng tế bào mang cADN gen định tìm thấy khơng dùng để phân tích gen phạm vi lồi đó, mà cịn dùng để tìm kiếm so sánh với trình tự tương đồng lồi khác; dịng tế bào dùng để sàng lọc dòng tế bào tương ứng thư viện hệ gen để định lượng mARN nghiên cứu điều hòa biểu gen tương ứng Điểm bắt đầu dịch mã Đoạn ADN cài Promoter Tín hiệu kết thúc phiên mã  Vectơ plasmid tái tổ hợp Vector biểu  Biến nạp vectơ biểu mang cADN vào tế bào E coli  Nuôi cấy vi khuẩn môi trường chọn lọc; khuẩn lạc phát triển  Chuyển khuẩn lạc tương ứng vào giếng khay ni cấy  “Đóng dấu” khuẩn lạc lên màng lai tiếp tục nuôi; protein cADN biểu  Lấy màng lai phân giải tế bào insitu; protein cADN dính vào màng  Tạo phản ứng protein màng với kháng thể đánh dấu phóng xạ Kháng thể đánh dấu phóng xạ  Dựa ảnh phóng xạ tự chụp xác định dịng tế bào mang cADN biểu protein quan tâm Hình 11 Sàng lọc thư viện cADN để tìm dịng tế bào mang gen quan tâm nhờ “mẫu dò” kháng thể 3.2 SÀNG LỌC THƯ VIỆN HỆ GEN Khi có mẫu dị bắt nguồn từ cADN nhân dịng, xác định dòng tế bào thư viện hệ gen liên quan đến gen quan tâm Hình 12 minh họa quy trình sàng lọc thư viện hệ gen dùng vectơ nhân dòng plasmid sở phương pháp lai với mẫu dò chuẩn bị từ thư viện cADN Trong phương pháp này, trước tiên ADN từ dòng tế bào thư viện hệ gen tách chiết, tinh chuyển lên màng lai gây biến tính (tách thành mạch đơn) ADN tế bào biến tính tiến hành lai với mẫu dị cADN đánh dấu (chẳng hạn đồng vị phóng xạ gốc phát huỳnh quang) Các mẫu dò cADN đánh dấu khuếch tán bề mặt màng lai liên kết vào vị trí có ADN (lúc biến tính trạng thái mạch đơn) có trình tự nucleotit kết cặp bổ sung với Lúc này, phương pháp phát phù hợp, chẳng hạn kỹ thuật phóng xạ tự chụp (với mẫu dị đánh dấu phóng xạ) hay ảnh chụp huỳnh quang (với mẫu dò đánh dấu huỳnh quang), xác định vị trí kết cặp mẫu dị, từ luận dịng tế bào mang trình tự gen quan tâm nghiên cứu Trong nhiều trường hợp, sàng lọc thư viện hệ gen lồi mà khơng thiết phải có mẫu dị cADN từ lồi Do xu hướng gen chức lồi khác có mức độ tương đồng cao, nên sử dụng cADN loài để sàng lọc thư viện hệ gen lồi khác; ví dụ sử dụng cADN mã hóa gen -globin chuột để sàng lọc dịng tế bào mang trình tự ADN liên quan đến gen -globin người Mẫu dò trường hợp gọi mẫu dò tương đồng Các khuẩn lạc ADN khác loài Ngoài ra, riêng rẽ Màng lai nhiều protein biết phần trình Ủ với mẫu dò cADN đánh dấu Đặt màng lai lên đĩa ni cấy tự axit amin để “đóng dấu” khuẩn lạc Các đoạn ADN biết phần trình tự Màng lai tương đồng bắt (nitrocellulose) nucleotit gen cặp với Rửa trơi mẫu dị ADN mã hóa chúng, người Ủ màng lai dung dư thừa (khơng liên kết) dịch kiềm để làm biến tính ta trực tiếp ADN; tiến hành lai với mẫu dị đánh dấu phóng xạ tổng hợp mẫu dò (thường đoạn oligonucleotit ngắn Chụp ảnh phương pháp phóng xạ tự chụp Chụp ảnh phương pháp gồm khoảng 20 phóng xạ tự chụp Vị trí cho biết khuẩn lạc (dịng nucleotit) phương tế bào) mang đoạn ADN có pháp hóa học sử trình tự bổ sung với mẫu dị dụng chúng để sàng Hình 12 Sàng lọc thư viện hệ gen để tìm dịng tế bào mang trình lọc thư viện hệ gen tự ADN đặc thù nhờ sử dụng mẫu dò ADN dựa nguyên tắc lai ADN – ADN mơ tả IV PHÂN TÍCH ADN ĐƯỢC NHÂN DÒNG: LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HAN Các đoạn ADN nhân dịng dùng cho nhiều phân tích di truyền khác nhau, chẳng hạn lập đồ di truyền enzym giới hạn (lập đồ giới hạn), phân tích ADN (lai Southern), phân tích ARN (lai Nothern), v.v Trong phạm vi này, đề cập đến việc sử dụng chúng việc lập đồ giới han Do trình tự ADN nhân dòng thư viện hệ gen có tính đồng cao kích thước, nên chúng cắt enzym giới hạn, có số tương đối phân đoạn khác biệt kích thước tạo Những phân đoạn dễ dàng phân biệt với điện di Trên sở đó, người ta dễ dàng xác định vị trí giới hạn khoảng cách vị trí giới hạn enzym định trình tự ADN nhân dịng Q trình gọi lập đồ giới hạn, đồ vẽ vị trí giới hạn phân tử ADN gọi đồ giới hạn Bản đồ giới hạn dùng cho số mục đích khác nhau, chẳng hạn để định hướng cho việc nhân dòng phân đoạn gen hay cADN, kiểm chứng thí nghiệm nhân dịng định có tạo phân tử ADN tái tổ hợp hay không hay so sánh cADN với trình tự gen đầy đủ Hình 13 minh họa bước quy trình lập đồ giới hạn sau có phân đoạn ADN nhân dịng có kích thước 5,0-kb Theo quy trình này, ban đầu phân đoạn ADN nhân dòng xử lý với enzym giới han theo bốn phương thức khác nhau: i) không xử lý (phương thức đối chứng), ii) cắt enzym giới hạn EcoRI, iii) cắt enzym giới hạn BamHI, iv) cắt đồng thời hai enzym EcoRI BamHI Các phân đoạn ADN thu từ phương thức xử lý sau phân tách khỏi phương pháp điện di (hoặc gel agarose hay gel polyacrylamide tùy theo kích thước phân đoạn ADN dự đốn thu được) Việc phân tích sản phẩm cắt enzym giới hạn trường điện di giúp vẽ đồ giới hạn, cụ thể sau: 1) Khi xử lý riêng rẽ EcoRI, đoạn ADN 5,0-kb (biểu băng điện di tương ứng kích thước 5,0-kb phương thức đối chứng) phân cắt thành hai phân đoạn ADN 4,5-kb 0,5-kb Điều cho thấy đoạn ADN 5,0-kb có vị trí giới hạn EcoRI cách đầu 0,5-kb 2) Khi đoạn ADN 5,0-kb xử lý riêng với BamHI, hai phân đoạn ADN 3,0-kb 2,0-kb tạo Bằng logic suy luận tương tự thấy thấy đoạn ADN 5,0-kb có vị trí giới hạn cho enzym BamHI vị trí cách đầu 2,0-kb 3) Đến đây, xác định đoạn ADN 5,0-kb có vị trí giới hạn EcoRI vị trí giới hạn BamHI Tuy vậy, chưa xác định khoảng cách hai vị trí giới hạn Có hai trường hợp xảy Trong trường hợp thứ (mơ hình A), vị trí giới hạn EcoRI cách đầu 0,5-kb vị trí giới hạn BamHI cách đầu 2,0-kb Lúc này, đoạn ADN 5,0-kb cắt đồng thời hai enzym có phân đoạn  Phân đoạn ADN 5,0 kb nhân dịng, từ thu nhiều ADN dài  Cắt Cắt bằng EcoRI BamHI   Chiều dịch chuyển Kích thước phân đoạn ADN Thang ADN chuẩn kích thước Khơng cắt  (đối chứng)  Phân tích ADN xử lý với enzym giới hạn, điện di phân đoạn cắt Cắt EcoRI BamHI  ADN ngắn  Dựa đường cong chuẩn kích thước khoảng cách di chuyển trường điện di, xác định kích thước phân đoạn ADN  Xây dựng đường cong chuẩn kích thước dựa kích thước thang ADN chuẩn  Kết Không cắt  Diễn giải Khơng cắt Dự đốn đoạn cắt EcoRI BamHI  Xây dựng mơ hình  Kết luận Mơ hình A 3,0, 1,5 0,5 kb Mơ hình B 2,5, 2,0 0,5 kb Kết cắt hai enzym cho thấy mơ hình B Hình 13 Lập đồ giới hạn phân đoạn ADN EcoRI BamHI tạo với kích thước tương ứng 0,5-kb, 1,5-kb 3,0-kb Trong trường hợp thứ hai (mơ hình B), vị trí giới hạn EcoRI cách đầu 0,5-kb vị trí giới hạn BamHI cách đầu đối diện 2,0-kb Lúc này, đoạn ADN 5,0-kb cắt đồng thời hai enzym có phân đoạn tạo có kích thước tương ứng 0,5-kb, 2,5-kb 2,0-kb Kết phân tích phân đoạn ADN điện di thứ (cắt đồng thời hai enzym) cho thấy mơ hình B đồ giới hạn thu (0,5-kb)-EcoRI-(2,5-kb)-BamHI-(2,0-kb) Trong thực tế, việc lập đồ giới hạn phức tạp so với ví dụ đây, chẳng hạn có nhiều enzym giới hạn hơn, số vị trí giới hạn xuất nhiều Tuy vậy, vấn đề khắc phục phương pháp điện di chuẩn bị gel agarose Theo phương pháp này, ban đầu lượng lớn ADN cắt enzym giới hạn phù hợp (ví dụ BamHI) phân đoạn cắt phân tách gel điện di agarose Sau phân đoạn quan sát ghi nhận, phân đoạn thu hồi cách khỏi gel agarose Mỗi phân đoạn sau cắt enzym giới hạn thứ hai vẽ đồ vị trí giới hạn enzym thứ hai cho phân đoạn Chẳng hạn, ví dụ đây, phân đoạn cắt 3,0-kb BamHI xác định có vị trí giới hạn EcoRI, phân đoạn cắt 2,0-kb BamHI khơng có Theo phương pháp này, cần tiến hành thêm số bước tinh điện di ADN, song số mơ hình mối quan hệ vị trí giới hạn enzym khác dễ xác định V NHÂN DÒNG ADN BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP - PCR Ngồi kỹ thuật nhân dịng gen tế bào (in vivo), phương pháp nhân dòng gen invitro đơn giản, hiệu dùng phổ biến hầu hết phịng thí nghiệm di truyền học sinh học phân tử phản ứng chuỗi trùng hợp - PCR (Hình 14) Kỹ thuật PCR dùng ADN polymerase để tổng hợp phân tử ADN từ trình tự phân tử ADN làm khn với tiền chất dNTP Như biết, ADN polymerase tổng hợp ADN theo chiều 5’ 3’ xúc tác gắn nucleotit vào đầu 3’ đoạn oligonucleotit có sẵn Thế nên, ta ó cú on oligonucleotit liờn ADN khuôn Mồi ng-ợc kt bổ sung vào mạch ADN làm khn, 5 ADN polymerase dùng đoạn mi ADN đích Mồi xuôi xúc tác phản ứng kéo dài chuỗi ADN phía đầu 3’ hết trình tự mạch khn Ph¶n øng PCR Câu hỏi đặt là: cách dùng phản ứng PCR để nhân dịng on trỡnh t ADN Đoạn ADN c hiu? Lỳc ny, ngi ta s tng hp v s dng đích Đoạn ADN hai đoạn oligonuleotide có vị trí liên kết chặn hai đích Đoạn ADN đích u ca on ADN ớch cn nhõn dũng on Nhiều đoạn ADN ®Ých oligonucleotit thứ có trình tự bổ sung với đầu 5’ mạch mã hóa, gọi mồi xuụi; on th Hình 14 Nhân dòng ADN PCR hai có trình tự bổ sung với đầu 5’ mạch đối mã, gọi mồi ngược Phân tử ADN làm khn gây biến tính nhiệt, tạo điều kiện cho mồi xi mồi ngược đính kết vào vị trí hai đầu đoạn ADN cần nhân dịng Với có mặt tiền chất dNTP, ADN polymerase nhân dịng đoạn trình tự ADN đích giới hạn hai đoạn mồi Trong phản ứng PCR, phân tử ADN gây biến tính tổng hợp ADN diễn lặp lại qua nhiều chu kỳ nhờ khả điều nhiệt máy Kết là: sau chu kỳ điều nhiệt, số phân tử ADN lại tăng gấp đôi Đây phản ứng có độ nhạy cao Chỉ cần vài ADN có mẫu nghiên cứu, thu hàng tỉ sau khoảng 30 chu kỳ phản ứng (số ADN ước tính xấp xỉ 2n với n số chu kỳ phản ứng) 5.1 MỘT SỐ ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA PCR PCR phương pháp nhân phân đoạn ADN nhanh hiệu Nguyên lý phân tử trình chép ADN giống với nhân dòng ADN tế bào, song PCR có độ nhạy tốc độ nhân ADN cao nhiều Từ phân đoạn ADN ban đầu, sau vài giờ, có hàng triệu phân đoạn ADN Ngược lại, tiến hành nhân dòng ADN tế bào, nguồn vật liệu ADN ban đầu thường cần với số lượng lớn; ngồi ra, thường phải cần tuần để hồn thành tất bước quy trình nhân dịng ADN tế bào Mặc dù vậy, phương pháp PCR có hai hạn chế lớn Thứ nhất, để tiến hành phản ứng PCR cần thiết kế cặp mồi PCR đặc hiệu với phân đoạn ADN đích Điều có nghĩa trình tự nucleotit phân đoạn ADN đích cần phải biết trước (ít phần) Thứ hai, chiều dài phân đoạn ADN nhân dịng PCR bị hạn chế hoạt tính enzym điều kiện mơi trường xung quanh; kích thước sản phẩm PCR tối đa đạt khoảng 20 kb Một vấn đề khác liên quan đến PCR enzym Taq ADN polymerase thiếu hoạt tính đọc sửa; nghĩa là, bazơ kết cặp sai hoạt động enzym điều kiện invitro không sửa chữa Vì PCR có độ nhạy cao, nên sai sót xuất sớm (trong chu kỳ PCR đầu tiên), phần lớn phân tử ADN nhân dịng sau mang lỗi Để hạn chế nhược điểm này, người ta thường sử dụng Taq polymerase phối hợp với số enzym ADN polymerase có hoạt tính đọc sửa Pfu polymerase hay Vent polymerase thí nghiệm địi hỏi độ xác cao sản phẩm PCR 5.2 PCR PHIÊN Mà NGƯỢC (RT-PCR) VÀ ĐỊNH LƯỢNG mARN Giống với PCR, RT-PCR (PCR phiên mã ngược) phương pháp nhạy hiệu để nhân cADN dựa khuôn phiên mã mARN gen tương ứng Phương pháp trực tiếp giúp phát định lượng ARN Một quy trình RT-PCR thường có hai bước Trong bước thứ nhất, cADN tổng hợp dựa mạch khn ARN nhờ hoạt tính enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) từ mồi phù hợp (ví dụ oligo-dT với mạch khn mARN; Hình 10) Trong bước thứ hai, cADN đặc thù nhân phản ứng PCR thơng thường RT-PCR dùng để xác định có mặt ARN đặc thù Chẳng hạn như, với nhiều virut gây bệnh có hệ gen ARN, RT-PCR giúp nhân hệ gen chúng, qua phát cá thể định có bị nhiễm virut ARN gây bệnh hay khơng Đây phương pháp chẩn đốn bệnh trở thành thường quy xét nghiệm HIV, virut sởi, quai bị nhiều virut ARN gây bệnh khác Việc ứng dụng RT-PCR để định lượng ARN, qua đánh giá mức độ biểu gen mức độ phiên mã, thực sau: RT-PCR diễn số chu kỳ, sản phẩm cADN nhuộm với ethidium bromide Do hàm lượng sản phẩm RT-PCR tỉ lệ thuận với cường độ phát quang ethidium bromide tương quan với số ARN đầu tiên, nên từ số liệu cường độ phát quang đo được, người ta ước tính lượng mARN có vật liệu ban đầu Tuy vậy, ethidium bromide thuốc nhuộm ADN có độ nhạy cao, nên sai số định lượng ARN lớn Một phương pháp định lượng ARN coi xác tiến hành lai ARN với mẫu dị ADN đánh dấu phóng xạ huỳnh quang (phương pháp thẩm tách Northern) Tuy vậy, nhược điểm thẩm tách Northern quy trình gồm nhiều thao tác bước lai phải thực cẩn thận xác Gần đây, nhà khoa học phát triển phương pháp cải tiến sở RT-PCR cho phép định lượng ARN xác cao gọi phương pháp PCR thời gian thực (real-time PCR), Trong kỹ thuật này, bước phiên mã ngược ban đầu dùng để tổng hợp nên cADN mạch đơn thứ nhất, bước nhân dịng cADN sau tiến hành có mặt SYBR-green, thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu ADN có độ nhạy cao Đồng thời với trình nhân cADN, cường độ phát quang thuốc nhuộm đo thời gian thực (vì gọi RT-PCR thời gian thực) nhờ thiết bị đo huỳnh quang dựa nguồn sáng laser lắp đặt máy PCR Phương pháp phương pháp định lượng ARN có độ tin cậy cao dùng rộng rãi để định lượng mARN nghiên cứu điểu hòa biểu gen đối tượng sinh vật khác VI GIẢI TRÌNH TỰ ADN VÀ TÌM KIẾM CÁC GEN Trong phần xem cách xác định trình tự nucleotit đoạn ADN ngắn toàn phân tử ADN dài Nguyên tắc hầu hết phương pháp giải trình tự ADN dựa phương pháp Sanger cộng công bố năm 1977, gọi phương pháp dideoxyribonucleotit (gọi tắt phương pháp dideoxy) Nguyên tắc phương pháp dideoxy dựa việc bổ sung dẫn Baz¬ Baz¬ xuất tương ứng dNTP 2’,3’dideoxynucleotit (viết tắt ddNTP, Hình 15) vào thành phần phản ứng tổng hợp ADN ống nghiệm Do Hình 15 Cấu trúc dNTP (trái) ddNTP (ph¶i) ddNTP thiếu nhóm C3’-OH, nên gắn vào mạch ADN tổng hợp, trình tổng hợp ADN dừng lại Trong phương pháp Sanger, chép ADN bắt đầu việc gắn đoạn mồi oligonucleotit có trình tự bổ sung với trình tự ADN cần giải trình tự ủ ChiỊu ®iÖn di chúng với enzym ADN pol Phân tử ADN tổng hợp có trình tự bổ sung với mạch ADN làm khn Các phản ứng giải trình tự chia làm bốn ống nghiệm tách biệt Mỗi ống bổ sung hỗn hợp gồm loại dNTP thông thường (vốn cần cho tổng hợp mạch ADN mới); loại dNTP đánh dấu phóng xạ để phát mạch tổng hợp Ngoài ra, loại loại ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP ddTTP) bổ sung tương ứng vào ống nghiệm nêu với nồng độ 1/10 so với nồng độ loại dNTP tương ứng Với thành phần phản ứng vậy, phần lớn trường hợp, dNTP liên kết vào mạch ADN tổng hợp, ddNTP (ở nồng độ thấp) liên kết vào số mạch ADN tổng hợp làm kết thúc trình chép Do có nhiều phân tử ADN tổng hợp đồng thời nên trình dẫn đến hình thành hỗn hợp nhiều phân tử ADN chép khơng hồn chỉnh giống đầu 5’ đánh dấu khác đầu 3’ chiều dài loại nucleotit kết thúc chuỗi (Hình 16) Các sản phẩm sau phân tách gel polyacrylamide đọc trình tự theo thứ tự băng xuất điện di theo chiều từ cực dương sang cực âm Đã có nhiều cải tiến đưa nhằm nâng cao hiệu phương pháp dideoxy kể từ Sanger công bố Trong phương pháp Sanger, enzym ADN pol I E coli dùng làm enzym chép Sau đó, thay ADN pol có nguồn gốc từ phagơ T7 có hiệu chép ADN mạch dài tốt Ngày nay, phần lớn việc giải trình tự ADN dựa phương pháp dideoxy kết hợp với phản ứng PCR sử dụng enzym chịu nhiệt, Taq ADN pol, ưu việt enzym có tên thương mại l sequenase õy l enzym tỏi t Hình 16 Giải tr×nh tù ADN nhê sư dơng Sù chÐp ADN sÏ kÕt thóc hợp có nguồn gốc từ ADN pol ca phag T7 ddNTP ddNTP đ-ợc kết hợp vào chuỗi Trình tự mạch Enzym ny cú hiu qu chộp tt cỏc mch ADN tổng hợp đ-ợc đọc theo chiỊu 5’  3’ ADN dài, có tính chịu nhit, cú hot tớnh c t-ơng ứng từ đáy lên ®Ønh cđa b¶n ®iƯn di sửa lắp ráp loại nucleotit cải biến (ngoài loại nucleotit bản) vào mạch ADN tổng hợp Việc kết hợp với phương pháp PCR cho phép giải trình tự ADN từ lượng nhỏ ADN sợi kép, đồng thời cho phép giải trình tự trực tiếp số hệ gen kích thước nhỏ, virut vi khuẩn Trong đó, việc giải trình tự hệ gen sinh vật bậc cao (có kích thước hệ gen lớn) cần phải qua bước nhân dòng sử dụng thư viện hệ gen 6.1 GIẢI TRÌNH TỰ ADN T NG C-ờng độ phát quang K thut gii trỡnh tự Sanger mơ tả xác định xác trình tự nucleotit đoạn ADN dài tới 300 bp Tuy nhiên, phương pháp cần nhiều thao tác kỹ thuật Cụ thể, nhiều bước pipet xác phải thực đồng thời cho kết tốt; mẫu phân tích phải đồng thời chạy điện di khác Ngoài ra, việc đọc kết điện di mắt đơi có sai sót Hiện nay, để giải trình tự ADN hệ gen lớn (như người, ~3,2x109 bp) chủ yếu dựa vào phương pháp giải trình tự tự động Phương pháp giải trình tự tự động kết hợp đồng thời phản ứng độc lập vào phản ứng chung Trong điều kiện vậy, việc dùng nucleotit đánh dấu phóng xạ (gắn vào đầu 5’ mạch ADN tổng hợp mới) không phù hợp đoạn ADN tổng hợp khác nucleotit nên khó phân tách điện di thơng thường Tuy nhiên, trở ngại khắc phục đầu 3’ đoạn ADN tổng hợp “đánh dấu” “phát tín hiệu” Để làm điều đó, người ta dùng ddNTP gắn chất phát quang (Glazer Mathies, 1997) Các ddNTP lúc liên kết vào mạch ADN kéo dài làm ngừng phản ứng chép Cấu trúc phần phát quang a) ddNTP gồm “gốc phát quang” RE ChÊt nhËn dRhodamine liên kết với bốn gốc dichlororhodamine (viết tắt dRhodamine, chất nhận lượng quang) khác qua mt on ni Chất phát quang Đoạn nối (Hỡnh 17) Bốn gốc dRhodamine bị “gốc phát quang” kích thích (bởi nguồn sáng laser thường từ Argon) nhận lượng phát quang bước sóng khác Nhờ vậy, loại ddNTP b) kích thích nguồn sáng Argon máy giải trình tự phát “tín hiệu” khác Thơng tin cảm biến tín hiệu kết hợp với máy tính xử lý tự động chuyển thành trình tự ADN (Hình 18) Các ddNTP gắn chất phát quang theo nguyên lý gọi B-íc sãng (nm) yếu tố kết thúc chuỗi BigDyeTM H×nh 17 Thuèc nhuém gắn với ddNTP đ-ợc dùng cho giải trình tự ADN a) Cấu trúc hóa học chất kết thúc chuỗi BigDyeTM Trong đó, ddNTP kết thúc chuỗi khác có thuộc tính phát quang khác phụ thuộc vào c¸c gèc R b) Phỉ ph¸t quang cđa gèc BigDyeTM gắn vào loại ddNTP khác Giải trình tự tự động có nhiều ưu a) điểm hn so vi phng phỏp th cụng Mồi để giải tr×nh tù Sanger Ưu điểm lớn khả tự động hóa phần lớn bước trình phân tích Nhiều bước phản ứng Tr×nh tù thu đ-ợc gii trỡnh t cú th thc hin bng rôbốt, kể từ việc pipet mẫu đến phản ứng PCR Các sản phẩm sau tinh cho chạy qua cột điện di mao quản mà không cần thao tác trực tiếp người Tốc độ đọc mức độ xác ca phng phỏp t ng rt Chuyển thành trình cao, đặc biệt đoạn ADN dài từ tù m¹ch m· hãa 30 đến 1000 bp (độ xác cao ViÕt l¹i theo đoạn có trình tự chiỊu 5’ 3’ 600 bp) Một hệ thống giải trình tự ADN trung bình đọc - triệu bp ngày với độ b) xác 99% Ngồi ra, phương pháp có độ nhạy cao mà khơng cần phải sử dụng chất phóng xạ Tuy nhiên, phải nói kỹ thuật giải trình tự ADN tự động lúc cho kết qu 18 Giải trình tự ADN tự động a) Sử dơng phân tích hồn tồn xác Một số hạn Hình mồi để tổng hợp ADN Quá trình kết thóc b»ng ddNTP chế phương pháp gồm có: nú phát quang Chuỗi pic tách biệt cho biết tr×nh tù ADN khơng đọc trình tự q ngn b) Phổ trình tự đ-ợc xác định máy ABI Prism377 (dưới 30 bp, hiệu suất PCR phân đoạn ADN thấp, thân chúng bền phát tín hiệu yếu); sai số đọc tăng lên giải trình tự đoạn ADN 1000 bp; ngồi ra, đoạn ADN mang nhiều trình tự lặp có xu hướng bị “nén” lại chạy qua cột chứa gel (lắp máy), dẫn đến tượng pic vùng trình tự lặp lại có xu hướng lồng vào (khơng phân tách) nên khó xác định trình tự xác Các trình tự thường cần kiểm tra lại phương pháp thủ công Trong thực tế, đoạn ADN cuối giải trình tự dự án hệ gen người (hoàn thành năm 2006) đoạn ADN có mức độ lặp lại lớn thuộc NST số 6.2 GIẢI TRÌNH TỰ TỒN HỆ GEN Như nêu trên, việc giải trình tự đoạn ADN ngắn thực tương đối dễ dàng nhờ máy giải trình tự tự động Tuy vậy, hệ gen lớn giải trình tự nào? Dưới số phương pháp giải trình tự hệ gen Từ phần trên, biết để xây dựng thư viện hệ gen, ADN hệ gen tổng số cắt thành phân đoạn trước nhân dòng nhờ vectơ Mặc dù nguyên tắc, việc giải trình tự thực trực tiếp ADN hệ gen, thực tế cần phải biết trước nhiều trình tự hệ gen thiết kế mồi để nhân đoạn khác khắp hệ gen Để khắc phục trở ngại này, người ta thường nhân dòng đoạn ADN vectơ, đoạn cài sau giải trình tự nhờ dùng mồi oligonucleotit kết cặp với trình tự biết vectơ Vấn đề cịn lại cách tái xếp lại đoạn ADN riêng rẽ thành trình tự đầy đủ liên tục hệ gen Có thể thực việc số cách sau đây: 1) Nhân dịng trình tự nằm gối lên (contig) Cách đơn giản để tạo trình tự nằm gối lên giải trình tự dịng từ thư viện hệ gen, dùng trình tự dịng thứ để xác định dịng thứ hai có phần đoạn cài gối lên đoạn thứ (nhờ lai với mẫu dị) Dịng thứ hai lại giải trình tự thơng tin trình tự lại dùng để xác định đoạn thứ ba gối lên đoạn thứ hai, v.v Nguyên tắc sở phương pháp bước nối tiếp nhiễm sắc thể dùng để xác định trật tự đoạn ADN gối lên (contig) dòng tế bào thư viện hệ gen Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp tốn nhiều thời gian công sức Một dịng phải phân lập giải trình tự trước tìm thấy dịng Ngồi ra, trình tự lặp lại (phổ biến hệ gen) dễ gây xếp nhầm 2) Giải trình tự ngẫu nhiên tồn hệ gen (kỹ thuật "shortgun") Toàn đoạn ADN hệ gen nhân dịng nhờ vectơ giải trình tự ngẫu nhiên Các trình tự sau phân tích phần mềm máy tính khả gối lên từ xếp nên trình tự tồn hệ gen (Hình 19) Phương pháp lần áp dung thành cơng giải trình tự hệ gen Haemophilus influenzae Toàn hệ gen vi khuẩn phân cắt ngẫu nhiên thành đoạn nhỏ “siêu âm”, đoạn nhỏ (1,5 – kb) nhân dòng vectơ plasmid pUC18 Tổng cộng thư viện hệ gen lồi gồm khoảng 20.000 dịng vi khuẩn khác Mỗi dòng (tương ứng với đoạn ADN vi khuẩn) sau giải trình tự để ri Giải trình tự ngẫu Giải trình tự ngẫu t hợp lại tạo nên tập hợp thơng tin nhiªn phân cấp nhiên toàn hệ gen ADN hệ gen v trình tự ADN gồm 12 triệu bp Độ dài tồn đoạn ADN giải trình tự dài gp ln h gen vi Giải trình tự khun Trình tự hệ gen cuối thu ngÉu nhiªn nhờ tổ hợp đoạn ADN S¾p xÕp ngn thnh cỏc on contig Cỏc on trình tự rỗng contig cuối Tr×nh tù hƯ lp y bng vic xỏc nh cỏc gen đ-ợc xác ®Þnh dịng bổ sung từ số thư viện hệ gen khác (thực tế, để giải trình tự H×nh 19 Giải trình tự hệ gen ph-ơng pháp giải trình tự ngẫu nhiên toàn h gen, ngi ta cn xõy dng ớt nht hệ gen giải trình tự ngẫu nhiên phân cấp th vin gen mang đoạn cài có kích thước trung bình khác nhau, ví dụ: 1, 10 kb) Ưu điểm rõ phương pháp “shortgun” nhanh khơng cần biết trước trình tự hệ gen, đặc biệt phù hợp với hệ gen nhỏ (như vi khuẩn) Phần lớn hệ gen vi khuẩn giải trình tự phương pháp “shortgun” vài tuần Tuy vậy, giải trình tự hệ gen lớn (như người), phương pháp có nhược điểm khó xếp đoạn contig vùng hệ gen có nhiều trình tự lặp lại kế tiếp; ngồi ra, số lượng contig lớn nên cần máy tính hiệu cao 3) Giải trình tự ngẫu nhiên phân cấp Để giải trình tự hệ gen lớn, có cải tiến ADN toàn hệ gen ban đầu cắt thành đoạn lớn tách dòng vào NST nhân tạo vi khuẩn (BAC) Sau đó, dòng BAC dùng để xây dựng thư viện “con” mang đoạn ADN cài kích thước ngắn (ví dụ: vectơ pUC18) Việc giải trình tự ngẫu nhiên tiến hành thư viện “con” Phương pháp giải trình tự ngẫu nhiên phân cấp giúp việc xếp contig dễ dàng 6.3 TÌM GEN TỪ HỆ GEN Đà ĐƯỢC GIẢI TRÌNH TỰ Sau hệ gen sinh vật giải trình tự, người ta dùng số phương pháp để tìm xác định vị trí gen NST, bao gồm: 1) Duyệt trình tự Các gen mã hóa protein phải chứa khung đọc mở (ORF) mang chuỗi ba (codon) mã hóa tương ứng cho trình tự axit amin protein Khung đọc mở mã mở đầu 5’-ATG-3’ mạch mã hóa (tương ứng với 3’-TAC-5’ mạch khơng mã hóa, tức mạch làm khn; mã 5’-AUG-3’ mARN), đồng thời kết thúc trước mã ba kết thúc dịch mã (TAA, TAG TGA) Chiều dài trung bình ORF khác loài Ở E coli, chiều dài trung bình ORF 317 codon; nấm men, chiều dài trung bình ORF 483 codon Nhìn chung, ORF thường chứa nhiều 50 codon Vì vậy, để tìm gen hệ gen, áp dụng phương pháp duyệt trình tự theo kiểu trượt dọc mạch ADN tìm codon mở đầu kết thúc cách 100 codon Phương pháp hiệu duyệt trình tự hệ gen prokaryote hệ gen chúng khơng có tính phân mảnh Nhưng, với hệ gen eukaryote, phương pháp gặp khó khăn ORF thường bị phân mảnh thành exon intron Việc duyệt trình tự hệ gen eukaryote thường phải nhờ phần mềm máy tính Grail, Genemark, v.v… Những phần mềm xác định ORF không dựa vào mã mở đầu kết thúc, mà dựa số thuật toán thống kê xác định đoạn có tiềm mã hóa, trình tự vùng biên exon intron, trình tự điều hòa phiên mã, hộp TATA, INR, DPE … trình tự cần thiết cho hoạt động yếu tố phiên mã TFIID phức hệ phiên mã ARN polymerase II Tuy vậy, mã mở đầu kết thúc dịch mã, trình tự khác có mức độ biến đổi lớn, nên việc xác định xác gen khơng phải lúc dễ dàng Để khắc phục hạn chế này, phương pháp bổ sung gen xác định sở gen biết lồi khác (vì chúng thường có mức tương đồng cao) Tuy nhiên, biện pháp so sánh có nguy gen giả (pseudogene) xác định nhầm gen 2) So sánh cADN Một cách hiệu để xác định gen hệ gen so sánh trình tự với cADN tương ứng Chúng ta biết rằng, cADN tạo từ mARN chủ yếu chứa trình tự exon ORF Việc so sánh trình tự thực nhờ phần mềm máy tính sử dụng phương pháp lai đoạn ADN hệ gen với mARN (phương pháp lai Northern) Các đoạn đánh dấu trình tự biểu - EST (expressed sequence tag) thường dùng cho mục đích EST thực chất đoạn trình tự ngắn (dài 200 – 500 bp) thường tạo sở giải trình tự từ hai đầu cADN Nhờ EST có tính đại diện cho phần hệ gen biểu nên chúng hiệu để tìm kiếm gen Trong thực nghiệm, EST cịn nhiều ưu điểm nữa, là: (1) đoạn EST tạo tương đối dễ dàng với chi phí thấp; (2) cần giải trình tự lần đủ để tạo EST đặc thù với cADN, tức gen; (3) lỗi gây giải trình tự thường không cần kiểm tra lại, EST dùng để tìm trình tự gần giống Các sở liệu EST (ví dụ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/) cung cấp triệu trình tự EST khác người Tất nhiên, có nhiều trình tự trùng nhiều lần (đặc biệt gen có mức độ biểu cao phổ biến); thiếu số EST tương ứng với gen có mức độ biểu thấp gặp (ví dụ: có tế bào, biểu điều kiện đặc biệt) 6.4 XÁC ĐỊNH VAI TRÒ VÀ CHỨC NĂNG GEN Các dự án giải trình tự hệ gen dẫn đến khơng bất ngờ Chẳng hạn như, nghiên cứu E coli S cereviseae dường tiến hành chi tiết hàng chục năm, giải trình tự xong hệ gen chúng, người ta biết có 30 - 40% số gen nghiên cứu Ở loài khác, bao gồm người, tỉ lệ gen nghiên cứu thấp Tuy vậy, sau hệ gen giải trình tự xong, có số phương pháp khác giúp nhanh chóng xác định vai trò chức nhiều gen hệ gen, bao gồm: 1) Tìm kiếm trình tự giống Giống việc dùng công cụ tin học việc tìm kiếm trình tự mã hóa hệ gen, sở liệu gen biết (ở lồi sinh vật khác nhau) dùng để xác định vai trò chức gen chưa biết Việc tìm kiếm trình tự giống thường dựa trình tự axit amin tương ứng với trình tự gen, tính đa dạng trình tự ADN thường cao trình tự polypeptide tương ứng tính thối hóa mã di truyền Thực nghiệm xác nhận rằng, gen có chức sinh vật khác ln có đặc điểm chung Chẳng hạn như, hầu hết lồi có khả chuyển hóa galactose  glucose-6P, enzym tham gia bước đường chuyển hóa (galactose  galactose-1-P) galactose kinase có tính đặc thù lồi, chúng có số đoạn trình tự giống (Hình 20) Như nói, trước giải trình tự hệ gen nấm men, có khoảng 30% tổng số 6000 gen nấm men biết Nhưng, sau giải xong hệ gen nấm men, phương pháp tìm kiếm trình tự giống nhau, người ta xác định thêm khoảng 30% gen Như vậy, khoảng 40% gen chưa rõ chức Tất nhiên, số có số gen giả 2) Xác định chức gen thực nghiệm Ở lồi sinh vật mơ hình, E coli hay S cereviseae, phương pháp để xác định chức gen chưa biết làm bất hoạt gen kỹ thuật “knockout” Trong kỹ thuật này, người ta dùng nguyên tắc tái tổ hợp tương đồng để làm hỏng bình thường gen Kiểu hình thể đột biến kiểm tra đối chiếu với kiểu dại để xác định chức gen Phương pháp có hiệu nghiên cứu xác định vai trò nhiều gen Chẳng hạn nấm men, việc so sánh trình tự khơng giúp xác định chức gen có tên SNU17, trình tự khác với trình tự gen biết Nhưng gen bị hỏng, tế bào nấm men phát triển chậm thường có nhiều sai hỏng q trình hồn thiện mARN Qua đó, chức SNU17 tìm thấy yếu tố tham gia hồn thiện mARN Điểm khó phương pháp nhiều trường hợp, cá thể mang gen bị hỏng a) chết sớm không biểu kiểu hình Cả hai trường hợp khơng Galactokinase dẫn đến kết luận chắn Khi gen bị “knock-out” gây chết suy luận protein gen mã hóa có vai trị sống cịn b) sinh vật, chức cụ thể chưa rõ Mặc dù có phương pháp phát chức gen trên, nhìn chung nhiều sinh vật, chức nhiều gen chưa rõ Thế nên, khối lượng công việc cho hướng h gen hc chc 20 So sánh trình tự năng” cịn lớn Riêng nấm men, cịn khoảng H×nh galactokinase từ loài khác 2000 gen cha c xác định chức năng; số a) Ph¶n øng xóc tác enzym galactokinase b) So sánh đoạn trình tù axit amin cđa người ước tính gần 20.000 gen galactokinase loài Hs: Homo sapiens, Sc: Saccharomyces cerevisiae, Ec: Escherichia coli, Bs: Bacillus subtilis, Ca: Candida albicans, Hi: Haemophilus influenza, St: Salmonella typhimurium, Kl: Kluyveromyces lactis, At: Arabidopsis thaliana