TỔNG QUAN
Tổng quan về hành tím
Hành tím, có tên khoa học là Allium ascalonicum, là một loại củ không có thông tin rõ ràng về nguồn gốc Tuy nhiên, hành tím đã được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực tại Trung Quốc.
Hành, một gia vị có nguồn gốc từ Ba Tư và Ai Cập, đã được sử dụng từ hàng ngàn năm trước Các dấu vết của hành được phát hiện từ thời Đồ Đồng tại Trung Quốc cho thấy rằng loại gia vị này đã được ưa chuộng nhờ hương thơm đặc trưng của nó từ khoảng 5000 trước Công Nguyên.
Hành được người Ai Cập cổ đại tôn sùng vì hình cầu của chúng tượng trưng cho sự tròn vẹn vĩnh cửu và sự sống bất diệt Chúng được sử dụng trong các nghi lễ mai táng và còn là phương thuốc chữa trị bệnh dân gian của người xưa.
2.1.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của hành tím
Theo nghiên cứu của Irene Dini và cộng sự, hành tím chứa 22.4% chất xơ và 24.8% protein thô Ngoài ra, hành tím còn có các dẫn xuất cysteine và hợp chất sinh học s-propylmercapto-cysteine, một hợp chất chưa được phát hiện trong vỏ hành tây Hợp chất này được biết đến như một chất hỗ trợ quan trọng trong điều trị bệnh béo phì, nhờ vào khả năng cải thiện đường huyết và giảm lượng thức ăn tiêu thụ.
Hình 2 1.Hình ảnh về củ hành tím
Bảng 2 1 Thành phần hóa học của củ hành tím [7]
Thành phần Tính trên 148g hành tím
Flavonol, anthocyanin và dihydroflavonol là các hợp chất quan trọng có trong hành tím, với flavonoid là sắc tố chủ yếu, chủ yếu là quercetin Mỗi kilogram hành tím chứa từ 415 đến 1917 mg flavonoid, cho thấy giá trị dinh dưỡng cao của loại thực phẩm này Các dẫn xuất của quercetin cũng đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao lợi ích sức khỏe của hành tím.
6 trọng trong hành, các dẫn xuất của kaempferol và isorhamnetin cũng được xác định là các chất màu phụ
2.1.3 Thành phần hóa học của vỏ hành tím
Vỏ hành tím chứa nhiều hợp chất có lợi như carbohydrate, chất xơ, polyphenol và các hợp chất tạo hương Các hợp chất sinh học như phenolics, flavonoid và anthocyanins tập trung chủ yếu ở hành tím và lớp vỏ khô bên ngoài Hàm lượng các hợp chất này trong vỏ hành tím thường cao hơn so với hành tây, với phenolic chủ yếu là flavonoid, bao gồm hai nhóm chính: flavonols và anthocyanins.
Flavonols thường xuất hiện dưới dạng glycosyl hóa, trong đó hai dạng quercetin phổ biến nhất trong vỏ hành tím là quercetin 4’-O-β-D-glucoside và quercetin 3,4’-O-β-D-diglucoside, chiếm từ 80 đến 85% tổng hàm lượng flavonoid.
- Cyanidin 3-glucoside là anthocyanin chính được tìm thấy trong lớp vỏ màu đỏ của hành tím Cyanidin 3-laminaribioside, peonidin và pelargonidin glucosides chiếm một phần nhỏ hơn [10]
Tổng quan về polyphenol
Polyphenol là hợp chất chuyển hóa thứ cấp chủ yếu trong thực vật, thuộc nhóm lớn các dẫn xuất phenylalanine với cấu trúc đặc trưng gồm ít nhất hai vòng phenolic thơm (C6 – OH) Một vòng thơm hình thành từ sự ngưng tụ của ba đơn vị malonyl Co – A liên kết với gốc phenylpropanoid từ phenylalanine Polyphenol được chia thành ba nhóm chính: flavonoid (C6 – C3 – C6), stilbene (C6 – C2 – C6) và proanthocyanidin [(C6 – C3 – C6)n].
[11] Polyphenol là hợp chất có khả năng tan trong nước, có trọng lượng phân tử từ 500 –
3000 (Da), chứa từ 12 đến 16 nhóm phenolic hydroxyl [12]
Polyphenol được chuyển hóa qua hai con đường chính: con đường shikimic, dẫn đến sản phẩm phenylpropanoid, và con đường acid acetic, với các phenol đơn giản là sản phẩm chủ yếu Nghiên cứu cho thấy có khoảng 100.000 đến 200.000 chất chuyển hóa thứ cấp tồn tại, chiếm 20% carbon cố định qua quang hợp nhờ vào con đường phenylpropanoid Sự kết hợp giữa hai con đường chuyển hóa này còn tạo ra các hợp chất khác như flavonoid.
Các hợp chất phenolic được phân loại thành nhiều nhóm nhỏ dựa trên cấu trúc phenol, nhóm thế và loại liên kết giữa các đơn vị phenol Polyphenol có thể được chia thành các loại như acid phenolic, phenolic aldehyde (bao gồm vanillin và salicyaldehyde), flavonoid, isoflavonoid, tannin, lignin và lignan.
Acid phenolic là một loại polyphenol với nhiều nhóm OH gắn trên vòng thơm, bao gồm hai khung chính: acid benzoic với 7 nguyên tử C (C6 – C1) và acid cinnamic với 9 nguyên tử C (C3 – C6) Các dẫn xuất của acid benzoic như ρ – hydroxybenzoic, protocatechuic, salicylic, gallic và ellagic, trong khi acid cinnamic có các dẫn xuất như ρ – coumaric, caffeic và ferulic Acid phenolic đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng, hỗ trợ sức khỏe con người thông qua các tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, cân bằng hệ miễn dịch, ngăn ngừa dị ứng, xơ cứng động mạch, kháng khuẩn, bảo vệ tim mạch, và phòng ngừa ung thư cũng như tiểu đường.
Flavonoid là một loại polyphenol phổ biến, nổi bật với sự hiện diện của màu sắc trong các nguyên liệu thực vật như rau củ, thảo dược và gia vị Chúng có cấu trúc gồm 15 nguyên tử carbon và 2 vòng thơm được nối với nhau bằng một cầu 3 nguyên tử carbon Dựa vào sự khác biệt trong cấu trúc của các vòng carbon, flavonoid được phân loại thành nhiều nhóm khác nhau, bao gồm flavones, flavanones, isoflavanones, flavanols, flavan-3-ols và anthocyanidins.
Flavones và flavanols là hai loại flavonoid quan trọng trong thực vật Flavones có cấu trúc ba vòng với ba nhóm chức, bao gồm một ketone tại vị trí C4, một liên kết đôi tại C2 – C3 và các nhóm hydroxyl khác nhau tùy thuộc vào từng loại flavone Trong khi đó, flavonols thiếu một nhóm OH ở vị trí thứ ba so với flavones Các flavonol tiêu biểu bao gồm quercetin, kaempferol, myricetin và isorhamnetin.
Isoflavanones là các chất chuyển hóa phụ trợ có hoạt tính sinh học, được tạo ra từ đường phenylpropanoid và thường xuất hiện dưới dạng glycoside như 7-O-β-D-glycoside, 6”-O-acetyl-7-O-β-D-glucoside và 6”-O-malonyl-7-O-β-D-glycoside, với màu vàng đặc trưng Chúng có khả năng kết hợp với các thụ thể estrogen, do đó được xem là phytoestrogen Isoflavanones khác biệt với các flavonoid khác nhờ vị trí vòng benzene C3, và chúng mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như bảo vệ đường ruột, ngăn ngừa loãng xương, kháng viêm, chống ung thư, béo phì và tiểu đường.
Flavanones là một nhóm flavonoid quan trọng trong y học, thường có mặt trong trái cây họ múi như chanh, cam và bưởi Một số flavanones phổ biến bao gồm hesperidin, naringenin và eriodictyol Chúng có khả năng chống gốc tự do, chống viêm, chống ung thư, bảo vệ tim mạch và chống virus, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.
Anthocyanins là hợp chất màu tự nhiên quan trọng thuộc nhóm flavonoid, bao gồm các dẫn xuất polyhydroxy và polymethoxy của glycosyl hóa hoặc muối phenylbenzopyrylium Một số anthocyanin phổ biến như pelargonidin, cyanidin, peonidin, delphinidin, petunidin và malvidin, chủ yếu xuất hiện ở vỏ các loại quả như mâm xôi và nho đen Chúng có khả năng tiêu diệt gốc tự do qua hai con đường: tấn công nhóm hydroxyl trên vòng B và tấn công ion oxonium trên vòng C.
- Stilbenes: Stilbenes chứa 2 phân tử phenyl được nối với nhau bằng cầu metylen 2 –
C, chứa 2 vòng thơm và tồn tại ở dạng đồng phân, tự do và glycosyl hóa
Lignans và lignin là hai hợp chất quan trọng trong tự nhiên, với lignans là các đơn vị C6 – C3 liên kết tại vị trí 8 và 80, trong khi lignin có cấu trúc phức tạp hơn với các vị trí C9 và C90 được thay thế khác nhau Lignans thường có mặt dưới dạng tự do trong các loại đậu, hạt và dầu thực vật nhờ vào cấu trúc glycosylated, bao gồm các thành phần như furan, dibenzylbutane và aryltetralin Ngược lại, lignin là một polymer sinh học được hình thành từ sự liên kết oxy hóa phenolic của các monomer ρ – hydroxycinnamoyl thông qua enzyme peroxidase.
Tannins là một hợp chất phenolic có trọng lượng lớn, tồn tại tự nhiên và tan trong nước Chúng được chia thành hai dạng chính: tannin thủy phân và tannin ngưng tụ Tannin thủy phân được phân loại thành gallotannin, trong đó quá trình thủy phân tạo ra đường và acid gallic, và ellagitannin, sau khi thủy phân sẽ tạo ra đường, acid gallic và acid ellagic.
2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến polyphenol a pH pH là yếu tố chỉnh ảnh hưởng đến sự ổn định của polyphenol trong nguyên liệu thực vật Giá trị pH càng thấp, độ ổn định của polyphenol càng cao Ví dụ, phenolic của vỏ hạt kê không thay đổi ở pH cao đến pH gần như trung tính (pH = 6.5), tuy nhiên hàm lượng phenolic lại giảm khi kiềm tăng lên pH = 10 [14] Thành phần catechin có trong trà ổn định khi pH dưới 4 nhưng khi ở pH từ 6 trở lên, nó trở nên mất ổn định [15] Các tác động của pH cũng được phản ánh thông qua khả năng hấp thụ, hình dạng và phản ứng hóa học của polyphenol, đây cũng là nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi về màu sắc của chúng Anthocyanin có thể được tìm thấy ở các dạng hóa học khác nhau tùy thuộc vào độ pH của
10 dung dịch Đối với môi trường pH = 1, anthocyanin có màu đỏ nhưng ở pH 6 anthocyanin bị thoái hóa [16] b Nhiệt độ
Việc kiểm soát nhiệt độ là yếu tố quan trọng để duy trì sự ổn định của polyphenol Nghiên cứu cho thấy tổng hàm lượng phenolic giảm 20.21% khi đun nóng ở 70°C trong 30 phút, và giảm đáng kể khi gia nhiệt ở 90°C Ngược lại, ở nhiệt độ 4°C, polyphenol giữ được độ ổn định tốt và cấu trúc tương đối bền vững trong thời gian dài, nhờ vào việc ức chế hoạt động của phenol oxidase, làm giảm quá trình oxy hóa.
Quá trình oxy hóa polyphenol thành quinon là nguyên nhân chính làm giảm hàm lượng polyphenol, với tỷ lệ oxy tác động tỷ lệ thuận với mức độ oxy có mặt Oxy có thể thúc đẩy quá trình oxy hóa ngay cả ở áp suất thấp Hiện tượng hóa nâu xảy ra do sự mất cân bằng giữa quá trình oxy hóa và khử, ảnh hưởng đến hàm lượng và hiệu suất trích ly polyphenol.
Hình 2 3.Sự thay đổi cấu trúc hóa học của anthocyanin theo pH [16]
Hàm lượng polyphenol có thể bị ảnh hưởng nghiêm trọng khi tiếp xúc với ánh sáng Nghiên cứu cho thấy rằng anthocyanin giảm đáng kể sau 24 giờ tiếp xúc với ánh sáng so với việc bảo quản trong tối Ánh sáng không được kiểm soát có thể dẫn đến đồng phân hóa polyphenol, trong khi chiếu xạ UV có thể làm tăng sự thay đổi màu sắc, khiến polyphenol chuyển sang trạng thái sẫm màu, từ đó ảnh hưởng đến chất lượng của chúng.
Tổng quan về các phương pháp trích ly
Phương pháp Soxhlet là một kỹ thuật cổ điển thường được áp dụng để trích ly chất béo và các hợp chất sinh học Trong quy trình này, mẫu được ngâm trong dung môi, dung môi sẽ liên tục bốc hơi, ngưng tụ và tiếp xúc với mẫu để tách chiết các chất cần thu nhận Phương pháp này đảm bảo nhiệt độ hệ thống ổn định, không cần thực hiện bước lọc sau khi trích và cho phép trích xuất nhiều mẫu cùng lúc.
Mặc dù có 14 mẫu tăng năng suất xử lý mẫu, phương pháp này vẫn gặp một số hạn chế như thời gian trích ly kéo dài, dẫn đến việc tiêu tốn một lượng lớn dung môi Việc trích ly trong thời gian dài và ở nhiệt độ cao có thể làm hỏng các thành phần bên trong mẫu, ảnh hưởng đến chất lượng hợp chất cần trích ly Hơn nữa, kỹ thuật này còn hạn chế trong việc lựa chọn dung môi và không có hệ thống khuấy trộn mẫu.
2.3.2 Phương pháp ngâm dung môi
Ngâm dung môi là phương pháp truyền thống dễ thực hiện, được phân chia thành hai loại chính: ngâm dầm và ngấm kiệt, dựa vào trạng thái làm việc của hai pha.
Ngâm dầm là một phương pháp chiết xuất đơn giản, trong đó mẫu được ngập trong dung môi và giữ ở nhiệt độ, thời gian nhất định Sau khi hoàn thành, hỗn hợp được lọc để thu được dịch trích Có nhiều cách ngâm khác nhau như ngâm tĩnh, ngâm động, và ngâm ở nhiệt độ thấp hoặc cao, tùy thuộc vào đặc tính của mẫu Phương pháp này có thao tác dễ thực hiện, chi phí thấp và không yêu cầu nhiều thiết bị Tuy nhiên, năng suất thu được từ quá trình ngâm dầm thường thấp, và tiêu tốn nhiều thời gian cũng như dung môi.
Ngấm kiệt là phương pháp chiết xuất tương tự như ngâm dầm, nhưng khác ở bước lọc Sau khi lọc bã, dung môi sẽ được tiếp tục thêm vào để thực hiện quá trình ngâm, và bước này được lặp lại từ 2 đến 3 lần tùy thuộc vào nguyên liệu Phương pháp này nhằm chiết xuất triệt để lượng hoạt chất có trong mẫu Tuy nhiên, nó là phương pháp thủ công, có năng suất thấp, tốn thời gian và tiêu tốn nhiều dung môi.
2.3.3 Phương pháp trích ly hỗ trợ siêu âm
Phương pháp trích ly hỗ trợ siêu âm được coi là kỹ thuật xanh, cho phép chiết xuất nhanh chóng các hợp chất sinh học chỉ trong vài phút Sóng siêu âm tạo ra tác động cơ học, phá vỡ cấu trúc tế bào và tăng cường sự thẩm thấu của dung môi vào mẫu, giúp tiết kiệm thời gian, dung môi và năng lượng Thiết bị siêu âm không chỉ khởi động nhanh chóng mà còn có tính chọn lọc, giảm thiểu sự chênh lệch nhiệt độ, từ đó nâng cao hiệu suất trích ly Tuy nhiên, việc sử dụng sóng siêu âm có thể làm tăng nhiệt độ, ảnh hưởng đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất nhạy cảm với nhiệt như polyphenol.
2.3.4 Phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng
Trích ly hỗ trợ vi sóng là phương pháp sử dụng sóng điện từ để tác động trực tiếp đến các chất phân cực như nước và dung môi, nhằm phá vỡ cấu trúc tế bào mẫu Sóng điện từ có tần số từ 300 MHz đến 300 GHz và bước sóng từ 1mm đến 1m Phương pháp này mang lại nhiều lợi ích như gia nhiệt nhanh, chiết tách hiệu quả, năng suất cao, tiết kiệm thời gian và dung môi Mặc dù có hiệu quả cao và khả năng thu hồi lớn, nhưng nếu không kiểm soát nhiệt độ, vi sóng có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến các hoạt chất sinh học, chỉ phù hợp cho quy mô phòng thí nghiệm, vì nhiệt độ dung môi tăng nhanh có thể dẫn đến nguy cơ cháy nổ.
2.3.5 Trích ly siêu tới hạn Đây là một phương pháp hiện đại và thân thiện với môi trường Chất lỏng siêu tới hạn là chất khí có áp suất và nhiệt độ cao hơn điểm tới hạn nhưng độ nhớt và độ khuếch tán vẫn mang tính chất của một chất khí Những chất lỏng siêu tới hạn thường có độ khuếch tán cao, độ nhớt thấp và các tính vận chuyển tốt, dễ dàng khuếch tán vào mẫu và tăng tốc độ trích ly
CO2 là chất khí lý tưởng cho quá trình trích ly nhờ vào tính chất không mùi, không vị, không độc hại, và giá thành thấp Ngoài ra, CO2 có khả năng kết hợp với các chất chứa oxy, làm tăng hiệu quả trích ly Ethanol và methanol được bổ sung tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm Điều kiện vận hành tối ưu cho phương pháp trích ly siêu giới hạn thường là CO2 ở nhiệt độ 31°C và áp suất 7.4 MPa.
Chất lỏng siêu tới hạn có độ nhớt và sức căng bề mặt thấp, cùng với hệ số khuếch tán cao, giúp xâm nhập vào mẫu nhanh chóng và dễ dàng, ngăn chặn sự suy giảm và oxy hóa các hợp chất cần trích ly Quá trình chiết xuất diễn ra hoàn toàn trong thời gian ngắn, và sau khi hoàn tất, chất lỏng siêu tới hạn có thể tái sử dụng, góp phần giảm thiểu chất thải và tiết kiệm dung môi Phương pháp này hiện đang được áp dụng rộng rãi.
Độ ẩm và tạp chất trong CO2 công nghiệp có thể cản trở quá trình chiết xuất, do đó cần thiết phải có hệ thống làm sạch chất lỏng để loại bỏ các tạp chất này, giúp tăng cường hiệu quả và giảm chi phí cho quá trình.
2.3.6 Trích ly sử dụng dung môi ở áp suất cao
Phương pháp sử dụng dung môi ở áp suất cao (2 – 20 MPa) và nhiệt độ cao (lên đến
Công nghệ trích ly ở nhiệt độ 200 độ C sử dụng nước làm dung môi, được coi là công nghệ xanh Tính phân cực của nước ở nhiệt độ và áp suất cao tương tự như cồn, giúp hòa tan các hợp chất có phân cực thấp Quá trình này được thực hiện trong điều kiện tránh ánh sáng và oxy để đảm bảo hiệu quả tối ưu.
Phương pháp sử dụng nước làm dung môi thay thế cho dung môi hữu cơ giúp tiết kiệm chi phí và dung môi nhờ khả năng tái sử dụng hoặc loại bỏ sau quá trình trích ly Tuy nhiên, phương pháp này chỉ phù hợp cho phân tích, vì một số hợp chất sinh học có thể bị ảnh hưởng đến cấu trúc và tính chất khi tiếp xúc với nhiệt độ cao hoặc thời gian trích ly kéo dài.
Phương pháp tối ưu hóa
2.4.1 Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)
Tối ưu hóa là quá trình cải thiện hiệu suất của hệ thống, quy trình hoặc sản phẩm nhằm đạt hiệu suất tối đa Phương pháp truyền thống thường theo dõi ảnh hưởng của một yếu tố tại mỗi lần thí nghiệm, nhưng không phản ánh được sự tương tác giữa các biến, dẫn đến tăng số thí nghiệm và chi phí Để khắc phục, phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) đã ra đời, cung cấp công cụ tính toán và thống kê, giảm thiểu số thí nghiệm và rút ngắn thời gian thực hiện Ví dụ, trong nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết xuất vitamin E từ mầm lúa mì, RSM đã xác định ảnh hưởng của áp suất, nhiệt độ và tốc độ dòng khí CO2, dự đoán nồng độ vitamin E tối ưu là 2307mg/100g.
Phương pháp RSM mang lại nhiều ưu điểm trong nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện trích ly polyphenol từ bột vỏ hanh tím Phương pháp này được áp dụng để tối ưu hóa quá trình trích ly, giúp nâng cao hiệu quả và chất lượng sản phẩm.
17 ba điều kiện: nồng độ ethanol (%), tỉ lệ mẫu: dung môi (g/ml), thời gian vi sóng (giây) nhằm đạt được hiệu suất trích ly tốt nhất
2.4.2 Mô hình Box – benhken (BBD)
Thiết kế Box – Behnken (BBD) là một phương pháp hiệu quả trong việc thiết kế thí nghiệm, cho phép đánh giá tác động của các yếu tố thông qua ba mức giá trị (-1, 0, +1) tương ứng với thấp, trung bình và cao BBD thuộc về thiết kế trong mô hình phản ứng bề mặt (RSM), giúp ước tính hiệu quả của các hệ số bậc 1 và bậc 2 Phương pháp này tiết kiệm hơn so với các thiết kế khác, đặc biệt khi số lượng biến lớn, và do đó thường được áp dụng trong các nghiên cứu tối ưu hóa Một nghiên cứu đã sử dụng thiết kế Box – Behnken để xây dựng mô hình và tối ưu hóa các điều kiện liên quan đến đặc tính và màu sắc của cà chua trong hệ thống sấy đối lưu, cho thấy mô hình bậc 2 có ảnh hưởng đáng kể đến màu sắc của cà chua sau khi sấy.
Phân tích hồi quy và phương sai (ANOVA) trong quá trình trích ly được thực hiện qua phần mềm expert design để xây dựng các mô hình ANOVA giúp xác định mối quan hệ giữa các biến và đánh giá ý nghĩa thống kê của các yếu tố trong mô hình thông qua các giá trị p và F Độ tin cậy của mô hình được thể hiện qua các chỉ số R², R² hiệu chỉnh, R² dự đoán và hệ số biến thiên.
Tình hình nghiên cứu về tối ưu hóa quá trình trích ly polyphenol từ nguyên liệu tự nhiên 17 1 Tình hình nghiên cứu trong nước
2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu trong nước đã khám phá hiệu suất trích ly polyphenol từ vỏ hành tím, tối ưu hóa các thông số quan trọng như tỉ lệ dung môi:mẫu, thời gian và công suất vi sóng Nhiều nghiên cứu cũng đã đánh giá các hợp chất chống oxy hóa của polyphenol, so sánh các phương pháp trích ly khác nhau để tìm ra phương pháp tối ưu cho ứng dụng trong chăm sóc sức khỏe và chống oxy hóa tự nhiên.
Nghiên cứu này tập trung vào tối ưu hóa quá trình trích ly polyphenol từ vỏ lụa hạt điều bằng công nghệ vi sóng Mục tiêu chính là xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly và thực hiện tối ưu hóa để nâng cao hiệu quả.
Để đạt được hiệu suất tối ưu trong quá trình trích ly, các yếu tố quan trọng bao gồm công suất và thời gian vi sóng Kết quả tối ưu cho thấy rằng phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng mang lại hiệu quả cao hơn so với phương pháp truyền thống, với khả năng bắt gốc tự do tốt và hiệu suất kháng oxy hóa vượt trội.
Phương pháp đáp ứng bề mặt ứng dụng đã được áp dụng để tối ưu hóa quy trình trích ly quercetin từ củ hành tím Nghiên cứu tập trung vào việc khảo sát các thông số quan trọng như nồng độ, nhiệt độ và thời gian trích ly Kết quả cho thấy rằng biện pháp tiền xử lý đã có ảnh hưởng tích cực đến hiệu quả của quá trình trích ly.
Tuy nhiên, tình hình nghiên cứu về tối ưu hóa phương pháp trích ly polyphenol từ vỏ hành tím có hỗ trợ vi sóng còn khá hạn chế
2.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trên toàn cầu, việc tối ưu hóa phương pháp trích ly polyphenol từ vỏ hành tím đang nhận được sự chú ý và phát triển mạnh mẽ Nhiều quốc gia và tổ chức đã tiến hành nghiên cứu và đạt được những kết quả tích cực trong lĩnh vực này.
Khảo sát phương pháp trích ly hợp chất oxy hóa từ hành tím và hành tây với sự hỗ trợ của vi sóng và siêu âm cho thấy các phương pháp hiện đại mang lại hiệu quả cao, tiết kiệm thời gian và chi phí Nghiên cứu này mở ra tiềm năng ứng dụng cho các sản phẩm thực phẩm chức năng Bên cạnh đó, màu sắc tự nhiên của hành tím cũng có khả năng ứng dụng trong việc tạo màu cho thực phẩm, mỹ phẩm và vải.
Phương pháp trích ly bằng vi sóng không chỉ được áp dụng cho một số nguyên liệu tự nhiên mà còn cho rau diếp, nơi polyphenol được trích xuất thông qua thiết bị vi sóng Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa các thông số khảo sát, nhằm tạo nền tảng cho việc sản xuất quy mô lớn mà vẫn đảm bảo ngăn ngừa ô nhiễm.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và hóa chất
Vỏ hành tím được thu gom từ Chợ đầu mối nông sản Thủ Đức Địa chỉ: 141 QL1A, Tam Binh, Thành Phố Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh
Cửa hàng hóa chất SBC Scientific, tọa lạc tại 568/52 Lê Văn Việt, P Long Thạnh Mỹ, Tp Thủ Đức, TP.HCM, cung cấp các hóa chất phục vụ nghiên cứu với nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc, Mỹ và Hà Lan Các sản phẩm tại đây có độ tinh khiết từ 95% đến 99.5%, đảm bảo chất lượng cho các ứng dụng khoa học.
Quy trình sản xuất bột vỏ hành tím trong nghiên cứu
3.2.1 Sơ đồ quy trình công nghệ
3.2.2 Thuyết minh quy trình công nghệ
Vỏ hành tím sau khi thu gom từ chợ đầu mối sẽ được xử lý và phân loại, rửa sạch với nước để loại bỏ rác và bụi bẩn Tiếp theo, vỏ hành tím được sấy đối lưu ở nhiệt độ 40°C để bảo toàn polyphenol và đạt độ ẩm 8% Sau khi sấy, vỏ hành tím được nghiền nhỏ bằng máy nghiền bột, tạo độ đồng nhất cho hạt bột và được sàng qua rây 0.2mm, giúp tăng diện tích tiếp xúc với dung môi và nâng cao hiệu suất trích ly Cuối cùng, bột vỏ hành tím được bảo quản ở nhiệt độ 4°C cho đến khi sử dụng.
Hình 3 1 Quy trình sản xuất bột vỏ hành tím
Quy trình trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím có hỗ trợ vi sóng
3.3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ
3.3.2 Thuyết minh quy trình công nghệ
Tiến hành cân 1g bột vỏ hành tím và hút 10, 15, 20, 25, 30ml dung môi ethanol với các nồng độ 50, 60, 70, 80, 90% vào erlen 100ml, sau đó đậy kín bằng màng bọc thực phẩm Thiết lập thông số vi sóng với thời gian 30, 60, 90, 120, 150 giây và công suất 180, 360, 450, 720, 900W để xử lý các mẫu Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác Sau khi vi sóng, mẫu sẽ được li tâm trong 25 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút, tiếp theo là lọc để loại bỏ bã và thu được dịch trích Dịch trích sau khi ly sẽ được đựng trong ống thủy tinh tối màu để bảo vệ khỏi tác động của ánh sáng.
Vi sóng Phối trộn Định lượng
Hình 3 2 Quy trình trích ly polyphenol từ vỏ hành tím có hỗ trợ vi sóng
22 động của ánh sáng mặt trời đến chất lượng của polyphenol và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh cho đến khi đo.
Quy trình trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím bằng phương pháp ngấm kiệt
Bột vỏ hành Định lượng
Hình 3 3 Quy trình trích ly polyphenol từ vỏ hành tím bằng phương pháp ngấm kiệt
3.4.2 Thuyết minh quy trình công nghệ
Cân 1g bột vỏ hành tím và cho vào bình erlen 100ml cùng với 25ml dung môi ethanol, thực hiện thí nghiệm lặp lại 3 lần Đậy kín các bình bằng màng bọc thực phẩm và bọc giấy bạc để tránh ánh sáng Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng và ngâm trong 24h Sau đó, lọc bã để thu dịch trích, bã tiếp tục ngâm với 25ml dung môi ethanol và lặp lại quá trình 3 lần, mỗi lần cách nhau 24h Dịch trích sau mỗi lần lọc được trộn lại và bảo quản trong ống tối màu.
Nội dung nghiên cứu
3.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím
Thí nghiệm 1.1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến quá trình trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím a Mục đích
Sản xuất bột vỏ hành tím
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly pholyphenol từ bột vỏ hành tím
Quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím
So sánh các chỉ tiêu của trích ly polyphenol bằng vi sóng và truyền thống
- Dựng đường chuẩn gallic acid
- Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol
- Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu và dung môi
- Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian và công suất của thiết bị vi sóng
- Yếu tố ảnh hưởng đầu vào: Nồng độ dung môi, tỉ lệ mẫu và dung môi, thời gian, công suất vi sóng
- Hàm mục tiêu: Hàm lượng polyphenol tổng, anthocyanin, khả năng kháng oxy hóa và khử
- Thực hiện trích ly polyphenol theo phương pháp ngấm kiệt
- So sánh hiệu suất với phương pháp hiện đại
Hình 3 4 Sơ đồ nghiên cứu
Dung môi ethanol được coi là một trong những dung môi an toàn nhất và được người dùng tin tưởng Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trích ly, giúp tạo ra môi trường truyền nhiệt để phá vỡ cấu trúc mẫu và giải phóng polyphenol Do đó, thí nghiệm này sẽ khảo sát nồng độ dung môi nhằm tìm ra nồng độ tối ưu cho hiệu quả trích ly tốt nhất.
- Cố định các yếu tố:
Tỉ lệ mẫu/ dung môi: 1/25 (g/ml)
Thời gian vi sóng: 60 giây
- Tiến hành: Cân 1g bột hành tím và 25ml dung môi ethanol theo từng nồng độ 50, 60,
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành trích ly polyphenol với các nồng độ dung môi 70%, 80% và 90% theo sơ đồ Hình 3.2, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Kết quả thu được sẽ giúp xác định hàm lượng polyphenol và lựa chọn nồng độ dung môi tối ưu cho quá trình trích ly.
Thí nghiệm 1 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột vỏ hành tím/ dung môi ethanol đến quá trình trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím a Mục đích
Khảo sát tỷ lệ mẫu và dung môi không chỉ nâng cao hiệu suất trích ly mà còn ảnh hưởng tích cực đến hiệu quả kinh tế, giúp giảm thiểu lãng phí dung môi Việc tiến hành khảo sát này là rất cần thiết để tối ưu hóa quy trình.
- Cố định các yếu tố:
Nồng độ dung môi: Kết quả thu được ở thí nghiệm 1
Thời gian vi sóng: 60 giây
Để tiến hành nghiên cứu, chúng tôi đã định lượng tỉ lệ bột vỏ hành tím và dung môi theo các tỉ lệ 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, 1/30 (g/ml) và thực hiện quá trình trích ly theo sơ đồ Hình 3.2, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Sau đó, hàm lượng polyphenol được xác định để chọn ra nồng độ dung môi tối ưu.
Thí nghiệm 1 3: Khảo sát ảnh hưởng của công suất vi sóng đến quá trình trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím a Mục đích
Vi sóng sử dụng sóng điện từ để phá vỡ cấu trúc tế bào của bột vỏ hành, nhưng công suất vi sóng cần được điều chỉnh cẩn thận Công suất quá cao có thể làm giảm hoạt tính sinh học của polyphenol, trong khi công suất quá thấp sẽ không đủ để trích ly triệt để hàm lượng polyphenol trong vỏ hành tím Do đó, việc khảo sát công suất vi sóng là rất quan trọng trong quá trình nghiên cứu.
- Cố định các yếu tố:
Nồng độ dung môi: Kết quả thu được ở thí nghiệm 1
Tỉ lệ mẫu/ dung môi: Kết quả thu được ở thí nghiệm 2
Thời gian vi sóng: 60 giây
Tiến hành định lượng mẫu và dung môi theo tỉ lệ và nồng độ đã thiết lập trong thí nghiệm 1 và 2 Sau đó, thực hiện vi sóng hỗn hợp với công suất vi sóng lần lượt là 180, 360 và 540.
720, 900W và bố trí thí nghiệm theo sơ đồ Hình 3.2 (mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần) Xác định hàm lượng polyphenol và chọn nồng độ dung môi tối ưu
Thí nghiệm 1 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian vi sóng đến quá trình trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím a Mục đích
Thời gian vi sóng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly polyphenol Thời gian kéo dài có thể dẫn đến thất thoát polyphenol do tác động nhiệt, trong khi thời gian quá ngắn không đủ để thu hồi hết polyphenol Do đó, khảo sát đã được thực hiện để xác định thời gian vi sóng tối ưu nhất.
- Cố định các yếu tố:
Nồng độ dung môi: Kết quả thu được ở thí nghiệm 1
Tỉ lệ mẫu/ dung môi: Kết quả thu được ở thí nghiệm 2
Công suất vi sóng: Kết quả thu được ở thí nghiệm 3
Tiến hành định lượng mẫu và dung môi theo tỉ lệ và nồng độ của thí nghiệm 1 và 2 Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ Hình 3.2, với thời gian vi sóng là 30 giây.
60, 90, 120, 150 giây (mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần) Sau đó xác định hàm lượng polyphenol và chọn nồng độ dung môi tối ưu
3.5.2 Thí nghiệm 2: Tối ưu hóa các điều kiện trích ly và kiểm chứng kết quả tối ưu a Mục đích
Quá trình tối ưu hóa điều kiện trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím nhằm xác định các thông số tối ưu và đưa ra dự đoán chính xác về hàm mục tiêu Thực nghiệm kiểm tra đối chứng kết quả của mô hình sẽ giúp rút ra những kết luận quan trọng Bên cạnh đó, quy trình này còn giúp giảm thiểu số lượng thí nghiệm cần thực hiện, tiết kiệm thời gian và chi phí.
Sau khi khảo sát các yếu tố, chúng tôi đã thu được thông số tối ưu cho kết quả TPC cao nhất Các yếu tố này được tối ưu hóa bằng phương pháp RSM với sự hỗ trợ của phần mềm Expert Design Thí nghiệm được thiết kế nhằm đánh giá mức độ ảnh hưởng và tương tác của các yếu tố như nồng độ ethanol, tỉ lệ mẫu: dung môi, và thời gian vi sóng đến hàm lượng polyphenol, anthocyanin và khả năng kháng oxy hóa, thông qua mô hình BBD Các yếu tố đã được mã hóa thành các biến để thuận tiện cho việc phân tích.
X1, X2, X3 và giá trị biến được biểu diễn ở 3 mức -1, 0, +1 tương ứng với giá trị thấp, trung bình và cao
Thiết kế BBD bao gồm 15 thí nghiệm, trong đó có 3 thí nghiệm tại tâm và 12 thí nghiệm tổ hợp Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần để lấy giá trị trung bình làm kết quả Quá trình trích ly được thực hiện theo Hình 3.2.
Các hàm mục tiêu được xác định theo phương trình:
Y = β0 + β1X1 + β2X2 + β3X3 + β12X1X2 + β13X1X3 + β23X2X3 + β11𝑋 1 2 + β22𝑋 2 2 + β33𝑋 3 2 Trong đó: Y: Hàm mục tiêu β0: Hằng số β1, β2, β3, β4: Các hệ số tuyến tính β1 β2, β1 β3, β2 β3: Các hệ số tương tác của 3 biến β11, β22, β33: Các hệ số bậc 2
Sau khi thực hiện 15 thí nghiệm, chúng tôi đã xác định được TPC, anthocyanin và DPPH Kết quả ANOVA, đồ thị RSM và hàm mục tiêu đã được phân tích để đưa ra nhận xét và kết luận rõ ràng về các biến độc lập X1, X2, X3.
Tiến hành thực nghiệm với các thông số tối ưu hóa từ mô hình đã chỉ ra, chúng tôi xác định khả năng kháng oxy hóa của mẫu thực nghiệm thông qua phương pháp khử Fe 3+.
3.5.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu suất trích ly polyphenol và khả năng kháng oxy hóa của polyphenol trích ly bằng phương pháp hỗ trợ vi sóng và phương pháp trích ly ngấm kiệt a Mục đích
Khảo sát và đánh giá hiệu suất trích ly giữa phương pháp hiện đại vi sóng và phương pháp truyền thống ngấm kiệt Bài viết sẽ phân tích ưu điểm, nhược điểm và khả năng ứng dụng của từng phương pháp trong quá trình trích ly Cách tiến hành nghiên cứu sẽ được trình bày chi tiết, nhằm cung cấp cái nhìn toàn diện về hiệu quả và tính khả thi của các phương pháp này.
Phương pháp phân tích
3.6.1 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng (TPC) a Nguyên tắc
Polyphenol được xác định thông qua phương pháp đo màu sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu, trong đó chứa acid phosphor-vonframic có tính oxy hóa Trong quá trình khử, các nhóm hydroxyl phenol dễ dàng bị oxy hóa, tạo ra màu xanh ở bước sóng 765nm do sự hiện diện của vonfarm và molypden.
Để chuẩn bị dung dịch Folin – Ciocalteu 10%, cần hút 10ml thuốc thử vào bình định mức 100ml và thêm nước cất đến vạch Bình đựng thuốc thử nên được bọc bằng giấy bạc để bảo vệ khỏi ánh sáng, và dung dịch này chỉ nên sử dụng trong ngày.
- Chuẩn bị dung dịch Na2CO3 7.5%: Cân 7.5g Na2CO3 khan vào bình định mức 100ml và đong đến vạch bằng nước cất
- Xây dựng đường chuẩn acid gallic:
Cân 0.11 ± 0.001g acid gallic khan vào bình định mức 100ml, đong đến vạch bằng nước cất và lắc đều
Nồng độ acid gallic pha loãng với nước cất 20, 40, 60, 80, 100 mg/l Hút 2ml mỗi nồng độ acid gallic vào ống nghiệm, thêm 5ml Folin – ciocalteu 10% ủ trong tối
5 phút Sau đó, thêm 4ml dung dịch Na2CO3 7.5%, tiếp tục ủ tối trong 1 giờ Đo độ hấp thụ ở bước sóng 765nm
Để xác định hàm lượng polyphenol tổng, hút 2ml mẫu (pha loãng 100 lần) vào ống nghiệm và thêm 5ml dung dịch thuốc thử Folin – Ciocalteu 10%, ủ trong 5 phút Tiếp theo, thêm 4ml dung dịch Na2CO3 7.5% và ủ trong 1 giờ ở nơi tối Đo độ hấp thụ ở bước sóng 765nm và lặp lại thí nghiệm 3 lần Acid gallic được sử dụng để dựng đường chuẩn, kết quả đo hàm lượng polyphenol của mẫu được biểu diễn bằng mg acid gallic (mg GAE/g chất khô).
Trong đó: A: Giá trị hấp thụ của mẫu ở 765 nm b: Điểm cắt trục y của đường chuẩn
𝑚: Độ dốc của đường chuẩn độ
V: Thể tích dịch trích (ml)
Nồng độ (ppm) Đường chuẩn Gallic Acid
Hình 3 5 Đường chuẩn gallic acid
1000: Hệ số chuyển đổi đơn vị ppm sang mg/ml
DW: Hàm lượng chất khô của mẫu thử (%)
3.6.2 Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa (DPPH) a Nguyên tắc
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một hợp chất cho phép đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua sự thay đổi màu sắc của dung dịch Khi electron tự do của phân tử nito trong DPPH bắt cặp với gốc hydro của chất kháng oxy hóa, màu sắc của dung dịch sẽ giảm Mức độ kháng oxy hóa được xác định bằng cách đo độ hấp thu quang ở bước sóng λmax = 517 nm.
Để chuẩn bị dung dịch DPPH 0.1 mM, hòa tan 0.0039g bột DPPH trong methanol và định mức đến 100 mL trong bình định mức Dung dịch này nên được bảo quản trong bình có bọc giấy bạc để tránh ánh sáng và sử dụng trong ngày.
Để xác định khả năng kháng oxy hóa, 0.1ml dịch chiết mẫu (pha loãng 100 lần) được cho vào 3.9 mL dung dịch DPPH - methanol trong ống nghiệm Sau đó, hỗn hợp được lắc đều và ủ trong bóng tối trong 30 phút ở nhiệt độ 30°C Độ hấp thu được đo ở bước sóng 517 nm, với mẫu đối chứng là dung dịch DPPH - methanol, và giá trị trung bình của 3 lần lặp được ghi nhận.
- Xây dựng đường chuẩn trolox:
Dung dịch chuẩn gốc trolox (1000 mg/L): Cân 0.110 ± 0.001 g trolox khan cho vào bình định mức 100 mL Hòa tan trong nước cất đến vạch và trộn đều
Nồng độ của trolox được pha loãng với nước cất ở các mức 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 và 0.1 mg/mL Mỗi nồng độ 0.1 mL được cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 3.9 mL dung dịch DPPH-methanol Ống nghiệm được lắc đều và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 517 nm.
- Xác định Xác định % ức chế DPPH
Trong đó: Ao: Độ hấp thu quang của mẫu đối chứng
Am: Độ hấp thụ quang của mẫu thử
- Xác định hàm lượng kháng oxy hóa
Trong đó: a: Nồng độ trolox (giá trị x) từ đường chuẩn (mg/ml)
V: Thể tích dịch trích (ml)
DW: Hàm lượng chất khô của mẫu thử (%) y = 338.44x R² = 0.9965
Nồng độ Trolox (mg/ml) Đường chuẩn DPPH
3.6.3 Phương pháp xác định hàm anthocyanin a Nguyên tắc
Chất màu anthocyanin có khả năng thay đổi theo pH, với pH = 1, anthocyanin tồn tại dưới dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ tối đa Ở pH = 4.5, chúng chuyển sang dạng carbinol không màu Việc đo mật độ quang của mẫu tại pH = 1 và pH = 4.5 được thực hiện ở bước sóng hấp thụ cực đại, cụ thể đối với vỏ hành tím là 520nm, so với bước sóng 700nm.
- Chuẩn bị dung dịch KCl 0.025M: Hòa tan 0.372g KCl và0 196ml nước cất, dùng HCl hiệu chỉnh dung dịch sao cho dung dịch có pH = 1
- Chuẩn bị dung dịch NaCH3COONa.3H2O 0.4M: Hòa tan 10.886g NaCH3COONa.3H2O vào 192ml nước cất, hiệu chỉnh dung dịch bằng HCl sao cho dung dịch có pH = 4.5
Để xác định hàm lượng anthocyanin, hút 1ml mẫu vào 2 ống nghiệm Thêm 9ml dung dịch KCl vào ống nghiệm 1 và 9ml dung dịch NaCH3COONa.3H2O vào ống nghiệm 2, sau đó ủ ống nghiệm trong 20 phút Tiến hành đo độ hấp thụ ở 2 bước sóng 520nm và 700nm cho mỗi ống nghiệm.
Trong đó: M: Phân tử khối của cyanidin-3glucoside, M = 449.2g/mol
A520, A700: Độ hấp thu tại bước sóng cực đại là 520nm và 700nm ở pH =1 và pH 4.5
DF: Hệ số pha loãng ε: Hệ số tắt phân tử cyanidin-3 glucoside, ε = 26900
1000: Hệ số chuyển đổi từ g sang mg λ: Chiều dày của mẫu khi ánh sáng đi qua, λ = 1cm m: Khối lượng bột mẫu (g)
3.6.4 Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp khử Fe 3+ a Nguyên tắc
Hàm lượng kháng oxy của polyphenol được xác định qua khả năng khử Fe 3+ xuống Fe 2+ Các hợp chất chống oxy hóa tương tác với kali ferricyanide (K3[Fe(CN)6]), tạo thành kali ferrocyanide (K4[Fe(CN)6]) K4[Fe(CN)6] tiếp tục phản ứng với triclorua sắt, dẫn đến sự hình thành feroxyanua sắt, một phức chất màu xanh lam có độ hấp thụ cực đại.
- Chuẩn bị các dung dịch:
Để chuẩn bị đệm phosphate 0.2 M với pH = 6.6, bạn cần cân 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 3.58 g Na2HPO4.12H2O và 0.24 g KH2PO4 Hòa tan các thành phần này trong 800 ml nước cất, sau đó điều chỉnh pH về 6.6 bằng HCl Cuối cùng, chuyển dung dịch vào bình định mức và bổ sung nước cất đến 1000 ml.
K3Fe(CN)6 1 %: Cân 1 g K3Fe(CN)6, hòa tan bằng nước cất, sau đó cho vào fiol định mức lên 100 ml
TCA (Acid trichloroacetic) 10 %: Cân 10 g TCA, hòa tan bằng nước cất, sau đó cho vào fiol định mức lên 100 ml
FeCl3.6H2O 0.1 %: Cân 0.17 g FeCl3.6H2O, hòa tan bằng nước cất, sau đó cho vào fiol định mức lên 100 ml
Ascorbic acid 0.1 %: Cân 0.01 g ascorbic acid, hòa tan bằng nước cất, sau đó cho vào fiol định mức lên 100 ml
- Xác định khả năng kháng oxy hóa bằng khử Fe 3+ :
Lấy 200 µl dịch chiết từ các mẫu cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 200 µl nước, 600 µl K3Fe(CN)6 và 600 µl đệm phosphat pH 6.6 Tiến hành lắc hỗn hợp này ở tủ lắc ở nhiệt độ 50 độ C trong 20 phút để đảm bảo phản ứng diễn ra hiệu quả.
Thờm 600 àl TCA, 2000 àl H 2 O, 400 àl FeCl 3 , lắc đều Sau đú đo hấp phụ quang phổ ở 700 nm (Mỗi phép đo được lặp lại 3 lần)
- Xây dựng đường chuẩn FRAP
Pha loãng acid ascorbic 0.1 % thành 0.01 % Sau đó pha loãng acid ascorbic này với nước cất lần lượt với các nồng độ: 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005 (mg/ml)
Lấy 200 µl dung dịch acid ascorbic pha loãng vào các ống nghiệm, sau đó thêm 200 µl nước, 600 µl K3Fe(CN)6 và 600 µl đệm phosphat pH 6.6 vào từng ống nghiệm Cuối cùng, lắc các ống nghiệm ở tủ lắc ở nhiệt độ 50 độ C trong 20 phút để hoàn thành quá trình.
Thờm 600 àl TCA, 2000 àl H2O, 400 àl FeCl3, lắc đều Sau đú đo hấp phụ quang phổ ở 700 nm
Tiến hành dựng đường chuẩn acid ascorbic theo khả năng chống oxi hóa bằng cách khử sắt tương ứng với từng nồng độ acid ascorbic c Công thức tính
𝑚 Trong đó: DF: hệ số pha loãng
V: thể tích dịch trích ly (ml) m: khối lượng mẫu đem đi trích ly (g) x: giá trị x được tính từ đường chuẩn với y là giá trị hấp thụ của mẫu đo được
3.6.5 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Phương pháp đáp ứng bề mặt được áp dụng để tối ưu hóa điều kiện trích ly polyphenol hỗ trợ vi sóng, với ba yếu tố chính là nồng độ ethanol (X1), tỷ lệ mẫu:dung môi (X2) và thời gian vi sóng (X3) Các thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp Box-Benhnken, bao gồm 15 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả.
Phương pháp xử lí số liệu
Quy trình tối ưu hóa được thực hiện với sự hỗ trợ của phần mềm Expert Design 11.0, trong khi số liệu được phân tích và thống kê bằng phần mềm Minitab 19 Các biểu đồ được tạo ra từ Microsoft Excel 2016, và mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần Kết quả cho thấy mối quan hệ giữa các biến với phương trình y = 60.401x và hệ số xác định R² = 0.9934.
Nồng độ acid ascorbic (mg/ml) Đường chuẩn FRAP
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím có hỗ trợ vi sóng
4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến quá trình trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím
Khả năng trích ly hợp chất thực vật chịu ảnh hưởng mạnh mẽ bởi nồng độ dung môi Kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng TPC đạt 127.1 ± 5.8 (mg GAE/g chất khô) ở nồng độ ethanol 80% là cao nhất và có sự khác biệt có ý nghĩa so với các mẫu khác Điều này chứng tỏ rằng polyphenol, với nhiều nhóm hydroxyl linh động và cấu trúc phân tử lớn, hòa tan tốt trong ethanol 80% nhờ độ phân cực tương đồng giữa ethanol và polyphenol.
Nghiên cứu cho thấy dung môi ethanol là một lựa chọn an toàn và hiệu quả trong việc trích ly các hợp chất phenolic tự nhiên, đặc biệt trong ngành thực phẩm Đặc tính phân cực của dung môi này phụ thuộc vào hằng số điện môi và khả năng hình thành liên kết hydro, trong đó nước có hằng số điện môi và khả năng liên kết hydro cao hơn ethanol Điều này ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất các thành phần phenolic.
H àm lượng po ly ph eno l ( m gG AE /g m ẫu)
Nồng độ ethanol trong dung môi ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả trích ly từ vỏ hành tím Các ký tự ab khác nhau chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong kết quả thu được.
Nghiên cứu của Li và cộng sự cho thấy quá trình chiết xuất polyphenol từ hạt nho được hỗ trợ bởi vi sóng có thể đạt hiệu quả cao Cụ thể, ở nồng độ ethanol 47,2% cùng với các điều kiện tối ưu khác, hàm lượng polyphenol thu được là 78 mg GAE/g chất khô Kết quả này chứng minh rằng mức độ phân cực của môi trường chiết xuất có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất chiết xuất polyphenol.
4.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ bột vỏ hành tím/ dung môi ethanol đến quá trình trích ly polyphenol từ bột vỏ hành tím
Việc tăng thể tích dung môi có thể nâng cao hiệu quả trích ly nhưng cũng làm tăng chi phí và gây lãng phí dung môi Ngược lại, giảm thể tích dung môi có thể dẫn đến hiệu suất trích ly thấp hơn do tác động bão hòa Do đó, tìm ra tỉ lệ hợp lý giữa mẫu và dung môi là yếu tố quan trọng trong quá trình trích ly các hợp chất polyphenol.
Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng polyphenol tăng khi thể tích dung môi tăng từ 10 ml lên 25 ml, đạt cao nhất ở tỉ lệ 1:25 (g/ml) với 131.9 ± 6.2 (mgGAE/g chất khô) Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thể tích nồng độ ethanol, hàm lượng polyphenol lại giảm.
Nồng độ phenolic và các hoạt chất chống oxy hóa trong quá trình chiết xuất phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu và dung môi sử dụng Nghiên cứu về chiết xuất phenolics từ vỏ quả cho thấy sự ảnh hưởng đáng kể của các yếu tố này đến hiệu quả chiết xuất.
H àm lượng po ly ph eno l (m gG AE /g chấ t khô )
Tỉ lệ mẫu : dung môi (g/ml )
Tỉ lệ dung môi/mẫu có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả trích ly polyphenol, với các ký tự abc khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p 0.9.
Các giá trị R² của TPC, anthocyanin và DPPH lần lượt đạt 0.9976, 0.9855 và 0.9953, cho thấy mô hình có độ ổn định cao Sự chênh lệch giữa giá trị R² hiệu chỉnh và R² dự đoán đều lớn hơn 0.2, trong khi độ chính xác phù hợp phải lớn hơn 4, điều này khẳng định rằng mô hình này là phù hợp để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 4 3 Kết quả phân tích ANOVA tối ưu hóa hiệu suất trích ly polyphenol
X2-Tỉ lệ mẫu: dung môi
Fit 3.85 3 1.28 0.3126 0.81962 Không có nghĩa Sai số thuần 8.21 2 4.10
Bảng 4 4 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình và thực nghiệm polyphenol
Bảng 4 5 Kết quả phân tích ANOVA hàm lượng anthocyanin
Trung bình Giá trị F Giá trị P Độ lệch chuẩn 1.55 R 2 0.9976
Giá trị trung bình 152.40 R² hiệu chỉnh 0.9933
Hệ số biến thiên 1.02 R² dự đoán 0.9841 Độ chính xác phù hợp 39.2937
X2-Tỉ lệ mẫu: dung môi
Fit 4.37 3 1.46 2.37 0.3107 Không có nghĩa Sai số thuần 1.23 2 0.6158
Bảng 4 6 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình và thực nghiệm anthocyanin Độ lệch chuẩn 1.06 R 2 0.9855
Giá trị trung bình 65.05 R² hiệu chỉnh 0.9595
Hệ số biến thiên 1.63 R² dự đoán 0.8121 Độ chính xác phù hợp 17.2033
Bảng 4 7 Kết quả phân tích ANOVA hàm lượng kháng oxy hóa
X2-Tỉ lệ mẫu: dung môi
Fit 1.72 3 0.5742 0.2823 0.8377 Không có nghĩa Sai số thuần 4.07 2 2.03
Bảng 4 8 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình và thực nghiệm DPPH
Hình 4.3 và Hình 4.4 minh chứng rằng các yếu tố và sự tương tác giữa chúng có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình trích ly polyphenol, được đánh giá qua giá trị p Các biến độc lập (X2, X3) cùng với ba hệ số bậc hai (X1², X2², X3²) thể hiện tác động mạnh mẽ đến hàm lượng polyphenol Sau khi loại bỏ các hệ số hồi quy không có ý nghĩa, mô hình hàm lượng polyphenol (Y1) được trình bày dưới dạng một phương trình rõ ràng.
Tương tự, ANOVA từ Hình 4.5 và 4.6 cũng cho thấy, các biến độc lập (X2, X3) và cả
3 hệ số bậc 2 đều ảnh hưởng mạnh mẽ đến anthocyanin (Y2) và được biểu diễn ở dạng phương trình:
Phương trình biểu diễn sự ảnh hưởng của 2 biến độc lập ((X2, X3) và 3 hệ số bậc 2 lên khả năng kháng oxy hóa (Y3) từ Hình 4.7 và Hình 4.8 là:
4.3.3 Biểu đồ đáp ứng bề mặt
Mô hình 3D cho thấy mối quan hệ giữa hai yếu tố và một yếu tố cố định tại tâm Dựa vào Bảng 4.3 và Hình 4.5, tỷ lệ mẫu dung môi với giá trị p = 0.0121 cho thấy yếu tố này có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng polyphenol Nồng độ dung môi cũng tác động đến TPC với mức độ ảnh hưởng 90% (p 0.1), nhưng lại tương tác mạnh mẽ với thời gian vi sóng (p < 0.05) Ngoài ra, tương tác bậc 2 giữa các yếu tố cũng cho thấy ảnh hưởng mạnh đến hàm lượng anthocyanin (p < 0.05).
Biểu đồ đáp ứng bề mặt trong Hình 4.6 cho thấy sự tương tác giữa các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng anthocyanin, bao gồm nồng độ dung môi và tỉ lệ mẫu/dung môi, thời gian vi sóng và nồng độ dung môi, cũng như thời gian vi sóng và tỉ lệ mẫu/dung môi.
Theo Bảng 4.7 và Hình 4.7, tỉ lệ dung môi và mẫu có ảnh hưởng lớn đến khả năng kháng oxy hóa của polyphenol với p = 0.0113 Mặc dù nồng độ dung môi không có tác động đáng kể đến khả năng kháng oxy hóa (p > 0.1), nhưng tương tác bậc 1 giữa nồng độ dung môi và thời gian vi sóng lại ảnh hưởng mạnh mẽ đến DPPH (p < 0.05) Hơn nữa, tương tác bậc 2 giữa nồng độ ethanol, tỉ lệ mẫu: dung môi và thời gian vi sóng cũng thể hiện ảnh hưởng lớn đến khả năng kháng oxy hóa với p < 0.05.
Biểu đồ đáp ứng bề mặt cho thấy sự tương tác giữa các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng oxy hóa, bao gồm nồng độ dung môi và tỷ lệ mẫu/dung môi, thời gian vi sóng và nồng độ dung môi, cũng như thời gian vi sóng và tỷ lệ mẫu/dung môi.
Tỉ lệ dung môi ethanol và mẫu có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả trích ly polyphenol Sử dụng dung môi quá nhiều có thể dẫn đến hiện tượng cân bằng pha, gây bão hòa và giảm hiệu suất trích ly Ngược lại, nếu dung môi không đủ, sẽ không đảm bảo sự tiếp xúc đầy đủ giữa mẫu và dung môi, làm giảm khả năng khai thác polyphenol Bột vỏ hành tím cho thấy hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ, chứng minh khả năng dập tắt gốc tự do hiệu quả.
Hàm mục tiêu là công cụ quan trọng trong tối ưu hóa đa mục tiêu, như thể hiện trong biểu đồ hàm mong muốn Kết quả cho thấy hàm lượng TPC cao nhất đạt 187.7 mgGAE/g chất khô, anthocyanin đạt 74.3 mg/g chất khô, và DPPH là 151.2 mgTE/g chất khô Điều này được thực hiện dưới các điều kiện trích ly tối ưu với nồng độ dung môi 80%, tỉ lệ mẫu và dung môi 1:25, và thời gian vi sóng 62 giây, với mức mong muốn đạt 0.963.
Kiểm chứng điều kiện tối ưu và so sánh với phương pháp trích ly truyền thống
Tiến hành trích ly mẫu tối ưu với các điều kiện đã xác định, đồng thời thực hiện các thí nghiệm trích ly ngấm kiệt với thông số tương tự Tỉ lệ mẫu và dung môi được sử dụng là 1:25 (g/ml) với nồng độ dung môi đạt 80%.
Bảng 4 9 So sánh kết quả mô hình và thực nghiệm, kết quả trích ly hỗ trợ vi sóng và phương pháp ngấm kiệt
Mô hình Thực nghiệm TPC (mgGAE/g chất khô) 187.7 187.9 ± 1.8 197.7 ± 7.1
Hình 4 8 Các điều kiện mong muốn để tối ưu hóa quá trình trích ly
DPPH (mg TE/g chất khô) 151.2 150.1 ± 1.2 143.6 ± 6.8
FRAP (mg AAE/g chất khô) 13.2 ± 0.1 28.3 ± 1.4
Kết quả từ Bảng 4.9 cho thấy sự tương đồng giữa kết quả thực nghiệm và mô hình, với phần trăm chênh lệch chỉ từ 0,2 – 1,1% Điều này chứng minh rằng cả mô hình và thực nghiệm đều có thể được áp dụng cho quy mô rộng hơn Do đó, có thể kết luận rằng các số liệu đối chứng giữa mẫu thực nghiệm và mô hình là hợp lý.
Phương pháp ngấm kiệt là một phương pháp trích ly truyền thống đơn giản, được so sánh với phương pháp trích ly vi sóng để làm rõ ưu và nhược điểm của cả hai Kết quả từ Bảng 4.9 cho thấy, phương pháp ngấm kiệt có hàm lượng polyphenol cao hơn vi sóng, với sự khác biệt có ý nghĩa Trong khi đó, khả năng kháng oxy hóa của phương pháp vi sóng lại cao hơn, nhưng sự khác biệt không đáng kể Nghiên cứu của Li và cộng sự cũng xác nhận kết quả tương tự khi khảo sát trích ly polyphenol từ nho hỗ trợ vi sóng Phương pháp ngấm kiệt tiêu tốn 75ml dung môi và mất 72 giờ, dẫn đến dịch trích loãng và màu sắc nhạt, khiến hàm lượng anthocyanin thấp hơn so với vi sóng Một nghiên cứu khác về cây sim cũng cho thấy hàm lượng anthocyanin trích ly từ cây sim hỗ trợ vi sóng cao hơn phương pháp ngấm kiệt Mặc dù hàm lượng FRAP của ngấm kiệt cao hơn vi sóng, điều này chứng tỏ rằng việc ngâm mẫu lâu dài giúp trích kiệt các hợp chất chống oxy hóa hiệu quả hơn trong bột vỏ hành tím.
Theo Bảng 4.9 và những nhận xét đã nêu, phương pháp ngấm kiệt cho hiệu suất trích ly polyphenol cao hơn so với phương pháp hỗ trợ vi sóng Tuy nhiên, quá trình ngấm kiệt tốn nhiều thời gian, dung môi và chi phí đầu tư nguyên liệu Ngược lại, phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng có thể khắc phục những nhược điểm của ngấm kiệt, mặc dù hiệu suất thu được thấp hơn một chút nhưng không đáng kể.