Khoảng 100 loại carotenoid tự nhiên đã được báo cáo từ năm 2004 - 2018 Maoka T, 2009.Các nghiên cứu tổng hợp về carotenoid cũng cho thấy hóa học lập thể của một số cấu trúc phức tạp của
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÁ VỠ TẾ BÀO ĐẾN HIỆU SUẤT TÁCH CHIẾT BCAROTENE TỪ NẤM MEN RHODOTORULA MUCILAGINOSA GVHD: TS PHẠM KHÁNH DUNG SVTH: TRẦN THỊ MINH THẢO SKL009609 Tp Hồ Chí Minh, tháng 12/2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO CHẤT LƯỢNG CAO NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2022 – 18116111 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÁ VỠ TẾ BÀO ĐẾN HIỆU SUẤT TÁCH CHIẾT 𝜷-CAROTENE TỪ NẤM MEN RHODOTORULA MUCILAGINOSA GVHD: TS PHẠM KHÁNH DUNG SVTH: TRẦN THỊ MINH THẢO THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 12/2022 i 18116111 iii LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp phá vỡ tế bào đến hiệu suất tách chiết 𝜷 – carotene từ nấm men Rhodotorula mucilaginosa” kết trình cố gắng hướng dẫn tận tình thầy cô Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới q thầy giúp đỡ em hồn thành đồ án Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô TS Phạm Khánh Dung – giảng viên hướng dẫn đồ án em Em xin cám ơn cô hướng dẫn, dạy cho em kiến thức quý giá truyền tải nhiều tài liệu cần thiết suốt trình em thực hiện, động viên tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt đề tài Em xin cám ơn cô ThS Hồ Thị Thu Trang – phụ trách phịng thí nghiệm taọ điều kiện cho em thực thí nghiệm thật tốt, tận tình giúp đỡ hỗ trợ thiết bị, vật tư Em xin chân thành cảm ơn nhà trường, Quý Thầy Cơ Khoa Hố học Cơng nghệ thực phẩm nói chung, quý thầy cô môn Công nghệ thực phẩm nói riêng dành nhiều tâm huyết, dạy trao tri thức quý giá để em không hoàn thành đề tài tốt nghiệp trường mà cịn giúp em hồn thiện thân vốn kiến thức phong phú chuyên ngành Trong trình thực đề tài, dù em cố gắng học hỏi từ nhiều nguồn kiến thức thực tế nhiêu chưa đủ với vốn kiến thức đa chiều chuyên ngành, em nhiều thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp từ Qúy Thầy Cơ để em học hỏi thêm nhiều kiến thức bổ ích, phát triển áp dụng vào điều kiện thực tế, phục vụ công việc sau Em xin chân thành cảm ơn! iv v vi vii viii ix x 4.1.3 Thí nghiệm 2: Sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ tế bào nấm men, thu 𝜷 − carotene Để phá vỡ tế bào nấm men, phương pháp siêu âm tiến hành Tế bào khô sau bổ sung dung môi tách chiết aceton đưa vào bể siêu âm siêu âm mốc thời gian khác Sau thời gian siêu âm phá vỡ tế bào, 𝛽 − carotene khỏi tế bào, hấp thụ vào dung mơi acetone xác định qua độ hấp thụ quang 480nm Kết hàm lượng 𝛽 − carotene thu khoảng thời gian siêu âm khác trình bày hình 4.3 Hình 4.3: Mối quan hệ tổng lượng 𝛽 − carotene thời gian dùng sóng siêu âm 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút Có thể thấy, hiệu suất 𝛽 − carotene phụ thuộc vào thời gian đánh sóng siêu âm chúng tỉ lệ thuận với Ở trường hợp siêu âm 30 phút, hàm lượng 𝛽 − carotene thu 160.53𝜇g, cao mốc thời gian Ngoài thấy, siêu âm 25 phút, hàm lượng 𝛽 − carotene không chênh lệch nhiều so với siêu âm 30 phút (158.2 𝜇g) Điều chứng tỏ thời gian phá vỡ tế bào nấm men không chênh lệch nhiều điều kiện khảo sát, hiệu suất thu 𝛽 − carotene gần Dựa vào kết biểu đồ thấy, hàm lượng 𝛽 − carotene tỉ lệ thuận với thời gian dùng phương pháp phá vỡ tế bào nấm men Khi sử dụng phương pháp, thời gian tăng khả thu 𝛽 − carotene tăng, khơng có trường hợp 31 ngoại lệ Hàm lượng 𝛽 − carotene thu cao 160.8𝜇g điều kiện sử dụng sóng siêu âm 30 phút 4.2 Bàn luận Ảnh hưởng phương pháp phá vỡ tế bào nấm men đến hiệu suất thu 𝛽 − carotene: So sánh phương pháp bao gồm sử dụng glass beads, kết hợp glass beads với sóng siêu âm sử dụng sóng siêu âm, thấy hiệu thu 𝛽 − carotene không phụ thuộc vào việc sử dụng nhiều phương pháp lúc Cường độ thiết bị không phù hợp, thời gian dùng thiết bị không đồng thí nghiệm,… kết hợp glass beads sóng siêu âm nguyên nhân khiến hiệu suất thu 𝛽 − carotene không đạt giá trị cao Ảnh hưởng thời gian phá vỡ tế bào nấm men đến hiệu suất thu 𝛽 − carotene: Trong trường hợp phá vỡ tế bào nấm men cho thấy hàm lượng 𝛽 − carotene phụ thuộc vào thời gian Khi thời gian lâu, khả phá vỡ tế bào nấm men tăng từ thu hàm lượng 𝛽 − carotene cao 32 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN Sau trình nghiên cứu thực đề tài, rút kết luận sau: - Dung môi sử dụng đề tài (acetone) cho hiệu tách chiết 𝛽 − carotene cao từ nấm men R mucilaginosa - Điều kiện tách chiết 𝛽 − carotene tối ưu không phụ thuộc vào việc sử dụng kết hợp nhiều thiết bị phương pháp phá vỡ tế bào nấm men - Thời gian phá vỡ nấm men có ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng 𝛽 − carotene thu - Thời gian dài khả tế bào nấm men bị phá vỡ cao, nhiên kết hợp nhiều phương pháp khác thời gian dài (30 phút) hàm lượng 𝛽 − carotene không đạt giá trị cao - Kết hàm lượng 𝛽 − carotene thu cao 160.8𝜇g điều kiện sử dụng sóng siêu âm 30 phút Hiệu suất thấp thí nghiệm 66.72 𝜇g dùng glass beads phá vỡ tế bào nấm men 15 phút Nhìn chung, thực thí nghiệm thu 𝛽 − carotene từ R mucilaginosa, hiệu khơng hồn tồn phụ thuộc vào thời gian hay phương pháp phá vỡ tế bào nấm men Việc tách chiết 𝛽 − carotene từ tế bào nấm men bước đầu chưa thể mang lại hiệu cao tính kinh tế nhiên xem chiếm ưu so với việc tách chiết từ thực vật tính tốn hàm lượng carotenoid thu tính theo khối lượng khô Một số tác động nguyên nhân chủ quan thao tác sai, mẫu bị nhiễm khuẩn,…từ bước thí nghiệm ngun nhân khiến nguyên liệu bị hao hụt thời gian khảo sát bị ngắn lại, chi phí cao khơng kinh tế Đề tài hồn thành khối lượng cơng việc số vấn đề cần nghiên cứu thêm: - Khảo sát loại dung môi hữu có khả phá vỡ tế bào nấm men, điều kiện thời gian - Khảo sát tỉ lệ dung môi : chất khô tỉ lệ phối trộn dung mơi có khả phá vỡ tế bào nấm men hiệu 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Allen CM, Smith AM, Clinton SK, Schwartz SJ Tomato consumption increases lycopene isomer concentrations in breast milk and plasma of lactating women J Am Diet Assoc 2002 Allen L, Prentice A, Caballero B Encyclopedia of Human Nutrition (Third Edition), Academic Press, 2013 Bernardo Dias Ribeiro & Daniel Weingart Barreto & Maria Alice Zarur Coelho Technological Aspects of β − Carotene Production Food and Bioprocess Technology, 1, 693, 2011 Boileau TWM, Boileau AC, Erdman JW., Jr Bioavailability of all-trans and cis isomers of lycopene Exp Biol Med 2002 Britton G, Liaaen-Jensen S, Pfander H Carotenoids: a colourful history, Carote Nature, 2017 Britton G, Liaaen-Jensen S, Pfander H Carotenoids handbook Basel: Birkhäuser,2004 Britton G, Liaaen-Jensen S, Pfander H Carotenoids volume 3: biosynthesis and metabolism Basel: Birkhäuser; 1998 Britton G, Liaaen-Jensen S, Pfander H Carotenoids volume 4: natural functions Basel: Birkhäuser, 1998 Buzzini P, Innocenti M, Turchetti B et al Carotenoid profiles of yeasts belonging to the genera Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, and Sporidiobolus Can J Microbiol, 2007 10 Buzzini P, Martini A, Gaetani M et al Optimization of carotenoid production by Rhodotorula graminis DBVPG 7021 as a function of trace element concentration by means of response surface analysis Enzyme Microb Technol, 2005 11 Callon C, Duthoit F, Delbès C, et al Stability of microbial communities in goat milk during a lactation year: molecular approaches Systematic and Applied Microbiology, 30(7),547–560, 2007 12 Đàm Sao Mai Phụ gia thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 2012 13 Damasceno JL, Dos Santos RA, Barbosa AH, Casemiro LA, Pires RH, Martins CHG Risk of Fungal Infection to Dental Patients, ScientificWorldJournal, 2017 14 Delia B Rodriguez-Amaya, Ph.D A Guide to Carotenoid Analysis in Foods Printed in the United States of America, 2001 34 15 Đỗ Văn Chương Phụ gia bao bì thực phẩm NXB Lao động, 2010 16 Duboc de Almeida GM, Costa SF, Melhem M, et al Rhodotorula spp isolated from blood cultures: clinical and microbiological aspects Medical Mycology, 2008 17 Eklund MW, Spinelli J, Miyauchi D, Groninger H Characteristics of yeasts isolated from Pacific crab meat, Applied Microbiology, 13(6),985 – 990, 1965 18 Ferruzzi M, Nguyen ML, Sander LC, Rock CL, Schwartz SJ Analysis of lycopene geometrical isomers in biological microsamples by liquid chromatography with coulometric array detection J Chromatogr B, 2001 19 Food and Nutrition Board, Institute of Medicine 𝛽 − Carotene and other carotenoids Dietary reference intakes for vitamin C, vitamin E, selenium, and carotenoids Washington, D.C.: National Academy Press, 2000 20 Gallicchio L, Boyd K, Matanoski G, et al Carotenoids and the risk of developing lung cancer: a systematic review Am J Clin Nutr, 2008 21 Gardini F, Suzzi G, Lombardi A, et al A survey of yeasts in traditional sausages of Southern Italy FEMS Yeast Research, 1(2), 161 – 167, 2001 22 Giuseppe Maiani et al Carotenoids: actual knowledge on food sources, intakes, stability and bioavailability and their protective role in humans Molecular Nutrition and Food Research, 2009 23 Hadley CW, Clinton SK, Schwartz SJ The consumption of processed tomato products enhances plasma lycopene concentrations in association with a reduced lipoprotein sensitivity to oxidative damage J Nutr, 2003 24 Hof H Pilze im Darm – das Mykobiom des Darms Z Gastroenterol, 2017 25 Ito M, Yamano Y, Tode C, Wada A Carotenoid synthesis; retrospect and recent progress Arch Biochem Biophys, 2009 26 Jeana Gross Pigments in Vegetables: Chlorophylls and Carotenoids Springer US, 1991 27 Kajikazawa T, Sugita T, Takashima M, Nishikawa A Detection of pathogenic yeasts from processed fresh edible sea urchins sold in a fish market Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi, 48(4),169 – 172, 2007 28 Kitazawa T, Ishigaki S, Seo K, Yoshino Y, Ota Y Catheter-related bloodstream infection due to Rhodotorula mucilaginosa with normal serum (1→3)-β-D-glucan level J Mycol Med, 28(2), 393–395, 2018 Jun 35 29 Korhola M, Hakonen R, Juuti K, Edelmann M, Kariluoto S, Nyström L, Sontag- Strohm T, Piironen V Production of folate in oat bran fermentation by yeasts isolated from barley and diverse foods J Appl Microbiol, 117(3), 679–689, 2014 Sep 30 Larone DH Medically Important Fungi—A Guide to Identification 3rd edition Washington, DC, USA: American Society for Microbiology, 1995 31 Las Heras-Vazquez FJ, Mingorance-Cazorla L, Clemente-Jimenez JM, Rodriguez-Vico F Identification of yeast species from orange fruit and juice by RFLP and sequence analysis of the 5.8S rRNA gene and the two internal transcribed spacers FEMS Yeast Research, 3(1), – 9, 2003 32 Libkind D, Brizzio S, Ruffini A, Gadanho M, van Broock M, Sampaio JP Molecular characterization of carotenogenic yeasts from aquatic environments in Patagonia, Argentina Antonie van Leeuwenhoek, 84(4), 313–322, 2003 33 Maoka T, Etoh H Biological Antioxidation Mechanism: Quenching of Peroxynitrite, in Japanese food, in Functional Food Ingredicents and Nutraceuticals Processing Technologies (2nd Ed) John Shi ed Boca Raton: CRC Press, 2016, 589–607 34 Maoka T Carotenoids in marine animals Mar Drugs, 2011 35 Maoka T Recent progress in structural studies of carotenoids in animals and plants Arch Biochem Biophys, 2009 36 Marova I, Carnecka M, Halienova A et al Production of carotenoid-/ergosterol- supplemented biomass by red yeast Rhodotorula glutinis grown under external stress Food Technol Biotechnol, 2010 37 Matsuno T Aquatic animal carotenoids Fish Sci, 2001 38 Miceli MH, Díaz JA, Lee SA Emerging opportunistic yeast infections The Lancet Infectious Diseases, 2011 39 Nagahama T, Hamamoto M, Horikoshi K Rhodotorula pacifica sp nov., a novel yeast species from sediment collected on the deep-sea floor of the north-west Pacific Ocean International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56(1), 295– 299, 2006 40 Nguyen ML, Schwartz SJ Lycopene In: Lauro GL, Francis FJ, editors Natural Food Colorants: Science and Technology New York: Marcel Dekker, Inc, 2000 41 Nunes JM, Bizerra FC, Ferreira RC, Colombo AL Molecular identification, antifungal susceptibility profile, and biofilm formation of clinical and environmental Rhodotorula species isolates Antimicrob Agents Chemother, 2013 36 42 Rao AV, Rao LG Carotenoids and human health Pharmacol Res 2007 43 Sajilata MG, Singhal RS, Kamat MY The Carotenoid Pigment Zeaxanthin-A Review Compr Rev FOOD Sci FOOD Saf, 2008 44 Sanjay KR, Kumaresan N, Manohar B et al Optimization of carotenoid production by Aspergillus carbonarius in submerged fermentation using a response surface methodology Int J Food Eng, 2007 45 Senses-Ergul S, Ágoston R, Belák Á, Deák T Characterization of some yeasts isolated from foods by traditional and molecular tests International Journal of Food Microbiology, 108(1), 120 – 124, 2006 46 Staib F Rhodotorula in der Galle des Menschen Zbl Bakt I Abt Orig, 172, 142– 146, 1958 47 Staib F Rhodotorula, ihr Vorkommen im menschlichen Körper Zbl Bakt I Abt Orig, 167, 86–93, 1956 48 Strausbaugh LJ, Sewell DL, Tjoelker RC, Heitzman T, Webster T, Ward TT, Pfaller MA Comparison of three methods for recovery of yeasts from hands of healthcare workers J Clin Microbiol, 34(2), 471–473, 1996 Feb 49 Talsma, E F., Brouwer, I D., Verhoef, H., Mbera, G N., Demir, A Y., Boy, E., Zimmermann, M B., Melse-Boonstra, A Reply to S.A Tanumihardjo et al., American Journal of Clinical Nutrition, 2016 50 Tournas VH, Heeres J, Burgess L Moulds and yeasts in fruit salads and fruit juices Food Microbiology, 23(7),684 – 688, 2006 51 University of Wisconsin - Madison, USA 52 US Department of Agriculture, Agricultural Research Service USDA Nutrient Database for Standard Reference; Release 28, 2015 53 Venturini ME, Oria R, Blanco D Microflora of two varieties of sweet cherries: Burlat and Sweetheart Food Microbiology, 19(1), 15 – 21, 2002 54 Verwaal R, Wang J, Meijnen JP et al High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous Appl Environ Microbiol, 2007 55 Wang CH, Hsueh PR, Chen FL, Lee WS Breakthrough fungemia caused by Rhodotorula mucilaginosa during anidulafungin therapy J Microbiol Immunol Infect, 52(4),674–675, 2019 37 56 Wang XD Carotenoids In: Ross CA, Caballero B, Cousins RJ, Tucker KL, Ziegler TR, eds Modern Nutrition in Health and Disease 11th ed: Wolter Kluwer Lippincott Williams & Wilkins 2014 57 Weber D, Grune T The contribution of β − carotene to vitamin A supply of humans Molecular Nutrition & Food Research, 2012 58 Wirth F, Goldani LZ Epidemiology of Rhodotorula: an emerging pathogen Interdiscip Perspect Infect Dis, 2012 59 Wiemann P, Soukup AA, Folz JS et al Coin: Co-inducible nitrate expression system for secondary metabolites in Aspergillus nidulans Fungal Biol Biotechnol, 2018 60 Xue SJ, Chi Z, Zhang Y, Li YF, Liu GL, Jiang H, Hu Z, Chi ZM Fatty acids from oleaginous yeasts and yeast-like fungi and their potential applications Crit Rev Biotechnol, 38(7), 1049 – 1060, 2018 61 Zaas AK, Boyce M, Schell W, Lodge BA, Miller JL, Perfect JR Risk of fungemia due to Rhodotorula and antifungal susceptibility testing of Rhodotorula isolates Journal of Clinical Microbiology, 41(11), 5233 –5235, 2003 38 PHỤ LỤC Phụ lục A: Tổng lượng 𝜷 − carotene tương ứng với điều kiện phá vỡ tế bào nấm men Bảng pl 1: Tổng lượng 𝛽 − carotene tương ứng với điều kiện phá vỡ tế bào nấm men Điều kiện khảo sát Khối Thể OD OD lượng tế tích mẫu blank bào khơ mẫu (g) (mL) Tổng lượng Tổng lượng carotenoid carotenoid (mg/g) (μg/g) Dùng glass beads, không siêu âm 0.554 0.137 0.1 0.06672 66.72 15 phút 0.561 0.137 0.1 0.06784 67.84 0.558 0.137 0.1 0.06736 67.36 0.691 0.137 0.1 0.08864 88.64 0.711 0.137 0.1 0.09184 91.84 0.715 0.137 0.1 0.09248 92.48 0.738 0.137 0.1 0.09616 96.16 0.736 0.137 0.1 0.09584 95.84 0.741 0.137 0.1 0.09664 96.64 0.833 0.137 0.1 0.11136 111.36 0.838 0.137 0.1 0.11216 112.16 0.841 0.137 0.1 0.11264 112.64 0.754 0.137 0.1 0.09872 98.72 0.755 0.137 0.1 0.09888 98.88 0.758 0.137 0.1 0.09936 99.36 0.845 0.137 0.1 0.11328 113.28 0.841 0.137 0.1 0.11264 112.64 20 phút 25 phút 30 phút Glass beads + siêu âm 15 phút 20 phút 39 25 phút 30 phút 0.843 0.137 0.1 0.11296 112.96 1.013 0.137 0.1 0.14016 140.16 1.011 0.137 0.1 0.13984 139.84 1.014 0.137 0.1 0.14032 140.32 1.023 0.137 0.1 0.14176 141.76 1.021 0.137 0.1 0.14144 141.44 1.026 0.137 0.1 0.14224 142.24 0.811 0.137 0.1 0.10784 107.84 0.815 0.137 0.1 0.10848 108.48 0.818 0.137 0.1 0.10896 108.96 1.106 0.137 0.1 0.15504 155.04 1.104 0.137 0.1 0.15472 154.72 1.105 0.137 0.1 0.15488 154.88 1.122 0.137 0.1 0.1576 157.6 1.127 0.137 0.1 0.1584 158.4 1.128 0.137 0.1 0.15856 158.56 1.141 0.137 0.1 0.16064 160.64 1.138 0.137 0.1 0.16016 160.16 1.142 0.137 0.1 0.1608 160.8 Siêu âm, không glass beads 15 phút 20 phút 25 phút 30 phút Phụ lục B: Một số hình ảnh q trình làm thí nghiệm 40 Phụ lục B1: R mucilaginosa nuôi 4°C môi trường YPD2 agar Phụ lục B2: R mucilaginosa nuôi môi trường YPD10 ngày 41 Phụ lục B3: R mucilaginosa nuôi môi trường YPD10 ngày thứ Phụ lục B4: Dịch tế bào sau ly tâm 42 Phụ lục B5: Tế bào khô sau sấy Phụ lục C: Kết xử lý thống kê SPSS thí nghiệm khảo sát điều kiện phá vỡ tế bào nấm men Phụ lục C1: Kết trường hợp sử dụng glass beads để phá vỡ tế bào nấm men 43 Phụ lục C2: Kết trường hợp sử dụng glass beads kết hợp sóng siêu âm để phá vỡ tế bào nấm men Phụ lục C3: Kết trường hợp sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ tế bào nấm men 44 S K L 0