Phân lập, định tên khoa họ một số vi sinh vật gây bệnh trắng nhũn thân (ie ie disease) ở rong sụn (kappaphyus alvarezii, kappaphyus striatum) bị bệnh ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - BÙI ĐÌNH LÃM PHÂN LẬP, ĐỊNH TÊN KHOA HỌC MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRẮNG NHŨN THÂN (Ice-Ice disease) Ở RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striatum) BỊ BỆNH Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2011 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205300371000000 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - BÙI ĐÌNH LÃM PHÂN LẬP, ĐỊNH TÊN KHOA HỌC MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRẮNG NHŨN THÂN (Ice-Ice disease) Ở RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striatum) BỊ BỆNH Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Đặng Diễm Hồng Hà Nội - Năm 2011 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đặng Diễm Hồng, Trưởng phịng Cơng nghệ tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, người định hướng tận tình dẫn tơi suốt q trình thực luận văn Tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, Các thầy giáo tồn thể cán Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tham gia giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Qua đây, gửi lời cảm ơn chân thành đến tồn thể cán Phịng Công nghệ Tảo - Viện Công nghệ sinh học, ủng hộ giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè ln bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho học tập, nghiên cứu hồn thành ln văn Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2011 Học viên Bùi Đình Lãm i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu luận văn khoa học tơi Các số liệu sử dụng tham khảo có nguồn trích dẫn rõ ràng, kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực Bùi Đình Lãm ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Viết đầy đủ CĐAS Cường độ ánh sáng EM Effective Microorganisms LG Làm giàu NB Nước biển TĐTT Tốc độ tăng trọng TNT Trắng nhũn thân TSL Tổng sản lượng TT Trực tiếp VSV Vi sinh vật iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………… i LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………………… ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT……………………………………… iii MỤC LỤC…………………………… …………………………………… iv MỞ ĐẦU…………………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………… 1.1 Giới thiệu Rong Sụn……………………………………………… 1.2 Đặc điểm sinh học Rong Sụn…………………………………… 1.3 Nguồn gốc Rong Sụn Việt Nam………………………………… 1.4 Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng Rong Sụn…………… 1.4.1 Thành phần hóa học Rong Sụn…………………………… 1.4.1.1 Nước……………………………………………………………… 1.4.1.2 Gluxit………………………………………………………… 1.4.1.3 Protein…………………………………………………………… 10 1.4.1.3 Lipit……………………………………………………………… 10 1.4.1.5 Sắc tố ……………………………………………………… 10 1.4.1.6 Chất khoáng ……………………………………………… 10 1.4.1.7 Enzyme…………………………………………………………… 11 1.4.2 Giá trị dinh dưỡng Rong Sụn………………………………… 11 1.5 Tình hình nghiên cứu phát triển nghề trồng Rong Sụn 12 1.5.1 Tình hình nghiên cứu phát triển nghề trồng Rong Sụn…… … 12 1.5.2 Tình hình nghiên cứu phát triển nghề trồng Rong Sụn……… 15 1.6 Ứng dụng Rong Sụn……………………………………………… 17 iv 1.6.1 Trong lĩnh vực thực phẩm……………………………………… 17 1.6.2 Trong y dược dược phẩm……………………………………… 19 1.6.3 Trong công nghiệp……………………………………………… 20 1.6.4 Rong Sụn tác dụng xử lý môi trường………………………… 20 1.7 Các yếu tố tác động đến sản lượng Rong Sụn 21 1.7.1 Dấu hiệu bệnh……………………………………………… 22 1.7.2 Các nhóm nguyên nhân 22 1.7.2.1 Yếu tố ngoại sinh 22 1.7.2.2 Yếu tố nội sinh 26 B B B B 1.8 Các biện pháp phòng ngừa bệnh ice-ice disease………………………… 28 1.8.1 Chọn tạo giống khác chịu bệnh bệnh………………… 28 1.8.2 Các biện pháp kỹ thuật trồng……………………………… 28 1.8.3 Biện pháp xử lý rong bị bệnh………………………………… 29 1.8.4 Sử dụng vi sinh vật hữu hiệu 30 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 32 2.1 Mẫu Rong nước biển……………………………………………… 32 2.2 Phân lập vi khuẩn……………………………………………………… 32 2.2.1 Môi trường phân lập……………………………………………… 32 2.2.2 Phân lập vi khuẩn từ mẫu Rong Sụn…………………………… 33 2.3 Phương pháp giữ giống……………………………………………… 33 2.3.1 Giữ giống 40C………………………………………………… 33 2.3.2 Phương pháp giữ giống -200C………………………………… 33 2.4 Phương pháp xác định Gram vi khuẩn KOH 3% 33 2.5 Phương pháp sốc nhiệt để kiểm tra khả sinh bào tử…………… 34 2.6 Phương pháp phân loại vi khuẩn kít chuẩn sinh hóa…………… 34 2.6.1 Phương pháp phân loại vi khuẩn kít chuẩn sinh hóa API20NE ……………………………………………………………… 34 2.6.2 Phương pháp Phân loại vi khuẩn kít chuẩn sinh hóa 36 P P P P v API50CH ……………………………………………………………… 2.7 Phân tích trình tự nucleotide phần gen 16S rRNA…………… 37 2.7.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số…………………………… 38 2.7.1.1 Phương pháp không sử dụng Kit…………………………… 38 2.7.1.2 Tách chiết ADN theo kít………………………………… 40 2.7.2 Điều kiện cho phản ứng PCR…………………………………… 41 2.7.3 Tinh sản phẩm PCR 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………… 44 3.1 Kết phân lập 44 3.2 Kết phân loại chủng vi khuẩn phân lập được………………… 53 3.3 Kết định tên kỹ thuật đọc so sánh trình tự nucleotit…… 57 3.3.1 Tách chiết ADN tổng số chủng vi khuẩn……………… 57 3.3.2 Kết nhân đoạn gen 16S rRNA ……………………………… 59 3.3.3 Kết nhân gen 16S rRNA mẫu 4(2)6LG………………… 60 3.4 Kết xử lý trình tự nucleotit……………………………………… 61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………… 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 65 PHỤ LỤC…………………………………………………………………… 73 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ……………………………………… 93 vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Thành phần hoá học Rong Sụn Bảng Sự thay đổi hàm lượng protein theo tháng năm 10 Bảng Các nước trồng Rong Sụn giới 12 Bảng Sản lượng Rong Sụn Kappaphycus alvarezii Kappaphycus striatum nước giới Bảng Diện tích, số hộ trồng sản lượng Rong Sụn Ninh thuận Bảng Một số ứng dụng điển hình carageenan công nghiệp thực phẩm Bảng Màu sắc khác thí nghiệm sử dụng test TRP Bảng Trình tự mồi nhân gen 16S rRNA lồi vi khuẩn sử dụng Bảng Giá trị độ mặn mẫu nước biển thu thập đợt Bảng 10 Đặc điểm chủng vi khuẩn phân lập đợt thu mẫu 10/2008 Bảng 11 Đặc điểm chủng vi khuẩn đợt thu mẫu 7/2009 Bảng 12 Kết phân loại kit chuẩn sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập Bảng 13 Bảng tổng kết tần suất xuất chủng vi khuẩn phân lập từ đợt thu mẫu (10/2008 7/2009) Bảng 14 Danh sách chủng tách chiết ADN tổng số kit 13 16 19 36 38 45 46 50 54 56 57 Bảng 15 Kết định tên khoa học chủng phân lập kít chuẩn sinh hóa API kỹ thuật đọc so sánh trình tự nucleotit đoạn gen 16S rRNA sử dụng nghiên cứu vii 62 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình Hình ảnh hai lồi Rong Sụn Hình Sơ đồ vịng đời Rong Sụn Hình Cấu trúc phân tử dạng carrageenan Hình Hình ảnh mẫu Rong Sụn bị bệnh trắng nhũn thân (ice-ice diease) 22 Hình Hình ảnh thực vật phụ sinh phát triển kí sinh Rong Sụn 26 Hình Quy trình tách ADN tổng số từ sinh khối VSV khơng sử dụng Kit 39 Hình Quy trình tinh sản phẩm PCR Kit 42 Hình Hình thái mẫu rong thu thập đợt 44 Hình Hình thái mẫu rong thu thập đợt 45 Hình 10 Kết tách chiết ADN tổng số theo Kit Hình 11 Kết nhân đoạn gen 16S rRNA mẫu 2(5)-13 LG, 1(1)8 LG mẫu 5(2)-9 TT, 4(1)-6TT Hình 12 Kết tinh sản phẩm PCR mẫu: 2(5)-13 LG, 1(1)8 LG, 5(2)-9 TT 4(1)6TT Hình 13 Kết nhân gen 16S rRNA mẫu 4(2)-6 LG với cặp mồi Universal F R 58 59 60 60 Hình 14 Cây phát sinh chủng loại loài thuộc chi Pseudomonas 61 Hình 15 Cây phát sinh chủng loại loài thuộc chi Vibrio 61 viii