1. Trang chủ
  2. » Giáo Dục - Đào Tạo

Bài giảng Phổ khối (Mass spectrometry)

116 25 1

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Tiêu đề Phổ Khối (Mass Spectrometry)
Người hướng dẫn PGS. TS Vĩnh Định
Định dạng
Số trang 116
Dung lượng 5,34 MB

Nội dung

Hệ thống nạp mẫu Cấu tạo: - "lỗ rò phân tử" là một dĩa thủy tinh xốp để hạn chế lƣu lƣợng khí của mẫu, chỉ cho qua một lƣợng nhỏ phân tử khí, cung cấp đều đặn một lƣợng nhỏ phân tử mà vẫ

Trang 1

PHỔ KHỐI (MASS SPECTROMETRY)

BM HPT-KN PGS TS Vĩnh Định

1

Trang 3

• 1912: J.J THOMSON, giải Nobel 1906:

- thu đƣợc phổ khối đầu tiên của O2, N2 , CO, CO2, COCl2

- Phát hiện phân mãnh ion bền

- mô tả tỉ lệ khối trên điện tích m/z

• 1919: F.W ASTON gỉai Nobel 1922: tạo máy phân tích phổ khối (MS) đầu tiên

Trang 4

PHỔ KHỐI

1 Lịch sử - ứng dụng

4

• 1930: R CONRARD áp dụng MS vào hoá hữu cơ

• 1940: A.O NIER phân lập đƣợc uranium-235

• 1952: R.A MARCUS giải thích sự phân mãnh ion từ phân tử; giải Nobel 1992

• 1953: W PAUL mô tả bộ phân tích tứ cực và bẫy ion Giải Nobel 1989

• 1966: M.S.B MUNSON & FIELD phát hiện sự ion

hóa hóa học cho phép phân tích phân tử có số khối

đến 500

Trang 5

PHỔ KHỐI

1 Lịch sử - ứng dụng

5

• 1972: J.H BEYNON chỉ ra cách nhận biết ion bền và

ý tưởng về MS độ phân giải cao

• 1981: M BARBER mô tả nguồn ion hóa kiểu FAB,

cho phép phân tích những đại phân tử (M= 10.000)

• 1984: J.F.J TODD & cs sáng lập cty Finnigan, tạo nguồn ion hóa bằng bẫy ion (ion trappe)

• 1985: F.H.HILLENKAMP & M KARAS phát hiện

nguồn ion hóa MALDI (Matrix Assisted Laser

Desorption Ionisation)

Trang 9

Điện tích Khối lƣợng Proton +1 1*

Electron -1 0 Neutron 0 1*

- Số proton (Z) bằng với số điện tử

Đồng vị là nguyên tố khác số neutron, do đó khác số khối A

1 H có 1 proton, 1 electron, 0 neutron (A = 1); I * = ½

2 D có 1 proton, 1 electron, 1 neutron (A = 2); I * = 1

Trang 10

- Đa số các nguyên tố đều có các đồng vị khác nhau hiện

diện trong tự nhiên Tuỳ thuộc vào thời gian phân rã hạt

nhân (nuclear decay) của đồng vị đó mà ta thường gọi là

Đồng vị là nguyên tố khác số neutron, do đó khác số khối A

12 C có 6 proton, 6 electron, 6 neutron (A = 12); I* = 0

13 C có 6 proton, 6 electron, 7 neutron (A = 13); I* = ½

(* I: spin hạt nhân - NMR)

Trang 11

64 29

- Nguyên tử khối trung bình:

Mr(Cu) = (63*69) + (65*31)/100

= 63,62

11

PHỔ KHỐI

Trang 12

Nguyên tố Nguyên tử khối Hạt nhân Khối lƣợng

Trang 14

 Dưới tác động của điện trường 70 eV trong máy phân tích khối phổ, các electron sẽ bắn phá hợp chất hữu cơ được đưa vào để tạo thành những ion phân tử, ion phân mãnh Dựa trên phân tích những ion này cho phép xác định số khối của phân tử

 Sự bẻ gãy các liên kết hóa học của phân tử tạo thành các ion phân mãnh

 Dưới tác động của từ trường (hoặc điện trường), các ion phân mãnh sẽ tách ra theo tỉ lệ số khối trên điện tích (m/z)

2.1 Sự ion hóa hợp chất hữu cơ như thế nào?

14

PHỔ KHỐI

2 Nguyên tắc

Trang 15

 Những ion phân mãnh có tỉ lệ m/z phù hợp sẽ di chuyển đƣợc đến detector (bộ phân tích khối) và ghi thành phổ

 Dựa trên sự phân tích phổ khối này sẽ cho thông tin về

số khối của phân tử (giống nhƣ trò chơi ráp hình LEGO)

2.1 Sự ion hóa hợp chất hữu cơ nhƣ thế nào?

15

PHỔ KHỐI

2 Nguyên tắc

pages.usherbrooke.ca/bcm-514-bl/6a.html

Trang 16

- Máy phân tích khối phổ (Mass Spectrometer - MS) đo lường trực tiếp tỉ lệ khối lượng theo thế điện tích (ký hiệu

là m/z) của những ion trong pha khí của chất phân tích

C7H7NO2

M = 137

CH 3

N O O

2.2 Máy phân tích khối phổ là gì ?

Trang 17

PHỔ KHỐI

2.3 Máy khối phổ hoạt động như thế nào ?

Những ion của chất phân tích sinh ra từ nguồn ion hoá được gia tốc và được tách ra bởi bộ phận phân tích khối trước khi đến bộ phận phát hiện Tất cả quá trình này xảy ra trong một buồng có hệ thống bơm chân không sâu đạt từ 10 -3 đến 10 -6 Pa (1 Pa = 9,8.10 -6 atm)

Các ion phân mảnh

Từ trường / điện trường

Tách ra

theo m/z

* 1eV = 1,6.10 -19 J

Trang 18

PHỔ KHỐI

Thông tin từ khối phổ đồ cho phép:

- Định tính chất (dựa vào khối lƣợng của ion phân tử, dựa vào khối lƣợng của các ion phân mảnh)

- Định lƣợng (dùng chất chuẩn nội hay chuẩn ngoại) với giới hạn phát hiện từ picomol (10-12 M) đến femtomol (10-15 M)

2.4 Cung cấp thông tin gì ?

18

2 Nguyên tắc

Trang 19

Khối phổ đồ thu được chỉ ra sự tương quan giữa số

lượng các ion có giá trị m/z (đến được bộ phận phát

hiện, tính theo %) theo giá trị m/z

CH 3

N

O O

2.5 Hình dạng phổ như thế nào ?

137

19

2 Nguyên tắc

Trang 20

• Đơn vị: amu (atomic

mass unit), dalton =

1,0078 uma

Vì đa số các ion đều mang điện tích +1 sau quá trình

ion hóa, nên tỉ lệ m/z tương đương với m (do đó

thường gọi là phổ khối)

CH 3

N

O O

137

20

2 Nguyên tắc

Trang 21

PHỔ KHỐI

• Nhạy hơn phương pháp phân tích nguyên tố cổ điển (hóa học hay công cụ)

• Chỉ cần 10-12 mol (picomol) của mẫu phân tích

để có được phổ khối của chất có số khối 500 (với NMR là 10-6 mol (micromol)

• Giới hạn phất hiện chỉ dựa trên pic cơ bản là

10-14 mol (10 femtomol)

2.6 Độ nhạy phát hiện ?

21

2 Nguyên tắc

Trang 22

AA (Sequencing)

2.7 Lãnh vực áp dụng ?

22

2 Nguyên tắc

Trang 23

PHỔ KHỐI

Dùng cho mục đích phân tích thường qui và nghiên cưú trong các lãnh vực:

- Dược: tổng hợp, dược động học, chuyển hoá thuốc, tương đương sinh học, phân tích cấu trúc …

Trang 24

Nạp mẫu

Trang 25

H 0 PHỔ KHỐI

Trang 26

- Chuyển mẫu phân tích sang trạng thái khí trước khi đến buồng ion hoá

- Không làm xáo trộn chân không sâu đã đạt được trước đó

• buồng chứa mẫu: ~10 -2 torr

• Nguồn ion hóa: 10 -6 à 10 -8 torr

Trang 27

- Mẫu phân tích (rắn, lỏng, khí) có thể là đơn chất hoặc hỗn hợp nhƣng phải bảo đảm đƣợc yêu cầu

Trang 28

- ống chứa mẫu (thủy tinh thạch anh, thép không gĩ) nối với một loạt những nút chân không trung gian (giữa áp suất khí quyển và chân không sâu của hệ thống) để đi tới bình chứa khí có kích cỡ lớn hơn

3.1 Hệ thống nạp mẫu

Cấu tạo:

- "lỗ rò phân tử" là một dĩa thủy tinh xốp để hạn chế lưu lượng khí của mẫu, chỉ cho qua một lượng nhỏ phân tử khí, cung cấp đều đặn một lượng nhỏ phân tử mà vẫn giữ được chân không sâu của hệ thống máy

28

3 Máy khối phổ PHỔ KHỐI

Trang 29

cathod

anod

• Hóa hơi & ion hóa mẫu

• 2 kiểu ion hóa:

 mạnh: EI và CI cho ion (+) và ion (-)

 nhẹ nhàng: cho ít phân mãnh ion

29

3 Máy khối phổ

3.2 Buồng ion hóa

PHỔ KHỐI

Trang 30

Khí

- "dây tóc đèn" (tungsten, rhenium) được đun nóng

vài ngàn độ C nối với "tấm kim loại" (hoạt động như

một cặp điện cực cathod - anod) có điện thế dương

so với dây tóc, điện thế 70 V, để tạo các điện tử có năng lượng 70 eV

30

3.2 Buồng ion hóa

Cấu tạo:

PHỔ KHỐI

Trang 31

- " tấm đuổi ion" (ion repeller) có điện thế

dương nối với "tấm tăng tốc" (accelerating plate)

Trang 32

• Bẫy ion (ion trap)

• Thời gian bay (TOF)

Trang 33

- Sau khi bị ion hoá, các ion có tỉ số khối lượng

trên điện tích (m/z) khác nhau di chuyển đến bộ

phân tích khối lượng và tách ra nhờ từ trường áp đặt lên nó

ke = ½ m.v2 = z.V m: khối lượng ion

Trang 35

cathod

anod

H0

m/z = B2r2/2V

trường V không thay đổi thì chỉ ion nào có tỉ

số m/z thích hợp mới di chuyển được trên qũi đạo r để đến được bộ thu nhận tín hiệu

35

3.3 Bộ phân tích khối

3.3.1 Cấu tạo:

PHỔ KHỐI

Trang 36

m/z = B2r2/2V

định V và làm thay đổi từ trường B để quét

Trang 37

 Vận tốc quét: khoảng đo đƣợc của tỉ số m/z, biểu thị

bởi giây trên bộ mười (s.decade -1 )

Vd: máy có vận tốc quét 10 s.decade -1 thì thời gian để quét đƣợc toàn bộ các ion có m/z từ 1 đến 1.000 cần 30 giây

- 10 giây để quét m/z từ 1 đến 10 (10 0 – 10 1 ) (1 decade)

- 10 giây kế tiếp để quét m/z từ 10 đến 100 (10 1 – 10 2 ),

- 10 giây cuối để quét m/z từ 100 đến 1000 (10 2 – 10 3 )

37

3.3 Bộ phân tích khối

3.3.2 Hiệu năng:

PHỔ KHỐI

Trang 38

 Độ phân giải R = m/m

Khả năng phân biệt được 2 pic kề nhau (có m/z

khác nhau ở số lẽ) mà cường độ tín hiệu của đáy giao nhau nhỏ hơn 10% so với cường độ của pic

có cường độ lớn (đối với máy sử dụng từ trường)

Trang 39

Máy có độ phân giải 1000 nghiã là máy đo

được tín hiệu giữa hai pic có m/z = 1000 và m/z

= 1001 mà thung lũng giao nhau giữa hai pic có cường độ tín hiệu nhiều nhất là 10% so với cường độ của pic có cường độ lớn (1001)

Trang 40

 Độ phân giải R = m/w1/2

W1/2 (peak width): độ rộng ở ½ chiều cao của pic tương ứng với ion có số khối m (đối với máy dùng bộ phân tích thời gian bay TOF, máy tứ cực - quadrupole, máy dùng bộ phân tích bẫy ion)

1

R = 100/1 = 100

40

3.3 Bộ phân tích khối

3.3.2 Hiệu năng:

PHỔ KHỐI

Trang 41

3.3.3 MÁY KHỐI PHỔ NHị TIÊU (DOUBLE FOCUSING MS)

Máy có hai bộ quét là quét theo điện trường (thay đổi V) và quét theo

từ trường (thay đổi B), do đó độ phân giải cao hơn máy chỉ dùng từ trường,

độ phân giải của máy nhị tiêu có thể đạt tới 100.000

41

Trang 42

3.3.4 MÁY KHỐI PHỔ TỨ CỰC (QUADRUPOLE)

2 cặp cực hình trụ đƣợc đặt song song một cách chính xác Hiệu thế một chiều U và xoay chiều V.cos  t đƣợc áp đặt vào hai thanh kề nhau nên chúng chịu một hiệu thế chung (U - V.cos  t)

±[U - Vcos  t]

m/z = f(U.V)

Với một hiệu thế cố định chỉ những ion có động năng đặc trƣng mới đi vƣợt qua các thanh tứ cực để đến đƣợc bộ thu nhận tín hiệu

42

Trang 43

3.3.5 MÁY KHỐI PHỔ DÙNG BẪY ION (TRAP ION)

Có cấu tạo giống MÁY KHỐI PHỔ TỨ CỰC và thường được dùng trong hệ thống SK khí ghép nối khối phổ (GC- MS) vì đơn giản, dễ thao tác, rẻ tiền, chỉ áp dụng để phân tích các phân tử có khối lượng thấp đến 650 Da

Sự ion hoá và phân tích khối lượng xảy ra tại cùng một vị trí

Tứ cực

43

Trang 44

3.3.6 MÁY KHỐI PHỔ SỬ DỤNG KỸ THUẬT THỜI GIAN BAY

44

Trang 45

3.3.7 MÁY KHỐI PHỔ SỬ DỤNG KỸ THUẬT THỜI GIAN BAY

(TIME-OF-FLIGHT)

Do thời gian đến đích của các ion chỉ khác nhau khoảng thời gian rất ngắn (10-6 – 10-7 giây) nên cần có bộ thu nhận tín hiệu cực nhạy để có thể phân biệt được các ion Máy loại này thường sử

dụng kỹ thuật ion hoá bằng sự bắn phá nhanh

nguyên tử (Fast atom bombardment) để đo các

hợp chất có phân tử lượng lớn

ke = ½ m.v2 = z.V (1)

45

Trang 46

3.3.7 MÁY KHỐI PHỔ SỬ DỤNG KỸ THUẬT THỜI GIAN BAY

(TIME-OF-FLIGHT)

Bộ phân tích khối TOF

46

Trang 47

• Gồm các dynode xếp xen kẻ

nhau với điện thế áp đặt lên

từng dynode tăng dần theo cấp

số nhân Khi ion chạm vào

dynode đầu tiên làm bức xạ các

electron ra khỏi dynode, các

electron này va chạm vào

dynode tiếp theo tạo ra một

PHỔ KHỐI

Trang 48

• Tín hiệu khuếch đại này đủ lớn

để đƣợc ghi nhận bởi bộ thu

nhận tín hiệu gắn nối tiếp với bộ

PHỔ KHỐI

Trang 49

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

Tùy theo cấu tạo của nguồn ion hóa mà sự phân mãnh ion xảy ra khác nhau, do đó phổ khối thu đƣợc

có hình dạng khác nhau

* ION HÓA MẠNH:

• Bắn phá điện tử (Electronic impact – EI)

• Ion hóa hóa học (Chemical ionization – CI)

* ION HÓA NHẸ NHÀNG:

• Fast atom bombardment – FAB

• Phun ion (ionization by electrospray ionization - ESI)

49

Trang 50

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

* ION HÓA NHẸ NHÀNG:

• Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (ionization

by atmosphere pressure chemical ionization – APCI)

• Ion hoá bằng sự giải hấp mạng do tia laser (matrix-assisted laser desorption ionisation - MALDI)

• Ion hoá bằng sự ion hoá trường hoặc bằng sự giải hấp trường (field ionisation and field desorption)

Trang 51

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

by electron impact ionization – EI)

• Dempster, 1922 và hoàn thiện bởi Bleakney, 1929

• Mẫu khí đi vào buồng chân không, tại đây chùm tia điện

tử có năng lƣợng 70 eV (tạo ra từ dây tóc đèn) bị hút về anod sẽ va chạm với phân tử khí của mẫu phân tích (năng lƣợng để ion hoá phân tử chỉ cần 8 - 15 eV) nên sẽ tạo ra những ion mang điện tích +1 tách ra khỏi phân tử.

Phân tử khí

51

Trang 52

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

by electron impact ionization – EI)

52

www.univ-lille1.fr

Điện thế 70 V (cathod-anod)

Cathod tạo e -

Mẫu ở trạng thái khí

anod bắt e -

Tấm hội tụ Tấm tăng tốc

Dòng electron

Ion phân

tử Chân không

Trang 53

M + e - M o+ + 2e

Ƣu điểm:

- Thông dụng nhất trong nghiên cứu cấu trúc

- Vừa cho ion phân tử, vừa cho ion phân mảnh

- Biết đƣợc phân tử lƣợng cùng sự phân mảnh để suy

by electron impact ionization – EI)

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

M o+ : ion phân tử

Trang 54

Nhược điểm

- Không thích hợp cho hợp chất không bền nhiệt, vì bị phân hủy trước khi bị ion hoá nên phổ đồ là của sản phẩm phân hủy

- Không thích hợp cho hợp chất không bay hơi như polimer có phân tử lượng lớn

- Không phân biệt được các đồng phân vì cho khối phổ

đồ giống nhau

- Trong vài trường hợp, trên phổ đồ không nhận được tín hiệu của ion phân tử

54

by electron impact ionization – EI)

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

Trang 55

55 Phổ khối của methanol với M+o = 32

by electron impact ionization – EI)

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

Trang 56

4.2 ION HOÁ HOÁ HỌC (Ionization by chemical ionization - CI)

- Phát triển bởi Munson & Field vào 1996, thực hiện ion hóa qua 2 giai đoạn:

ion/phân tử sơ cấp

• phản ứng giữa ion/phân tử sơ cấp với mẫu phân tích

56

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

- Buồng ion hoá được nạp một lượng khí phản ứng (metan,

như trường hợp ion hoá bằng bắn phá điện tử nhưng với năng lượng cao hơn)

Trang 57

4.2 ION HOÁ HOÁ HỌC (Ionization by chemical ionization - CI)

Trang 58

Ion phân tử

Khí phản ứng

Phân tử ở trạng thái khí Khí phản ứng bị ion hóa

Trang 59

- Ion (MH) + có giá trị m/z lớn hơn 1 đơn vị so với ion phân

tử, và đƣợc gọi là ion tựa phân tử (quasi-molecular ion).

59

ionization - CI)

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

- Ion CH5+ và C2H5+ là những acid mạnh có khả năng proton hóa các phân tử hữu cơ

Trang 60

- Sự ion hoá này cho phép bảo tòan ion phân tử Phổ đồ thường thấy pic của ion tựa phân tử (MH) + với cường độ lớn (và có thể có ion [M+C2H5] + ) mà không có ion M +

Trang 61

61

ionization - CI)

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

Phổ khối của methan ion hóa bằng phương pháp CI

47%

41%

Trang 62

Phổ khối của benzophenon ion hóa bằng phương pháp CI

Trang 63

4.2 ION HOÁ HOÁ HỌC (Ionization by chemical ionization - CI)

Trang 64

Ưu điểm:

Thường được lựa chọn khi sử dụng cách ion hoá EI mà không thấy pic ion phân tử trong phổ đồ

Nhược điểm:

- Không thích hợp cho hợp chất không bền nhiệt,

- Không thích hợp cho hợp chất không bay hơi,

Trang 65

4.3 ION HOÁ BẰNG SỰ BẮN PHÁ NHANH NGUYÊN TỬ (Ionization by fast atom bombardment - FAB)

• Barber, 1981

• Mẫu pha loãng trong chất nền ở dạng lỏng phân cực

như glycerin, thioglycerin, triethanolamin được tẩm trên một giá mang là tấm kim loại đồng

argon) do được gia tốc bởi điện trường sẽ bị ion hóa

tựa phân tử [MH] +

65

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

Trang 66

4.3 ION HOÁ BẰNG SỰ BẮN PHÁ NHANH NGUYÊN TỬ (Ionization by fast atom bombardment - FAB)

M+0, [MH]+, [MNa]+ [MK]+, [M+matrix]+

Trang 67

4.3 ION HOÁ BẰNG SỰ BẮN PHÁ NHANH NGUYÊN TỬ (ionization by fast atom bombardment - FAB)

67

4 SỰ PHÂN MÃNH ION (SỰ ION HOÁ)

Sơ đồ nguyên lý của nguồn ion hóa FAB

Súng phun khí Ar

Buồng trao đổi thế

Điện trường

Bộ phân tich khối mẫu

giá mang

Trang 68

Ưu điểm:

- Không hoá hơi mẫu, thích hợp cho phân tích các

peptid, các nucleosid có M ~ 10.000 Da

- Ít tạo ion phân mãnh,

nhận biết M

Nhược điểm:

- Không thích hợp để phân tích các hơp chất không

phân cực (vì khó tan trong matrix)

- Thường xuyên làm sạch giá mang mẫu+matrix

Ngày đăng: 25/01/2024, 13:17