Bài giảng Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký lỏng hiện đại trong kiểm nghiệm thuốc

Trang 1 Ứng Dụng Các Kỹ Thuật Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm ThuốcPGS.TS.. Nguyễn Đức Tuấn Trang 2 Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm ThuốcMục tiêu Trình bàyđược xu hướng n

Ứng Dụng Các Kỹ Thuật Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong

Kiểm Nghiệm Thuốc

PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn

Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM

Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

Mục tiêu

 Trình bày được xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký

lỏng và các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

 Trình bày được cấu hình và lợi điểm của các hệ thống UHPLC,

và UPLC

 Biết được nguyên tắc chuyển đổi một quy trình phân tích bằng

HPLC sang UPLC và ngược lại

Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

Nội dung

 Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng

 Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

 Kỹ thuật UHPLC (Ultra High Performace Liquid Chromaography)

 Kỹ thuật UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography)

 Chuyển đổi phương pháp phân tích HPLC sang UPLC và ngược lại

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Xu hướng nghiên cứu hiện nay

trong sắc ký lỏng

Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng

Mục đích

 Phân tích nhanh (high-throughput)

 Hiệu năng cao (phương pháp phân tích, thiết bị, phòng thí

nghiệm)

 Phân tích tự động và liên tiếp với nhiều phương pháp

 Chuyển đổi phương pháp phân tích mà không cần thẩm định lại

 Tiện lợi cho người phân tích

 Quản lý, vận hành, xử lý và lưu trữ dữ liệu của 1 hệ thống,

nhiều hệ thống trong phòng thí nghiệm, nhiều phòng thí nghiệm

Những tiến bộ

về kỹ thuật phân tích sắc ký

Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng

Việc phân tách dựa vào độ chọn lọc chuyển pha

• Hiệu năng cao [N]

Sắc ký lỏng siêu tới hạn

Sắc ký lỏng siêu tới hạn (SFC, Supercritical Fluid Chromatography)

 Khởi đầu vào những năm 1990

 Khắc phục một số nhược điểm của GC và HPLC

Tại sao SFC không được chấp nhận ?

Mặc dù SFC có những ưu điểm, nhưng chưa

bao giờ được chấp nhận rộng rãi … Tại sao ?

• Thiếu ổn định

– Thời gian lưu thay đổi

– Thể tích tiêm có độ đúng thấp

– Việc phân phối dung môi không ổn định khi tỷ lệ

dung môi dưới 5%

• Thiết bị vận hành kém

– Độ tin cậy của thiết bị không đủ (hệ thống bơm,

kiểu tiêm, bộ phận điều hoà áp suất cột)

– Sự khuếch tán và thể tích hệ thống lớn nên ngăn

chặn sự dung nhận các hạt pha tĩnh nhỏ và thời

gian phân tích không nhanh

• Độ nhạy thấp

– Độ nhiễu cao do bơm và đầu dò

– Ảnh hưởng bởi chỉ số khúc xạ của CO2

Nếu tất cả cácvấn đề trênđược giảiquyết ?

Sắc ký hội tụ siêu hiệu năng

Sắc ký hội tu siêu hiệu năng (UPCC, Ultra Performance Convergence Chromatography)

 Khởi đầu vào năm 2012

 Phát triển từ SFC

Hệ thống

UPCC-PDA-MS

Một số chất lỏng siêu tới hạn

Lỏng siêu tới hạn

• Tinh khiết hóa học, dung môi ổn định và không phân cực

• Không độc và không cháy

• Dễ bay hơi

• Dễ kiểm soát trạng thái vật lý

• Luôn có sẳn

– Sản phẩm phụ của quá trình lên men

• Được xem như khí “ Xanh ”

– Định nghĩa khí “ Xanh ”:

• Ngăn chặn/giảm tối thiểu chất thải

• Giảm độc

• Tái sử dụng

• Giảm tối thiểu năng lượng sử dụng

Lợi điểm của CO2

Độ nhớt (g/cmxs)

10-4 – 10-3

như chất khí

Sức dung môi

rửa giải [E o ]

Độ phân cực [P’]

Lựa chọn dung môi

Lựa chọn pha tĩnh

Silica / BEH 2-ethylpyridine Cyano Aminopropyl Diol Amide PFP Phenyl

Lựa chọn pha tĩnh

41 mL dung môi

2.5mL/min x 2min

1) 4.85mL CO 2 2) 0.15mL Methanol (3%)

0,15mL Methanol

Sử dụng/thải bỏ dung môi – LC và UPCC

Các thuốc chẹn beta (β-blockers)

03-Aug-2012 FFA Mix 1 FFA Method 0.5ul inj 15CV0 17:14:13

Time 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

1.72 339.3196 1.52 311.2894

1.35 283.2587

1.18 255.2276

1.05 227.1970

0.91 199.1659

0.79 171.1348

1.93 367.3502

Method Conditions:

Instrument: ACQUITY UPC 2

Column: ACQUITY UPC 2 HSS C18SB Co-solvent: MeOH w/ 2g/L Ammonium Formate

Gradient: 1 to 10% over 5 minutes*

Flow: 2.5 mL/min Temperature: 60 0 C CCM Pressure: 1885 Injection Vol: 0.5uL

Make-up flow: 0.2mL/min of 0.1% formic acid Splitter: Upchurch cross 1/16 PEEK

Sample Concentration: 0.25mg/mL FFA: C8 to C24

C24

C20 C18 C16

*Run time can be shortened to 2.5 minutes is gradient slope is maintained 2% B Isocratic results in similar runt time (see next slides)

Phân tích acid béo bằng UPCC

Bay hơi Khả năng bay hơi Không bay hơi

Khả năng ứng dụng của UPCC

Kiểm soát tiến độ nghiên cứu chiết xuất

Dịch chiết với dung môi phân cực

Tiêm trực

tiếp vào LC

Chiết tiếp với dung môi không phân cực để phân tích bằng GC

Dịch chiết với dung môi không phân cực

Tiêm trực tiếp vào GC

Bốc hơi và hòa tan lại trong dung môi phân cực để phân tích bằng LC

Dịch chiết với dung môi phân cực hoặc không phân cực

Phân tích trực tiếp bằng UPC 2

Tạo dẫn xuất !

Ưu điểm của UPCC

 UPCC gia tăng hiệu năng và tính chọn lọc cho các phòng thí nghiệm phân tích bằng sắc ký

 UPC2 cải thiện công tác thực nghiệm

 Cung cấp thêm nhiều khả năng để kiểm soát tính chọn lọc

 Triển khai phương pháp phân tích nhanh

 Hiệu năng của UPCC là do:

 Hạt pha tĩnh dưới 2 µm, đường kính trong cột từ 2,1 – 3,0 mm

 Làm giảm thể tích hệ thống và khuếch tán

 UPCC có thể được áp dụng để phân tích nhiều loại hợp chất

 80 – 85% số hợp chất có thể được phân tích bởi SFC và RPLC

 Thích hợp để phân tích đồng phân vị trí, đồng phân quang học, đồng phân dia và các hợp chất bất đối

Nhận xét về UPCC

Hiệu năng cột tăng do cỡ hạt

giảm và khuếch tán hệ thống

giảm

ACQUITY UPLC

I-Class System

Hiệu năng cao hơn 70%

so với cỡ hạt 1.7 µm

Hiệu năng cao hơn 100%

so với cỡ hạt 3.5 µm

• Các kỹ thuật phân tách trong

sắc ký lỏng

Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

Tỷ số giữa chiều dài cột (L) và cỡ hạt pha tĩnh (dp)

Tỷ số giữa chiều dài cột (L) và cỡ hạt pha tĩnh (dp)

Cho biết khả năng đạt độ phân giải tối đa

Mẫu rất khó

Mẫu khó Mẫu trung bình

Mẫu dễ

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Sự khác nhau giữa 3 kỹ thuật phân tách

Tăng độ phân giải

Giảm thời gian sắc ký

Tăng độ nhạy

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về hiệu năng giữa

3 kỹ thuật phân tách

rộng pic ở đáy) của chất phân tích là do ảnh hưởng của cột

sắc ký (động học khuếch tán và chuyển khối phụ thuộc vào

cỡ hạt pha tĩnh và tốc độ dòng) và ảnh hưởng của hệ thống

(đường kính trong và chiều dài của ống mao quản, bộ phận

kết nối thiết bị, thể tích tế bào dòng của đầu dò ….)

 Hiệu năng tách thật sự bị ảnh hưởng bởi sự phân tán hệ

thống cùng với một khoảng tốc độ dòng để mang lại hiệu

năng cao nhất có thể với một cột sắc ký nhất định

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Ảnh hưởng của cỡ hạt và tốc độ dòng lên sự phân tán trong cột (hiệu năng cột)

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Ảnh hưởng của sự phân tán hệ thống lên sự phân tách

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Chi phí cho một lần phân tích sẽ giảm từ HPLC  UHPLC  UPLC do thời gian phân tích ngắn hơn và tốc độ dòng thấp hơn

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

UHPLC là cầu nối của hai kỹ thuật phân tách HPLC và UPLC

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Mức độ phân tán hệ

• Cỡ hạt: 1,7 - 5 µmTối ưu

• Cỡ hạt: 1,6 - 5 µmTối ưu

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Ảnh hưởng của sự phân tán lên hiệu năng: phân tách với chương trình đẳng dòng giữa HPLC, UHPLC và UPLC ( kỹ thuật phân tách không phù hợp với cột sắc

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

Minutes 0.50 1.00 1.50 2.00

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

Minutes 0.50 1.00 1.50 2.00

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

Minutes 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

Minutes 0.50 1.00 1.50 2.00

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

Minutes 0.50 1.00 1.50 2.00

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

Minutes 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Ảnh hưởng của sự phân tán lên hiệu năng: phân tách với

chương trình gradient giữa UHPLC và UPLC

Cột C 18 2,1x 50 mm Định lượng Diclazuril theo USP

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Kỹ thuật phân tách phù hợp với cột sắc ký  hiệu năng cao nhất

Tại sao cần UPLC ?

HPLC

2.5 µm – 75 mm Thể tích tiêm = 2,5 µL Tốc độ dòng = 0,5 ml/phút

Rs (2,3) = 2,34

5 µm – 150 mm Thể tích tiêm = 5,0 µL Tốc độ dòng = 0,2 ml/phút

Rs (2,3) = 2,28

3.5 µm – 100 mm Thể tích tiêm = 3,3 µL Tốc độ dòng = 0,3 ml/phút

Rs (2,3) = 2,32

0.00 0.10 0.20

Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

0.00 0.10 0.20

Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00

0.00 0.10 0.20

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80

2.00

UPLC ®

1.7 µm – 50 mm Thể tích tiêm = 1,7 µL Tốc độ dòng = 0,6 ml/phút

Rs (2,3) = 2,29

Minutes

0.00 0.10 0.20

Minutes 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.10

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Hiệu quả kinh tế

Vòng đời thiết bị HPLC

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Hiệu quả kinh tế

Chi phí/mẫu Dung môi sử

dụng/năm

Chi phí/năm/định lượng 12000 mẫu

Tiết kiệm với

hệ UHPLC $9,73 USD 388 Lít $38.870 USD

Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng

Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký lỏng hiện đại tại các phòng thí nghiệm phân tích thường qui

 Các kỹ thuật sắc ký lỏng mới được ứng dụng đầu tiên trong các giai đoạn đầu của quá trình nghiên cứu phát triển thuốc mới (khám phá thuốc mới, phát triển công thức bào chế thuốc ở giai đoạn đầu)

 Việc ứng dụng các kỹ thuật sắc ký lỏng này trong các phòng thí nghiệm phân tích thường qui chỉ xảy ra sau khi có sự chấp nhận các qui trình phân tích trong các giai đoạn đầu tiên của vòng đời sản phẩm

 Các kỹ thuật này phải cho kết quả lặp lại, ổn định và tin cậy

 Việc áp dụng các kỹ thuật này phải duy trì được sự tuân thủ khi triển khai các qui trình phân tích đã được xây dựng và thẩm định

 Các kỹ thuật này cũng phải duy trì sự tương hợp với các điều kiện phân tích đang được sử dụng

• Kỹ thuật UHPLC

Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

Kỹ thuật UHPLC

Thiết bị UHPLC có tính đa dụng

 Triển khai các qui trình định lượng bằng HPLC đã

được xây dựng

 Dễ dàng chuyển đổi phương pháp HPLC sangUHPLC bằng cách điều chỉnh thể tích dừng vàthời đểm trộn dung môi

 Công nghệ đa dòng chảy hình cung (Arc flow path) giúp

Multi- Chuyển đổi các phương pháp HPLC đangđược ứng dụng bằng cách thiết lập thể tíchdừng gradient của hệ HPLC

 Triển khai phương pháp với cột UHPLC cóhiệu lực cao hơn với thể tích dừng gradientcủa hệ UHPLC

 Cải thiện năng suất phân tích và giảm chi phí phân

tích khi sử dụng cột UHPLC có cỡ hạt 2,5 – 2,7 µm

Kỹ thuật UHPLC

Thiết bị UHPLC có tính đa dụng

 Dễ dàng ứng dụng và cho kết quả lặp lại các

phương pháp HPLC đã được xây dựng trên thiết bịHPLC của các nhà cung cấp thiết bị khác nhau

 Chấp nhận phương pháp UPLC trong các giai

đoạn đầu tiên của quá trình phát triển thuốc, sửdụng pha tĩnh với cỡ hạt dưới 2 µm được điềuchỉnh thành 3 – 5 µm cho mục đích phân tíchthường qui

 Tự chuẩn bị pha động trên dòng dung môi

(on-line) giúp làm giảm các sai số khi chuẩn bị phađộng thủ công với người chuẩn bị và ngày chuẩn

bị khác nhau

Agilent LC System

ACQUITY Arc System

Điều kiện sắc ký giống nhau giữa 2 hệ thống: 5 - 60% MeOH trong 15 phút; Pha động A: HCCOH 0,1% trong nước, pha động B: HCCOH 0,1% trong MeOH; F = 2,9 mL/phút; Cột: XSelect CSH C18 (4,6 x 150 mm, 5 µm); 45 o C; UV

270 nm; 10.0 µL

ACQUITY UPLC H-Class System

ACQUITY UPLC BEH C181.7 µm 2.1 x 50 mm

Flow Rate = 0.61 mL/min Inj Vol = 0.7 µL

The ACQUITY Arc System enables support HPLC and UHPLC methods on a single platform.50 to 80% MeOH; Temp = 40 o C; UV @ 254 nm; (1) prednisone, (2)

hydrocortisone, (3) dexamethazone, (4) estradiol, (5) 17α – hydroxyprogesterone, (6) levonorgestrel, (7) progesterone

Kỹ thuật UHPLC

Bộ trộn gradient “thông minh” (Gradient

SmartStart)

 Tự điều chỉnh đồng thời thời gian bắt đầu

gradient và các bước trước khi tiêm mẫu nên

làm giảm thời gian trống giữa các lần phân tích

và rút ngắn thời gian phân tích

 Tự điều chỉnh thể tích dừng mà không cần thay

đổi chương trình gradient

Bộ quản lý dung môi tứ phân

 Trộn đúng và chính xác đồng thời 4 dung môi

với tốc độ dòng đến 5 ml/phút và áp suất đến

9.500 PSI

 Van lựa chọn 4 trong số 6 dung môi khi trộn

Thích hợp với nhiều loại đầu dò

 Hiệu năng tối đa (HPLC và UHPLC)

 Độ nhạy cao

 Khoảng tuyến tính rộng

 PDA, UV/Vis, FD, RI, ELSD, MS

 Van chuyển cột nhanh và tự động

Lượng mẫu tồn dư không đáng kể (< 0,002%)

Với thiết kế kiểu tiêm mẫu “dòng chảy qua kim”(flow-through-needle) làm giảm tối thiểu lượngmẫu tồn dư do kim được rửa sạch trong thờigian phân tích

Có thể cài đặt nhiều chương trình rửa kim khácnhau nên phù hợp với các nền mẫu phức tạp

Kỹ thuật UHPLC

Công nghệ trộn dung môi tự động

 Theo chương trình gradient pH

và % dung môi mữu cơ

 Giảm sai số khi chuẩn bị phađộng thủ công

 Rút ngắn thời gian thẩm định độ

ổn định của phương pháp sắc kýpha đảo hoặc trao đổi ion

Công nghệ đa dòng chảy hình cung

UHPLC

 Giúp lặp lại hoặc cải tiến phương pháp đang

sử dụng với việc lựa chọn thể tích dừng theo

từng kỹ thuật HPLC hoặc UHPLC

Kỹ thuật UHPLC

Bộ quản lý dung môi tứ phân Chuyển đổi áp suất

Van tỷ lệ dung môi Khử khí dung môi

Van kiểm tra

Van chọn dung môi

Kỹ thuật UHPLC

Công nghệ đa dòng chảy hình cung (Arc Multi-flow pathTM Technology) giúp lặp lại kết quả phân tích của phương pháp đã xây dựng trên hệ thống sắc ký khác

Kỹ thuật UHPLC

Giải quyết những khó khăn trong chuyển đổi phương pháp

Lặp lại sự vận hành của hệ thống ban đầu

Những thách thức khi chuyển đổi

 Sự phân tán ngoài cột phải tương

đương hoặc tốt hơn hệ thống

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

UPLC trace

Programmed gradient

HPLC trace

Gradient delay UPLC

Gradient delay HPLC

Equilibration

Chương trình gradient

Gradient UHPLC thực tế

Gradient HPLC thực tế

Thể tích dừng của hệ HPLC

Thể tích dừng của

hệ UHPLC

Cân bằng

Kỹ thuật UHPLC

So sánh hướng dẫn về chuyển đổi phương pháp theo USP

37-NF 32 (1/8/2014) và EP

Kỹ thuật UHPLC

Công nghệ đa dòng chảy hình cung (Arc Multi-flow pathTM Technology)

Path 1 Gradient Delay Volume = 1100μL

Thể tích dừng = 700 μL

Thể tích trộn lớn hơn làm “phân tán” đường biên của chương trình gradient giống như HPLC

Kỹ thuật UHPLC

Lặp lại sự vận hành của hệ thống ban đầu nhờ công nghệ đa dòng chảy hình cung (Arc Multi-flow path TM Technology) và bộ trộn gradient “thông minh”

Lựa chọn đường đi của dòng chảy 1 hoặc 2

Bô trộn gradient

“thông minh”

 Thể tích dừng có thể được lựa chọngiúp tái lặp cả thể tích hệ thống và kiểutrộn dung môi như hệ thống ban đầu

 Điều chỉnh thời điểm bắt đầu chươngtrình gradient so với thời điểm tiêm mẫu(trước, trong và sau khi tiêm) giúp bùtrừ cho việc chuyển đổi phương phápđược xây dựng từ các hệ thống sắc kýlỏng có thể tích dừng khác nhau

 Không ảnh hưởng đến chương trình rửagiải gradient đã được xây dựng, phùhợp với hướng dẫn của USP37-NF32

về việc chuyển đổi phương pháp sắc kývới chương trình rửa giải gradient đượcxây dựng trên các hệ sắc ký lỏng khácnhau

Kỹ thuật UHPLC

Lặp lại kết quả của phương pháp đã xây dựng với công nghệ đa dòng chày hình cung

Metoclopramid 0,5 mg/mL và nồng độ tạp chất là 1,0% của metoclopramid

0.000 0.015 0.030

Minutes 0.00 1.50 3.00 4.50 6.00 7.50 9.00 10.50 12.00 13.50 15.00

Agilent 1260 Infinity LC System

ACQUITY Arc System

Kỹ thuật UHPLC

Thích hợp với nhiều phương pháp giúp tăng năng suất thiết bị

Kỹ thuật UHPLC

Công nghệ trộn dung môi tự động

Kỹ thuật UHPLC

Công nghệ trộn dung môi tự động

 Phân tích thường qui:

tránh chuẩn bị thủ công pha

động có pH mong muốn 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 (Phút)

pH 2,95

pH 3,75