tiểu luận công nghệ protein-enzyme ppt

ĐỊNH NGHĨA: Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit CO-NH trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số Protease vi

PHẦN 1: NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE

1 ĐỊNH NGHĨA:

Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự

Nhiều Protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin

2 phân loại

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành 2 loại:

- Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit

- Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch polypeptit

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase dược chia thành 4 nhóm:

- Serin proteinase: là những proteinase có chứa nhóm (-OH) của gốc serin có vai trò quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme

- Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm (-SH)

- Aspartic proteinase: thuộc nhón pepsin ( pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như chimosin, rennin, pepsin…)

- Metallo proteinase: là nhóm được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc

3 Đặc điểm và tính chất

Các công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày càng nhiều Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các Protease của cùng một loài

vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các Protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau:

P-xerin; P-thiol; P-kim loại; P-acid

Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm Proteinase này ở bảng 1.1

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân liên kết peptide

Bảng 1.1 Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật

TTHĐ

pH tối thích

P Xerin Bac.subtilis

Bac.pumilus Str.griseus Str.fradiae Art hrobacter B22 Asp.oryzae

Asp.flavus Asp.sojae E.coli

P-tiol Streplococcus

Clostridium histoly-ticum

Indoaxeta-mit Ps.cloromer-curbenzoat

7,0

P kim

loại

Bac.subtilus Bac.subtilus NRRL B3411

Bac Subtilisamy Losaccarilicis Bac Megaterium Psuedomonasaerugin oa

Atreptomeces naraensis Asp Oryzae Acremonium kiliense Clostridiumhisttolyti um

EDTA ++

1,10octa-fenantrolin

Kim loại hóa trị hai

Trung tính

P Acid Asp.niger

Asp.Awamori Sailoi,penicillium Janthinellum Rhizopus chinensis Mucor pucillus Endothia parasilica

Dizoaxetil Dlnorlox-inmetil este

3.1 Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease

Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút

ra một số nhận xét chung như sau:

- TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại

+ Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thể phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất

+ Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ

của các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa

chúng có khe hở vào khoảng 200A Khe hở này là phần xúc tác của các E,

các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.

- Đối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide

Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:

Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất, P1: Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng

3.2 nguồn thu nhận protease

Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống

Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật

và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê như sau:

+ Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm

+ Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao

+ Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao

3.3 đặc điểm nguồn vi sinh vật để sản xuất enzyme protease:

Trong nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme có một số kỹ thuật chung và một số kỹ thuật riêng

E + S enzyme – S enzyme – S + P1 enzyme + P2

Hình 1.4 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enxyme

h 1

Bac cil lus su btilis

+ Kỹ thuật tạo giống

+ Lựa chọn phương pháp nuôi cấy

+ Thiết kế thiết bị nuôi cấy

+ Kỹ thuật lên men

+ Tách, tinh chế thu nhận Enzyme

- Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease, các enzyme này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy Một số Protease ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong

y học

- Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn

Vi khuẩn:

Protease trong vi khuẩn có thể sinh ra 2 loai enzyme endopeptidase và exopeptidase Do đó Protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein

Bacillus subtilis là chưng vi khuẩn có khả năng tổng hợp manh nhất protease Ngoài ra còn có một số chủng khác B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus

và một số giống thuộc chi Clostridiu.

Nấm mốc:

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn Protease được

ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus, A saitoi, Penicilliumchysogenum)…các loại nấm mốc

này có khả năng tổng hợp cả ba loại P: acid, kiềm và trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các Protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.

Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp Protease có khả năng đông tụ

sữa sử dụng trong sản xuất phomát

Xạ khuẩn:

Về phương diện tổng hợp Protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số

chủng có khả năng tổng hợp cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S trerimosus…

Các chế phẩm xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết

từ S.grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân

tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành acid amin

Hình 2: Aspergillus

oryzae

Hình 3: Condium of Aspergillus oryzae

Hình 4: Xạ khuẩn

Bảng 1.2 Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease

(P)

Vi

khuẩn

Bac Subtilispha

Bac Cireulans

Bac Sphaericus

Bac Thermophilus

Bac Aerothermophilus

Bac Thermoacidurans

Bac.Thermoproteoly ticus

Bac Brevis

Bac Licheniformis

Bac Mesenlericus

Bac Megaterium

Bac Cereus

Bac Pumilus

Cl Perfringens

Cl Histolyticum

Cl Sporogens

Ps Aerruginosa

P trung tính, P kiềm (subtillzin)

P kiềm

P trung tính

P Trung tính, P acid

P acid và P kiềm

{ colagenase

P trung tính,P kiềm

Xạ

khuẩn

Str Griseus

Str Rimosus

Str fradiae

Str faeca is

Str reetus var pro-teolyticus

Dùng trong kỹ nghệ ở Nhật, Mỹ, gồm ít nhất 11 enzyme với cơ chất procolagen phân giải 70% đến aa có 5 P, hai peptidase (lơxinamino-peptidase, cacboxypeptidase), hai P: P- serin.

Nấm

mốc

Asp Oryzae

Asp Satoi

Asp Awamori

Asp Niegr

Asp Shirousami

P-kim loại, P xerin, có 3 loại

P acid, P trung tính, P kiềm

P acid (aspergilopepti- dase A)

P acid Hai P acid

P acid

Asp Fumigatus

Asp Tericola

Asp Candidus

Asp Ochraceus

Asp Sojae

Asp Flavus

Pen Janthinellum

Pen Chrysogenum

Pen Cyaneo fulvum

Mucor Pusillus

Rh Chinensis

Ph Delemar

Ph Niveus

Ph Nodous

Ph Pseudokinensis

Ph Peka

Phymatorrichum omnivorum

Hai P: Pacid, và P kiềm

P acid có tác dụng làm đông sữa

P trung tính

P kiềm Hai P: P kiềm và P trung tính

P acid

P kiềm

P acid có tác dụng làm đông sữa đã được dùng ở Nhật để thay thế cho rennin.

Chương II: sản xuất enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus

oryzae :

1 giới thiệu chung về nấm mốc Aspergillus oryzae:

Aspergillus oryzae Asp oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang khuẩn ) Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao

gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ) Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào

tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính Cuống đính bào tử của Asp.oryzae

thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là

đính bào tử Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng

hoa cau…

Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào

và ngoại bào ( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng

không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới

Quy trình thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp.oryzae

Thu nhận sinh khối

(enzyme thô)

Chế phẩm enzyme

thô đem tinh chế

Nghiền mịn

Trích ly

Chế phẩm ezyme thô đem sử dụng

Khoáng hỗn hợp

Nguyên liệu dinh dưỡng (bột bắp, cao nấm men, pepton)

Hấp thanh trùng

Làm nguội đến 30 0 C Nước

Đỗ lên khay

Giống Asp.oryzae

Nuôi cấy ở nhiệt độ

phòng 0,5-2%

Dùng trong chăn nuôi Lọc

Kết tủa enzyme

Thu nhận kết tủa

Sấy

Tinh chế

Bã

Chế phẩm ezyme

Kỹ thuật

Thu nhận enzyme protease tinh khiết

Sấy

Giải thích quy trình:

Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ

ẩm không khí Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển

Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường

Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ

Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi

trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:

 Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt

đầu nuôi cấy Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ

 Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ Enzym protease

được tổng hợp mạnh Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ

cố gắng duy trì trong khoảng 29-300C là tốt nhất

 Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ Quá trình trao đổi

chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ Nhiệt dộ

đó lượng Enzym protease tạo ra sẽ giảm xuống Chính vì thế việc xác

định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết

4.5.2.3 Thu nhận sản phẩm:

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô.

Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải quá trình tinh sạch Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzym Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau:

 Nghiền mịn

Toàn bộ khối lượng enzym thô protease được đem đi nghiền nhỏ Mục đích của qúa trình này là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzym nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào Phần lớn

enzym protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay

lập tức thấm vào thành phần môi trường Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát

ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn

Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền như cát thạch anh và bột thủy tinh Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi

sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 1000C để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật

 Trích ly: Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly

enzym protease Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước

nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc (chú ý cần

loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn)

Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy Việc tiếp theo là làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này

 Kết tủa enzym protease

Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây tủa Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác

Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính

Các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W)

Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ

bảo quản người ta sấy kết tủa enzyn protease ở 40OC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa một số enzym ngoài enzyme ta quan tâm