Hệ thống nạp mẫu Cấu tạo: - "lỗ rò phân tử" là một dĩa thủy tinh xốp để hạn chế lƣu lƣợng khí của mẫu, chỉ cho qua một lƣợng nhỏ phân tử khí, cung cấp đều đặn một lƣợng nhỏ phân tử mà vẫ
Trang 1PHỔ KHỐI (MASS SPECTROMETRY)
BM HPT-KN PGS TS Vĩnh Định
1
Trang 3• 1912: J.J THOMSON, giải Nobel 1906:
- thu đƣợc phổ khối đầu tiên của O2, N2 , CO, CO2, COCl2
- Phát hiện phân mãnh ion bền
- mô tả tỉ lệ khối trên điện tích m/z
• 1919: F.W ASTON gỉai Nobel 1922: tạo máy phân tích phổ khối (MS) đầu tiên
Trang 4PHỔ KHỐI
1 Lịch sử - ứng dụng
4
• 1930: R CONRARD áp dụng MS vào hoá hữu cơ
• 1940: A.O NIER phân lập đƣợc uranium-235
• 1952: R.A MARCUS giải thích sự phân mãnh ion từ phân tử; giải Nobel 1992
• 1953: W PAUL mô tả bộ phân tích tứ cực và bẫy ion Giải Nobel 1989
• 1966: M.S.B MUNSON & FIELD phát hiện sự ion
hóa hóa học cho phép phân tích phân tử có số khối
đến 500
Trang 5PHỔ KHỐI
1 Lịch sử - ứng dụng
5
• 1972: J.H BEYNON chỉ ra cách nhận biết ion bền và
ý tưởng về MS độ phân giải cao
• 1981: M BARBER mô tả nguồn ion hóa kiểu FAB,
cho phép phân tích những đại phân tử (M= 10.000)
• 1984: J.F.J TODD & cs sáng lập cty Finnigan, tạo nguồn ion hóa bằng bẫy ion (ion trappe)
• 1985: F.H.HILLENKAMP & M KARAS phát hiện
nguồn ion hóa MALDI (Matrix Assisted Laser
Desorption Ionisation)
Trang 9Điện tích Khối lƣợng Proton +1 1*
Electron -1 0 Neutron 0 1*
- Số proton (Z) bằng với số điện tử
Đồng vị là nguyên tố khác số neutron, do đó khác số khối A
1 H có 1 proton, 1 electron, 0 neutron (A = 1); I * = ½
2 D có 1 proton, 1 electron, 1 neutron (A = 2); I * = 1
Trang 10- Đa số các nguyên tố đều có các đồng vị khác nhau hiện
diện trong tự nhiên Tuỳ thuộc vào thời gian phân rã hạt
nhân (nuclear decay) của đồng vị đó mà ta thường gọi là
Đồng vị là nguyên tố khác số neutron, do đó khác số khối A
12 C có 6 proton, 6 electron, 6 neutron (A = 12); I* = 0
13 C có 6 proton, 6 electron, 7 neutron (A = 13); I* = ½
(* I: spin hạt nhân - NMR)
Trang 1164 29
- Nguyên tử khối trung bình:
Mr(Cu) = (63*69) + (65*31)/100
= 63,62
11
PHỔ KHỐI
Trang 12Nguyên tố Nguyên tử khối Hạt nhân Khối lƣợng
Trang 14 Dưới tác động của điện trường 70 eV trong máy phân tích khối phổ, các electron sẽ bắn phá hợp chất hữu cơ được đưa vào để tạo thành những ion phân tử, ion phân mãnh Dựa trên phân tích những ion này cho phép xác định số khối của phân tử
Sự bẻ gãy các liên kết hóa học của phân tử tạo thành các ion phân mãnh
Dưới tác động của từ trường (hoặc điện trường), các ion phân mãnh sẽ tách ra theo tỉ lệ số khối trên điện tích (m/z)
2.1 Sự ion hóa hợp chất hữu cơ như thế nào?
14
PHỔ KHỐI
2 Nguyên tắc
Trang 15 Những ion phân mãnh có tỉ lệ m/z phù hợp sẽ di chuyển đƣợc đến detector (bộ phân tích khối) và ghi thành phổ
Dựa trên sự phân tích phổ khối này sẽ cho thông tin về
số khối của phân tử (giống nhƣ trò chơi ráp hình LEGO)
2.1 Sự ion hóa hợp chất hữu cơ nhƣ thế nào?
15
PHỔ KHỐI
2 Nguyên tắc
pages.usherbrooke.ca/bcm-514-bl/6a.html
Trang 16- Máy phân tích khối phổ (Mass Spectrometer - MS) đo lường trực tiếp tỉ lệ khối lượng theo thế điện tích (ký hiệu
là m/z) của những ion trong pha khí của chất phân tích
C7H7NO2
M = 137
CH 3
N O O
2.2 Máy phân tích khối phổ là gì ?
Trang 17PHỔ KHỐI
2.3 Máy khối phổ hoạt động như thế nào ?
Những ion của chất phân tích sinh ra từ nguồn ion hoá được gia tốc và được tách ra bởi bộ phận phân tích khối trước khi đến bộ phận phát hiện Tất cả quá trình này xảy ra trong một buồng có hệ thống bơm chân không sâu đạt từ 10 -3 đến 10 -6 Pa (1 Pa = 9,8.10 -6 atm)
Các ion phân mảnh
Từ trường / điện trường
Tách ra
theo m/z
* 1eV = 1,6.10 -19 J
Trang 18PHỔ KHỐI
Thông tin từ khối phổ đồ cho phép:
- Định tính chất (dựa vào khối lƣợng của ion phân tử, dựa vào khối lƣợng của các ion phân mảnh)
- Định lƣợng (dùng chất chuẩn nội hay chuẩn ngoại) với giới hạn phát hiện từ picomol (10-12 M) đến femtomol (10-15 M)
2.4 Cung cấp thông tin gì ?
18
2 Nguyên tắc
Trang 19Khối phổ đồ thu được chỉ ra sự tương quan giữa số
lượng các ion có giá trị m/z (đến được bộ phận phát
hiện, tính theo %) theo giá trị m/z
CH 3
N
O O
2.5 Hình dạng phổ như thế nào ?
137
19
2 Nguyên tắc
Trang 20• Đơn vị: amu (atomic
mass unit), dalton =
1,0078 uma
Vì đa số các ion đều mang điện tích +1 sau quá trình
ion hóa, nên tỉ lệ m/z tương đương với m (do đó
thường gọi là phổ khối)
CH 3
N
O O
137
20
2 Nguyên tắc
Trang 21PHỔ KHỐI
• Nhạy hơn phương pháp phân tích nguyên tố cổ điển (hóa học hay công cụ)
• Chỉ cần 10-12 mol (picomol) của mẫu phân tích
để có được phổ khối của chất có số khối 500 (với NMR là 10-6 mol (micromol)
• Giới hạn phất hiện chỉ dựa trên pic cơ bản là
10-14 mol (10 femtomol)
2.6 Độ nhạy phát hiện ?
21
2 Nguyên tắc
Trang 22AA (Sequencing)
2.7 Lãnh vực áp dụng ?
22
2 Nguyên tắc
Trang 23PHỔ KHỐI
Dùng cho mục đích phân tích thường qui và nghiên cưú trong các lãnh vực:
- Dược: tổng hợp, dược động học, chuyển hoá thuốc, tương đương sinh học, phân tích cấu trúc …
Trang 24Nạp mẫu
Trang 25H 0 PHỔ KHỐI
Trang 26- Chuyển mẫu phân tích sang trạng thái khí trước khi đến buồng ion hoá
- Không làm xáo trộn chân không sâu đã đạt được trước đó
• buồng chứa mẫu: ~10 -2 torr
• Nguồn ion hóa: 10 -6 à 10 -8 torr
Trang 27- Mẫu phân tích (rắn, lỏng, khí) có thể là đơn chất hoặc hỗn hợp nhƣng phải bảo đảm đƣợc yêu cầu
Trang 28- ống chứa mẫu (thủy tinh thạch anh, thép không gĩ) nối với một loạt những nút chân không trung gian (giữa áp suất khí quyển và chân không sâu của hệ thống) để đi tới bình chứa khí có kích cỡ lớn hơn
3.1 Hệ thống nạp mẫu
Cấu tạo:
- "lỗ rò phân tử" là một dĩa thủy tinh xốp để hạn chế lưu lượng khí của mẫu, chỉ cho qua một lượng nhỏ phân tử khí, cung cấp đều đặn một lượng nhỏ phân tử mà vẫn giữ được chân không sâu của hệ thống máy
28
3 Máy khối phổ PHỔ KHỐI
Trang 29cathod
anod
• Hóa hơi & ion hóa mẫu
• 2 kiểu ion hóa:
mạnh: EI và CI cho ion (+) và ion (-)
nhẹ nhàng: cho ít phân mãnh ion
29
3 Máy khối phổ
3.2 Buồng ion hóa
PHỔ KHỐI
Trang 30Khí
- "dây tóc đèn" (tungsten, rhenium) được đun nóng
vài ngàn độ C nối với "tấm kim loại" (hoạt động như
một cặp điện cực cathod - anod) có điện thế dương
so với dây tóc, điện thế 70 V, để tạo các điện tử có năng lượng 70 eV
30
3.2 Buồng ion hóa
Cấu tạo:
PHỔ KHỐI
Trang 31- " tấm đuổi ion" (ion repeller) có điện thế
dương nối với "tấm tăng tốc" (accelerating plate)
Trang 32• Bẫy ion (ion trap)
• Thời gian bay (TOF)
Trang 33- Sau khi bị ion hoá, các ion có tỉ số khối lượng
trên điện tích (m/z) khác nhau di chuyển đến bộ
phân tích khối lượng và tách ra nhờ từ trường áp đặt lên nó
ke = ½ m.v2 = z.V m: khối lượng ion
Trang 35cathod
anod
H0
m/z = B2r2/2V
trường V không thay đổi thì chỉ ion nào có tỉ
số m/z thích hợp mới di chuyển được trên qũi đạo r để đến được bộ thu nhận tín hiệu
35
3.3 Bộ phân tích khối
3.3.1 Cấu tạo:
PHỔ KHỐI
Trang 36m/z = B2r2/2V
định V và làm thay đổi từ trường B để quét
Trang 37 Vận tốc quét: khoảng đo đƣợc của tỉ số m/z, biểu thị
bởi giây trên bộ mười (s.decade -1 )
Vd: máy có vận tốc quét 10 s.decade -1 thì thời gian để quét đƣợc toàn bộ các ion có m/z từ 1 đến 1.000 cần 30 giây
- 10 giây để quét m/z từ 1 đến 10 (10 0 – 10 1 ) (1 decade)
- 10 giây kế tiếp để quét m/z từ 10 đến 100 (10 1 – 10 2 ),
- 10 giây cuối để quét m/z từ 100 đến 1000 (10 2 – 10 3 )
37
3.3 Bộ phân tích khối
3.3.2 Hiệu năng:
PHỔ KHỐI
Trang 38 Độ phân giải R = m/m
Khả năng phân biệt được 2 pic kề nhau (có m/z
khác nhau ở số lẽ) mà cường độ tín hiệu của đáy giao nhau nhỏ hơn 10% so với cường độ của pic
có cường độ lớn (đối với máy sử dụng từ trường)
Trang 39Máy có độ phân giải 1000 nghiã là máy đo
được tín hiệu giữa hai pic có m/z = 1000 và m/z
= 1001 mà thung lũng giao nhau giữa hai pic có cường độ tín hiệu nhiều nhất là 10% so với cường độ của pic có cường độ lớn (1001)
Trang 40 Độ phân giải R = m/w1/2
W1/2 (peak width): độ rộng ở ½ chiều cao của pic tương ứng với ion có số khối m (đối với máy dùng bộ phân tích thời gian bay TOF, máy tứ cực - quadrupole, máy dùng bộ phân tích bẫy ion)
1
R = 100/1 = 100
40
3.3 Bộ phân tích khối
3.3.2 Hiệu năng:
PHỔ KHỐI
Trang 413.3.3 MÁY KHỐI PHỔ NHị TIÊU (DOUBLE FOCUSING MS)
Máy có hai bộ quét là quét theo điện trường (thay đổi V) và quét theo
từ trường (thay đổi B), do đó độ phân giải cao hơn máy chỉ dùng từ trường,
độ phân giải của máy nhị tiêu có thể đạt tới 100.000
41
Trang 423.3.4 MÁY KHỐI PHỔ TỨ CỰC (QUADRUPOLE)
2 cặp cực hình trụ đƣợc đặt song song một cách chính xác Hiệu thế một chiều U và xoay chiều V.cos t đƣợc áp đặt vào hai thanh kề nhau nên chúng chịu một hiệu thế chung (U - V.cos t)
±[U - Vcos t]
m/z = f(U.V)
Với một hiệu thế cố định chỉ những ion có động năng đặc trƣng mới đi vƣợt qua các thanh tứ cực để đến đƣợc bộ thu nhận tín hiệu
42
Trang 433.3.5 MÁY KHỐI PHỔ DÙNG BẪY ION (TRAP ION)
Có cấu tạo giống MÁY KHỐI PHỔ TỨ CỰC và thường được dùng trong hệ thống SK khí ghép nối khối phổ (GC- MS) vì đơn giản, dễ thao tác, rẻ tiền, chỉ áp dụng để phân tích các phân tử có khối lượng thấp đến 650 Da
Sự ion hoá và phân tích khối lượng xảy ra tại cùng một vị trí
Tứ cực
43
Trang 443.3.6 MÁY KHỐI PHỔ SỬ DỤNG KỸ THUẬT THỜI GIAN BAY
44
Trang 453.3.7 MÁY KHỐI PHỔ SỬ DỤNG KỸ THUẬT THỜI GIAN BAY
(TIME-OF-FLIGHT)
Do thời gian đến đích của các ion chỉ khác nhau khoảng thời gian rất ngắn (10-6 – 10-7 giây) nên cần có bộ thu nhận tín hiệu cực nhạy để có thể phân biệt được các ion Máy loại này thường sử
dụng kỹ thuật ion hoá bằng sự bắn phá nhanh
nguyên tử (Fast atom bombardment) để đo các
hợp chất có phân tử lượng lớn
ke = ½ m.v2 = z.V (1)
45
Trang 463.3.7 MÁY KHỐI PHỔ SỬ DỤNG KỸ THUẬT THỜI GIAN BAY
(TIME-OF-FLIGHT)
Bộ phân tích khối TOF
46
Trang 47• Gồm các dynode xếp xen kẻ
nhau với điện thế áp đặt lên
từng dynode tăng dần theo cấp
số nhân Khi ion chạm vào
dynode đầu tiên làm bức xạ các
electron ra khỏi dynode, các
electron này va chạm vào
dynode tiếp theo tạo ra một
PHỔ KHỐI
Trang 48• Tín hiệu khuếch đại này đủ lớn
để đƣợc ghi nhận bởi bộ thu
nhận tín hiệu gắn nối tiếp với bộ
PHỔ KHỐI
Trang 494 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
Tùy theo cấu tạo của nguồn ion hóa mà sự phân mãnh ion xảy ra khác nhau, do đó phổ khối thu đƣợc
có hình dạng khác nhau
* ION HÓA MẠNH:
• Bắn phá điện tử (Electronic impact – EI)
• Ion hóa hóa học (Chemical ionization – CI)
* ION HÓA NHẸ NHÀNG:
• Fast atom bombardment – FAB
• Phun ion (ionization by electrospray ionization - ESI)
49
Trang 504 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
* ION HÓA NHẸ NHÀNG:
• Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (ionization
by atmosphere pressure chemical ionization – APCI)
• Ion hoá bằng sự giải hấp mạng do tia laser (matrix-assisted laser desorption ionisation - MALDI)
• Ion hoá bằng sự ion hoá trường hoặc bằng sự giải hấp trường (field ionisation and field desorption)
Trang 514 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
by electron impact ionization – EI)
• Dempster, 1922 và hoàn thiện bởi Bleakney, 1929
• Mẫu khí đi vào buồng chân không, tại đây chùm tia điện
tử có năng lƣợng 70 eV (tạo ra từ dây tóc đèn) bị hút về anod sẽ va chạm với phân tử khí của mẫu phân tích (năng lƣợng để ion hoá phân tử chỉ cần 8 - 15 eV) nên sẽ tạo ra những ion mang điện tích +1 tách ra khỏi phân tử.
Phân tử khí
51
Trang 524 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
by electron impact ionization – EI)
52
www.univ-lille1.fr
Điện thế 70 V (cathod-anod)
Cathod tạo e -
Mẫu ở trạng thái khí
anod bắt e -
Tấm hội tụ Tấm tăng tốc
Dòng electron
Ion phân
tử Chân không
Trang 53M + e - M o+ + 2e
Ƣu điểm:
- Thông dụng nhất trong nghiên cứu cấu trúc
- Vừa cho ion phân tử, vừa cho ion phân mảnh
- Biết đƣợc phân tử lƣợng cùng sự phân mảnh để suy
by electron impact ionization – EI)
4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
M o+ : ion phân tử
Trang 54Nhược điểm
- Không thích hợp cho hợp chất không bền nhiệt, vì bị phân hủy trước khi bị ion hoá nên phổ đồ là của sản phẩm phân hủy
- Không thích hợp cho hợp chất không bay hơi như polimer có phân tử lượng lớn
- Không phân biệt được các đồng phân vì cho khối phổ
đồ giống nhau
- Trong vài trường hợp, trên phổ đồ không nhận được tín hiệu của ion phân tử
54
by electron impact ionization – EI)
4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
Trang 5555 Phổ khối của methanol với M+o = 32
by electron impact ionization – EI)
4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
Trang 564.2 ION HOÁ HOÁ HỌC (Ionization by chemical ionization - CI)
- Phát triển bởi Munson & Field vào 1996, thực hiện ion hóa qua 2 giai đoạn:
ion/phân tử sơ cấp
• phản ứng giữa ion/phân tử sơ cấp với mẫu phân tích
56
4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
- Buồng ion hoá được nạp một lượng khí phản ứng (metan,
như trường hợp ion hoá bằng bắn phá điện tử nhưng với năng lượng cao hơn)
Trang 574.2 ION HOÁ HOÁ HỌC (Ionization by chemical ionization - CI)
Trang 58Ion phân tử
Khí phản ứng
Phân tử ở trạng thái khí Khí phản ứng bị ion hóa
Trang 59- Ion (MH) + có giá trị m/z lớn hơn 1 đơn vị so với ion phân
tử, và đƣợc gọi là ion tựa phân tử (quasi-molecular ion).
59
ionization - CI)
4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
- Ion CH5+ và C2H5+ là những acid mạnh có khả năng proton hóa các phân tử hữu cơ
Trang 60- Sự ion hoá này cho phép bảo tòan ion phân tử Phổ đồ thường thấy pic của ion tựa phân tử (MH) + với cường độ lớn (và có thể có ion [M+C2H5] + ) mà không có ion M +
Trang 6161
ionization - CI)
4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
Phổ khối của methan ion hóa bằng phương pháp CI
47%
41%
Trang 62Phổ khối của benzophenon ion hóa bằng phương pháp CI
Trang 634.2 ION HOÁ HOÁ HỌC (Ionization by chemical ionization - CI)
Trang 64Ưu điểm:
Thường được lựa chọn khi sử dụng cách ion hoá EI mà không thấy pic ion phân tử trong phổ đồ
Nhược điểm:
- Không thích hợp cho hợp chất không bền nhiệt,
- Không thích hợp cho hợp chất không bay hơi,
Trang 654.3 ION HOÁ BẰNG SỰ BẮN PHÁ NHANH NGUYÊN TỬ (Ionization by fast atom bombardment - FAB)
• Barber, 1981
• Mẫu pha loãng trong chất nền ở dạng lỏng phân cực
như glycerin, thioglycerin, triethanolamin được tẩm trên một giá mang là tấm kim loại đồng
argon) do được gia tốc bởi điện trường sẽ bị ion hóa
tựa phân tử [MH] +
65
4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
Trang 664.3 ION HOÁ BẰNG SỰ BẮN PHÁ NHANH NGUYÊN TỬ (Ionization by fast atom bombardment - FAB)
M+0, [MH]+, [MNa]+ [MK]+, [M+matrix]+
Trang 674.3 ION HOÁ BẰNG SỰ BẮN PHÁ NHANH NGUYÊN TỬ (ionization by fast atom bombardment - FAB)
67
4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)
Sơ đồ nguyên lý của nguồn ion hóa FAB
Súng phun khí Ar
Buồng trao đổi thế
Điện trường
Bộ phân tich khối mẫu
giá mang
Trang 68Ưu điểm:
- Không hoá hơi mẫu, thích hợp cho phân tích các
peptid, các nucleosid có M ~ 10.000 Da
- Ít tạo ion phân mãnh,
nhận biết M
Nhược điểm:
- Không thích hợp để phân tích các hơp chất không
phân cực (vì khó tan trong matrix)
- Thường xuyên làm sạch giá mang mẫu+matrix