Bài giảng Khảo sát cấu trúc các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp phổ NMR

- kích thích bằng các xung RF cộng hưởng được với B0• Khi ngắt xung kích thích RF, các hạt nhân trở lại mức cơ bản, trả lại năng lượng kích thích ∆E = hν.• Ghi nhận tín hiệu của ∆E = hν

1 Trình bày được các nguyên lý cơ bản về phổ NMR

2 Khai thác được các thông tin cấu trúc từ các dữ liệu phổ học, chủ yếu là từ các kỹ thuật phổ NMR.

3 Trình bày được các dữ liệu NMR trong một văn bản khoa học để xác nhận cấu trúc của chất nghiên cứu.

4 So sánh được cấu trúc của 1 hợp chất với các cấu trúc

đã được công bố trong các TLTK.

5 Xác định được cấu trúc vài hợp chất đơn giản nhờ các

kỹ thuật phổ NMR khác nhau.

• Nhiều thông tin, chính xác, tin cậy, phân biệt được.

• Bắt buộc phải có khi công bố về cấu trúc hóa học.

• Là một nội dung chính khi viết & đọc TLTK.

• Có thể tiếp cận được.

• Sẽ phát triển mạnh ở nước ta.

5'

2' 4'

2 HO

OH

H 7

4' 2'

5' Daidzein (4’-OH) Formononetin (4’-OMe)

6

O HO

OH O O OH

Rhamnosyl OH

3 5

3' 4' 7

O HO

OH O O OH

Rhamnosyl

3 5

3' 4' 7

7

O HO

5

3' 4' 7

8

kênh 1Hkênh 13C & 1H

kênh 13C

DEPT*

HMBCHMQCHSQC

COSY*

NOESYROESY

13C-NMR

13C-CPDINADEQUATE

Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của afzelin vs quercitrin

quercitrin = quercetin-3-O-αL-rha

afzelin = kaempferol-3-O-αL-rha

9 8 7

6 5 4

3

2 6' 5' 4' 3' 2' 1' O

O OH

9 8 7

6 5 4

3

2 6' 5' 4' 3' 2' 1' O

O OH

O

OH

OH

H –

Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của afzelin vs quercitrin

quercitrin = quercetin-3-O-α-L-rha

afzelin = kaempferol-3-O-α-L-rha

6 5 4

3

2 6' 5' 4' 3' 2' 1' O

O OH

MeO

OH OH

6' 5'

4' 3' 2' 1' 10

9 8 7

6 5 4

3

2 O MeO

OH OH

rhamnocitrin (M = 300)

dihydro rhamnocitrin (M = 302)

-O-CH-O-14

Cùng là glucose, nhưng “bộ” tín hiệu phần glucosyl của:

• aglycon là eu- flavonoid thì khác với iso- flavonoid.

• O -glucosyl thì khác với C -glucosyl.

• 8- C -glc (vitexin) thì khác với 6- C -glc (isovitexin).

Bộ tín hiệu (của phần glucosyl…) sẽ khác nhau tùy theo:

- kiểu khung aglycon,

- loại glycosid,

- vị trí gắn đường…

Đây chính là 1 điểm thú vị của phổ NMR!

15

• Phổ NMR có rất nhiều (hàng trăm) kỹ thuật (phức tạp hơn

hẳn UV, IR, MS), mỗi kỹ thuật cung cấp một loại thông tin.

• Phổ NMR cung cấp rất nhiều thông tin về cấu trúc

(chi tiết & cụ thể hơn hẳn UV, IR, MS).

• Ứng dụng trong y khoa, sinh học: NMR >> (UV, IR)

• Máy đo phổ NMR đắt gấp hàng trăm lần máy UV, IR.

1 Dùng một bức xạ điện từ (có năng lượng E) tác động vào một hệ thống vật chất đang ở mức E0, năng lượng thấp

2 Dưới tác động của BXĐT này, hệ thống từ mức E0 (E thấp)

sẽ chuyển lên mức kích thích E* (E cao, kém bền).

3 Hệ thống ở mức E* có khuynh hướng trở về lại mức E0

4 Khi về lại mức E0, hệ thống sẽ giải phóng (trả lại) năng lượng

∆E dưới dạng bức xạ có tần số ν thỏa: ∆E = (E*– E0) = h ν

5 Bức xạ có tần số ν này được phát hiện, khuếch đại, ghi lại →

Lưu ý: Năng lượng của vùng này không thểcộng hưởng với dao động thuộc vùng khác

tia γ tia X UV IR MW sóng radio (RF)

E lớn

EUV

điện tử (p, π…)

10 8

nhóm chức (-OH, C=O…)

EIR

10 6

hạt nhân ( 1 H, 13 C )

ENMR

1

- kích thích bằng các xung RF cộng hưởng được với B0

• Khi ngắt xung kích thích RF, các hạt nhân trở lại mức cơ bản, trả lại năng lượng kích thích ∆ E = h ν

• Ghi nhận tín hiệu của ∆ E = h ν (nhờ các thiết bị phù hợp với tần số ν, tùy loại hạt nhân): đây chính là tín hiệu phổ NMR.

23

A Hạt nhân AXZ phù hợp (có từ tính).

B Ngoại từ trường B0 phù hợp (mạnh, ổn định, đồng nhất).

C Xung RF phù hợp (với AXZ, với B0).

D Kênh (channel) phát hiện phù hợp với AXZ.

Phải hội đủ đồng thời 4 điều kiện phù hợp

A

24

• Một nguyên tử X gồm có

- phần vỏ = các orbital chứa electron (è) xoay bên ngoài,

- phần lõi = hạt nhân, ở bên trong.

• Phần hạt nhân chứa các proton (p) và các neutron (n).

• Tổng số (p + n) là số khối của hạt nhân.

• Một nguyên tử X có thể có vài đồng vị.

(isotope = cùng vị trí trên bảng phân hạng tuần hoàn).

• Các đồng vị này khác nhau về số neutron trong nhân (n).

• Trong tự nhiên, các đồng vị này chiếm tỉ lệ % khác nhau.

Điều này có nghĩa là, trong một phân tử như CH3– CH2– CHO

ta # luôn luôn gặp 3 loại proton (a, b, c) đồng thời ở dạng 1H nhưng chỉ có 10–6 cơ hội gặp 3C (a, b, c) đồng thời ở dạng 13C.

• Các hạt nhân có I ≠ 0 mới có thể “cộng hưởng với từ trường”

và do đó mới cho tín hiệu phổ NMR (hạt nhân hợp lệ).

• I cho biết số hướng quay (k) của một hạt nhân có từ tính

k = (2.I + 1)

thuận chiều B0 nghịch chiều B0

số hướng quay = (2.I + 1)

31

γγγγ

Tỉ số từ hồi chuyển ( γ , gyromagnetic ratio) của 1 hạt nhân là

độ biến thiên của tần số cộng hưởng (∆ ν0, tính bằng MHz)

khi ngoại từ trường B0 thay đổi 1 Tesla

Ví dụ: ν0của 2 hạt nhân 1H và 13C trong ngoại từ trường B0

Sự đáp ứng với từ trường của 1H vs 13C

34

là thời gianhoàn thành

1 chu kỳ này

Vectơ M từ trục z “rớt” xuống trục y, xoay quanh mp (xy)

Vừa xoay, vectơ M vừa “nhấc đầu” lên, rồi lại trở về trục z

Là thời gian cần thiết để hoàn thành 1 lần scan (đo) mẫu.

(xem sơ đồ ở slide kế).

Với một thời gian đo mẫu cố định, một hạt nhân có

• thời gian hồi phục ngắn (như 1H):

sẽ được quan sát (scan) nhiều lần (tín hiệu rõ hơn).

• thời gian hồi phục dài (như 13C):

sẽ được quan sát (scan) ít lần hơn (tín hiệu kém hơn).

36

Thời gian hồi phục càng nhỏ → càng mau lặp lại giao động

→ được scan càng nhiều lần → tín hiệu càng rõ (S/N tăng)

→ thời gian đo phổ càng ngắn (phổ 1H-NMR: vài giây)

Thời gian thực hiện 1 lần quét: (TT1) = (d1 + p1 + aq)

Vì d1 (vài µsec) << < d1 & aq (vài sec), nên

• thời gian quét 1 lần: TT1 ~ (d1 + aq), sec

• thời gian quét NS lần: TTNS~ NS ×(d1 + aq), sec

1

Với phổ 1H-NMR Thông thường, NS = 16 là quá đủ

• Thời gian scan 01 lần: TT1 # 4,3 sec

• Thời gian scan 16 lần: TT16# 70 sec (~ 1 phút)

13

Với 13C-NMR, số lần scan NS lớn (ví dụ NS = 1024 = 1K)

• Thời gian scan 01 lần # 3,1 sec

• Thời gian scan 1K lần # 3200 sec (> 50 phút)

Khi đo phổ của các chất có MW < 2-3 KDa (máy 500 MHz) thì:

C: NS/20 phút

# 52 phút

10243,05 sec

13C-NMR

H: # 1 phút

# 70 sec

164,28 sec

Dù cùng loại hạt nhân (ví dụ 13C), nhưng nếu:

khác môi trường hóa học → khác thời gian hồi phục.

(dù cùng thời gian đo, cường độ tín hiệu cũng sẽ khác nhau).

20 21

6.9 6.9 36

• Nhưng trên thực tế, xác suất gặp hạt nhân 1H = 99,9%

cao gấp ~ 90 lần xác suất gặp hạt nhân 13C (chỉ 1,11%).

• Và xác suất để phát hiện hạt nhân 1H sẽ cao gấp

(64 x 90) = 5760 lần xác suất phát hiện hạt nhân 13C.

- kích thích được hạt nhân X (→ ν0thay đổi theo X)

- và cộng hưởng được với B0 (→ ν0thay đổi theo B0)

• ν0cũng là vùng tần số của tín hiệu phổ của X

• ν0thì tỉ lệ với ngoại từ trường B0 (Tesla) và γX (MHz/Tesla) theo phương trình Larmor: ν0= γX.B0

13 1

Tần số cộng hưởng của 1H (νH) và 13C (νC) sẽ thay đổi theo B0:

Nghĩa là, khi dùng máy có từ trường 11,75 Tesla, thì các hạt nhân

- 1H sẽ cộng hưởng với giải xung RF có tần số (500 ± ε) MHz

-13C sẽ cộng hưởng với giải xung RF có tần số (125 ± ε) MHz

46

13 1

Lưu ý quan trọng về TSCH:

• TSCH của hạt nhân X là 1 giải tần số xung quanh “tần số chủ” F0 Khi kích thích hạt nhân X bằng 1 xung RF có tần số F0 cụ thể trong một thời gian rất ngắn (t = vài µ.sec) sẽ tạo được một

“giải tần số kích thích”trải rộng từ (F0 – 1/t) đến (F0+ 1/t)

Như vậy, bề rộng của giải tần số này là PW= 2/t

• Vì t rất nhỏ (vài µs) nên PW khá lớn, chứa nhiều xung có tần số khác nhau, đủ để kích thích mọi hạt nhân đồng loại trong mẫu đo (hoặc 1H, hoặc 13C…)

13 1

• Khi đo phổ 1H, xung RF (F0= 500,1335 MHz) được phát trong

thời gian chớp nhoáng (t # 10 µs) sẽ tạo 1 giải tần số trong vùng

(500.133.500 ± 100.000 Hz) Giải tần số này rộng 200.000 Hz

thì quá đủ để kích thích mọi hạt nhân 1H trong mẫu đo

(Phổ 1H-NMR chỉ rộng khoảng 20 ppm x 500 MHz = 10.000 Hz)

Ví dụ, với máy NMR có B0 = 11,75 Tesla (# máy 500 MHz):

• Khi đo phổ 13C, xung RF (F0= 125,7715 MHz) được phát trong

thời gian chớp nhoáng (t # 5 µs) sẽ tạo 1 giải tần số trong vùng

1H sẽ cho các tín hiệu thuộc vùng [500 ± ε] MHz

13C sẽ cho các tín hiệu thuộc vùng [125 ± ε’] MHz

Ở máy 11,75 T

13 1

• tỉ số từ hồi chuyển (γ, 106rad/s.Tesla) 267,513 67,262

• tần số cộng hưởng (với B0= 11,75 Tesla) 500 MHz 125 MHz

TSCH (MHz/11,75 T)

thời gian đo phổ NMR (và số scan) n giây (ít) 10n phút (nhiều)

cường độ tín hiệu tỉ lệ với số hạt nhân có tỉ lệ không tỉ lệ

52

B1 Ngoại từ trường (B0) B2 Nội từ trường (TT cảm ứng, TT chắn; Bi) B3 Từ trường hiệu dụng (Beff)

Quan sát các hạt nhân có từ tính (vd I = 1/2) đang hỗn độn,

và quay ngẫu nhiên trong không gian chưa có từ trường.

Lúc này, theo quy luật số lớn, tổng moment từ M = zero.

Nα

Nβ

= e–(Eβ– EkTα) ≈ 1 – ∆E

kT = 1 –(Nα– Nβ)

γ.ħ.B0kT

Nα

∆N

2kTN

∆N

→ ∆N thì tỉ lệ với cường độ ngoại từ trường B0

56

γ.ħ.B0kT

(Nα– Nβ)

≈ γ.ħ.B0

2kTN

∆N

=(Nα+ Nβ)

Sự tương quan giữa ngoại từ trường và năng lượng

Theo phương trình phân bố dân số Boltzmann thì:

Các hệ quả thu được:

→ ∆E, ∆N thì tỉ lệ với cường độ ngoại từ trường B0

2

57(Eβ– Eα) = ∆E= γ.ħ.B0(với ħ = h/2π)

Sự tương quan giữa ngoại từ trường và năng lượng

(Nα– Nβ)

≈ γ.ħ.B0

2kTN

∆N

=(Nα+ Nβ)

• Trong từ trường B0 một dân số N hạt nhân (có I = 1/2) sẽ có 2 hướng spin

* Nα hạt nhân sẽ spin thuận chiều B0, có năng lượng thấp (Eα)

* Nβ hạt nhân sẽ spin nghịch chiều B0, có năng lượng cao (Eβ)

• Ở nhiệt độ phòng, dân số Nα> Nβ (với ∆N rất nhỏ, # vài phần triệu)

Định luật phân bố Boltzmann đã cho thấy: (Nβ/ Nα) = e-∆E/kT, với

* ∆E là sự chênh lệch năng lượng giữa 2 trạng thái Eβ và Eα

* k = hằng số Boltzmann (1.3805 x 10-23 J/K); và T = nhiệt độ Kelvin

• Khi nhiệt độ giảm, tỉ số (Nβ/ Nα) sẽ giảm

Khi nhiệt độ tăng, tỉ số (Nβ/ Nα) sẽ tăng và tiệm cận giá trị 1

• B0 càng lớn thì ∆N sẽ càng lớn →∆E sẽ càng lớn, càng dễ phân biệt, phát hiện

Cội nguồn của tín hiệu phổ NMR (1)

Đọc thêm

59

• Trong từ trường B0, khi hấp thụ một năng lượng ∆E từ xung RF thì một phần

(trong ∆N) các hạt nhân sẽ dịch chuyển từ mức Eα thấp → lên mức Eβ cao

• Khi về lại trạng thái Eα, hệ thống sẽ giải phóng lại ∆E dưới dạng các tín hiệu

FID có tần số v0 khác nhau thỏa hệ thức ∆E = hv0

• Từ trường B0 càng lớn →∆N càng lớn →∆E càng lớn →v0 càng lớn

• Kỹ thuật NMR có thể phát hiện sự chênh lệch ∆N (tức ∆E) rất nhỏ

• Tất nhiên, ta sẽ không có tín hiệu phổ NMR khi

- không có từ trường, hoặc

- khi ∆N = 0 (do hạt nhân không có từ tính)

• Nhờ sự cộng hưởng giữa năng lượng E (tức là xung RF có tần số đặc biệt)

với từ trường B0, các hạt nhân ở các trạng thái khác nhau sẽ cho các

tín hiệu có tần số khác nhau→ Phổ cộng hưởng từ của hạt nhân khảo sát

Cội nguồn của tín hiệu phổ NMR (2)

• B0 / FT-NMR rất mạnh (~ 7 – 23 Tesla, # vài trăm ngàn lần

từ trường địa cầu) và cực kỳ ổn định (nhờ điều kiện siêu dẫn)

từ trườngđịa cầu

nam châm thường(gia dụng)

nam châm điện(máy CW-NMR)

n châm siêu dẫn(máy FT-NMR)

~ (50) µТ ~ (50) mТesla ~ (1 – 2) Tesla ~ (7 – 23) Tesla

Còn được gọi là từ trường cảm ứng (induced), ký hiệu là Bi.

• Nguồn gốc

Bi là từ trường do các electron (trên các orbital

bao quanh hạt nhân) chuyển động và tạo thành.

• Tính chất cơ bản

- Bi thì ngược chiều với B0 (làm giảm tác động của B0).

- Bi thì tỉ lệ với B0 và tỷ lệ với mật độ electron quanh hạt nhân.

- khi mật độ electron quanh hạt nhân càng lớn, ta nói hạt nhân

có hệ số chắn σ càng lớn → cường độ Bi sẽ càng lớn.

62

• Ngoại từ trường (B0, rất mạnh, hàng chục Tesla) do máy cung cấp

• Nội từ trường (Bi = từ trường cảm ứng, ngược chiều với B0)

do lớp electron quanh hạt nhân xoay và tạo thành

Bi rất yếu: các hạt nhân 1H có ∆Bi # vài (chục) phần tỉ (10-9) so với B0

100 tấn và (100 tấn + 1 gam)!

63

Bi = σ.B0

• Hệ quả

Khi đặt trong ngoại từ trường B0 thì một hạt nhân (có σ > 0)

sẽ chỉ thực nhận một từ trường hiệu dụng Beff nhỏ hơn B0, với

Beff= (B0– Bi) = B0 (1 – σ)

(chú ý: vì σ ≥ 0 nên Beff≤ B0)

• Ý nghĩa

Khi σ thay đổi → Beff thay đổi và →tần số cộng hưởng ν0 (Hz)

cũng thay đổi → cho các tín hiệu cộng hưởng ở vị trí khác nhau

(khi σ tăng →Beff sẽ giảm và → ν0 cũng giảm)

• Biểu thức cơ bản của nội từ trường

(với σ = hằng số chắn; thay đổi tùy từng hạt nhân ở từng vị trí)

65 66

• 6 C của D-glucose cho 6 tín hiệu ≠ trên phổ 13C-NMR

• 12 H của D-glucose cho 12 tín hiệu ≠ trên phổ 1H-NMR

Do khác nhau về vị trí (môi trường hóa học) → khác σ, nên:

67

1 Năng lượng của xung RF

2 Tần số của xung RF

3 Thời lượng phát xung RF (P1)

4 Cách phát xung [rời + liên tiếp] / [loạt xung]

5 Trình tự xung (chuỗi xung, pulse sequence)

6 Vai trò, ảnh hưởng của tần số xung RF

7 Kênh phát hiện tín hiệu RF

68

Thường chỉ ghi nhận năng lượng của xung trung tâm SFO1

(power level of the central pulse, PLW1; tính bằng Watt)

Ví dụ, khi đo trên máy Bruker 500 (MHz) thì:

• Phổ 13C có PLW1 ~ 88 Watt

• Phổ 1H có PLW1 ~ 22 Watt

Các kỹ thuật viên đo phổ sẽ chú ý cài đặt thông số này

Thông số PLW1 không được khai thác khi giải phổ NMR

Quan sát 1 d dịch chứa rất nhiều phân tử X đang ở trong từ trường

B0 = 11,75 Tesla X gồm hàng chục C và hàng chục H khác nhau

Phát 1 loạt xung có tần số RF = (SFO1 ± ε) MHz vào hệ thống này

• Nếu SFO1 # 500 MHz, chỉ có các hạt nhân 1H trong hệ thống này

cộng hưởng được với xung RF; và mới có thể cho tín hiệu phổ NMR

Nhờ 1 bộ phát hiện phù hợp, ta sẽ thu được phổ 1H-NMR của X

• Nếu SFO1 # 125 MHz, chỉ có các hạt nhân 13C trong hệ thống này

cộng hưởng được với xung RF; và mới có thể cho tín hiệu phổ NMR

Nhờ 1 bộ phát hiện phù hợp, ta sẽ thu được phổ 13C-NMR của X

Tổng quát, 1 xung RF muốn cộng hưởng được với 1 loại hạt nhân

có tỉ số từ hồi chuyển (γ; MHz/T) ở trong ngoại từ trường B0 (Tesla), thì xung RF này phải có tần số ν0 (MHz) thỏa phương trình Larmor:

ν0= γ.B0Tần số cộng hưởng của xung RF với 1H & 13C ớ các B0 khác nhau:

71

Là tần số trung tâm (tần số chủ) ở trục chính giữa của giải xung

Với máy Bruker Avance 500 (11,75 Tesla; Viện Hóa – Hà Nội):

Với t = 10 µs = 10–5 sec, SFO1 này sẽ tạo 1 giải xung trong vùng

(Bề rộng phổ, Spectral Width in Hertz)

72

Với t = 5 µs = 5.10–6 sec, SFO1 sẽ tạo 1 giải xung trong vùng (SFO1 ± 1/t) = (SFO1 ± 106/5) Hz = (125.771.500 ± 2.105) Hz

Bề rộng lý thuyết của giải xung này = PW, với

PW = 2/t = 4.105 Hz = 400 KHz

Bề rộng hữu hiệu của giải xung này thường

# 1/10 PW = 40 KHzLưu ý: SWH của 13C cũng chỉ # 30 KHz (= 240 ppm x 125 MHz)

(Bề rộng phổ, Spectral Width in Hertz)

(Máy 11,75 T; SFO1 # 500,133 MHz; P1 = 10 µ sec)

1

có thể chọn vùng 0.0 → 20.0 ppm -0.5 → 19.5 ppm -1.0 → 19.0 ppm…

1 Cần chọn SWH sao cho SF (= tần số của chuẩn, TMS…)

nằm ở cực bên phải của phổ đồ (δ0,000 ppm).

2 SFO1 không phải lúc nào cũng ở ngay chính giữa phổ đồ.

1 Để ý rằng SFO1 chỉ đi ngay qua trục giữa của phổ thứ 2 mà thôi

(SFO1 không nằm ngay chính giữa phổ 1 & 3)

2 Cả 3 phổ 1, 2, 3 đều chứa tín hiệu SF (của TMS) ở cực phải của phổ

Phổ 13 C-NMR (P1 # 5 µs)

SF SF

76

Xung RF có: * Cường độ PLW1 ~ 22 Watt (ít quan trọng)

* Tần số SFO1 ~ 500.133.500* Hz

* Thời lượng phát P1 ~ 10*µsec

P1 được tính toán sao cho:

a Giải tần số (tạo từ xung RF này) phải có bề rộng PW >> SWH (SWH = bề rộng phổ tính bằng Hz = 20 ppm × 500 MHz = 10 KHz)

b Hạt nhân 1H phát ra tín hiệu cực đại Đây còn gọi là xung (π/2)x (làm cho vectơ từ xoay quanh trục x một góc đúng bằng 90o)

Một xung RF được xác định bởi ít nhất 3 thông số:

cường độ xung, tần số xung và thời lượng phát xung Ví dụ:

Trong phổ NMR, xung RF quan trọng nhất là xung làm cho vectơ

moment từ (M) xoay 900 (từ trục z xoay quanh trục x, xuống trục y)

Lúc này, các hạt nhân hấp thu 1 năng lượng E cực đại

Detector đặt trên mặt phẳng (xy) sẽ ghi nhận được hình chiếu của M

Cường độ của M [hình chiếu trên (xy)] là một hàm dạng sin

xung 90x

78

Xung RF phát trong P1 (= t1µsec) sẽ tạo một giải tần số từ

SFO1 – (1/t) đến SFO1 + (1/t) Hz *Như vậy, giải tần số này có bề rộng PW = 2.(1/t) HzVới hạt nhân 1H, đo trên máy 11,75 Tesla (# máy 500 MHz):

nếu chọn t1< 10 µsec = 10–5 sec, thì:

• Trước hết, PW > 2.105 Hz = 200 KHz

Giá trị PW này đã >> SWH (10 KHz), thỏa yêu cầu (a.)

• Kế đến, để có tín hiệu cực đại (thỏa yêu cầu b.),

cần phải xác định t1 này một cách chính xác

t = 1/4 thời gian tín hiệu đi qua mức zero lần thứ nhì(âm → dương)

4t t

80

Lưu ý: Do detector được đặt trên mặt phẳng (xy)nên chỉ phát hiện được hình chiếu của vectơ M trên (xy)

cực đại (+)

cực đại ( ̶ ) zero lần 1

• Đo liên tiếp 20 lần với 20 giá trị P1 (2, 4, 6… đến 40 µsec)

• Máy sẽ tự động chọn tín hiệu có cường độ (+) mạnh nhất

• Đây là giá trị sơ bộ posmax (chưa chính xác, ví dụ 12 µsec)

• Thử lại với giá trị 4 x posmax (48 ± n.0,2µsec)# xung 360o

• Ghi nhận P360 cho cường độ = 0 (tín hiệu từ ↓ chuyển sang ↑)

Để xác định P1 (của xung 90o) trên phổ 13C-NMR

• Đo liên tiếp 20 lần với 20 giá trị P1 (2, 4, 6… đến 40 µsec)

• Máy sẽ tự động chọn tín hiệu có cường độ (+) mạnh nhất

• Đây là giá trị sơ bộ posmax (chưa chính xác, ví dụ 6 µsec)

• Thử lại với giá trị 4 x posmax (24 ± n.0,2µsec)# xung 360o

• Ghi nhận P360 cho cường độ = 0 (tín hiệu từ ↓ chuyển sang ↑)

(ví dụ P360= 23,2 µsec)

• Giá trị chính xác của P1 = P360/4 = (23,2 : 4 = 5,8 µsec)

Thường, P1 của 13C (~5 µs) # 1/2 P1 của 1H (~10 µs)

thích hợpcho phổ 1H

Bề rộng của giải xung: PW = (2/t) MHz = (2000/t) KHz

Bề rộng hữu hiệu của giải xung ~ PW /10 = (200/t) KHz

PW = Pulse Width >>> SWH = Spectral / Sweep Width

88

Để có phổ NMR, có thể tạo sự cộng hưởng (duy trì tương quan ν0= γ B0) bằng 3 cách

1 cố định tần số RF, thay đổi dần từng từ trường B0 (quét trường trong continuous wave / CW-NMR)

2 cố định từ trường B0, thay đổi dần từng tần số RF (quét xung trong continuous wave / CW-NMR)

3 cố định từ trường B0, dùng 1 loạt xung RF đồng thời (Fourier Transform, FT-NMR)

* Phát liên tiếp từng xung rời rạc (CW-NMR)

Ví dụ - mỗi giây phát 1 xung có tần số nhất định νHz

(2 xung liên tiếp có ∆ν = 1 Hz # tốc độ 1 Hz/s)

* Phát chớp nhoáng hàng loạt xung có ν thay đổi (FT-NMR)

Cùng lúc, phát chớp nhoáng (t ~ chục µsec) hàng loạt xung

t được tính toán sao cho giải xung tạo thành (PW) có khả năng

kích thích mọi hạt nhân (đồng loại, nhưng có thời gian hồi phục ≠)

Nghĩa là, một hạt nhân bất kỳ nào đó cũng sẽ cộng hưởng được

với 1 xung nào đó trong giải xung PW này

X

Khuyết điểm chính:

1 Chậm (ví dụ đo 1H-NMR từ 0 − 12 ppm, máy 100 MHz):

Scan 12 ppm # 1200 Hz cần 600 sec = 10 phút (NS = 1).

2 Độ phân giải thấp (do ∆ ν = 1 Hz).

3 Khó tăng S/N: S/N ↑ k lần, số scan (thời gian) ↑ k2 lần ***

4 Cần nhiều mẫu (để tăng nồng độ, do khó tăng số scan NS).

5 Không số hóa phổ được, ko thực hiện được phổ 2-D, 3-D.

*** nếu S/N tăng 10 lần, thời gian tốn 100 lần

Quét tuần tự bằng từng tần số rời rạc (∆ ν = 1 Hz; B0 cố định) Tốc độ quét (scan) thường chậm (1 đến 2 Hz/sec)

XX

91

Ưu điểm chính:

1 Nhanh (ví dụ đo 1H-NMR từ 0 − 12 ppm, máy 500 MHz):

scan 12 ppm << 1 sec (NS = 1); < 5 sec (NS = 16)

2 Dễ tăng độ phân giải.

3 Dễ cải thiện được tỉ số S/N (Signal / Noise, độ sạch )

S/N tăng k lần, số scan (NS, thời gian) tăng k2 lần !

4 Số hóa, lưu trữ phổ được Thực hiện được phổ 2-D, 3-D.

5 Không cần nhiều mẫu.

Dùng đồng thời hàng loạt tần số để quét (Bo cố định)

Tốc độ quét (scan) thường << 1 Hz/sec

Lưu ý: Mất 3,5 h để đo được 1 phổ có độ phân giải thấp (1 Hz)

• Ở máy FT-NMR, với độ phân giải này (∆ ν = 1 Hz),

→ cần < 1 sec cho 1 lần quét 1 loạt xung 1500 Hz (NS = 1).

→ cần < 8 sec cho NS = 8 (nhanh gấp > 1500 lần !) Với máy 100 MHz, phổ 1H có bề rộng # 15 ppm = 1500 Hz

• Cùng với thuật toán FT, lý thuyết về trình xung chính là

phần tinh hoa của phổ tương tác đa chiều (2D-, 3D-NMR).

• Đây cũng là phần dễ nản nhất, vì nó được xây dựng trên

1 nền tảng toán học cao cấp (cơ học sóng, lượng giác,

đa tích phân, hàm số ảo ) Không thể ng.cứu sâu về NMR

nếu không nắm vững các vấn đề này.

• Tuy nhiên, không nắm vững trình xung thì vẫn

có thể tạm dùng phổ NMR để giải cấu trúc được

96

Trình xung là yếu tố quyết định loại phổ nào sẽ ghi được

(13C-CPD hay DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY )

tham khảo

Một tài liệu cần thiết (online): Hans J Reich, (2013),Structure determination using spectroscopic methods

http://www.chem.wisc.edu/areas/reich/chem605/index.htm

Dù đo cùng 1 máy (cùng B0), các hạt nhân khác loại sẽ cho ra

các tín hiệu cộng hưởng ở những vùng (kênh) khác hẳn nhau

1H sẽ cho các tín hiệu thuộc vùng [500 ± ε] MHz

13C sẽ cho các tín hiệu thuộc vùng [125 ± ε’] MHz

Ở máy 11,75 T

13 1

102CW-NMR 40 MHz (1961)

CW-NMR 60 MHz (1964)

FT-NMR 80 MHz (1979)

nam châm điện

máy in phổ cụm trung tâm

106

Hệ thống nam châm điện của máy FT-NMR 80 MHz (1986)

107Phổ đồ 1H-NMR ghi từ máy CW-NMR (100 MHz)

108

7 NMR Probe

110

112

Σ = 3.0421 sec

NS = 3072 transients Time = Σ *NS = 156 min

• Khi có ngoại từ trường B0: các H này chỉ có 2 hướng xoay

- hoặc thuận chiều với B0 (năng lượng E thấp)

- hoặc ngược chiều với B0 (năng lượng E cao)

• Khi chưa có ngoại từ trường: toàn bộ dân số (ví dụ 2N) các

hạt nhân H này định hướng ngẫu nhiên trong không gian

B0

∆N

E cao, dân số ít hơn

E thấp, dân số nhiều hơn các hạt nhân H

124

Theo định luật Boltzmann thì tổng dân số (= 2N hạt nhân)

sẽ được phân bố thành 2 mức năng lượng E (do I = 1/2)

N α hạt nhân ở mức E α (thấp)

N β hạt nhân ở mức E β (cao).

Sự chênh lệch dân số của 2 mức năng lượng này là ∆N = ε.

∆N được biểu diễn bằng vectơ M cùng chiều với B0.

∆N

Khi tiếp nhận 1 xung RF phù hợp (cộng hưởng được với B0)

thì vectơ M sẽ hấp thu năng lượng và xoay 1 góc 900.

Nếu dùng 1 băng xung RF đủ rộng, ta có thể ghi nhận tín hiệu

của mọi hạt nhân (hoặc 13C, hoặc 1H) trong toàn bộ cấu trúc.

128

A Độ sạch của tín hiệu (Tỉ số S/N)

B Số scan (NS)

C Độ phân giải của phổ

thời gian thu tín hiệu

thời gian chờ lặp lại

thời gian phát xung

số scan

bề rộng phổ # 20 ppm

số điểm ghi trên phổ dung môi đo

độ phân giải FID

tần số “làm việc” của máy

tần số của chuẩn (TMS)

loại probehead dùng ngày giờ đo mẫu

nhiệt độ vùng mẫu đo

công suất của xung hạt nhân đo phổ ( 1 H)

TD = 65536 points (= 64 K; số điểm ghi phổ, Total of Digital points)

FIDRES = SWH/TD (độ phân giải của tín hiệu) = 0,152588 Hz/điểm

AQ = TD/(2.SWH) = (65536/20000) = 1/(2.FIDRES) = (1/0305176)

AQ = 3,2768 sec (thời gian thu nhận, ghi tín hiệu FID)

D1 = 1,0000 sec (thời gian “hồi phục” giữa 2 lần scan)

P1 = 10 µsec (thời lượng phát xung kích thích h nhân)

Độ nhạy của máy (S/N) là tỉ số giữa cường độ (~ chiều cao)

- của tín hiệu (S, Signal) và

- của nhiễu (N, Noise); được chọn lựa theo quy định*

• S/N nói lên “độ sạch của tín hiệu”; đặc biệt trên phổ 13C-NMR

(chứ chưa nói đến độ tinh khiết của mẫu)

• S/N càng lớn: phổ / tín hiệu càng sạch (thường: vài trăm)

• S/N quá bé (khó ph.biệt S & N, mất tín hiệu yếu) thường do:

- nồng độ mẫu đo quá thấp (quá ít mẫu / quá kém tan)

- NS quá nhỏ # thời gian đo phổ quá ít, quá vội

Thông số quan trọng / phổ 1H-NMR: Độ phân giải (Res.)

Thông số quan trọng / phổ 13C-NMR: Tỉ lệ S/N

S/N thay đổi theo khá nhiều yếu tố như

- cường độ từ trường B0, - tần số đo SFO1 của máy,

- loại hạt nhân & [C] mẫu, - số lần quét mẫu NS

- loại ống đo, nhiệt độ đo, - loại probe & kỹ thuật phát hiện

Với loại máy (B0) & loại hạt nhân đã xác định (vd hạt nhân 13C) thì:

C của mẫu đo

số lần scan NS

Để tính S/N, có thể sử dụng chức năng SpectView ngay trên máy

TEB (MW = 162) có 3 nhóm ×đủ 4 loại C(3CH3+ 3CH2+ 3CH + 3CIV)Phổ 1H cho cả triplet, quartet và doublet !

Thường thực hiện định kỳ để kiểm tra máy, theo SOP* trên phổ 1H;

NS 16, của triethylbenzen (TEB) dd 1% /CDCl3 Tín hiệu được chọn:

vạch cao nhất (trong 4 vạch) của quartet(>CH2, ở δH~ 2.55 ppm)

75 50

37 25

1.3

30 mg TEB (C ~ 3,33%)

33 2.6

NS 1600

25 2,0

NS 800

50 16.5

1.2

20 mg TEB (C ~ 2,22%)

4.0 1.3

Cùng điều kiện trên, khi đo phổ 13C-NMR của TEB (trong CDCl3),

ta còn thấy sự ảnh hưởng của nồng độ mẫu đo và NS đến S/N:

thì (S/N) sẽ tăng (1,67)3/2 # 2,3 lần (hơn gấp đôi).

Muốn (S/N) tăng 10 lần thì C mẫu phải tăng 10 lầnhoặc NS (tức thời gian đo) phải tăng gấp 100 lần!

• Và vì (S/N) ∝k.C.(NS)1/2

• Vì

a Vì không thể tăng [C] mãi được (dd mẫu đo bị đục hoặc tủa)

b Nên phải tăng NS (số lần scan mẫu ∝ tăng thời gian đo mẫu)

Đây chính là điều mà CW-NMR không giải quyết được (quá lâu!)

1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của 1 saponin (trích)

Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của 1 triterpen biosid có MW 752

Chú ý: cả 4 hình đều chỉ từ một phổ duy nhất, và S/N là như nhau!

NS là số lần thực hiện việc [chuẩn bị + kích thích + thu tín hiệu] trong một thời gian nhất định (~ Σ thời gian đo mẫu)

Phổ 1H: NS # hàng chục* Phổ 13C: NS # hàng ngàn* • Khi đo phổ NMR (từ đây chỉ nói về FT-NMR), nếu:

- NS quá nhỏ: mất tín hiệu yếu; S/N kém, res kém (phổ xấu)

- NS quá lớn : tốn thời gian đo mẫu (TTNS quá lớn)

• Lưu ý rằng, trong lý lịch phổ, ta thường gặp:

ở phổ 1H-NMR: d1 ~ 1,0 sec aq ~ 3,3 sec NS 16*

TT16~ 70 sec (> 1 phút để đo một phố 1H)

ở phôµµ 13C-NMR: d1 ~ 2,0 sec aq ~ 1,1 sec NS 1024 (1K)

TT1K~ 3200 sec (> 50 phút để đo một phố 13C)

• Khi đo phổ NMR (từ đây chỉ nói về FT-NMR), nếu:

- NS quá nhỏ: sẽ bỏ sót tín hiệu yếu, hoặc S/N kém (phổ xấu)

- NS quá lớn : tốn thời gian đo mẫu (TTNS quá lớn)

• Vì NS phụ thuộc vào γ, Ab%, độ nhạy & thời gian hồi phục d1

của hạt nhân, nên NS trong phổ 13C sẽ > NS trong phổ 1H-NMR:

Thực tế, ở máy 500 MHz, khi đo phổ các hợp chất có MW < 2 KDa,

• 1H-NMR: với NS # 16 là quá đủ để phân tích phổ (Σ ~70 sec)

• 13C-NMR: phải đo với NS 256, 512, 1024, 4K, 5K… tùy trường hợp (ví dụ, với NS 1024 ~ 1K, tốn Σ # 50 phút/mẫu)

• Trên phổ 13C, chỉ nhìn đường nền (base line) cũng có thể ước lượngđược tỉ số S/N (chấp nhận được hay không)

• Trên phổ 1H, bằng mắt-thường, không thể ước lượng được điều này

• Để định kỳ kiểm tra chất lượng của máy, người ta dùng chức năng (sẵn có trong máy) để tính toán S/N theo SOP chung*

Như đã nói, với phổ 1H-NMR, người ta chỉ quan tâm đến độ phân giải

(Res, resolution) của phổ (vì NS ~ 16, còn S/N thường đã rất lớn, OK)

Với phổ 13C-NMR, người ta lại thường chỉ quan tâm đến NS và S/N

(Res thường không đáng ngại, vì SWH # 30 KHz, khó overlapped)

Ở phổ 13C-NMR, S/N phụ thuộc vào NS & vào nồng độ mẫu đo

Với 1 ống d dịch mẫu duy nhất, tất nhiên NS tăng thì S/N sẽ tăng

Với nhiều lần đo khác nhau (về máy, về loại mẫu, nồng độ mẫu…)

thì chưa hẳn NS lớn hơn (tức là đo lâu hơn) sẽ cho tỉ số S/N tốt hơn

Wh/2

Khả năng phân giải (res.) của máy là khả năng phân biệt được

sự chênh lệch tần số (∆ν, Hz) của 2 điểm tín hiệu kế cận nhau

Độ phân giải (resolution) của máy được định nghĩa là tỉ số giữa

[bề rộng của vạch phổ ở nửa độ cao] và [tần số của máy ghi]

(ko có đơn vị)

Thường chọn vạch phổ là tín hiệu 1HMe/Me-CHO hay –CH/o-diclorobenzen(CDCl3, tube 5 mm)

Hiện nay, res # (5 – 10).10–10

Res là vấn đề mà các KTV đo máy quan tâm tính toán & cài đặt

Trên phổ, thường chỉ ghi độ phân giải của tín hiệu FID (FIDRES)

Với định nghĩa: FIDRES = (SWH/TD) Hz/point

Khi đo phổ 1H và 13C, thường cài đặt TD = 64K = 65536 điểm

• phổ 1H có SWH ~ 10000 Hz nên FIDRES # 0,15 Hz

• phổ 13C có SWH ~ 30000 Hz nên FIDRES # 0,50 Hz

Trị số của res càng nhỏ, phổ có độ phân giải càng cao (càng tốt)

→độ phân giải của phổ 1H thường cao hơn phổ 13C khoảng 3 lần

Tham khảo

Khi TD quá nhỏ, sẽ không có đủ điểm (point) để mô tả peak

→ Độ phân giải của FID và của phổ (res.) càng kém

Số điểm ghi phổ (TD, np) càng nhiều, thì giá trị FIDRES càng giảm

→ Độ phân giải của FID và của phổ (res.) càng tăng

RES (Hz)

0.4798360.152588

FIDRES (Hz)

65.536 (64 K)65.536 (64 K)

FIDRES = SWH/TD và RES = 2 ×FIDRES

Ví dụ với máy Bruker 500 MHz

6 Tần số cộng hưởng của hạt nhân* 41