Luận án nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và hiệu quả điều trị phác đồ methotrexate liều cao phối hợp rituximab trong điều trị lymphoma não nguyên phát tế bào b lớn lan toả

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ận Lu HOÀNG THỊ THÚY HÀ án tiế NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, n CẬN LÂM SÀNG VÀ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ PHÁC ĐỒ METHOTREXATE LIỀU CAO PHỐI HỢP RITUXIMAB TRONG ĐIỀU TRỊ LYMPHOMA NÃO NGUYÊN PHÁT TẾ BÀO B LỚN LAN TOẢ sĩ ới M ất nh LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI HOÀNG THỊ THÚY HÀ Lu ận NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG VÀ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ PHÁC ĐỒ METHOTREXATE LIỀU CAO PHỐI HỢP RITUXIMAB TRONG ĐIỀU TRỊ LYMPHOMA NÃO NGUYÊN PHÁT TẾ BÀO B LỚN LAN TOẢ án n tiế sĩ Ngành: Nội khoa ới Mã số: 9720107 M Chuyên ngành: Huyết học truyền máu nh LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC ất Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phạm Quang Vinh PGS.TS Nguyễn Trường Sơn HÀ NỘI – 2023 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ABC Activated B-cell-like Tế bào B hoạt hóa AIDS Acquired Immuno Deficiency Syndrom Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải BN Patient Bệnh nhân CCr Clearance creatinine Độ lọc cầu thận CD Cluster of Differentiation Cụm biệt hóa CHOP Cyclophosphamide, doxorubicin , vincristin, prednisone CT Computed Tomography Lu Viết tắt ận CTCAE Chụp cắt lớp vi tính Common Terminology Criteria Tiêu chuẩn đánh giá biến cố bất for Adverse Events lợi án Lymphoma tế bào B lớn lan toả Diffused Large B-cell Lymphoma DNA Deoxyribonucleic Acid ĐƯHT Complete response Đáp ứng hoàn toàn ĐƯMP Partial response Đáp ứng phần EBV Epstein Barr virus FDG Fluorodeoxyglucose FISH Flourescent In-Situ Hybridization GCB Germinal center B-cell-like Tế bào B tâm mầm GEP Gene Expression Profiling Hình thái biểu gen n tiế DLBCL sĩ Virus Epstein Barr M Fluorodeoxyglucose ới Lai huỳnh quang chỗ ất nh GTBGTM Hemapoetic cell transplantation Ghép tế bào gốc tạo máu HIV Human Immuno-deficiency Virus Virus gây suy giảm miễn dịch mắc phải người HLA Human Leucocyte Antigen Kháng nguyên bạch cầu người HTLV-1 Human T-lymphotropic Virus type- Virus hướng tế bào lympho T người type IELSG International Extranodal Nhóm nghiên cứu quốc tế Lymphoma Study Group lymphoma hạch IgHV Immunoglobulin variable heavy Chuỗi nặng biến thiên globulin miễn dịch IL Interleukine KT Refractory LDH Lactac dehydrogenase LKH Non Hodgkin lymphoma Kháng trị Lymphoma không Hodgkin LKHNNP Primary cerebral lymphoma Lu Lymphoma không Hodgkin não nguyên phát Methotrexate, cytarabine, thiotepa, rituximab MPV Methotrexate, procarbazine, vincristin MPV-A ận MATRix Methotrexate, procarbazine, vincristin, cytarabine án Chụp cộng hưởng từ Magnetic Resonance Imaging MTR Methotrexate, temozolomide, rituximab MTX Methotrexate NOS Not otherwise specified Không có định danh khác NST Chromosome Nhiễm sắc thể OS Overal survival PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PET-CT Positron emission tomography scans Chụp cắt lớp phát xạ positron PFS Progression-free survival R-MP Rituximab, methotrexate, procarbazine R-MPL Rituximab, methotrexate, procarbazine, lomustin SEER Surveillance, Epidemiology, and End Results Program TT Progressive disease Bệnh tiến triển TV Death Tử vong ƯCMD Immunosuppressor Ức chế miễn dịch WBRT Whole brain radiotherapy Xạ toàn não WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới n tiế MRI sĩ Sống thêm tồn ới M nh ất Sống thêm bệnh khơng tiến triển MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu bệnh lymphoma không Hodgkin não nguyên phát tế bào B lớn lan tỏa 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Đặc điểm dịch tễ học Lu 1.1.3 Tiên lượng bệnh ận 1.1.4 Nguy mắc bệnh 1.1.5 Sinh bệnh học án 1.1.6 Đặc điểm mô bệnh học tiế 1.1.7 Bất thường gen 12 1.1.8 Đặc điểm lâm sàng 15 n 1.1.9 Hình ảnh học 16 sĩ 1.1.10 Chẩn đoán 19 M 1.1.11 Đánh giá yếu tố nguy 22 ới 1.2 Các phương pháp điều trị Lymphoma không Hodgkin não nguyên nh phát kết nghiên cứu lâm sàng 23 1.2.1 Đánh giá trước điều trị 23 ất 1.2.2 Các phương pháp điều trị 24 1.2.3 Phác đồ điều trị cơng với tảng có methotrexate liều cao 27 1.2.4 Đánh giá đáp ứng điều trị công 32 1.2.5 Điều trị củng cố 33 1.2.6 Điều trị hỗ trợ 36 1.2.7 Điều trị trường hợp đặc biệt 37 1.2.8 Theo dõi 39 1.2.9 Điều trị bệnh tái phát kháng trị 40 1.2.10 Tiên lượng 42 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 Đối tượng nghiên cứu 43 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 43 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 44 2.2 Phương pháp nghiên cứu 44 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 44 2.2.2 Cơng thức tính cỡ mẫu 44 Lu 2.2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 45 ận 2.3 Nội dung nghiên cứu 45 2.3.1 Các bước nghiên cứu 45 án 2.3.2 Các thông số nghiên cứu 51 tiế 2.3.3 Định nghĩa biến số nghiên cứu 52 2.3.4 Các tiêu chí đánh giá 55 n 2.3.5 Vật liệu nghiên cứu 58 sĩ 2.3.6 Phương tiện, dụng cụ nghiên cứu 59 M 2.3.7 Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng nghiên cứu 59 ới 2.4 Phương pháp phân tích kết 60 nh 2.4.1 Cách mô tả kết 60 2.4.2 So sánh kết 60 ất 2.5 Đạo đức nghiên cứu 61 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 63 3.1 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh nhân lymphoma không Hodgkin não nguyên phát tế bào B lớn lan tỏa 63 3.1.1 Đặc điểm độ tuổi 63 3.1.2 Đặc điểm giới tính 64 3.1.3 Bệnh lý kèm 64 3.1.4 Toàn trạng bệnh nhân thời điểm chẩn đoán 65 3.1.5 Phương pháp phẫu thuật 65 3.1.6 Vị trí tổn thương 66 3.1.7 Triệu chứng lâm sàng trước chẩn đoán 67 3.1.8 Một số số huyết học thời điểm chẩn đoán 68 3.1.9 Một số số sinh hóa thời điểm chẩn đoán 68 3.1.10 Đặc điểm dấu ấn miễn dịch khối u 69 3.1.11 Đặc điểm dấu ấn miễn dịch Ki67 70 3.1.12 Đặc điểm bất thường di truyền khối u 70 Lu 3.1.13 Chỉ số tiên lượng theo thang điểm IELSG 71 ận 3.2 Hiệu điều trị phác đồ methotrexate liều cao phối hợp rituximab 71 3.2.1 Kết đáp ứng sau hóa trị 71 án 3.2.2 Thời gian sống thêm sau điều trị 74 tiế 3.2.3 Thay đổi số huyết học, sinh hóa trước sau điều trị 75 3.2.4 Liên quan số yếu tố tới kết điều trị phác đồ n methotrexate liều cao phối hợp rituximab 76 sĩ 3.2.5 Biến cố bất lợi hóa trị 87 M Chương BÀN LUẬN 94 ới 4.1 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh nhân lymphoma không nh Hodgkin não nguyên phát tế bào B lớn lan tỏa 94 4.1.1 Đặc điểm tuổi 95 ất 4.1.2 Đặc điểm giới tính 96 4.1.3 Bệnh lý kèm 96 4.1.4 Toàn trạng bệnh nhân thời điểm chẩn đoán 97 4.1.5 Phương pháp phẫu thuật 97 4.1.6 Vị trí tổn thương 99 4.1.7 Triệu chứng lâm sàng trước chẩn đoán 100 4.1.8 Một số số huyết học thời điểm chẩn đoán 101 4.1.9 Một số số sinh hóa thời điểm chẩn đốn 103 4.1.10 Đặc điểm dấu ấn miễn dịch khối u 104 4.1.11 Đặc điểm dấu ấn miễn dịch Ki67 106 4.1.12 Đặc điểm bất thường di truyền khối u 106 4.1.13 Chỉ số tiên lượng theo thang điểm IELSG 109 4.2 Hiệu điều trị phác đồ methotrexate liều cao phối hợp rituximab 110 4.2.1 Kết đáp ứng sau hóa trị 110 4.2.2 Thời gian sống thêm sau điều trị 113 Lu 4.2.3 Thay đổi số huyết học, sinh hóa trước sau điều trị 114 ận 4.2.4 Liên quan số yếu tố tới kết điều trị phác đồ methotrexate liều cao phối hợp rituximab 115 án 4.2.5 Biến cố bất lợi 123 tiế KẾT LUẬN 129 KIẾN NGHỊ 131 n DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ới PHỤ LỤC M TÀI LIỆU THAM KHẢO sĩ LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ ất nh ĐẶT VẤN ĐỀ Lymphoma khơng Hodgkin (LKH) bệnh lý ác tính tế bào lympho dịng B, T hay NK, vị trí hạch hay quan hạch LKH nguyên phát hệ thần kinh trung ương biến thể khơng phổ biến LKH ngồi hạch, chúng não, màng não mềm, mắt hay tủy sống mà khơng có dấu hiệu lymphoma hệ thống Mặc dù tỉ lệ mắc bệnh gia tăng đáng kể năm gần đây, LKH nguyên phát hệ thần kinh trung ương Lu loại lymphoma gặp thể hạch Theo thống kê hàng ận năm có khoảng 2,5 – 30 trường hợp mắc/ 10 triệu dân Trong LKH nguyên phát hệ thần kinh trung ương, LKH não nguyên phát (LKHNNP- án Primary cerebral lymphoma- PCL) chiếm đến 80% 1,2,3,4,5 Với đặc điểm mô học LKH nguyên phát hệ thần kinh trung ương tiế ác tính (thường tế bào B lớn lan toả độ ác cao chiếm 95% ngun n bào miễn dịch), khơng điều trị tử vong nhanh chóng, sĩ trung bình 1,5 tháng kể từ sau chẩn đốn Do bệnh đáp ứng cao với hoá xạ M trị nên vai trò phẫu thuật dần giảm Xạ trị toàn não giúp kéo dài thời ới gian sống khoảng 10 – 18 tháng, kèm theo biến chứng muộn đặc biệt bệnh nhân lớn tuổi, gây giảm chất lượng sống Tuy nh nhiên thời gian sống trung bình tăng lên 42 tháng hóa trị kết hợp ất hóa trị đơn Mặc dù có nhiều phác đồ hóa trị giúp kéo dài thời gian sống bệnh khơng chữa khỏi bệnh có khuynh hướng tái phát chí gây tử vong Phác đồ CHOP (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristin, prednisone) phác đồ chuẩn điều trị lymphoma hệ thống - không hiệu điều trị LKH nguyên phát hệ thần kinh trung ương (do khơng qua hàng rào máu não), không sử dụng Tác giả Blay JY, Ferreri AJ cộng (CS) cho thời gian sống cải thiện cho bệnh nhân LKH nguyên phát hệ thần kinh trung ương hóa trị khởi đầu so với xạ trị khởi đầu 3,7,8,9 Theo tác giả Ryuya Yamanaka, Shibamoto Y, Herrlinger U CS, nhiều phác đồ phối hợp với methotrexate liều cao (≥ 500mg/m2) methotrexate liều cao đơn có hiệu việc kéo dài thời gian sống chất lượng sống bệnh nhân LKH nguyên phát hệ thần kinh trung ương so với phác đồ methotrexate 4,5,10 Rituximab- liệu pháp điều trị nhắm đích với mục tiêu kháng nguyên CD20 có mặt bệnh nhân lymphoma tế bào B Nhiều nghiên cứu tác Lu giả cho thấy, điều trị LKH nguyên phát hệ thần kinh trung ương với phác đồ ận phối hợp methotrexate liều cao với rituximab mang lại hiệu cao so với điều trị methotrexate đơn độc 1,2 án Số bệnh nhân hàng năm chẩn đoán LKHNNP Khoa Huyết họcbệnh viện Chợ Rẫy chiếm khoảng 4% tổng số bệnh nhân lymphoma Tỷ tiế lệ có xu hướng tăng dần tỷ lệ cao so với dịch tễ chung n (0.4% LKH) Từ năm 2008, Khoa Huyết học Bệnh viện Chợ Rẫy bắt đầu áp dụng phác đồ hoá trị methotrexate liều cao điều trị bệnh, từ vài trường sĩ hợp/năm, đến phác đồ hoá trị methotrexate liều cao phác đồ lựa M chọn tối ưu điều trị bệnh nhân mắc LKHNNP Tuy nhiên thời điểm ới tại, có số sở y tế (Bệnh viện Ung bướu thành phố Hồ Chí Minh, Bệnh viện Bạch Mai, Viện Huyết học Truyền máu Trung ương, Bệnh nh viện Chợ Rẫy…) điều trị LKHNNP với methotrexate liều cao với số ất lượng bệnh không lớn Ngay chuyên ngành ngoại thần kinh ung bướu, có nghiên cứu LKHNNP nước ta Vì mong muốn tiến hành nghiên cứu đề tài với mục tiêu: Mô tả đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh lymphoma không Hodgkin não nguyên phát tế bào B lớn lan toả Đánh giá hiệu điều trị bệnh nhân lymphoma não nguyên phát tế bào B lớn lan tỏa phác đồ methotrexate liều cao phối hợp với rituximab Đặc điểm Độ Độ Độ Độ Độ Giảm tiểu cầu Giảm hồng cầu Viêm phổi Nhiễm trùng hầu họng Nhiễm trùng huyết Nhiễm trùng tiết niệu Lu Nhiễm trùng tiêu hóa Nhiễm trùng da/mơ mềm ận Nhiễm trùng vị trí khác Giảm chức thận án Tăng men gan n tiế Độ Độ Độ Độ sĩ ới M ất nh 6.2 Chu kì 2: Đặc điểm Buồn / Nôn Mệt mỏi Giảm cân Chán ăn Rối loạn tiêu hóa Tổn thương niêm mạc Viêm gan B tái hoạt Giảm bạch cầu đoạn trung tính Giảm tiểu cầu Giảm hồng cầu Viêm phổi Nhiễm trùng hầu họng Nhiễm trùng huyết Nhiễm trùng tiết niệu Nhiễm trùng tiêu hóa Nhiễm trùng da/mơ mềm Nhiễm trùng vị trí khác Giảm chức thận Tăng men gan Độ Độ Độ Độ Độ Độ Độ Độ Độ Độ ận Lu 6.3 Chu kì 3: Đặc điểm Buồn / Nôn Mệt mỏi Giảm cân Chán ăn Rối loạn tiêu hóa Tổn thương niêm mạc Viêm gan B tái hoạt Giảm bạch cầu đoạn trung tính Giảm tiểu cầu Giảm hồng cầu Viêm phổi Nhiễm trùng hầu họng Nhiễm trùng huyết Nhiễm trùng tiết niệu Nhiễm trùng tiêu hóa Nhiễm trùng da/mơ mềm Nhiễm trùng vị trí khác Giảm chức thận Tăng men gan 6.4 Chu kì 4: Đặc điểm Buồn / Nôn Mệt mỏi Giảm cân Chán ăn Rối loạn tiêu hóa Tổn thương niêm mạc Viêm gan B tái hoạt Giảm bạch cầu đoạn trung tính Giảm tiểu cầu Giảm hồng cầu Viêm phổi Nhiễm trùng hầu họng Nhiễm trùng huyết Nhiễm trùng tiết niệu Nhiễm trùng tiêu hóa Nhiễm trùng da/mơ mềm Nhiễm trùng vị trí khác Giảm chức thận Tăng men gan án n tiế sĩ Độ ới M ất nh Độ Độ Độ Độ Độ Độ Độ Độ Độ ận Lu 6.5 Chu kì 5: Đặc điểm Buồn / Nơn Mệt mỏi Giảm cân Chán ăn Rối loạn tiêu hóa Tổn thương niêm mạc Viêm gan B tái hoạt Giảm bạch cầu đoạn trung tính Giảm tiểu cầu Giảm hồng cầu Viêm phổi Nhiễm trùng hầu họng Nhiễm trùng huyết Nhiễm trùng tiết niệu Nhiễm trùng tiêu hóa Nhiễm trùng da/mơ mềm Nhiễm trùng vị trí khác Giảm chức thận Tăng men gan 6.6 Chu kì 6: Đặc điểm Buồn / Nơn Mệt mỏi Giảm cân Chán ăn Rối loạn tiêu hóa Tổn thương niêm mạc Viêm gan B tái hoạt Giảm bạch cầu đoạn trung tính Giảm tiểu cầu Giảm hồng cầu Viêm phổi Nhiễm trùng hầu họng Nhiễm trùng huyết Nhiễm trùng tiết niệu Nhiễm trùng tiêu hóa Nhiễm trùng da/mơ mềm Nhiễm trùng vị trí khác Giảm chức thận Tăng men gan án n tiế sĩ Độ ới M ất nh Độ Độ Độ Độ Độ Độ Độ Độ ận Lu 6.7 Chu kì 7: Đặc điểm Buồn / Nôn Mệt mỏi Giảm cân Chán ăn Rối loạn tiêu hóa Tổn thương niêm mạc Viêm gan B tái hoạt Giảm bạch cầu đoạn trung tính Giảm tiểu cầu Giảm hồng cầu Viêm phổi Nhiễm trùng hầu họng Nhiễm trùng huyết Nhiễm trùng tiết niệu Nhiễm trùng tiêu hóa Nhiễm trùng da/mơ mềm Nhiễm trùng vị trí khác Giảm chức thận Tăng men gan án n tiế sĩ Độ Độ ới M ất nh 6.8 Chu kì 8: Đặc điểm Buồn / Nôn Mệt mỏi Giảm cân Chán ăn Rối loạn tiêu hóa Tổn thương niêm mạc Viêm gan B tái hoạt Giảm bạch cầu đoạn trung tính Giảm tiểu cầu Giảm hồng cầu Viêm phổi Nhiễm trùng hầu họng Nhiễm trùng huyết Nhiễm trùng tiết niệu Nhiễm trùng tiêu hóa Nhiễm trùng da/mơ mềm Nhiễm trùng vị trí khác Giảm chức thận Tăng men gan Theo dõi sống cịn sau kết thúc hóa trị: Sau tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định tái phát/tiến triển tử vong Sau tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định tái phát /tiến triển  tử vong Sau tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định tái phát/tiến triển  tử vong Sau 12 tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định tái phát/tiến triển  tử vong Sau 18 tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định tái phát/tiến triển  tử vong Sau 24 tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định tái phát/tiến triển  tử vong Sau 30 tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định tái phát/tiến triển  tử vong Lu tái phát/tiến triển  tử vong Sau 42 tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định tái phát/tiến triển  tử vong Sau 48 tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định tái phát/tiến triển  tử vong ận Sau 36 tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định án Sau 54 tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định tái phát/tiến triển  tử vong Sau 60 tháng:  hoàn toàn  phần  ổn định tái phát/tiến triển  tử vong n tiế sĩ ới M ất nh Phụ lục 1: BẢN CHẤP THUẬN TỰ NGUYỆN THAM GIA NGHIÊN CỨU Tôi đọc mẫu thỏa thuận đồng ý Tôi có hội để trao đổi với:  Bác sĩ: ……………………………………………, bác sĩ nghiên cứu tơi  Người có trách nhiệm thu xếp q trình ký chấp thuận tự nguyện tham gia nghiên cứu Tơi biết rủi ro, lợi ích tham gia vào nghiên cứu Tơi có Lu hội để đặt câu hỏi Tất câu hỏi trả lời rõ ràng theo cách tơi hiểu rõ thỏa đáng ận Tôi đồng ý để bác sĩ nghiên cứu thu thập xử lý thông tin, kể thông tin sức khỏe Tôi đồng ý với bác sĩ nghiên cứu bệnh viện án Chợ Rẫy sử dụng thông tin thu thập nghiên cứu “Nghiên cứu đặc điểm tiế lâm sàng, cận lâm sàng hiệu điều trị phác đồ Methotrexate liều cao phối hợp với Rituximab điều trị Lymphoma não nguyên phát tế bào B lớn lan n toả”, bao gồm thông tin sức khỏe, cho nghiên cứu y học tương lai sĩ Tôi đồng ý bác sĩ nghiên cứu bệnh viện Chợ Rẫy phân tích M thơng tin Tôi đồng ý cho thông tin chuyển tới công ty ới làm việc với bệnh viện Chợ Rẫy Tôi đồng ý để người sau phép truy cập trực tiếp thông tin cá nhân (bảo mật) tôi: nh + Nhân viên nhóm nghiên cứu chuẩn tiến hành nghiên cứu ất + Các nhà chức trách y tế có thẩm quyền Hội đồng y đức kiểm tra phê Tôi hiểu tơi rút khỏi nghiên cứu lúc Việc rút khỏi nghiên cứu khơng ảnh hưởng đến việc chăm sóc sức khỏe sau Nếu định rời khỏi nghiên cứu, đồng ý thông tin thu thập thời điểm rút khỏi, tiếp tục sử dụng Tơi không từ chối quyền trách nhiệm ký vào đơn Tôi tự nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu Bằng việc ký tên đây, khẳng định giải thích đầy đủ thơng tin có liên quan nghiên cứu.Tôi giữ vai trị tơi nghiên cứu kết thúc _ Chữ ký bệnh nhân _ Họ tên _ Ngày ký Lu ận Tôi, người ký tên đây, giải thích đầy đủ thơng tin có liên quan tới nghiên cứu có tên nêu cung cấp cho người bệnh cam kết đồng ý ký ghi ngày án n tiế _ Họ tên sĩ _ Chữ ký Nghiên cứu viên _ Ngày ký ới M ất nh Phụ lục 2: QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT FISH (PP lai huỳnh quang chỗ-Hệ thống BIOVIEW) ận Lu MỤC ĐÍCH - Phát có mặt vắng mặt đoạn gen nhiễm sắc thể - Kỹ thuật Fish chẩn đoán bệnh lý: Ung thư máu, Lymphoma, Ung thư phổi, Ung thư dày, Ung thư vú, Ung thư xương, Khối u ác tính, U thần kinh đệm, Ung thư tiền liệt tuyến - Đảm bảo nhân viên thao tác máy kỹ thuật - Giúp trình thực xét nghiệm xác PHẠM VI- TRÁCH NHIỆM - Phạm vi: áp dụng nội Đơn vị Sinh học phân tử di truyền - Khoa Huyết họcBệnh viện Chợ Rẫy - Trách nhiệm:  Nhân viên Đơn vị Sinh học phân tử di truyền - Khoa Huyết học đào tạo sử dụng thiết bị thực quy trình kỹ thuật, bảo dưỡng thiết bị  Trưởng đơn vị chịu trách nhiệm giải vấn đề phát sinh, giải khó khăn thực quy trình ĐỊNH NGHĨA VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT - FISH (Fluorescent insitu hybridization) kỹ thuật trung gian di truyền tế bào di truyền phân tử, sử dụng đoạn mồi đặc hiệu (probe) gắn tín hiệu huỳnh quang, để phát có mặt vắng mặt đoạn gen nhiễm sắc thể, với ưu điểm nhanh, đặc hiệu xác FISH đặc biệt có hiệu việc phát đoạn gen nhỏ (microdeletion), để khẳng định nguồn gốc loại chuyển đoạn đặc biệt NGUYÊN LÝ án n tiế sĩ ới M ất nh - Kỹ thuật FISH tiến hành dựa sở phản ứng lai ghép - Trong tế bào, phân tử ADN tồn dạng phân tử kép gồm chuỗi đơn gắn kết bổ sung với thông qua liên kết hydro Liên kết hydro liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy tác động nhiệt độ hay pH cao Lúc đó, phân tử ADN bị ận Lu tách thành chuỗi đơn.Tuy nhiên nhiệt độ hay pH giảm, chuỗi đơn lại ghép theo nguyên tắc bổ sung - Dựa đặc tính này, kỹ thuật FISH sử dụng probe đoạn ADN đặc hiệu có gắn huỳnh quang để lai ghép với đoạn ADN tương đồng nhiễm sắc thể KIỂM TRA XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA QUY TRÌNH - Thực xác nhận giá trị sử dụng quy trình xét nghiệm trước sử dụng phương pháp (máy mới, thuốc thử mới), thay đổi vị trí điều kiện phịng xét nghiệm - Việc xác nhận giá trị sử dụng phải đủ thông số cần thiết khẳng định, thông qua cung cấp chứng khách quan (dưới dạng tính hiệu lực thông số), đáp ứng yêu cầu cụ thể cho mục đích sử dụng quy trình xét nghiệm ban hành - Việc tổ chức thực xác nhận giá trị sử dụng quy trình xét nghiệm phải tuân theo quy trình 5.5.1 THIẾT BỊ VÀ VẬT LIỆU (dụng cụ, thuốc thử) 6.1 Thiết bị: án n tiế sĩ ới M nh Hệ thống Bioview TM ất Máy lai HYBrite Dụng cụ Máy đo pH Cân điện tử 6.2 VẬT LIỆU 6.2.1 Dụng cụ hóa chất EQUIPMENT SUPPLIIES (TRANG THIẾT BỊ) (NGUỒN CUNG CẤP) REAGENTS (HOÁ CHẤT) ận Lu Máy quay ly tâm Máy lai Bể ổn nhiệt BCL2 Break Apart FISH Probe Kit, Pipette 1-10 µL Cytotest/ BCL6 Break Apart FISH Pipette 20-200 µL Probe Kit, Cytotest/ IGH-MYC Dual Pipette 100-1000 µL Fusion/ Translocation FISH Probe Lam tích điện dương Kit, Cytotest Lamelle DAPI Keo cao su CYTOTEST Dung dịch KCl 0.075M 10 Găng tay Dung dịch Carnoy’s 11 Kẹp kim loại Cồn 99.5oC 12 Cốc Coplin Dung dịch rửa 0.4X SSC /0.3% NP-40 13 Nhiệt kế Dung dịch rửa 2X SSC/ 0.1% NP-40 14 Ống đong 15 Thùng đựng rác y tế 16 Máy đo PH 17 Cân điện tử Lưu ý: thuốc thử phải bảo quản nơi khơ thống, nhiệt độ lưu trữ – 8oC, án n tiế sĩ - Mẫu mơ vùi nến có kích thước 04µm nh AN TOÀN ới 6.2.2 Mẫu nghiệm phẩm M tránh sáng Nguồn điện ổn định - Không để thức ăn nước uống vật dụng khác lên máy khu vực ất - máy - Hóa chất thuốc thử cần có nhãn rõ ràng, đầy đủ thơng tin - Tài liệu, dụng cụ theo máy cần bảo quản riêng lẻ, ngăn nắp - Đảm bảo đầy đủ dụng cụ bảo hộ cá nhân vận hành máy phân tích mẫu - Tất mẫu hóa chất, mẫu bệnh phẩm, mẫu máu chuẩn, mẫu để tinh chỉnh máy… chứa máu người huyết thanh, nguy tiềm ẩn lây nhiễm bệnh Nhân viên thực phải thực quy trình kỹ thuật xét nghiệm, quy trình an tồn phịng xét nghiệm, quy trình xử lý chất thải y tế QUY TRÌNH THỰC HIỆN BUỚC HÀNH ĐỘNG ( ACTION) (STEP) Chuẩn bị lame mẫu Mẫu mô vùi nến cắt mỏng 04µm, gắn lên lame tích điện dương Căn vào lame có nhuộm HE khoanh vùng tế bào u bệnh phẩm Từ đánh dấu vùng tế bào u mẫu bệnh phẩm cần khảo sát Mẫu mô cắt đánh dấu ủ qua đêm nhiệt độ 60ºC Nhúng vào Clear-Rite lần, lần phút ận Lu Làm khơ nhiệt độ phịng 10 phút án Nhúng vào cồn 99,5º lần, lần phút Nhúng vào dung dịch Pretreatment Solution 80ºC ± 2ºC 30 phút Rửa với nước cất lần phút Ngâm dung dịch 62.5ml Protease Buffer + 250mg Protease n tiế sĩ 37ºC ± 1ºC 30 phút Rửa với nước cất lần phút 11 Nhúng vào cồn 70º phút nhiệt độ phòng 12 Nhúng vào cồn 85º phút nhiệt độ phòng 13 Nhúng vào cồn 99,5º phút nhiệt độ phịng 14 Làm khơ nhiệt độ phịng 10 phút ới M 10 15 ất nh Biến tính lai Lấy probe tủ đông -20ºC, làm ấm nhiệt độ phòng, vortex trộn spin nhanh để kéo hết dung dịch xuống đáy tube 16 Hút 10 µL probe lên mẫu lên lame Đậy nhanh coverslip lên khu vực vừa nhỏ probe Loại bỏ bọt khí Dán keo kín xung quanh coverslip Bật máy Thermobrite, cài đặt chương trình sau: 17 - Nhiệt độ biến tính: 75 ± ºC phút - Nhiệt độ lai: 37 ± ºC 16 - 20 Lưu ý: Cần làm ẩm xốp trước lắp vào máy 18 19 Đặt lame lên bề mặt máy Thermobrite Đậy nắp máy chạy chương trình Biến tính lai máy Thermobrite Rửa sau lai 20 Làm ấm dung dịch rửa 0.4X SSC/0.3% NP-40 pH 7.2 73 ± ºC bể ủ nhiệt Chuẩn bị dung dịch 2X SSC/0.1% NP-40 pH 7.0 nhiệt độ phòng 22 Gỡ keo khỏi lame 23 ận 24 Đặt lame vào dung dịch 0.4X SSC/0.3% NP-40 73 ± 1ºC phút Lu 21 toàn phịng tối Thêm µL DAPI vào vùng mẫu, đậy coverslip lên lame mẫu n Loại bỏ bọt khí Cố định sơn móng tay sĩ Bảo quản lame -20ºC hộp tối 20 phút trước đọc kết ới kính hiển vi huỳnh quang M 27 Lấy lame ra, đặt lame dựng đứng miếng khăn giấy, để khơ hồn tiế 26 phút án 25 Đặt lame vào dung dịch 2X SSC/0.1% NP-40 pH 7.0 nhiệt độ phòng 29 Đặt lame vào kính, chọn loại xét nghiệm 30 Cho hệ thống quét lame tự động 31 Xem xét, phân tích kết hệ thống 32 Lưu trữ lame -20 ºC hộp tối ất Bật kính hiển vi huỳnh quang tự động nh 28 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG - Chọn lame biết trước kết có tế bào bất thường hay không bất thường NST quan sát kính hiển vi huỳnh quang - BCL2 Break Apart FISH Probe Kit, Cytotest: Khảo sát bất thường mẫu bệnh phẩm cách dựa vào đứt gãy tín hiệu nhiễm sắc thể 18 (Nếu có) - BCL6 Break Apart FISH Probe Kit, Cytotest: Khảo sát bất thường mẫu bệnh phẩm cách dựa vào đứt gãy tín hiệu nhiễm sắc thể (Nếu có) - IGH-MYC Dual Fusion/ Translocation FISH Probe Kit, Cytotest: Khảo sát bất thường mẫu bệnh phẩm cách dựa vào chuyển đoạn tín hiệu nhiễm sắc thể 14 (Nếu có) 10 NHIỄU (các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả) Mẫu sau nhuộm không cho kết quả, kết khơng xác trường hợp sau: Kính hiển vi khơng thích hợp có cố - Probe khơng biến tính hồn tồn - Điều kiện lai khơng thích hợp - Điều kiện rửa khơng thích hợp - Xuất bọt khí tiêu coverslip - Bảo quản probe không cách - Điều kiện lai khơng thích hợp - Nhiệt độ dung dịch rửa thấp - Tiêu làm già mức cho phép chứa nhiều tế bào chất - Tiêu không nhiều mảnh vỡ tế bào tiêu - Các mảnh ADN không - Dung dịch rửa sai thành phần nhiệt độ - Để tiêu bị khô - Tiêu chưa sấy khơ trước biến tính - Tiêu chưa khơ sau biến tính - Nhiệt độ bể ủ nhiệt cao - Thời gian biến tính lâu - Nồng độ probe sử dụng cao so với dải màu kính hiển vi - Hạn sử dụng probe ận Lu - án n tiế sĩ ới M ất nh 11 NGUN TẮC TÍNH TỐN KẾT QUẢ - Quan sát kính hiển vi huỳnh quang xác định tế bào có NST bình thường hay bất thường theo mặc định cấu trúc kit Từ phần mền BIOVIEW phát chia tỷ lệ phần trăm cho kết xét nghiệm - Kết thị biểu đồ hình trịn sau: Lu 12 KHOẢNG THAM CHIẾU ận - Kết bình thường khơng có bắt cặp đoạn mồi đột biến với nhiễm sắc thể bệnh nhân (kết âm tính) án 13 KHOẢNG BÁO CÁO KẾT QUẢ (KHOẢNG CHẤP NHẬN) - Dựa tỉ lệ bắt cặp probe 14 KHOẢNG KIỂM TRA LẠI tiế - Vùng tế bào u cần thiết để khảo sát không đủ số lượng < 50 tế bào n - Tín hiệu huỳnh quang mẫu thử khơng thể quan sát mắt thường kính sĩ hiển vi huỳnh quang KHOẢNG ĐO ới - Kiểm tra chạy lại mẫu lần M 15 HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH KẾT QUẢ KHI KẾT QUẢ NẰM NGỒI vong) ất - Khơng nh 16 TRỊ SỐ CẢNH BÁO, GIÁ TRỊ NGUY HIỂM (có thể gây nguy hiểm tử 17 DIỄN GIẢI LÂM SÀNG - Nếu có diện bất thường NST điều có nghĩa bệnh nhân mang gen bất thường mặt di truyền học ngược lại 18 NGUỒN BIẾN ĐỘNG TIỀM ẨN - Lưa chọn Probe khơng thích hợp - Thời gian lưu trữ mẫu - Quá trình vận chuyển mẫu - Nhiễu thao tác kĩ thuật lấy mẫu 19 LƯU HỒ SƠ VÀ TÀI LIỆU LIÊN QUAN STT Tên hồ sơ lưu Hướng dẫn sử dụng Biên bảo trì, bảo dưỡng thiết bị Biên hiệu chuẩn thiết bị Mã số Theo lô thuốc thử Theo quy trình quản lí thiết bị Nơi lưu Thời gian lưu Đơn vị Sinh học phân tử di truyền năm Lu 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO ận Nguyễn Thị Băng Sương 2013, Kỹ thuật chẩn đoán bệnh di truyền, Nhà xuất Y học Y học án Đỗ Trung Phấn 2013, Kỹ thuật xét nghiệm Huyết học Truyền máu, Nhà xuất tiế Phạm Quang Vinh 2013, Bất thường di truyền tế bào bệnh máu ác tính, Nhà n xuất Y học sĩ Nguyễn Thị Xuyên 2014, Quyết định việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Huyết học-Truyền máu-Miễn dịch-Di truyền-Sinh ới M học phân tử”, Bộ Y tế Nguyễn Thị Xuyên 2015, Quyết định việc ban hành tài liệu chuyên môn nh “Hướng dẫn chẩn đoán điều trị số bệnh lý Huyết học”, Bộ Y tế Yêu cầu chất lượng lực phòng xét nghiệm y tế, điều khoản 5.5.3 tiêu ất chuẩn ISO 15189:2012 Catalog hướng dẫn Công ty ABBOTT Yêu cầu chất lượng lực phòng xét nghiệm y tế, điều khoản 5.5.3 tiêu chuẩn ISO 15189:2012