Tiểu luận tạo hoa hồng xanh bằng công nghệ ADN tái tổ hợp

PHẦN I MỞ ĐẦU Hoa hồng (Rosa chinensis Jacq.) loài thực vật thuộc Phân họ Hoa hồng (Rosoideae) Họ hoa hồng (Rosoideae) Bộ Hoa hồng (Rosales) thuộc Lớp Hai mầm (Dicotyledonae) hay Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Cây hoa hồng bụi leo lâu năm thân bụi mềm, cành có nhiều gai, hoa đẹp cành có nhiều gai, kép lơng chim, có khía răng, hoa có cánh nhị đực phát triển thành Hạt hoa hồng tụ đế hoa, phát triển thành Tuy nhiên hoa hồng thường nhân giống cách giâm cành, chiết cành ghép không gieo hạt Hoa hồng đa phần có nguồn gốc địa châu Á, số cịn lại có nguồn gốc địa châu Âu, Bắc Mỹ, Tây Bắc Phi Hoa hồng trồng làm cảnh lấy tinh dầu Hoa hồng biểu tượng tình yêu mang nhiều ý nghĩa văn hóa khác Hoa hồng xanh tồn tự nhiên biểu tượng cho tình yêu vĩnh cửu Hoa hồng xanh dương màu trời biển Nó liền với cảm giác sâu thẳm, vững vàng n bình Nó cịn màu trung thành, tin tưởng, thơng thái, tự tin, thơng minh Vì hoa hồng xanh quà tặng quý mang ý nghĩa đặc biệt Nhưng hoa hồng xanh không tồn tự nhiên hoa hồng thiếu gen tạo nên màu xanh hoa [12] Công nghệ di truyền (công nghệ gene – gene technology) bao gồm kỹ thuật đại thực axit nucleic (AND ARN) nhằm nghiên cứu cấu trúc gen, điều chỉnh biến đổi gen, nhằm tách, tổng hợp chuyển gen mong muốn vào tế bào vật chủ để tạo thể sinh vật mang nhũng đặc tính mới, tạo sản phẩm Để thực công nghệ di truyền, thực nghiệm cần phải sử dụng AND tái tổ hợp[1] Do đó, cơng nghệ AND tái tổ hợp công nghệ tảng, cơng nghệ di truyền, có ứng dụng lớn cơng nghệ chuyển gen Mục đích cơng tác chọn giống nhân giống cải tiến tiềm di truyền trồng, vật nuôi nhằm nâng cao suất, hiệu sản xuất nông nghiệp Trong công tác cải tạo giống cổ truyền chủ yếu sử dụng phương pháp lai tạo chọn lọc để cải tạo nguồn gen sinh vật Tuy nhiên, trình lai tạo tự nhiên, lai thu qua lai tạo chọn lọc cịn mang ln gen không mong muốn tổ hợp hai nhiễm sắc thể đơn bội giao tử đực giao tử Một hạn chế việc lai tạo tự nhiên thực cá thể lồi Lai xa, lai khác lồi gặp nhiều khó khăn, lai thường bất thụ sai khác nhiễm sắc thể số lượng lẫn hình thái bố mẹ, cấu tạo quan sinh dục, tập tính sinh học lồi khơng phù hợp với Nhờ thành tựu lĩnh vực DNA tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen đời cho phép khắc phục trở ngại nói Triển vọng cơng nghệ chuyển gen lớn, cho phép tạo giống vật ni, trồng mang đặc tính di truyền hồn tồn mới, có lợi cho người mà chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, khơng thể ln ln có được[1, 2] Một phát minh mang tính cách mạng kỹ thuật di truyền kỹ thuật ARNi ứng dụng nghiên cứu lĩnh vực khác cơng nghệ sinh học kiểm sốt bệnh virus, tạo thể chuyển gen sản xuất sinh dược trị liệu bệnh hiểm nghèo ung thư , AIDS….Kỹ thuật ARNi nhà khoa học người Mĩ Andrew Fire Craig Mello phát minh chế gây bất hoạt gen RNAi đăng tạp chí Nature năm 1998 đạt giải Nobel năm 2006 Kỹ thuật ARNi nhà khoa học ứng dụng lĩnh vực nông ngiệp chuyển gen thực vật giúp cải tiến trồng giá trị dinh dưỡng đối tượng thực vật: lúa mạch, gạo, bông, đay sợi, tinh dầu có giá trị dinh dưỡng cao , thay đổi màu sắc hoa : hoa khổ sâm, hoa hồng Các nhà khoa học Florigene (Australia) Suntory (Nhật Bản) nghiên cứu thành công việc tạo hoa hồng xanh – giảm hoạt động gen cyanidin hoa hồng cẩm chướng công nghệ RNAi công nghệ AND tái tổ hợp chuyển gen delphinidin tạo màu xanh vào hoa hồng, khắc phục vắng mặt gen tự nhiên [4 ] Do vậy, em sâu tìm hiểu đề tài tiểu luận là:“ Tạo hoa hồng xanh cơng nghệ ADN tái tổ hợp ” PHẦN II NỘI DUNG CHƯƠNG I SỰ HÌNH THÀNH MÀU SẮC CỦA HOA I.Vai trị màu sắc hoa Màu sắc hoa đóng vai trò quan trọng thụ phấn cách thu hút trùng thụ phấn, trùng lồi chim, ngồi cịn giúp bảo vệ hoa chống lại tác động bất lợi từ tia cực tím Màu hoa hấp dẫn người đặc điểm quan trọng hoa đặc trưng cho loại hoa[8, 10] II Anthocyanin tạo nên màu sắc cánh hoa Anthocyanin hợp chất glycoside athocyanidin Anthocyanin bao gồm chất flavonoid, carotenoids betalains Các chất khác số lượng vị trí nhóm hydroxyl phân tử, mức độ methyl hóa nhóm hydroxyl, chất, vị trí nhóm đường gắn vào phân tử, số nhóm acid mạch thẳng hay mạch vòng gắn vào phân tử[11] Màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào pH, chất màu có mặt nhiều yếu tố khác Tuy nhiên màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc mạnh vào pH môi trường Thông thường pH mơi trường < athocyanin có màu đỏ, pH > có màu xanh Ở pH = athocyanin thường dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, pH = 4-5 chúng chuyển sang dạng không màu, pH 7- có màu xanh Anthocyanin có bước sóng hấp thụ miền nhìn thấy, khả hấp thụ cực đại bước sóng 510 - 540nm Độ hấp thụ liên quan trực tiếp đến màu sắc anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH dịch bào, nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin cành lớn khả hấp thụ cành mạnh.[11] Anthocyanin bao gồm chất: carotenoid, betalains, flavonoid Trong carotenoid có vai trị chủ yếu để tạo nên màu vàng màu da cam hoa hướng dương hoa cà chua Betalains hình thành nên màu vàng cánh hoa cách kết hợp với hợp chất chứa nitơ dẫn xuất từ tyrosine tồn hoa cẩm chướng Flavonoids quy định loạt màu sắc hoa từ vàng nhạt sang màu đỏ, màu tím màu xanh Các đường sinh tổng hợp flavonoid có nhiều hướng để di truyền màu hoa có màu sắc đa dạng Trong có sáu anthocyanidins lớn : pelargonidin, cyanidin, peonidin (3'O-methyl cyanidin), delphinidin, petunidin (3 'delphinidin O-methy) malvidin (3', 5' delphinidin Odimethy) Vì số lượng nhóm hydroxyl nhóm tăng lên hấp thu ánh sáng quang phổ hấp thụ nên nhìn thấy bước sóng ánh sáng dài Cực đại dung dịch HCl-methanol 0,01% pelargonidin, cyanidin delphinidin 520, 535 546 nm tương ứng cho sắc tố Sự biến đổi anthocyanidins chủ yếu kết glycosyl hóa acyl hóa anthocyanins Bên cạnh cấu trúc anthocyanins, thay đổi không bào pH, tương tác phân tử (sự liên kết anthocyanins với đồng sắc tố anthocyanin với polyphenol), sửa đổi sau tổng hợp anthocyanins, tạo phức kim loại hình dạng tế bào tham gia vào hình thành nên màu sắc hoa Anthocyanins tạo nên màu đỏ đồng cánh hoa pH khơng bào thấp, tạo nên màu xanh cánh hoa không đồng ổn định pH khơng bào có tính axit Các yếu tố tương tác q trình tạo phức kim loại góp phần ổn định anthocyanins màu sắc hoa, đặc biệt màu xanh.[5,8,9] III Cơ chế hình thành màu sắc hoa Cơ chế hình thành màu sắc hoa có tham gia enzym, tiền chất điều khiển gen tổng hợp anthocyanin [6, 11] Các tiền chất để tổng hợp tất chất flavonoid, bao gồm anthocyanins, malonyl-COA p-coumaroyl-COA Các enzyme tham gia sản xuất flavonoid chalcone synthase (CHS) Enzyme xúc tác theo bước phản ứng ngưng tụ ba đơn vị acetate malonyl-CoA với p-coumaroyl-CoA để tạo thành 4, 2', 4', 6- tetrahydroxychalcone Tiếp theo với xúc tác flavanone 3-hydroxylase (F3H) (một loại enzime thuộc 2-oxoglutarate dioxygenases) xúc tác phản ứng hydroxyl hóa naringenin để chuyển hóa sang dihydrokaempferol (DHK) DHK sau hydroxy hóa flavonoid 3'hydroxylase (F3'H) để tạo thành dihydromyricetin (DHQ) flavonoid 3’ 5'hydroxylase (F3’5'H) để sản xuất dihydromyricetin (DHM) F3'5’H chuyển đổi DHQ từ DHM Ít ba enzyme cần thiết để chuyển đổi màu sắc dihydroflavonols (DHK, DHQ, DHM) từ anthocyanins Việc enzyme xúc tác giảm dihydroflavonols từ flavan9,4-cis-diol (leucoanthocyanidins) dihydroflavonol4-reductase (DFR) Sự oxy hóa đường hóa leucoanthocyanidins tạo sản phẩm khác pelargonidin tương ứng màu gạch đỏ, cyani-din tương ứng màu đỏ, sắc tố màu xanh delphinidin Các đường sinh tổng hợp anthocyanin thể tổng quát hình 1[11] Hình Sơ đồ đường sinh tổng hợp flavonoid để tạo nên màu sắc hoa Anthocyanidin 3-glucosides biến đổi nhiều loài glycosyl hóa, methyl hóa acyl hóa, minh họa hình 2[11] Hình Kiểm sốt q trình di truyền biến đổi Anthocyanin Petunia Các gen tổng hợp enzim tham gia vào tổng hợp màu sắc hoa số thể bảng Bao gồm gen: c2, whp, NA, An3, Hf1 Bảng Các gen tổng hợp enzim tham gia vào tổng hợp màu sắc hoa ngô, kim ngư thảo, yên thảo Các gen điều hịa màu sắc hoa ngơ, kim ngư thảo, yên thảo thể bảng Bao gồm gen CSH, DRF, 3GT, ANS Bảng Các gen điều hòa màu sắc hoa ngô, kim ngư thảo, yên thảo CHƯƠNG II AND TÁI TỔ HỢP I Khái niệm AND tái tổ hợp AND tái tổ hợp (recombinant DNA) AND tạo từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác Phân tử AND tái tổ hợp tạo nhờ kỹ thuật ghép nối đoạn AND cá thể khác loài, loài khác nhau[1,2] II Nguyên lý tạo AND tái tổ hợp Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (vi khuẩn Gram âm) để chuyển gen thực vật phương pháp hiệu phổ biến nhờ vào khả gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật cách xác ổn định: + Phương pháp sử dụng Ti plasmid A tumefaciens Ti plasmid Arhzogennes làm vecter đưa AND vào tế bào Ti platmid gồm hai thành phần: TDNA vùng Vir + T- DNA chuyển từ Argobacterium vào tế bào thực vật, nhờ mà gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào, T- DNA chứa gen điều hòa sinh trưởng cục (auxin, cytokikie), gen tổng hợp chất opine gen gây khối u Đoạn cuối có 25 cặp bazo lặp lại, đoạn vùng xâm nhập vào phân tử AND thực vật Trong plasmid vị trí T + DNA giới hạn bờ vai bờ phải, vir phụ trách khả lây nhiễm Chúng gồm nhóm từ VirA đến VirG Vire có tác dụng làm tăng tần số biến nạp Để thiết kế vector dung biến nạp: Trước hết cắt gen điều hòa sinh trưởng cục Sau gắn thêm thị (kháng thuốc chất diệt cỏ) với đoạn điều khiển phù hợp để chọn thể biến nạp cuối gắn gen cần biến nạp + Các plasmid Agrobacterium sử dụng công nghệ gen thực vật gồm có loại: vector liên hiệp vector nhị thể Vector liên hiệp: vector liên hiệp dựa tái tổ hợp plasmid Một vector liên hợp gồm có: Vị trí ghép gen quan tâm, thường vị trí có nguồn gốc từ plasmid vi khuẩn E.coli Gen thị kháng sinh giúp cho chọn lọc vi khuẩn E.coli, Agrobacterium gen chọn lọc hoạt động tế bào thực vật Như vector liên hợp hình thành từ plasmid mang trình tự AND mong muốn plasmid có chứa vùng vir gen vùng bờ lặp lại T – AND Sau tái tổ hợp, vecter liên hợp tạo dùng cho chuyển gen vào thực vật Vector nhị thể hệ thống dùng plasmid riêng biệt: cung cấp T- AND độc gây khối u, plasmid Ti plasmid có khả thâm nhập vào tế bào thực vật (mang gen vir) Plasmid thứ mang gen chọn lọc thực vật gen ghép vào gen thực vật plasmid đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, sực vản phẩm mang gen vir đưa T – AND vào tế bào thực vật, T- AND nằm phân tử AND khác + Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen thu nhiều kết quả, đặc điểm chuyển gen vào lúa mì lương thực quan trọng Nhiều giống lúa chuyển gen vào lúa mì lương thực quan trọng Xác định thông số chuyển gen: • Tìm thời gian lây nhiễm vi khuẩn tối ưu • Tìm thời gian đồng ni cấy tối ưu • Tìm nồng độ Acetosyringone thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi vi khuẩn lây nhiễm • Xác định mơi trường tái sinh thích hợp • Kiểm tra mẫu chuyển gen: sử dụng chất X- gluc để phát vật liệu biến nạp có chứa gen [1,2] III Các bước tạo AND tái tổ hợp Từ người ta khám phá thí nghiệm chuyển gen thực nhờ loại vi khuẩn đất Agrobacterrium tumefaciens chuyển gen vào nhiều loại trồng Kỹ thuật tái tổ hợp AND thực qua nhiều công đoạn phức tạp, tinh vi, thực chất công nghệ gồm bước chủ yếu sau: Bước : Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen nuôi tế bào cho để cung cấp AND Bước : Tách chiết AND plasmid AND tế bào cho Bước gọi phân lập gen Bước : Cắt hai đoạn AND (AND plastmid AND tế bào cho) loại enzim giới hạn (restriction enzym – RE) Bước : Trộn chung AND plastmid cắt với AND tế bào cho bị cắt loại enzim giới hạn nêu bước Bước : Bổ sung enzim nối ligase để tạo AND tái tổ hợp hoàn chỉnh Bước : Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào vật chủ nhân dòng Bước : Chọn lọc tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang AND tái tổ hượp theo dõi hoạt động, biểu gen thông qua sản phẩm gen lấy từ tế bào cho Biến nạp vào mô tế bào thực vật : để chuyển gen ta thực bước sau:  Chọn lọc thể gen nạp môi trường chọn lọc  Tái sinh biến nạp  Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen ( PCR southern blot) đánh giá mức độ biểu chủng ( Norther lot, Western blot, ELISA thử nghiệm in vitro khác… )  Nguyện liệu để thực biến nạp tế bào thực vật riêng rẽ, mơ hồn chỉnh 10 Sau phương pháp phân tích genome PCR, Southern blot, Nothern blot thực để tìm xác biến đổi gen [2] Sơ đồ khái qt q trình tạo dịng AND tái tổ hợp thể hình CHƯƠNG III CƠNG NGHỆ ARN CAN THIỆP I Khái niệm cơng nghệ gen bất hoạt gen ARNi Công nghệ gây bất hoạt gen (ARN interfarance – RNAi), công nghệ mạnh mẽ cần vài phân tử RNA sợi kép (ds ARN) tế bào đủ để phân hủy mARN gen đặc thù Kết thực nghiệm cho thấy cơng nghệ RNAi cho phép gây bất hoạt gen cách có hiệu quat thể nhân thực Nó có tác dụng điều hịa biểu gen hiệu mạnh gấp 1000 lần công nghệ gen đối nghĩa (antisense) Dựa thành tựu chương trình genomic, trình tự hầu hết sinh vật nhân thực xác định, từ người 11 thiết kế dsARN tương đồng để gây bất hoạt gen đích Điều thú vị là, chế im lặng gen bảo vệ sinh vật hệ gen từ gene nhảy, virus[3] ARNi trình làm câm gen cách đặc thù, làm bất hoạt gen (gen đích) có trình tự tương đồng với tác nhân bất hoạt gen (các sợi ARN ngắn khoảng 21 – 27 nucleotide)[4] Thành phần cấu trúc để tạo ddRNAi đoạn gen cDNA xuôi gắn sau promoter (chỗ bám RNA polymerase để phiên mã) nối qua đoạn ngắn với đoạn cDNA tương tự ngược chiều cuối trình tự kết thúc terminator Khi đưa vào tế bào, RNA polymerase tạo đoạn ngắn RNA mạch kép dạng ‘kẹp tóc’ Sau vào tế bào chất trình tự kẹp tóc bị cắt đoạn Dicer, lạo enzim đặc hiệu cắt RNA mạch kép (dsRNA specific nuclease), gây nên tích tụ siRNA mạch kép (21 bp dsRNA) Các siRNA gắn vào phức hợp làm im lặng (RNA – induced silencing complex – RISC) Với mạch siRNA gắn phức hượp tương tác với mRNA nội hay ngoại lai (endogenous ỏ exogenous) dẫn đến cắt trình tự mục tiêu phân hủy phiên mã phần hình[2] Cơ chế hoạt động ARNi thể qua sơ đồ sau: 12 Một số enzim quan trọng tham gia qua trình gây bất hoạt gen: - Decier ribonuclease III giống nuclease, phát minh chịu trách nhiệm cho trình cắt dsARN thành đoạn ARN ngắn -RISC tổ hợp phức tạp chứa protein họ argonaute hoạt động endonuclease có vai trị cắt mARN Khả tương tác cảu phức RISC với DNA (gen) với mARN phụ thuộc vào tương đồng siRNA với mARN Khi tương tác với AND, RISC methul hóa DNA biến đổi histone, dẫn đến ngăn cản khởi động phiên mã Khi tương tác với Marn , RISC tạo tín hiệu để RNase phân hủy mARN - Enzyme tổng hợp ARN khuôn ARN (ARN deependent ARN polymerase – RdRp): số sinh vật, đặc biệt trồng, giun tròn, nấm , ARN – polymerase phụ thuộc ARN (ARN dependent ARN polyerase (RdRP) đóng vai trị quan trọng tạo nên sợi dsARN, nhân sợi siARN miARN - ARNi tham gia kiểm sốt hoạt hóa gen giai đoạn phiên mã (TGS transcriptional gene silencing), phân tử siARN ngăn cản phiên mã, khống chế 13 số lượng phân tử mARN Cơ chế xảy nhân đích chịu tác động AND, gen (marker 2004, mimker 2007) Một vài enzyme tham gia trính phát hiện: + Enzyme methyl hóa AND (AND methyl transferase) gắn nhóm methyl vào cytosine (C) ngăn cản trình phiên mã + Enzyme biến đổi nhóm chức protein (histone) nằm lõi nucleosome Ví dụ gắn thêm nhóm methyl khử nhóm acetyl số aminoacid đặc biệt protein histone làm thay đổi cấu trúc không gian sợi nhiễm sắc, làm sợi nhiễm sắc cuộn chặt ngăn cản phiên mã - Đặc tính cơng nghệ ARNi: + ARN sợi kép tác nhân gây tượng làm bất hoạt gen mạnh ARN đối nghĩa sợi đơn ( single – stranded antisense ARN) + Có đặc tính đặc hiệu cao, làm bất hoạt mARN trình tự tương đồng + Có hiệu cao mạnh cần vài phân tử ARN sợi kép đủ để gây bất hoạt gen tế bào virus.Có thể làm bất hoạt nhóm gen +Có thể dịch chuyển từ tế bào này, mô sang tế bào sang tế bào khác, mô khác cá thể chí từ hệ sang hệ khác +Có thể chí từ hệ sang hệ khác Cơ chế bất hoạt gen hai giai đoạn khác biểu gen giai đoạn phiên mã(TGS) giai đoạn sau phiên mã (PTGS)[4] II ARNi tạo hoa màu xanh Phương pháp tiếp cận kỹ thuật di truyền áp dụng cho số cảnh phát triển hoa cẩm chướng xanh hoa cách sử dụng kỹ thuật di truyền Các nhà khoa học tạo hoa khổ sâm màu trắng chuyển gen cách ức chế enzym tổng hợp chalcone (CHS) sử dụng công nghệ gen antisense Trong trường hợp này, có 17 dịng chuyển gen độc lập hiển thị màu trắng-hoa kiểu hình, khác transform- kiến không dẫn đến ức chế thành công gen CHS biểu thức Hơn nữa, khơng có nhà máy gentian chuyển gen với biểu ức chế sinh tổng hợp anthocyanin khác gen, dihydroflavonol 4-reductase (DFR) flavonoid 3’5’-hydroxylase (F3’5’H) gen, có thu 14 antisense ý thức đàn áp công nghệ (Nishihara et al., 2005) Các tần số thấp tên xuống quy định gen mục tiêu cho kết từ sử dụng hai virus khảm súp lơ (CaMV) 35S promoter công nghệ ức chế gen antisense Gene im lặng RNAi sử dụng để sửa đổi hoa màu số lồi thực vật, có dã yên thảo, torenia thuốc lá, hoa hồng xanh[6, 7, 9] CHƯƠNG IV ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ AND TÁI TỔ HỢP VÀ CÔNG NGHỆ ARNi TRONG TẠO HOA HỒNG XANH I Cơ sở khoa học Đa số hoa hồng sản xuất số lượng anthocyanins acylated nhỏ hoa hồng không sản xuất flavon Độ pH không bào tế bào biểu bì cánh hoa thấp pH từ 3,69-5,78 Do đó, hoa hồng thiếu thành phần cần thiết để cánh hoa màu tím màu xanh cánh hoa Mặc dù có nhiều cách để tạo màu xanh cánh hoa hồng, nhà khoa học lựa chọn sản xuất delphinidin cánh hoa hồng delphinidin sinh tổng hợp quy định đơn enzyme F3’5’H mà biểu mạnh khơng ảnh hưởng bất lợi đến thực vật Delphinidin bước tiến đột phá lớn công nghệ tao hoa hồng xanh Sự biểu gen delphinidin F3’5’H tạo thành công hoa viola có màu xanh Tuy nhiên, diện pelargonidin cyanidin-based anthocyanins có nguồn gốc từ đường nội sinh làm ngăn cản tạo màu xanh Các nhà nghiên cứu phân tích thành phần flavonoid nhiềugiống để chọn giống trưng bày màu xanh delphinidin tích lũy Các biểu mức gen F3’5’H dẫn đến hiệu tích lũy delphinidin màu sắc thay đổi với t màu xanh vài số giống chọn Hơn nữa, điều chỉnh làm giảm hoạt động hoa hồng gen DFR biểu mức gen DFR iris, biểu mức gen F3’5’H viola, dẫn đến hiệu hiệu cap delphinidin sinh tổng hợp tạo màu hoa xanh di truyền qua hệ[6, 7, 11] II Vật liệu nghiên cứu 15 - Hoa có nguồn gốc ni cấy mơ tế bào thực vật giống hoa hồng sàng lọc thu hoạch vườn ươm Keisei Rose (Sawara, Nhật Bản) 1997-2000 Thân lóng thu hoạch từ hoa hồng trồng nhà kính bề mặt tiệt trùng cách ngâm chúng 5% (v/v dung dịch natri hypoclorit cho phút sau xả lại nước cất[7] - Các mẫu cấy chiều dài khoảng cm chuẩn bị từ lóng thân ni cấy 250C 16 điều kiện môi trường bao gồm muối khoáng Murashige Skoog vitamin, sucrose 30g/lít, agar 12g/ lít 1mg 6-benzylami nopurine (BA) 1mg/ lít[7] - Vector chuyển gen: vector nhị phân bao gồm: pSPB130,pSFL207, pSFL236 pSPB919, promoter (CaMV) 35S nguồn gốc từ pE2113 Hình Vector chuyển gen để biến đổi màu hoa[7] - Đối tượng chuyển gen: vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens Agl0 -Gen cần chuyển:+ Torenia anthocyanin 5-acyltransferase cDNA (cơ sở liệu AB332099) lấy từ thư viện cDNA Iris Hollandica DFR [7] 16 + cDNA (AB332098) nhân từ cánh hoa cDNA Viola spp chứa hai gen F3’5’H gen (clone BP40) sử dụng nghiên cứu này(AB332097) [7] III Phương pháp nghiên cứu Xác định màu hoa đo pH cánh hoa -Màu hoa đánh giá cách sử dụng so sánh màu hoa với bảng giá trị hệ thống CIE để xác định màu hoa đo với máy quang phổ CM-2022 số liệu tính tốn theo 108 quan sát viên D65 illuminants Dữ liệu màu phân tích sử dụng Spectra Magic TM phần mềm kiểm sốt màu Màu sắc hoa chọn gần màu sắc với số màu sắc phân loại RHSCC phiên 2.1.1 [7] - Độ pH nước ép cánh hoa đo với máy đo pH F-22 với điện cực 6069-10C [7] Phân tích anthocyanins Anthocyanins hoa hồng chiết xuất với 50% (v v) acetonitrile có chứa axit trifluoroacetic (TFA) HPLC tiến hành cách sử dụng RSpak DE-413L cột tốc độ dịng chảy dung mơi 0.6mlmin/s; dung môi Hệ thống sử dụng sau: sau 15 phút rửa 10-50% acetonitrile chứa 0,5% TFA với H2O 10 phút rửa isocratic 50%, acetonitrile chứa 0,5%.TFA H2O tiến hành 10phút phát anthocyanins với photodiode dị mảng SPD-M10A đo độ hấp thụ 600-250 nm Các thời gian lưu anthocyanins aromatically acylated khoảng 19 phút Phổ anthocyanin đo với mảng photodiode Anthocyanins, Aromatically acylated xác định chúng thể thay đổi sóng dài 280 nm Phân tích TOF-MS NMR [7] Phân tích anthocyanidins Chiết xuất dịch bào chuẩn bị hòa tan HCl 6N (0.2ml) giữ 1008C 20 phút Các anthocyanidins thủy phân chiết xuất với 0.ml 1pentanol HPLC thực cách sử dụng ODS-A312 Vad phát phổ hấp thụ sắc tố 600-400 nm SPD-M10A mảng photodiode dò 17 Hệ thống dung mơi sử dụng sau:acetic acid: methanol: water¼ 15: 20: 65 Dưới HPLC điều kiện, thời gian lưu giữ delphinidin lớn 4.0min 534 nm, tương ứng với giá trị so sánh với delphinidin chlorid[7] Phân tích flavonol Chiết xuất từ cánh hoa thủy phân 0.2ml 0,1M potassium phosphate đệm (pH 4.5) với 6U b-glucosidase IU naringinase ủ 16 308C Acetonitril (0.2ml, 90%) bổ sung vào hỗn hợp phản ứng, mà sau phân tích HPLC HPLC tiến hành cách sử dụng Develosil C30UG-5 cột tốc độ dịng chảy dung mơi cới tốc độ 0.6ml/ phút [7] Lai giống hoa hồng Giống lai thực cách sử dụng chuyển gen (LA / 919-4-10) giống bố mẹ cho phấn hoa có màu đỏ sậm, hồng thu thập sau 100 ngày sau thụ phấn Hạt nảy mầm thực cách lột vỏ nhúng chúng vào giấy lọc ẩm đĩa nhựa Các nước sử dụng cho hạt giống nảy mầm tiệt trùng nước có chứa 1.0ml/ lít 50mg/lít, 1kanamycin / lít, giống trồng từ chậu với mầm có màu xanh cây[7,9] III Kết 1.Màu sắc hoa Màu sắc hoa họ tương đối màu xanh hoa hồng phạm vi thực tế từ màu hồng, đỏ tím đến màu xám,màu hoa cà Cánh hoa chứa chủ yếu cyanidin anthocyanidin, không chứa delphinidin Cánh hoa chứa số lượng lớn flavonol Màu xanh họ flavonol cao tỷ lệ anthocyanidin, flavonol có chức đồng sắc tố[7] Độ pH PH hoa hồng xanh cao so với hoa hồng đỏ góp phần tạo ên màu hoa Một số hoa hồng chứa lượng nhỏ chất dẫn xuất cyanidin tiểu thuyết (rosacyanins) thể màu xanh , mức độ đóng góp họ cho màu sắc hoa khơng rõ ràng Các tiêu chí để lựa chọn giống chủ thể đạt hoa thay đổi màu sắc theo hướng xanh delphinidin sản xuất là: (i) tích lũy 18 flavonol dự kiến đồng sắc tố; (ii) có cao khơng bào pH; (iii) lý tưởng, khơng có F3’H; (iv) tích lũy pelargonidin cyanidin Sự vắng mặt delphinidin myricetin khẳng định thiếu hụt gen F3’5H’[7] Phân tích anthocyanins Số lượng anthocyanins tăng lên màu hoa trở nên tối Các màu sắc bơng hoa đỏ tươi, có lẽ độ pH cánh hoa thấp so với giống khác Những kết delphinidin sản xuất đem lại màu xanh cho hoa Họ tiết lộ nội dung delphinidin màu sắc kết phụ thuộc vào giống chủ Một sản phẩm chủ đạo delphinidin luôn dễ dàng để đạt mức F30 50 Gen H giống chọn Chỉ có số anthocyanins (lên đến 44%) tiết lộ để aromatically acylated torenia 5AT giới thiệu gen Những ảnh hưởng acyl hóa anthocyanin màu hoa quan sát mắt anthocyanins phần acylated 5-acyl hóa ca anthocyanin có bước sóng dài 4nm[7] Để đánh giá hiệu việc chuyển hướng đường từ cyanidin để delphinidin Phấn hoa LA / 919-4-10 lai với hạt giống ban đầu so sánh màu cánh hoa Các hồng hoa hồng giống Lavande (A, trái B, a) biến đổi với pSPB919 Các chuyển gen bao gồm LA / 919-4-10 sản xuất hoa màu tím biến đổi gen màu) có chứa 98% Một số hoa hồng biến đổi gen có nguồn gốc từ pSPB919 thường có màu nhạt hoa chứa lượng giảm anthocyanidin[7] Phân tích phân tử gen tăng LA / 919-4-10 Các kết phân tích lai phân tử LA / 919-4-10 thể hình 6A Các bảng điểm F3’5’H gen iris DFR quan sát để có kích thước ngun vẹn, ban nhạc kích thước nhỏ hoa hồng DFR mRNA Can thiệp RNA nhỏ (siRNA) khoảng 23 bp phát sử dụng DFR cDNA Những kết cho thấy hoa hồng nội sinh DFR 19 mRNA bị suy thối thành cơng RNAi băng giới thiệu hoa hồng DFR (Fig 6B) Phân tích phía Nam LA / 919- 4-10 với F3’5’H viola, iris DFR, tăng DFR nptIIgen thực vật có chứa đơn T-DNA thể giống với bố mẹ ban đầu[7] 20 PHẦN III: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ Kết luận Hoa màu chủ yếu xác định anthocyanins Hoa hồng khơng có gen tổng hợp (F3’5’H) enzyme quan trọng sinh tổng hợp delphinidin Các yếu tố khác đồng sắc tố độ pH không bào ảnh hưởng đến màu Nhờ sử dụng công nghệ ARNi mà delphinidin khơng phân biệt loại thực vật, sử dụng đoạn ARN nhỏ làm giảm hoạt động dihydroflavonol 4-reductase (DFR) nội sinh biểu mức hoa hồng chuyển gen DFR Iris F3’5’H Viola vào hoa hồng để tạo màu xanh [4,7] Kiến nghị Tạo hoa hồng xanh bước tiến quan trọng công nghệ tạo màu sắc hoa kỹ thuật di truyền mà cụ thể công nghệ ARNi Tạo màu hoa mong muốn di truyền qua hệ mà không làm ảnh hưởng tới gen khác Do công nghệ cần nghiện cứu áp dụng nhiều đối tượng trồng khác [4] 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tham khảo viết tiếng việt [1].Trịnh Đình Đạt(2008) Cơng nghệ sinh học tập 4: Công nghệ di truyền, NXB giáo dục [2] Phạm Thành Hổ (2005) Nhập môn công nghệ sinh học, NXB giáo dục [3] Đỗ Năng Vịnh(2007) Công nghệ can thiệp ARN (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí cơng nghệ sinh học II Tài liệu tham khảo viết tiếng nước [4] Abdolhamid Angaji, S., Sara Sadate Hedayati , Reihane Hosein poor , Sanaz Samad poor, Shima Shiravi, Safoura Madani : Review article : Application of RNA interference in plants POJ 3(3):77-84, (2010) [5] Antonio Ferrante, Alice Trivellini, Giovanni Serra, Colours Intensity and Flower Longevity of Garden Roses Research Journal of Biological Sciences (1): 125-130, 2010 [6] Fukuchi-Mizutani, M., Okuhara, H., Fukui, Y., Nakao, M.,Katsumoto, Y., Yonekura-Sakakibara, K., Kusumi, T., Hase, T and Tanaka, Y., : Biochemical and molecular characterization of a novel UDP-glucose:anthocyanin 30-Oglucosyltransferase, a key enzyme for blue anthocyanin biosynthesis, from gentian Plant J 132: 1652–1663 [7] Katsumoto Y et al.,: Engineering of the rose flavonoid biosynthetic pathway successfully generated blue-hued flowers accumulating delphinidin Plant Cell Physiol 48, 1589–1600.( 2007) [8] Kenneth R Markhama, Kevin S Gould , Chris S Winefield , Kevin A itchell Stephen J Bloor , Murray R Boase, : Anthocyanic vacuolar inclusions Ð their nature and significance in flower colouration Phytochemistry 55 : 327±336, (2000) [9] Power, J.B., Lucas,J., A., Davey, M R., : Marchant, R., Biolistic Transformation of Rose (Rosa hybrida L.) Annals of Botany 81: 109-114, (1998) [10] Tanaka, Y (2006) Flower colour and cytochromes P450 Phyochem Rev 5: 283–291 22 [11] Timothy A Holton, Edwina C Cornish: Genetics and Biochemistry of Ant hocyanin Biosynthesis The Plant Cell, Vol 7, 1071-1083, American Society of Plant Physiologis [12] Wikipedia 23 24 ... công nghệ AND tái tổ hợp chuyển gen delphinidin tạo màu xanh vào hoa hồng, khắc phục vắng mặt gen tự nhiên [4 ] Do vậy, em sâu tìm hiểu đề tài tiểu luận là:“ Tạo hoa hồng xanh công nghệ ADN tái. .. sửa đổi hoa màu số lồi thực vật, có dã yên thảo, torenia thuốc lá, hoa hồng xanh[ 6, 7, 9] CHƯƠNG IV ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ AND TÁI TỔ HỢP VÀ CÔNG NGHỆ ARNi TRONG TẠO HOA HỒNG XANH I Cơ sở khoa học... F3’5’H Viola vào hoa hồng để tạo màu xanh [4,7] Kiến nghị Tạo hoa hồng xanh bước tiến quan trọng công nghệ tạo màu sắc hoa kỹ thuật di truyền mà cụ thể công nghệ ARNi Tạo màu hoa mong muốn di