Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường. Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Lệ Quyên NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC KỸ THUẬT MỚI ỨNG DỤNG ĐỂ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Burkholderia pseudomallei TRONG CÁC MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG VÀ NGỒI MƠI TRƯỜNG Chun ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420101.07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2023 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: TS Trịnh Thành Trung PGS TS Bùi Thị Việt Hà Phản biện: PGS TS Phan Quốc Hoàn Phản biện: PGS TS Lê Thị Hội Phản biện: TS Trần Huy Hoàng Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN vào hồi ngày tháng năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thư viện Tri thức số, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Burkholderia pseudomallei nguyên gây nhiễm trùng melioidosis-bệnh truyền nhiễm cấp tính có tỉ lệ tử vong cao nhanh Việt Nam coi nước nằm tâm điểm lưu hành melioidosis Tuy nhiên, số liệu điều tra tỷ lệ melioidosis nước ta xa so với số ca nhiễm dự đốn (chỉ khoảng 1,5%) Trong chẩn đốn melioidosis, ni cấy vi sinh xem “tiêu chuẩn vàng” Tuy nhiên, xét nghiệm vi sinh bệnh viện gặp nhiều khó khăn địi hỏi người xét nghiệm phải đào tạo có kinh nghiệm việc nhận dạng B pseudomallei Hơn nữa, xét nghiệm thường quy B pseudomallei kéo dài từ 3-5 ngày, bệnh nhân melioidosis sốc nhiễm khuẩn huyết tử vong 48 nhập viện không điều trị kháng sinh kịp thời Điều đặt yêu cầu cấp thiết cần phải có quy trình xét nghiệm nhanh melioidosis để phục vụ cho điều trị Bên cạnh đó, B pseudomallei tồn ngồi mơi trường nên việc hiểu dịch tễ học vi khuẩn có ý nghĩa với sức khỏe cộng đồng Hiện nay, nuôi cấy qPCR TTSS1 hai phương pháp dùng điều tra B pseudomallei từ mẫu môi trường Trong đó, ni cấy theo hướng dẫn chuẩn có thành công việc phát B pseudomallei độ nhạy thấp qPCR cho độ nhạy cao kết dương tính nhận định ban đầu khu vực ô nhiễm vi khuẩn mà thay cho nuôi cấy vi khuẩn để khẳng định có mặt vi khuẩn vừa phục vụ nghiên cứu Vì vậy, phát triển phương pháp ni cấy có độ nhạy cao điều tra B pseudomallei ngồi mơi trường cần quan tâm nghiên cứu Đề tài “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật ứng dụng để phát vi khuẩn Burkholderia pseudomallei mẫu bệnh phẩm lâm sàng ngồi mơi trường” thực nhằm phát triển kỹ thuật phục vụ xét nghiệm nhanh melioidosis lâm sàng, điều tra vi khuẩn B pseudomallei ngồi mơi trường với độ nhạy cao Mục tiêu nghiên cứu: - Phát triển ứng dụng kỹ thuật miễn dịch xét nghiệm nhanh melioidosis từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng - Phát triển ứng dụng kỹ thuật ni cấy có độ nhạy cao để điều tra vi khuẩn B pseudomallei từ mẫu mơi trường Tính luận án: - Phát triển thành công WC/Hcp1-ELISA sử dụng kháng nguyên B pseudomallei VTCC70157 thuộc ST46 phổ biến Việt Nam để xét nghiệm melioidosis có độ nhạy độ đặc hiệu cao (98,4% 95,1%) Kỹ thuật ứng dụng xét nghiệm melioidosis BVĐK tỉnh Hà Tĩnh BV TƯ Huế - Phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy làm giàu hai bước (TBSS-C50 48 + EM 96 giờ) điều tra B pseudomallei đất với tỷ lệ phát cao gần lần so với hướng dẫn chuẩn (TBSSC50 48 giờ) đánh giá qPCR phân lập thạch Ashdown Kỹ thuật ứng dụng để điều tra có mặt B pseudomallei ngồi mơi trường Triệu Sơn (Thanh Hóa) Sóc Sơn (Hà Nội) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN Burkholderia pseudomallei VÀ BỆNH NHIỄM TRÙNG MELIOIDOSIS 1.1.1 Giới thiệu chi vi khuẩn Burkholderia loài B pseudomallei Chi vi khuẩn Burkholderia thuộc họ Burkholderiaceae, Burkholderiales, lớp Betaproteobacteria, ngành Proteobacteria (Vio et al., 2020) Một lồi chi Burkholderia mơ tả Burkholderia caryophylli (trước gọi Phytomonas caryophylli) - gây bệnh thối thân thực vật (Dowson, 1929) Năm 1942, loài vi khuẩn nhà vi sinh vật học người Mỹ Walter Burkholder phân loại lại vào chi Pseudomonas nhóm II với tên gọi Pseudomonas caryophylli (Burkholder, 1942) Năm 1992, Yabuuchi cs phân loại chi Pseudomonas nhóm II thành chi Burkholderia gồm loài (Yabuuchi et al., 1992) Là loài thuộc chi Burkholderia, B pseudomallei B mallei tác nhân gây bệnh cho người động vật; B caryophylli B gladioli gây bệnh thực vật; lồi B cepacia theo mơ tả ban đầu tác nhân gây bệnh thối củ hành tây; riêng loài B solanacearum gây bệnh thực vật B pickettii gây bệnh hội người sau chuyển sang chi Ralstonia (Eberl and Vandamme, 2016) Loài B cepacia định loài chuẩn (Depoorter et al., 2016) Thuộc chi Burkholderia, loài B pseudomallei vi khuẩn gây nhiễm trùng melioidosis Whitmore Krishnaswami mô tả lần Rangoon, Myanmar vào năm 1912 (Whitmore and Krishnaswami, 1912) Do độc lực cao, khả gây bệnh nguy hiểm cho người động vật với mối lo ngại việc lây truyền qua đường khí dung, B pseudomallei Trung tâm Kiểm soát Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ (US CDC) phân loại tác nhân gây khủng bố sinh học cấp độ vi sinh vật nguy hiểm loại B Trên phát sinh chủng loại, B pseudomallei với loài B mallei B thailandensis có quan hệ gần gũi với Trong B mallei ký sinh bắt buộc động vật CDC xếp vào nhóm tác nhân đe dọa sinh học cấp độ B, B thailandensis phân bố tự nhiên đất nước không gây bệnh cho người động vật 1.1.2 Bệnh nhiễm trùng melioidosis Melioidosis ghi nhận lần Rangoon, Myanmar (Whitmore and Krishnaswami, 1912) Các đường lây truyền melioidosis (i) qua tiếp xúc trực tiếp vết trầy xước da với đất nước nhiễm khuẩn; (ii) qua hít phải hạt bụi hạt khí dung có chứa vi khuẩn; (iii) qua đường tiêu hóa ăn uống phải thực phẩm/nước nhiễm khuẩn Melioidosis bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm gây tử vong cao nhanh (trong vịng 48 nhập viện) bệnh nhân khơng chẩn đoán sớm điều trị kịp thời kháng sinh (Wiersinga et al., 2012) Biểu lâm sàng melioidosis vô đa dạng, từ nhiễm trùng huyết cấp tính đến bệnh lý mạn tính, nhiễm trùng tiềm ẩn khởi phát sau nhiều thập kỷ phơi nhiễm (Maharjan et al., 2005) Do vậy, melioidosis gọi với thuật ngữ “the great mimicker” nhằm ám bệnh có triệu chứng lâm sàng khơng điển hình thường bị nhầm lẫn với bệnh truyền nhiễm khác lao phổi sốt thương hàn (Vidyalakshmi et al., 2008) Tỷ lệ tử vong melioidosis dao động từ 30-70%, tùy thuộc vào điều kiện y tế quốc gia bệnh nhân có bị nhiễm trùng huyết hay không (Vidyalakshmi et al., 2008; Puthucheary et al., 2009) 1.2 NGHIÊN CỨU VỀ B pseudomallei VÀ MELIOIDOSIS TẠI VIỆT NAM Bằng chứng khả sống hoại sinh ngồi mơi trường tự nhiên B pseudomallei Vaucel chứng minh Việt Nam vào năm 1937 (Vaucel 1937) Khoảng 20 năm sau, Chambon công bố chứng phân lập trực tiếp B pseudomallei mẫu môi trường miền Nam Việt Nam (Chambon 1955) Năm 1961, Luong phân lập hai chủng mẫu nước ruộng rau muống miền Nam Việt Nam (Luong and Kim 1961) Cùng với miền Nam,nghiên cứu khác công bố phân lập B pseudomallei từ mẫu đất thu ruộng lúa ngoại thành Tp HCM từ năm 1992-1998 (Parry et al 1999) Dự đoán gần phân bố B pseudomallei toàn giới cho thấy tính chất tự nhiên đất phần lớn lãnh thổ Việt Nam phù hợp cho tồn B pseudomallei (Limmathurotsakul et al 2016) Ca nhiễm melioidosis người Việt Nam phát vào năm 1925 bệnh nhân nữ mang thai tháng thứ năm, sống Tp HCM (Pons and Advier 1927) Các ca nhiễm melioidosis sau cơng bố Menard vào năm 1928 Tp HCM năm 1930 Hà Nội (Pons 1930) Sau đó, trường hợp nhiễm melioidosis xác nhận nuôi cấy, bao gồm trường hợp liên quan đến tai nạn giao thông, công bố Huế miền Bắc (Vaucel 1937) Năm 1947, 28 ca nhiễm melioidosis cấp tính, bán cấp tính mạn tính mơ tả bệnh viện miền Nam (Alain et al 1949) Từ năm 1951-1953, trường hợp viêm phổi nhiễm melioidosis chẩn đoán bệnh viện miền Nam Việt Nam Pháp Tất trường hợp công dân Pháp cư trú đóng quân khu vực Đông Dương (Duroux 1965) Từ năm 1948-1954, khoảng 100 ca melioidosis báo cáo số 400.000 quân Pháp đóng Việt Nam, Lào Campuchia (Sanford 1978) Trong số lượng lớn ca melioidosis liên quan đến Việt Nam thời gian công bố, thơng tin bệnh báo cáo người Việt Năm 1991, luận án Đại học Y Hà Nội mô tả 16 ca melioidosis bệnh viện Hà Nội thời gian từ 1980-1990 (Trinh et al 2018) Sau đó, Phung cs (1993) công bố 6,4-31,8% người dân thuộc vùng dân cư sống ngoại thành Hà Nội có huyết dương tính với xét nghiệm IHA Năm 1999, nghiên cứu hồi cứu công bố ca melioidosis từ 3.653 ca cấy máu bệnh nhân sốt nhập viện bệnh viện bệnh nhiệt đới lớn Tp HCM vào năm 1992-1998 (Parry et al 1999) Năm 2008, nghiên cứu hồi cứu khác BV Bạch Mai báo cáo 55 ca melioidosis xác nhận nuôi cấy từ năm 1997-2005 Dựa vào địa cư trú bệnh nhân, nghiên cứu kết luận melioidosis phân bố rộng xảy 18 số 25 tỉnh phía Bắc (Phuong et al 2008) Từ đề tài “Thiết lập mạng lưới Quốc gia nghiên cứu chẩn đoán điều trị bệnh melioidosis Việt Nam” (RENOMAB), Trung cs (2018) công bố 70 ca melioidosis tháng bệnh viện Bắc Trung Bộ Theo kết điều tra, melioidosis chiếm tỉ lệ 3,4-10,2% số ca cấy máu dương tính Mặc dù RENOMAB đạt kết quan trọng, nhiều khu vực khác Việt Nam, gánh nặng thực melioidosis Bắc Trung Bộ cần tiếp tục nghiên cứu điều tra (Trinh et al 2018) 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM VI KHUẨN B pseudomallei TỪ MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG 1.3.1 Các phương pháp xét nghiệm phụ thuộc nuôi cấy Bệnh phẩm nuôi cấy trực tiếp môi trường đĩa thạch thường quy chọn lọc Ashdown nhằm phân lập khuẩn lạc vi khuẩn nghi ngờ B pseudomallei Đối với bệnh phẩm tạp nhiễm, bước làm giàu môi trường dịch thể chọn lọc thực trước cấy trải đĩa thạch Sau đó, khuẩn lạc nghi ngờ B pseudomallei định danh kỹ thuật khác nhau, tùy điều kiện phịng xét nghiệm 1.3.1.1 Định danh hình thái khuẩn lạc tế bào Nuôi cấy thường quy B pseudomallei phòng xét nghiệm vi sinh gặp nhiều khó khăn vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng chậm, dẫn đến bị loài sinh trưởng nhanh lấn át thường bị bỏ sót Hơn nữa, khuẩn lạc B pseudomallei có hình thái đa dạng dẫn đến nhầm lẫn nhận dạng Do vậy, nhận dạng khuẩn lạc B pseudomallei đòi hỏi kỹ thuật viên đào tạo thường thao tác với B pseudomallei 1.3.1.2 Định danh phương pháp thường quy Các hệ thống định danh B pseudomallei thường quy sử dụng rộng rãi phòng xét nghiệm API 20NE, VITEK 2, Phoenix MicroScan WalkAway 96 Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy xét nghiệm định danh nhầm B pseudomallei (Lowe et al., 2006, Kiratisin et al., 2007, Deepak et al., 2008) 1.3.1.3 Định danh phương pháp phân tử Hiện nay, MALDI-TOF MS đánh giá công cụ linh hoạt hiệu để xác định nhanh B pseudomallei sở liệu phù hợp liên tục cập nhật (Wang et al., 2016) Bên cạnh phân tích trình tự gen rRNA 16S phần thiếu định danh nhiều chi vi khuẩn, việc sử dụng gen phân loại chi Burkholderia có nhiều hạn chế, đặc biệt lồi B cepacia complex Trong đó, gen recA sử dụng rộng rãi hệ thống phân loại vi khuẩn (Karlin et al., 1995) cơng cụ hiệu định danh lồi B cepacia complex (Mahenthiralingam et al., 2000) Ngoài ra, phương pháp sinh học phân tử khác nghiên cứu để định danh B pseudomallei Novak cs (2006) phát triển real-time PCR khơng dựa tính đặc hiệu lý thuyết mà dựa vào đa dạng phân bố chủng Đoạn trình tự đích có kích thước 115 bp thuộc gen orf2 cụm TTSS1 phân biệt B pseudomallei với lồi khác (Novak et al., 2006) Năm 2020, kỹ thuật PCR đẳng nhiệt (iiPCR) khuếch đại gen đích bimA (BPSS1492) để định danh B pseudomallei Chua cs (2020) phát triển 1.3.1.4 Định danh phương pháp miễn dịch Steinmetz cs (1999) phát triển kỹ thuật ngưng kết miễn dịch latex sử dụng MAb3015 IgG1 đánh giá hiệu định danh nhanh chủng B pseudomallei phân lập từ vùng địa lý khác cho thấy 100% chủng B pseudomallei cho phản ứng dương tính mạnh mẽ với latex MAb3015, khơng có phản ứng chéo (Steinmetz et al., 1999) Năm 2014, Duval cs phát triển thành công thương mại latex test sử dụng MAb4B11 định danh nhanh B pseudomallei có độ nhạy 98,7% (Duval et al., 2014) Tuy nhiên, latex test có hạn chế phân biệt B pseudomallei B thailandensis phân lập từ môi trường (Songsri et al., 2018) 1.3.2 Các phương pháp xét nghiệm không phụ thuộc nuôi cấy 1.3.2.1 Xét nghiệm melioidosis phương pháp sinh học phân tử Nhiều kỹ thuật PCR phát nhanh B pseudomallei từ mẫu bệnh phẩm nhà khoa học Úc Thái Lan phát triển (Haase et al., 1998; Kunakorn et al., 2000; Gal et al., 2005; Supaprom et al., 2007; Meumann et al., 2006) 1.3.2.2 Xét nghiệm melioidosis phương pháp miễn dịch Xét nghiệm nhanh kỹ thuật ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) phát kháng thể kháng B pseudomallei huyết người bệnh phát triển từ năm 1965 sử dụng phổ biến bệnh viện Tuy nhiên, độ nhạy đặc hiệu phương pháp IHA khơng cao, cho kết dương tính giả phản ứng chéo với số kháng ngun từ lồi có quan hệ gần gũi với B pseudomallei B mallei B thailandensis (Tiyawisutsri et al., 2005; Gilmore., 2007) Vì vậy, phương pháp IHA dùng để xác định khả phơi nhiễm với vi khuẩn B pseudomallei khơng có giá trị chẩn đốn melioidosis tỷ lệ huyết dương tính với IHA người dân sinh sống vùng dịch bệnh lưu hành cao ELISA kỹ thuật xét nghiệm nhanh, có độ nhạy cao để phát có mặt protein đặc hiệu mẫu cần phân tích Trong xét nghiệm melioidosis, nhiều nghiên cứu cơng bố kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch có độ nhạy độ đặc hiệu cao (Chantratita et Chủng B pseudomallei VTCC 70157 (thuộc ST46- phồ biến Việt Nam) sử dụng để chuẩn bị kháng nguyên toàn tế bào kháng nguyên tái tổ hợp AhpC, Hcp1 GroEL1 2.1.2 Mẫu huyết Bộ huyết để phát triển phương pháp ELISA: 185 mẫu huyết thu BVĐK tỉnh: Bắc Giang (n= 13), Nghệ An (n=76), Hà Tĩnh (n=13) Bình Định (n= 83) khoảng thời gian từ tháng 1/2018-12/2020 Mẫu huyết chia thành nhóm: (1) nhóm dương tính với melioidosis khẳng định phương pháp nuôi cấy (n=63); (2) nhóm dương tính với nhiễm khuẩn khác khẳng định ni cấy (n=62) (3) nhóm khỏe mạnh (n=60) Bộ huyết để ứng dụng phương pháp ELISA: 1.011 mẫu thu BVĐK tỉnh Hà Tĩnh (n=511) BV TƯ Huế (n=500) vào tháng 10-11/2020 Huyết thu ngày thứ đến sau bệnh nhân nhập viện với biểu nghi ngờ nhiễm melioidosis 2.1.3 Mẫu môi trường Mẫu đất để phát triển phương pháp nuôi cấy: tháng 6-7/2018, 80 mẫu đất lấy 16 điểm, gồm điểm Bắc Trung Bộ (nơi có nhiều ca melioidosis: Thanh Hóa (n=3), Hà Tĩnh (n=6)); điểm Nam Trung Bộ (nơi chưa có ca melioidosis: Quảng Ngãi (n=2), Bình Định (n=3), Phú n (n=1) Khánh Hịa (n=1)) Mẫu mơi trường cho ứng dụng phương pháp nuôi cấy: (1) Mẫu nước ruộng lúa Triệu Sơn-Thanh Hóa: Năm 2019, 800 mẫu nước ruộng lúa thu 100 điển khác (mỗi điểm cách 2,5 m) vào thời điểm thời gian canh tác lúa (27/2; 10/4; 9/5; 23/5; 11/6; 16/7; 15/8 20/9) huyện Triệu Sơn-Thanh Hóa (2) Mẫu đất nước khu vực gia đình trẻ em tử vong melioidosis (huyện Sóc Sơn-Hà Nội) thu vào đợt: 11 Đợt (17/11/2019): mẫu đất vườn độ sâu 10 cm, mẫu nước giếng từ giếng (giếng tắm A, giếng chăn nuôi B giếng ăn C) mẫu nước uống gia đình nạn nhân Đợt (23/11/2019): 46 mẫu đất vườn 10 điểm quanh giếng A độ sâu khác (10-50 cm); 40 mẫu đất ruộng ruộng lúa độ sâu 30 cm; 26 mẫu nước giếng từ giếng A sau phút bơm từ phút đến 240; 39 mẫu nước giếng từ giếng B, C 11 giếng hộ hàng xóm; 30 mẫu nước ao từ 10 ao xung quanh khu đất nhà nạn nhân 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chuẩn bị kháng nguyên toàn tế bào (WC) 2.2.2 Phương pháp chuẩn bị kháng nguyên tái tổ hợp 2.2.3 Phương pháp ELISA chẩn đốn nhanh melioidosis 2.2.4 Phương pháp ni cấy trực tiếp vi khuẩn B pseudomallei 2.2.5 Phương pháp nuôi cấy làm giàu vi khuẩn B pseudomallei 2.2.6 Phương pháp real-time PCR TTSS1 2.2.7 Phương pháp phân tích MLST 2.2.8 Thống kê xử lý số liệu 12 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM NHANH MELIOIDOSIS TỪ MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG 3.1.1 Nghiên cứu phát triển kỹ thuật ELISA xét nghiệm nhanh melioidosis Các protein kháng nguyên tái tổ hợp AhpC, Hcp1 GroEL1 mã hóa gen BPSL 2096, BPSS1498 BPSL 2697 biểu thành dòng E coli BL21(DE3) pLysS với kích thước tương ứng 20,7, 22,3 59,1 kDa nồng độ 19,0; 9,9 21,4 μg/mL Hiệu xét nghiệm WC/AhpC/Hcp1/GroEL1-ELISA đánh giá với 185 mẫu huyết Kết cho thấy giá trị OD trung bình nhóm bệnh nhân melioidosis cao đáng kể so với hai nhóm cịn lại (P 0,05) Xét nghiệm Hcp1-ELISA cho giá trị OD trung bình cao nhóm meliodosis (1,916), sau WC-ELISA (1,530), GroEL1-ELISA (0,920) AhpC-ELISA (0,680) 14 Hình 3.5 Giá trị OD490 xét nghiệm WC/Hcp1/AhpC/GroEL1-ELISA sử dụng 185 mẫu huyết nhóm (1) bệnh nhân melioidosis (ME, n=63); (2) bệnh nhân nhiễm khuẩn khác (NKK, n=62) người khỏe mạnh (KM, n=60) Nét đứt ngang thể giá trị cut-off xét nghiệm ELISA đảm bảo độ đặc hiệu >95% Đường cong ROC biểu diễn mối tương quan giá trị cut-off độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm ELISA Diện tích đường cong ROC xét nghiệm WC-ELISA (0,982) Hcp1-ELISA (0,957) cao so với GroEL1-ELISA (0,854) AhpC-ELISA (0,832) Giá trị cut-off ước tính để tất xét nghiệm ELISA đạt độ đặc hiệu 95% Ở ngưỡng cut-off 0,60, độ nhạy độ đặc hiệu WC-ELISA tương ứng 93,7% 97,5% Ở ngưỡng cut-off 0,50, độ nhạy độ đặc hiệu Hcp1-ELISA 87,3% 96,7% Ở ngưỡng cut-off 0,68, độ nhạy độ đặc hiệu GroEL1-ELISA 61,9% 95,1% Ở ngưỡng cut-off 0,6, độ nhạy độ đặc hiệu AhpC-ELISA 57,1% 95,1% Khi kết hợp hai kết xét nghiệm WC-ELISA Hcp1ELISA, độ nhạy độ đặc hiệu xét nghiệm chẩn đoán huyết tương ứng 98,4% 95,1% Vì vậy, xét nghiệm kết hợp WC/Hcp1- 15 ELISA lựa chọn để chẩn đoán huyết bệnh nhân nghi nhiễm melioidosis 3.1.2 Đánh giá hiệu xét nghiệm melioidosis WC/Hcp1ELISA 3.1.2.1 Kết ứng dụng WC/Hcp1-ELISA xét nghiệm melioidosis BV TƯ Huế Xét nghiệm WC/Hcp1-ELISA phát 41/500 (8,2%) mẫu huyết thu BV TƯ Huế dương tính với melioidosis (Bảng 3.6) Trong đó, số huyết dương tính với melioidosis xét nghiệm WC-ELISA 41 (8,2%) mẫu cao đáng kể so với Hcp1-ELISA 24 (4,8%) mẫu (p0,05), 39 (7,6%) mẫu dương tính WC-ELISA 34 (6,7%) mẫu dương tính Hcp1ELISA (Bảng 3.6) Tuy nhiên, có 21 (61,7%) mẫu huyết dương tính Hcp1-ELISA dương tính với WC-ELISA Bảng 3.6 Kết xét nghiệm ELISA huyết thu thập BV TƯ Huế BVĐK tỉnh Hà Tĩnh dương tính với melioidosis Trong số 511 bệnh nhân thu huyết thanh, có 14 (2,8%) bệnh nhân dương tính với B pseudomallei xét nghiệm nuôi cấy Cả hai xét độc lập WC-ELISA Hcp1-ELISA phát 13/14 (92,8%) trường hợp nuôi cấy xác nhận nhiễm melioidosis Xét nghiệm kết hợp WC/Hcp1-ELISA phát 14/14 (100%) ca nhiễm melioidosis xác nhận nuôi cấy vi sinh (Bảng 3.7) Bảng 3.7 Các ca dương tính với melioidosis BV TƯ Huế BVĐK tỉnh Hà Tĩnh khẳng định ni cấy dương tính với xét nghiệm ELISA 17 Bên cạnh đó, nghiên cứu theo dõi tình trạng 38 bệnh nhân âm tính với melioidosis ni cấy khơng xét nghiệm ni cấy có huyết dương tính với WC/Hcp1ELISA sau tháng xét nghiệm huyết Kết 38 bệnh nhân chia thành nhóm (i) bệnh nhân xác nhận lại nuôi cấy nhiễm trùng melioidosis (n = 2; 5,3%), (ii) bệnh nhân tử vong (n = 9; 23,7%), (ii) bệnh nhân không khỏe mạnh (n = 17; 44,7%), (iv) người khỏe mạnh (n = 10; 26,3%) Giá trị OD trung bình WC-ELISA Hcp1-ELISA khơng cho thấy khác biệt đáng kể nhóm Đáng ý nhóm xác nhận lại ni cấy nhiễm trùng melioidosis (n=2), bệnh nhân không định xét nghiệm nuôi cấy vi sinh thời gian nằm viện bệnh nhân âm tính với B pseudomallei xét nghiệm nuôi cấy vi sinh Như vậy, xét nghiệm kết hợp WC/Hcp1-ELISA phát số lượng nhiều bệnh nhân dương tính với melioidosis nhập viện sau tượng thời tiết khắc nghiệt 3.2 PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT PHÁT HIỆN B pseudomallei NGOÀI MƠI TRƯỜNG 3.2.1 Nghiên cứu phát triển kỹ thuật ni cấy phát vi khuẩn B pseudomallei ngồi mơi trường Với kỹ thuật làm giàu bước, giá trị CT trung bình dịch làm giàu TBSS-C50 144 (CT 27,49) EM 144 (CT 30,46) thấp đáng kể so với dịch làm giàu TBSS-C50 48 (CT 32,55) EM 48 (CT 33,48) Bên cạnh đó, tỉ lệ mẫu dương tính với realtime PCR dịch làm giàu 144 nhiều so với dịch làm giàu 48 (Hình 3.6A) 18 A B Hình 3.6 Hiệu kỹ thuật làm giàu vi khuẩn B pseudomallei từ 80 mẫu đất đánh giá real-time PCR TTSS1 (A) phân lập (B) Mẫu dương tính với real-time PCR TTSS1 trình bày dạng dấu chấm với giá trị CT tương ứng trục hoành Với kỹ thuật làm giàu hai bước, dịch làm giàu TBSS-C50 48 + EM 96 (CT 21,93) EM 48 + TBSS-C50 96 (CT 24,18) có tải lượng B pseudomallei cao vượt trội thể qua giá trị CT trung bình thấp đáng kể so với dịch làm giàu bước TBSS-C50 144 (CT 27,49) EM 144 (CT 30,46) Tỉ lệ dương tính dịch làm giàu loại môi trường kết hợp khác không đáng kể, 51% (41/80) mẫu dương tính TBSS-50 48 + EM 96 so với 55% (44/80) mẫu dương tính EM 48 + TBSS-C50 96 Đồng thời, tải lượng B pseudomallei loại dịch làm giàu khơng khác biệt với giá trị CT trung bình 21,93 24,18 Cùng kỹ thuật làm giàu hai bước, dịch làm giàu đơn môi trường TBSS-C50 48 + TBSS-C50 96 (CT 31,33) cho hiệu làm giàu so với dịch làm giàu kết hợp TBSS-C50 EM Bên cạnh đó, tỉ lệ mẫu dương tính ni cấy dịch làm giàu TBSS-C50 48 + EM 96 (58%) cao so với dịch làm giàu lại TBSS-C50 48 (9,8%) TBSS-C50 144 (25,5%) TBSS-C50 48 + TBSSC50 96 (31,4%) Phân lập vi khuẩn B pseudomallei thực với 408 dịch làm giàu 51 mẫu đất dương tính từ xét nghiệm real-time PCR 19 TTSS1 Lượng mẫu 100 µL cấy trải đĩa thạch Ashdown, ủ 40oC ngày Kết cho thấy tỷ lệ phân lập vi khuẩn B pseudomallei từ dịch làm giàu TBSS-C50 48 + EM 96 (30/51; 58%) cao so với dịch làm giàu lại (Hình 3.6B) Kết tóm tắt sau: (i) nuôi cấy làm giàu TBSS-C50 EM 144 làm tăng khả sinh trưởng B pseudomallei tăng số mẫu dương tính so với ni cấy làm giàu TBSS-C50 48 theo hướng dẫn chuẩn (ii) làm giàu hai bước (TBSSC50 48 + EM 96 giờ) giúp cho B pseudomallei sinh trưởng mạnh mẽ cho số mẫu dương tính ni cấy cao gấp lần so với TBSSC50 48 3.2.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy làm giàu hai bước điều tra có mặt B pseudomallei ngồi mơi trường 3.2.2.1 Điều tra có mặt vi khuẩn B pseudomallei nước ruộng lúa huyện Triệu Sơn-tỉnh Thanh Hóa Điều tra tần xuất bắt gặp vi khuẩn B pseudomallei 800 mẫu nước ruộng lúa (100 mẫu/thời điểm) cho thấy có biến động lớn thời điểm thu thập mẫu (Hình 3.8A) Số mẫu dương tính tăng nhiệt độ khu vực lấy mẫu tăng (Hình 3.8B) Tổng số mẫu nước dương tính với B pseudomallei thu từ tháng đến tháng 258/400 (64,5%), cao gấp gần lần so với tổng số mẫu dương thu từ tháng đến tháng (90/400, 22,5%) Nhiệt độ mơi trường trung bình tỉnh Thanh Hóa từ tháng 2-5 22,75oC thấp đáng kể so với tháng 6-9 (29,1oC) Ghi nhận cho thấy nhiệt độ mơi trường có mối tương quan với tần xuất bắt gặp vi khuẩn B pseudomallei nước ruộng lúa 20 Kỹ thuật nuôi cấy làm giàu hai bước phát 348/800 (43,5%) mẫu dương tính với B pseudomallei, kỹ thuật ni cấy trực tiếp phát 13/800 (1,6%) mẫu dương tính với B pseudomallei Đáng ý, kỹ thuật nuôi cấy trực tiếp phát vi khuẩn B pseudomallei tháng 7, với số mẫu dương tính 4, 7/100 mật độ trung bình 32; 25 158 CFU/mL Kết chứng minh nhiệt độ ảnh hưởng khơng đến tần xuất bắt gặp mà cịn đến mật độ vi khuẩn Hình 3.8 (A) Số mẫu nước dương tính với vi khuẩn B pseudomallei thời điểm lấy mẫu kỹ thuật nuôi cấy trực tiếp làm giàu hai bước; (B) Nhiệt độ lượng mưa trung bình tháng tỉnh Thanh Hóa năm 2018 20 chủng B pseudomallei gồm 13 chủng vi khuẩn B pseudomallei phân lập trực tiếp từ mẫu nước chủng phân lập từ dịch nuôi cấy làm giàu, chủng phân lập từ đất ruộng (năm 2015) lựa cho cho phân tích MLST Kết cho thấy chủng thuộc ST gồm ST541 (n=1), ST543 (n=2), ST533 (n=3), ST542 (n=5) ST1994 (là ST mới) (n=9) Tại thời điểm lấy mẫu, vị trí mẫu gần có xu hướng xuất ST giống điểm xa có xu hướng gặp ST khác Mặc dù mẫu phân lập ngẫu nhiên chủng, có 20 chủng lựa chọn cho phân tích MLST, kết cho thấy đa dạng 21 dòng vi khuẩn B pseudomallei lưu hành nước ruộng lúa khu vực lấy mẫu hẹp 3.2.2.2 Điều tra có mặt vi khuẩn B pseudomallei ngồi mơi trường huyện Sóc Sơn-Tp Hà Nội Tháng 11/2019, Trung tâm Y tế Sóc Sơn báo cáo trường hợp trẻ em tử vong gia đình huyện Sóc Sơn (Tp Hà Nội) nhiễm khuẩn B pseudomallei vòng tháng Điều tra nguồn lây nhiễm vi khuẩn B pseudomallei cho thấy 3/3 (100%) mẫu nước giếng khoan A dương tính với B pseudomallei ni cấy trực tiếp, nuôi cấy làm giàu real-time PCR TTSS1, mẫu nước giếng B, C mẫu đất âm tính Sau phát B pseudomallei nước giếng khoan A, đợt thu mẫu lần thứ tiến hành nhằm mở rộng điều tra nguồn ô nhiễm Theo thông tin cung cấp, giếng khoan A khoan vào năm 2010 Sau năm, gia đình cải tạo khu vườn xung quanh giếng khoan A (phía sau nhà) cách phủ lên vườn lớp đất, dẫn đến làm miệng lỗ khoan nằm bề mặt đất khoảng 80 cm Cuối năm 2018, phận côn thu đường ống hút máy bơm nước bị hỏng sửa chữa Nhưng sau đó, miệng lỗ khoan khơng bịt kín, việc tạo điều kiện cho nước mưa kéo theo hạt đất bề mặt bị nhiễm B pseudomallei chảy vào mạch nước ngầm qua miệng lỗ khoan bị hở Để kiểm tra giả thuyết này, nghiên cứu tập trung vào việc thu mẫu nước giếng A đất vườn xung quanh giếng A Kết cho thấy 26/26 (100%) mẫu nước giếng A 27/46 (58,7%) mẫu đất vườn 8/10 (80%) điểm dương tính với B pseudomallei phương pháp nuôi cấy Điều chứng minh giả thuyết B pseudomallei bị kéo theo với đất bề mặt vào mạch nước ngầm qua miệng giếng khoan khơng đậy kín mùa mưa năm sau, tháng 4/2019, trùng thời điểm phát bệnh tử vong đứa trẻ Ngoài ra, 22 5/40 (12,5%) mẫu đất từ 2/8 (25%) ruộng lúa dương tính với B pseudomallei kỹ thuật ni cấy làm giàu hai bước Nuôi cấy định lượng phát mẫu đất vườn vị trí thu mẫu có mật độ B pseudomallei trung bình 406 CFU/g đất (dao động từ 12 đến 746 CFU/g đất) (Bảng 3.21) Bảng 3.21 Kết ni cấy xác định có mặt B pseudomallei đất nước thu thập gia đình nạn nhân khu vực xung quanh thơn Đơ Lương, xã Bắc Sơn, huyện Sóc Sơn, Hà Nội Mối quan hệ di truyền chủng B pseudomallei từ ngồi mơi trường lâm sàng phân tích, kết cho thấy 20 chủng thuộc ST 541, chủng phân lập từ giếng A (n=7), đất vườn quanh giếng A (n=6), đất ruộng (n=5) bệnh nhân (n=2) 23 KẾT LUẬN Phát triển ứng dụng kỹ thuật miễn dịch xét nghiệm nhanh melioidosis từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng Phát triển thành công kỹ thuật WC/Hcp1-ELISA sử dụng kháng nguyên từ chủng B pseudomallei VTCC 70157 thuộc ST46 phổ biến Việt Nam để xét nghiệm melioidosis người Việt có độ nhạy độ đặc hiệu cao tương ứng 98,4% 95,1% WC/Hcp1-ELISA phát 52/511 (10,2%) 41/500 (8,2%) mẫu huyết dương tính với melioidosis BVĐK tỉnh Hà Tĩnh BV TƯ Huế Trong đó, có 14/14 (100%) 21/23 (91,3%) bệnh nhân dương tính với melioidosis khẳng định nuôi cấy bệnh viện phát WC/Hcp1-ELISA Phát triển ứng dụng kỹ thuật ni cấy có độ nhạy cao để điều tra vi khuẩn B pseudomallei môi trường Phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy làm giàu hai bước (TBSS-C50 48 + EM 96 giờ) điều tra B pseudomallei đất với tỷ lệ phát cao gần lần so với hướng dẫn chuẩn (TBSS-C50 48 giờ) đánh giá real-time PCR TTSS1; cao lần đánh giá phân lập đĩa thạch Ashdown Kỹ thuật làm giàu hai bước (TBSS-C50 48 + EM 96 giờ) phát 348/800 (43,5%) số mẫu nước ruộng lúa Triệu Sơn-Thanh Hóa; 100% mẫu nước giếng tắm 57,8% mẫu đất vườn Sóc Sơn-Hà Nội dương tính với B pseudomallei KIẾN NGHỊ Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu xác kỹ thuật xét nghiệm kết hợp WC/Hcp1-ELISA bệnh nhân nghi ngờ melioidosis ba thời điểm là: nhập viện, điều trị tái khám sau xuất viện tuần; so sánh chúng với phương pháp nuôi cấy real-time PCR Đánh giá độ nhạy kỹ thuật làm giàu hai bước TBSS-C50 48 + EM 96 loại mẫu đất nước 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Tran Q.T.L., Phan P.H., Bui L.N.H., Bui H.T.V., Hoang N.T.B., Tran D.M., Trinh T.T (2022), “Child Melioidosis Deaths Caused by Burkholderia pseudomallei-Contaminated Borehole Water, Vietnam, 2019”, Emerg Infect Dis Vol 28(8), pp.1689-1693 Tran Q.T.L., Nguyen H.V., Pham H.T., Mai T.V., Nguyen Q.H.M, Le D.V., Bui L.N.H., Hoang L.T.H., Hoang T.Q., Trinh T.T (2022), “Clinical Utility of Combined Whole-cell Antigen and Recombinant Hemolysis Co-regulated Protein 1Enzyme-linked Immunosorbent Assays Reveals Underdiagnosed Cases of Melioidosis in Vietnam”, Am J Trop Med Hyg Vol 107(3), pp 585-91 Trần Thị Lệ Quyên, Nguyễn Thị Tình, Bùi Nguyễn Hải Linh, Đỗ Quốc Tuấn, Trần Anh Đào, Phạm Thị Huyền, Trịnh Hồ Tình, Quế Anh Trâm, Hồng Quang Trung, Trịnh Thành Trung (2020), “Đánh giá kháng nguyên tái tổ hợp hemolysin co-regulated protein (hcp1) chẩn đoán nhanh bệnh nhân nhiễm melioidosis (bệnh Whitmore) kỹ thuật ELISA”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Tập 62 (9) 9, tr 2631