TỔNG QUAN
Tổng quan về măng cụt
Măng cụt (Garcinia mangostana L.) là một loại trái cây nhiệt đới thuộc họ Clusiaceae, có nguồn gốc từ Đông Nam Á như Thái Lan, Malaysia, Philippines, Indonesia và Việt Nam Được mệnh danh là “Nữ hoàng của các loại trái cây”, măng cụt nổi bật với hương vị dịu ngọt và các công dụng chữa bệnh Loại cây này phát triển tốt ở vùng nhiệt đới ấm, với nhiệt độ lý tưởng từ 20°C đến 32°C Tại Việt Nam, măng cụt được trồng chủ yếu ở Đồng bằng sông Cửu Long và Đông Nam Bộ, đặc biệt ở các tỉnh như Bến Tre, Vĩnh Long, Trà Vinh, Bình Dương và Đồng Nai.
Cây măng cụt là loại cây phát triển chậm, thường cao từ 6 – 25m, nhưng cây trồng để thu hoạch quả thường chỉ cao từ 3 – 6m, với vỏ cây màu nâu sẫm đến đen Là cây thường xanh, lá măng cụt mọc đối xứng, có hình trứng thuôn hoặc elip, với mặt trên bóng màu xanh đậm và mặt dưới xỉn màu, kích thước dài từ 9 đến 25cm và rộng từ 4.5 – 10cm Quả măng cụt được bao phủ bởi đài hoa, có màu tím sẫm đến đỏ tím, đường kính từ 3,4 – 7,5cm, vỏ dày từ 6 – 10mm, mặt cắt vỏ quả có màu hồng sậm và dịch mủ vàng, chứa nhiều hợp chất sinh học Thịt quả màu trắng, vị chua nhẹ, chia thành các múi bao bọc lấy hạt, có thể có hoặc không có hạt tùy thuộc vào từng quả.
Theo các nghiên cứu y học, vỏ cây, lá và vỏ quả măng cụt đã được sử dụng trong y học dân gian từ hơn một ngàn năm trước, cho thấy giá trị dược liệu của loại cây này trong việc hỗ trợ sức khỏe.
Các hợp chất sinh học trong măng cụt có khả năng điều trị nhiều bệnh như viêm khớp, ung thư, loét, dị ứng và đau bụng Những hợp chất này chủ yếu tập trung ở vỏ quả, nhưng trong quá trình chế biến, chỉ phần thịt quả được sử dụng, còn vỏ thường bị loại bỏ Do đó, vỏ quả măng cụt được xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng để thu nhận các hợp chất sinh học có giá trị.
2.1.2 Thành phần hóa học của vỏ quả măng cụt
The primary chemical components found in the rind of the mangosteen fruit include polyphenols and polysaccharides, specifically xanthones, anthocyanins, flavonoids, and pectin.
Vỏ măng cụt chứa các hợp chất phenolic nhiều gấp 10 lần và hoạt tính chống oxy hóa gấp
20 lần so với thịt quả [33]
Nghiên cứu của Yoshimura và các cộng sự (2015) chỉ ra rằng việc sử dụng dung môi hữu cơ để chiết xuất hợp chất sinh học từ vỏ quả măng cụt đã dẫn đến việc phân loại các chất thành hai nhóm chính: nhóm hợp chất không phân cực bao gồm Xanthone và các dẫn xuất prenyl của benzophenone, và nhóm hợp chất phân cực bao gồm catechin, procyanidin và anthocyanidin.
Nghiên cứu của Nayik và cộng sự (2020) cho thấy có hơn 60 dẫn xuất xanthone được chiết xuất từ măng cụt, trong đó khoảng 40 loại xanthone chủ yếu từ vỏ quả, nổi bật là α-, β- và γ-mangostin Các mangostin này có ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của vỏ măng cụt, bao gồm kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư và kháng bệnh sốt rét Khảo sát của Pothitirat và cộng sự (2009) cho thấy hàm lượng α-mangostin trong vỏ quả non và quả chín lần lượt là 8,07 ± 0,11% và 13,63 ± 0,06%, cho thấy hàm lượng polyphenol phụ thuộc vào độ chín, vị trí trồng và điều kiện trích ly.
Theo nghiên cứu của Wathoni và các cộng sự (2019), hàm lượng galacturonic acid trong pectin từ vỏ măng cụt (73.16%) cao hơn so với vỏ chanh (72.5%) và vỏ xoài (56.67%) Nghiên cứu khác của Apsara và các cộng sự (2002) cũng cho thấy pectin từ vỏ măng cụt có chỉ số AUA% cao nhất (73.16%), tiếp theo là vỏ chanh vàng (72.5%).
2.2.3 Ứng dụng của vỏ măng cụt trong công nghệ thực phẩm
Tại thành phố Bogor, Indonesia, vỏ quả măng cụt sau chế biến đã tạo ra nhiều sản phẩm thực phẩm như trà, nước ép, món hầm và viên nang chiết xuất, được sử dụng phổ biến trong y học Các hợp chất chiết xuất từ vỏ măng cụt không chỉ được dùng làm thực phẩm mà còn làm chất màu tự nhiên và chất kháng vi sinh vật Dịch chiết từ vỏ măng cụt khi bổ sung vào thực phẩm giúp tăng cường hàm lượng chất chống oxy hóa Nghiên cứu của Indiarto và cộng sự (2023) cho thấy việc bổ sung chiết xuất vỏ măng cụt vào bánh quy chocolate với tỷ lệ 5% mang lại tính chất cảm quan và khả năng chống oxy hóa tốt nhất Trong khi đó, nghiên cứu của Shori và cộng sự (2018) chỉ ra rằng việc thêm dịch chiết vỏ măng cụt vào sữa chua làm tăng hoạt tính chống oxy hóa lên đến 62% trong tuần đầu, cao hơn nhiều so với sữa chua thông thường Những nghiên cứu này chứng minh rằng việc bổ sung hợp chất từ vỏ măng cụt không chỉ làm tăng giá trị dinh dưỡng mà còn kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm thực phẩm.
Vỏ quả măng cụt không chỉ cung cấp các hoạt chất sinh học chống oxy hóa mà còn chứa cellulose, một nguyên liệu quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm Nghiên cứu của Winuprasith và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng cellulose từ vỏ măng cụt có thể được sử dụng để sản xuất MFC (Microfibrillated cellulose) và gel cellulose, đóng vai trò như một chất nhũ hóa dầu trong nước Ngoài ra, vỏ quả măng cụt còn là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất pectin, một phụ gia thực phẩm được sử dụng để tạo gel và ổn định sản phẩm.
Pectin được sử dụng rộng rãi để làm dày và chất nhũ hóa trong các sản phẩm như jam, kẹo gummies, jelly, sốt và các sản phẩm từ sữa Ngoài ra, trong công nghệ bao gói, pectin còn được ứng dụng để chế tạo màng sinh học nhằm bảo vệ thực phẩm.
Tổng quan về phương pháp trích ly polyphenol và trích ly polysaccharide
2.2.1 Phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng (MAE)
Phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng là một kỹ thuật hiện đại, lần đầu tiên được áp dụng vào năm 1975 bởi Abu-Samra và cộng sự nhằm xử lý mẫu sinh học cho phân tích vi lượng kim loại.
Vi sóng được hình thành từ hai trường dao động vuông góc: điện trường và từ trường, trong đó điện trường đóng vai trò tạo ra nhiệt Khi sử dụng phương pháp vi sóng để trích ly, nhiệt độ sẽ tạo áp lực lên thành tế bào từ bên trong do sự bay hơi nước có trong tế bào, dẫn đến việc phá vỡ thành tế bào và giải phóng các hợp chất sinh học vào môi trường xung quanh.
Phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng (MAE) do Theo Destandau và cộng sự (2013) phát triển được coi là một kỹ thuật trích xuất xanh, nhờ vào khả năng tiết kiệm thời gian, dung môi và năng lượng trong khi vẫn đạt hiệu suất trích ly cao Hiện nay, MAE đang ngày càng được ưa chuộng và áp dụng rộng rãi để trích ly các hợp chất sinh học từ thực vật.
2.2.2 Phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm (UAE)
Phương pháp trích ly hỗ trợ siêu âm là một kỹ thuật hiện đại, được ứng dụng phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm để chiết xuất các hợp chất sinh học từ thực vật, tảo biển, vi khuẩn và động vật Phương pháp này không chỉ rút ngắn thời gian trích ly mà còn giảm thiểu việc sử dụng dung môi hữu cơ độc hại, đồng thời tiết kiệm lượng dung môi cần thiết cho quá trình chiết xuất.
Theo Pico và cộng sự (2013) [56] siêu âm được chia thành 2 loại bao gồm:
Siêu âm tần số cao với cường độ thấp là một kỹ thuật phân tích không gây hư hỏng mẫu, thường được áp dụng để xác định các thuộc tính vật lý và hóa học như độ cứng, độ chín, hàm lượng đường và hàm lượng acid.
Siêu âm cường độ cao với tần số thấp có khả năng thay đổi các tính chất vật lý và hóa học của sản phẩm, thường được áp dụng để tăng tốc và cải thiện hiệu suất trong quá trình chuẩn bị mẫu.
Phương pháp này áp dụng sóng siêu âm để tác động lên thành tế bào thực vật, dẫn đến việc phá hủy thành tế bào dưới áp suất cao và nhiệt độ trong một khoảng thời gian nhất định Quá trình này không chỉ làm hỏng cấu trúc tế bào mà còn giải phóng các hợp chất bên trong tế bào ra ngoài.
Quá trình trích ly các hợp chất sinh học hòa tan trong tế bào thực vật, đặc biệt là các hợp chất phenolic, được tăng cường hiệu quả nhờ sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vượt trội hơn so với các phương pháp trích ly truyền thống như ngâm dầm Phương pháp này không chỉ mang lại hiệu quả cao mà còn thân thiện với môi trường, thể hiện tính hiện đại trong nghiên cứu và ứng dụng.
2.2.3 Phương pháp trích ly có hỗ trợ enzyme
Phương pháp trích ly có hỗ trợ enzyme là một giải pháp tiềm năng thay thế cho các phương pháp chiết xuất bằng dung môi truyền thống nhờ vào hiệu quả vượt trội về thời gian, hiệu suất trích ly và chất lượng sản phẩm Đây là một kỹ thuật mới, an toàn cho việc chiết xuất các hợp chất sinh học từ thực vật như lipid, dầu, polysaccharide và nhiều hợp chất khác Hơn nữa, phương pháp này còn được coi là xanh và thân thiện với môi trường, vì các enzyme sử dụng trong quá trình trích ly chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, động vật hoặc thực vật.
Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ enzyme dựa vào đặc tính của enzyme để xác định điều kiện tối ưu, nhằm nâng cao hiệu quả trích ly các hợp chất sinh học Nguyên tắc chính của quá trình này là sử dụng enzyme để phá hủy thành tế bào thực vật, từ đó giải phóng các hợp chất sinh học bên trong và trên màng tế bào.
2.2.4 Phương pháp trích ly bằng trường xung điện (Pulsed Electric Field - PEF)
Kỹ thuật xung điện trường là phương pháp hiện đại giúp thanh trùng thực phẩm mà không cần nhiệt, đồng thời hỗ trợ trong việc trích ly hợp chất sinh học từ nguyên liệu tự nhiên Phương pháp này không chỉ cải thiện chi phí và tiết kiệm thời gian mà còn giảm thiểu việc sử dụng dung môi, mang lại hiệu quả trích ly cao Điều này giúp dễ dàng xác định và phân tích các thành phần mà không gây biến đổi hay tạo ra sản phẩm phụ không mong muốn trong quá trình trích ly.
Trong quá trình trích ly, cường độ xung điện trường được dùng trong khoảng từ 100 -
300 V/cm đối với trích ly theo mẻ và trong khoảng từ 20 – 80 kV/cm đối với trích ly liên tục
[63] Quá trình trích ly bằng phương pháp xung điện trường được tiến hành theo 3 bước [62]:
+ Bước 1: Hòa trộn nguyên liệu thô với dung môi trích ly
+ Bước 2: Xử lý hỗn hợp với xung điện trường phù hợp
+ Bước 3: Lọc hỗn hợp nhằm loiaj bỏ các hạt rắn, thu các hợp chất sinh học trong dịch lọc.
Phương pháp tối ưu hóa
2.3.1 Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)
Tối ưu hóa là quá trình xác định và cải thiện các yếu tố ảnh hưởng để tối đa hóa lợi ích từ quy trình hay hệ thống Trước đây, tối ưu hóa chỉ tập trung vào một yếu tố trong khi các yếu tố khác được giữ cố định, dẫn đến sự không toàn diện và tốn kém thời gian, chi phí cho thí nghiệm Để khắc phục nhược điểm này, vào những năm 1950, Box và các cộng sự đã phát triển phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) Để áp dụng phương pháp RSM, cần thực hiện năm bước cụ thể.
Bước 1: Xác định các biến độc lập có ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu, đông thời xác định các miền giá trị phù hợp của các biến này
Bước 2: Lựa chọn thiết kế thí nghiệm phù hợp và thực hiện các thí nghiệm theo ma trận của thiết kế thí nghiệm
Bước 3: Sử dụng phần mềm xử lý thống kê dữ liệu thu được sau khi thực hiện các thí nghiệm tại Bước 2
Bước 4: Đánh giá mức độ phù hợp của mô hình
Bước 5: Xác định giá trị tối ưu hóa cho mỗi biến nghiên cứu
2.3.2 Thiết kế Box-Behnken (BBD)
Việc chọn thiết kế thí nghiệm phù hợp là rất quan trọng trong tối ưu hóa quy trình Trong số các mô hình tối ưu hóa phổ biến, thiết kế Box-Behnken (BBD) được lựa chọn cho nghiên cứu này nhằm tối ưu hóa quy trình trích ly đồng thời polyphenol và polysaccharide từ vỏ quả măng cụt với bốn yếu tố khảo sát Thiết kế Box-Behnken được ưa chuộng nhờ vào sự đơn giản trong bố trí thí nghiệm, đồng thời mang lại hiệu quả cao cho phương pháp đáp ứng bề mặt Nghiên cứu đã áp dụng thiết kế Box-Behnken và thực hiện các thí nghiệm được bố trí một cách khoa học.
10 mức (-1, 0, +1) tương ứng với các giá trị thấp, trung bình và cao để đánh giá tác động của các yếu tố này và mối quan hệ giữa chúng
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Vỏ măng cụt được mua tại khu Chợ Lớn quận 5 Thành phố Hồ Chí Minh với giá giao động từ 40.000~60.000/kg
Hóa chất phục vụ cho nghiên cứu có thể được mua tại cửa hàng SBC Scientific, địa chỉ 568/52 Lê Văn Việt, P Long Thạnh Mỹ, Tp Thủ Đức, TP.HCM, với độ tinh khiết trên 95%.
Bảng 3 1: Hoá chất sử dụng trong thí nghiệm
STT Tên hoá chất Xuất xứ Trạng thái Độ tinh khiết
1 Thuốc thử Folin cicalteu’s Đức Lỏng 99%
2 Na2CO3 (Sodium Carbonate) Trung Quốc Rắn 99%
3 Acid gallic Trung Quốc Rắn >95%
5 DPPH (2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazyl) Mỹ Rắn 95%
6 Enzyme cellulase onozuka R-10 Hà Lan Rắn 99%
7 CH3COONa (Sodium acetate) Trung Quốc Rắn ≥97%
8 CH3COOH (Acetic acid) Trung Quốc Lỏng ≥99.5%
Quá trình nghiên cứu sử dụng các thiết bị bao gồm:
- Máy ly tâm, bể lắc ổn nhiệt, máy vi sóng
- Tủ sấy đối lưu memmert có quạt
- Thiết bị phân tích quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến
Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu:
- Cốc becher, bình tam giác, ống đong, phễu thuỷ tinh, đũa thuỷ tinh
- Miccropippette, Bóp cao su, pipet thuỷ tinh, đĩa petri
- Giấy lọc, giấy bạc, khay sấy, màng bọc thực phẩm
- Ống nghiệm, ống ly tâm
Quy trình sản xuất bột vỏ măng cụt sử dụng trong nghiên cứu
Hình 3 1: Quy trình sản xuất bột măng cụt
Mục đích của công đoạn rửa là loại bỏ bụi bẩn, cặn bã và các tạp chất từ nguyên liệu măng cụt, nhằm đảm bảo không ảnh hưởng đến quá trình khảo sát các hoạt tính sinh học trong vỏ Quá trình này giúp làm sạch măng cụt, tạo điều kiện thuận lợi cho các bước xử lý tiếp theo.
Cách tiến hành: Vỏ măng cụt được đem đi rửa, sau đó để ráo chuẩn bị cho quá trình sấy
Mục đích: Sấy khô nguyên liệu, chuẩn bị cho quá trình xay và rây
Cách tiến hành: Vỏ măng cụt sau khi để ráo sẽ đem đi sấy trong tủ Memmert có quạt với thông số nhiệt độ 50 o C đến độ ẩm 8%
Mục đích của quá trình xay nhỏ vỏ măng cụt đã được sấy là tạo ra bột măng cụt với diện tích bề mặt lớn hơn, từ đó tăng cường khả năng tiếp xúc với dung môi trong quá trình trích ly.
Cách tiến hành: Vỏ măng cụt sau khi sấy được đem xay nhuyễn thành bột mịn
Công đoạn rây bột măng cụt nhằm loại bỏ tạp chất và hạt lớn không mong muốn, từ đó giúp bột trở nên đồng nhất và chất lượng hơn.
Để tiến hành, bột măng cụt sau khi xay sẽ được đổ vào rây với kích thước lỗ 0.02mm nhằm lọc lấy bột mịn và loại bỏ các phần bột có kích thước lớn.
Mục đích chính của việc bảo quản bột vỏ măng cụt là ngăn chặn sự phát triển của mốc và nấm, đồng thời giảm thiểu tối đa sự hao hụt các hoạt chất sinh học trong suốt quá trình lưu trữ.
Cách tiến hành: Bột măng cụt sau khi rây được cho vào các túi zip, bảo quản trong tủ mát ở 5 o C kèm theo các túi hút ẩm
Quy trình đồng trích ly polyphenol và polysaccharide từ bột vỏ măng cụt trong nghiê n cứu
3.3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ
Hình 3 2: Sơ đồ quy trình trích ly polyphenol và polysaccharide từ vỏ măng cụt Đo TPC
Phối trộn Lắc ổn nhiệt
Thu dịch chiết Đo PS
Mục đích của quá trình phối trộn là tạo ra môi trường tối ưu cho enzyme cellulase hoạt động Việc sử dụng dung dịch đệm trong quá trình này giúp duy trì pH ổn định, điều kiện thiết yếu để enzyme hoạt động hiệu quả Qua đó, quá trình trích ly polysaccharide và polyphenol từ bột măng cụt diễn ra hiệu quả hơn.
Để tiến hành thí nghiệm, chuẩn bị dung dịch đệm sodium acetate 0.5M và điều chỉnh pH về 5 bằng acetic acid Sau đó, thêm enzyme cellulase onozuka-R10 vào hỗn hợp Mỗi mẫu thí nghiệm cần 1g bột vỏ măng cụt và 20ml dung dịch đệm, cho vào bình erlen 125ml.
Quá trình lắc ổn nhiệt là yếu tố quan trọng giúp bột măng cụt trong hỗn hợp tiếp xúc đồng đều với dung dịch đệm và enzyme, tạo môi trường ổn định và nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động hiệu quả, từ đó nâng cao hiệu suất trích ly Để thực hiện, các bình erlen chứa mẫu bột và dung dịch đệm được cố định trong tủ lắc, với các thông số nhiệt độ và thời gian lắc được thiết lập theo khảo sát đã đưa ra.
Mục đích chính của việc sử dụng quá trình vi sóng là tăng cường khả năng phá vỡ cấu trúc tế bào, từ đó giúp giải phóng hiệu quả các thành phần polysaccharide và nâng cao hiệu suất trích ly Bên cạnh đó, quá trình này còn giúp bất hoạt enzyme, giữ lại các polysaccharide đại phân tử một cách tối ưu.
Để tiến hành thí nghiệm, bạn cần cho các bình chứa mẫu đã được lắc ổn nhiệt vào máy vi sóng Sau đó, thiết lập công suất và thời gian vi sóng theo các thông số đã được khảo sát.
Quá trình ly tâm và lọc được thực hiện để tách dung dịch chiết và bã bột măng cụt, nhằm chuẩn bị cho việc đo đạt các chất hoạt tính sinh học.
Để tiến hành thí nghiệm, các mẫu sau khi vi sóng sẽ được cân vào ống ly tâm với khối lượng bằng nhau và sắp xếp đối xứng Tiến hành ly tâm ở tốc độ 6500 rpm trong 30 phút, sau đó lọc bã để thu dịch chiết Dịch chiết thu được sẽ được khảo sát hàm lượng polyphenol và polysaccharide.
Mục đích: Nhằm thu lượng polysaccharide có trong dịch trích, tạo điều kiện cho việc khảo sát hàm lượng polysaccharide
Để tiến hành, lấy 5ml dịch chiết sau quá trình ly tâm và trích xuất, sau đó kết tủa bằng ethanol 96 độ trong 12 giờ với tỉ lệ 1:12 (v/v) Sau khi kết tủa, dung dịch sẽ được lọc để tách riêng polysaccharide và dịch chiết, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sấy.
Mục đích: Xác định chính xác khối lượng polysaccharide bằng cách loại ẩm đến khối lượng không đổi
Cách tiến hành: Lượng polysaccharide nằm trên giấy lọc sau khi lọc được cho vào tủ sấy, thiết lập thông số nhiệt độ 50 o C, sấy đến khối lượng không đổi.
Nội dung nghiên cứu
Hình 3 3: Sơ đồ nghiên cứu quá trình trích ly đồng thời polyphenol và polysaccharide
- Khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng 4÷6,
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme trong khoảng 1÷3 (%)
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lắc ổn nhiệt trong khoảng 40÷60 o C
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắc ổn nhiệt trong khoảng 30÷180(phút),
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian vi sóng trong khoảng 3÷9 (phút)
Sản xuất bột vỏ măng cụt
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các chất hoạt tính sinh học từ vỏ măng cụt
Quy hoạch thực nghiệm, tối ưu hoá trích ly polyphenol và polysaccharide bột vỏ măng cụt
Yếu tố ảnh hưởng: pH dung dịch đệm, nhiệt độ lắc ổn nhiệt, thời gian lắc ổn nhiệt, thời gian vi sóng
- Hàm mục tiêu: Hàm lượng polyphenol tổng, polysaccharide tổng
Khảo sát một số tính chất của polyphenol và polysaccharide từ mẫu tối ưu hóa
- Khảo sát khả năng chống oxy hóa của polyphenol
- Khảo sát một số tính chất của polysaccharide
3.4.2 Thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly đồng thời polyphenol và polysaccharide từ bột vỏ măng cụt
❖ Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm
Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát các mức pH khác nhau của dung môi trích ly nhằm xác định giá trị pH tối ưu cho quá trình trích ly đồng thời polyphenol và polysaccharide Nghiên cứu được thực hiện dựa trên khoảng pH tối ưu của enzyme cellulase được sử dụng trong quá trình trích ly.
Cách thực hiện: Thực hiện các thí nghiệm theo Bảng 3.2, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần nhằm xác định hàm lượng TPC (mgGAE/g mẫu) và PS (%)
Bảng 3 2: Bảng khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình trích ly
Thông số khảo sát pH 4 5 6
Tỷ lệ bột enzyme/bột vỏ măng cụt (%)
Nhiệt độ xử lý enzyme (oC) 50 50 50
Thời gian xử lý enzyme (phút)
Năng lượng xử lý vi sóng (W) 360 360 360
Thời gian xử lý vi sóng (phút)
Thí nghiệm 1.2 nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ bột enzyme so với bột vỏ măng cụt, nhằm khảo sát tác động của hàm lượng enzyme đến tổng phenolic content (TPC) và hoạt tính chống oxy hóa (PS) trong quá trình trích ly.
Cách thực hiện: Thực hiện các thí nghiệm theo Bảng 3.3, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần nhằm xác định hàm lượng TPC (mgGAE/g mẫu) và PS (%)
Bảng 3 3: Bảng khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bột enzyme so với bột vỏ măng cụt đến quá trình trích ly
Thông số khảo sát pH pH tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm 1
Tỷ lệ bột enzyme/bột vỏ măng cụt (%)
Nhiệt độ xử lý enzyme (oC)
Thời gian xử lý enzyme (phút)
Năng lượng xử lý vi sóng (W)
Thời gian xử lý vi sóng (phút)
❖ Thí nghiệm 1.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý enzyme
Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của hiệt độ xử lý enzyme đến hàm lượng TPC và
PS của quá trình trích ly Khảo sát này được thực hiện dựa trên khoảng nhiệt độ tối thích của enzyme cellulase sử dụng
Cách thực hiện: Thực hiện các thí nghiệm theo Bảng 3.4, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần nhằm xác định hàm lượng TPC (mgGAE/g mẫu) và PS (%)
Bảng 3 4: Bảng khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý enzyme đến quá trình trích ly
Thông số khảo sát pH pH tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm 1
Tỷ lệ bột enzyme/bột vỏ măng cụt (%)
Tỷ lệ tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm 2
Nhiệt độ xử lý enzyme (oC) 40 50 60
Thời gian xử lý enzyme (phút)
Năng lượng xử lý vi sóng (W) 360 360 360
Thời gian xử lý vi sóng (phút)
❖ Thí nghiệm 1.4: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme
Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hàm lượng TPC và
PS của quá trình trích ly
Cách thực hiện: Thực hiện các thí nghiệm theo Bảng 3.5, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần nhằm xác định hàm lượng TPC (mgGAE/g mẫu) và PS (%)
Bảng 3 5: Bảng khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến quá trình trích ly
Thông số khảo sát pH pH tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm 1
Tỷ lệ bột enzyme/bột vỏ măng cụt (%)
Tỷ lệ tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm 2
Nhiệt độ xử lý enzyme (oC)
Nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm 3
Thời gian xử lý enzyme (phút)
Năng lượng xử lý vi sóng (W)
Thời gian xử lý vi sóng (phút)
❖Thí nghiệm 1.5: Ảnh hưởng của công suất vi sóng
Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hàm lượng TPC và PS trong quá trình trích ly Thí nghiệm được tiến hành dựa trên công suất của thiết bị sử dụng để đánh giá hiệu quả của phương pháp này.
Cách thực hiện: Thực hiện các thí nghiệm theo Bảng 3.6, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần nhằm xác định hàm lượng TPC (mgGAE/g mẫu) và PS (%)
Bảng 3 6: Bảng khảo sát ảnh hưởng của công suất vi sóng đến quá trình trích ly
Thông số khảo sát pH pH tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm 1
Tỷ lệ bột enzyme/bột vỏ măng cụt (%)
Tỷ lệ tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm 2
Nhiệt độ xử lý enzyme (oC) Nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm 3
Thời gian xử lý enzyme (phút) Thời gian tối ưu cho quá trình từ Thí nghiệm 4
Năng lượng xử lý vi sóng (W) 180 360 540 720 900
Thời gian xử lý vi sóng (phút) 3 3 3 3 3
❖ Thí nghiệm 1.6: Ảnh hưởng của thời gian xử lý vi sóng
Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý vi sóng đến hàm lượng TPC và
PS của quá trình trích ly
Cách thực hiện: Thực hiện các thí nghiệm theo Bảng 3.7, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần nhằm xác định hàm lượng TPC (mgGAE/g mẫu) và PS (%)
Bảng 3 7: Bảng khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý vi sóng đến quá trình trích ly
Thông số khảo sát pH pH tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm 1.1
Tỷ lệ bột enzyme/bột vỏ măng cụt (%)
Tỷ lệ tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm 1.2
Nhiệt độ xử lý enzyme (oC)
Nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly từ Thí nghiệm
1.3 Thời gian xử lý enzyme (phút) Thời gian tối ưu cho quá trình từ Thí nghiệm 1.4
Năng lượng xử lý vi sóng (W)
Năng lượng vi sóng tối ưu cho quá trình từ
Thí nghiệm 1.5 Thời gian xử lý vi sóng (phút) 3 5 7
3.4.3 Tối ưu hóa quá trình trích ly đồng thời polyphenol và polysaccharide
Phương pháp tối ưu hóa đáp ứng bề mặt (RSM) được áp dụng để tối ưu hóa bốn điều kiện chiết xuất polyphenol và polysaccharide từ bột vỏ quả măng cụt Nghiên cứu xác định bốn yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, bao gồm pH dung dịch đệm, nhiệt độ xử lý enzyme, thời gian xử lý enzyme và thời gian xử lý vi sóng Các biến số này được thể hiện qua thiết kế thí nghiệm Box-Behnken (BBD) với ba mức giá trị (-1, 0, +1) tương ứng với các mức thấp, trung bình và cao, nhằm đánh giá tác động và mối quan hệ giữa chúng.
Thiết kế BBD đã cho phép thực hiện 27 thí nghiệm, trong đó có 3 thí nghiệm tại tâm và 24 thí nghiệm tổ hợp Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần để lấy giá trị trung bình làm kết quả Để xác định nồng độ tổng hàm lượng polyphenol (TPC) và hàm lượng polysaccharide (PS), phương trình sử dụng là một đa thức bậc hai.
Trong đó: Y: Hàm mục tiêu β0: Hằng số
23 β1, β2, β3, β4: Các hệ số tuyến tính β1 β2, β1 β3, β2 β3: Các hệ số tương tác của 3 biến β11, β22, β33: Các hệ số bậc 2
3.4.4 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của polyphenol và một số tính chất của polysaccharide a) Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của polyphenol
Mục đích: Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của mẫu tối ưu Rút ra các nhận xét, đánh giá về hàm lượng kháng oxy hóa
Để tiến hành, cần thực hiện bố trí thí nghiệm theo Mục 3.5.4 trên mẫu tối ưu Sau đó, tiến hành so sánh kết quả và thảo luận về các tính chất của polysaccharide.
Mục đích: Đưa ra các đánh giá về chỉ tiêu bột polysaccharide Rút ra nhận xét về các chỉ tiêu, hướng ứng dụng
Để tiến hành, cần xác định khả năng hấp thụ nước, khả năng hấp thụ dầu, khả năng nhũ tương hóa và khả năng ổn định hệ nhũ tương theo các phương pháp đã nêu trong mục.
Phương pháp phân tích
3.5.1 Các phương pháp phân tích tính chất vật lý polysaccharide trích ly từ vỏ măng cụt a) Phương pháp xác định khả năng giữ nước
Khả năng giữ nước của polysaccharide được xác định bằng cách cân 1g polysaccharide trong ống ly tâm, sau đó thêm 10mL nước cất và giữ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Tiếp theo, hỗn hợp này được ly tâm ở tốc độ 7000 rpm trong 20 phút Cuối cùng, pha trên trong ống ly tâm được loại bỏ và cân phần còn lại, bao gồm mẫu và ống ly tâm.
Khả năng giữ nước được tính theo công thức:
Trong quy trình ly tâm, mN1 đại diện cho khối lượng mẫu và ống ly tâm trước khi thực hiện ly tâm (g), trong khi mN2 là khối lượng ống và mẫu sau khi ly tâm (g) Ngoài ra, mPS là khối lượng polysaccharide được cân trong quá trình ly tâm (g).
24 b) Phương pháp xác định khả năng giữ dầu
Khả năng liên kết với chất béo tham khảo theo [68] Cân 0.5g polysaccharide trong ống ly tâm và thêm 10 mL dầu đậu nành Dung dịch polysaccharide được trộn 30 giây, cách
Trong quá trình thí nghiệm, dung dịch được ủ trong 5 phút trước khi ly tâm ở tốc độ 1600 rpm trong 20 phút bằng máy ly tâm Sau khi ly tâm, phần dung dịch trên trong ống ly tâm được loại bỏ, và khối lượng còn lại (bao gồm mẫu và ống ly tâm) được cân để tính toán khả năng giữ dầu theo công thức đã định.
Trong nghiên cứu này, các thông số quan trọng được xác định bao gồm mD1, là khối lượng mẫu và ống ly tâm trước khi ly tâm (g), và mD2, là khối lượng ống và mẫu sau khi ly tâm (g) Ngoài ra, mPS đại diện cho khối lượng polysaccharide được cân trong quá trình ly tâm (g) Phương pháp xác định khả năng nhũ tương và độ ổn định nhũ tương cũng được trình bày rõ ràng.
Khả năng nhũ tương (EC) và độ ổn định nhũ tương (ES) của polysaccharide từ vỏ măng cụt đã được nghiên cứu và tham khảo theo [69] với một số điều chỉnh Các mẫu polysaccharide được hòa tan trong 10 mL nước cất trước khi kết hợp với 3 mL dầu thực vật.
EC được xác định thông qua quá trình nhũ hoá hỗn hợp nước và dầu bằng máy đồng hoá với tốc độ 8.000 rpm trong 2 phút Sau đó, hỗn hợp này được ly tâm ở 1300 rpm trong 5 phút để hoàn thiện quy trình.
Trong đó: h1: Thể tích của lớp nhũ tương của mẫu EC h: Tổng thể tích của chất lỏng
● ES được xác định bằng cách đun nóng nhũ tương ở 80°C trong 30 phút, làm nguội bằng nước trong 15 phút và ly tâm ở 1300 rpm trong 5 phút ES được tính như sau:
Trong đó: h2: Thể tích của lớp nhũ tương của mẫu ES h: Tổng thể tích của chất lỏng
3.5.2 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng
Nguyên tắc xác định bằng phương pháp đo màu với thuốc thử Folin - Ciocalteu sử dụng axit phospho-vonfra mic làm chất oxy hóa Trong quá trình khử, các nhóm hydroxyl phenol dễ dàng bị oxy hóa, tạo ra màu xanh với độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765 nm.
Chuẩn bị dung dịch 10 % Folin - Ciocalteu:
Hút 10 mL thuốc thử Folin - Ciocalteu vào bình định mức 100 mL và định mức bằng nước cất Để bảo quản, dung dịch thuốc thử cần được bọc giấy bạc nhằm tránh ánh sáng và nên được sử dụng trong ngày.
Chuẩn bị dung dịch Na2CO3 7.5 %:
Cân 37.5 g Na2CO3 khan và định mức bằng nước cất trong bình định mức 500 mL
Xác định hàm lượng phenolic tổng:
Mẫu 2 mL (tỉ lệ bột betacyanin:nước cất là 1:80 w/v) được trộn với 5 mL thuốc thử Folin - Ciocalteu 10% và ủ trong 5 phút, sau đó thêm 4 mL Na2CO3 7.5% và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng Dung dịch sẽ được đo quang phổ tại bước sóng 765 nm Gallic acid được sử dụng để xây dựng đường chuẩn, và kết quả được biểu diễn bằng miligram gallic acid tương đương (mg GAE/100 g chất khô), với giá trị trung bình của 3 lần lặp.
Xây dựng đường chuẩn gallic acid:
Dung dịch chuẩn gốc gallic acid (1000 mg/L): Cân 0.110 ± 0.001 g gallic acid khan cho vào bình định mức 100 mL Hòa tan trong nước cất đến vạch và trộn đều
Nồng độ gallic acid được pha loãng với nước cất ở các mức 20, 40, 60, 80 và 100 mg/L Mỗi nồng độ 2 mL được cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 5 mL dung dịch Folin - Ciocalteu 10% và ủ trong bóng tối trong 5 phút Tiếp theo, 4 mL dung dịch Na2CO3 7.5% được thêm vào và ống nghiệm tiếp tục được ủ trong bóng tối trong 1 giờ Độ hấp thụ của dung dịch được đo ở bước sóng 765 nm.
- Xác định tổng hàm lượng polyphenol (mg GAE/g chất khô)
Trong đó: A: Giá trị hấp thụ của mẫu ở 765 nm b: Điểm cắt trục y của đường chuẩn
𝑚: Độ dốc của đường chuẩn độ
V: Thể tích dịch trích (ml)
D: Hệ số pha loãng 1000: Hệ số chuyển đổi đơn vị ppm sang mg/ml DW: Hàm lượng chất khô của mẫu thử (%)
3.5.3 Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide
Khi pha dịch chiết polysaccharide với ethanol, sự gia tăng cường độ ethanol làm cho dung môi kém phân cực hơn Khi đạt đến một mức độ kết tủa nhất định, dung dịch không còn khả năng duy trì tính tan của polysaccharide, dẫn đến việc polysaccharide bắt đầu kết tủa và tách ra khỏi dung dịch Tỉ lệ hiệu suất trích ly polysaccharide được xác định bằng công thức cụ thể.
3.5.4 Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của polyphenol
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một chỉ số quan trọng để đánh giá khả năng kháng oxy hóa của các chất Sự thay đổi màu sắc của dung dịch DPPH xảy ra khi electron tự do của phân tử nito trong DPPH bắt cặp với gốc hydro của chất kháng oxy hóa Mức độ kháng oxy hóa được thể hiện qua việc giảm màu sắc của dung dịch, có thể được xác định bằng cách đo độ hấp thu quang tại bước sóng λmax = 517 nm.
Hình 3 4: Phương trình đường chuẩn Gallic Acid y = 0.0112x R² = 0.9976
Nồng độ (ppm) Đường chuẩn acid gallic
Hình 3 5: Cơ chế bắt gốc tự do của DPPH
Chuẩn bị dung dịch DPPH - methanol 0.1 mM:
Xác định hoạt tính kháng oxy hóa:
0.01972 g bột DPPH được hòa tan và định mức bằng methanol trong bình định mức
500 mL Dung dịch DPPH được sử dụng trong ngày Dung dịch được đựng trong bình định mức có bọc giấy bạc để tránh ánh sáng
0.1ml dịch chiết của mẫu được cho vào 3.9 mL dung dịch DPPH - methanol trong ống nghiệm, sau đó lắc đều và ủ trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ 30 phòng (30 oC) Độ hấp thu được đo ở bước sóng 517 nm với mẫu đối chứng là dung dịch DPPH - methanol Lấy giá trị trung bình của 3 lần lặp Xây dựng đường chuẩn ascorbic acid:
Dung dịch chuẩn gốc trolox (1000 mg/L): Cân 0.110 ± 0.001 g trolox cho vào bình định mức 100 mL Hòa tan trong nước cất đến vạch và trộn đều
Nồng độ ascorbic acid được pha loãng với nước cất ở các mức 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 và 0.1 mg/ml Mỗi nồng độ 0.1 mL được cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 3.9 mL dung dịch DPPH-methanol Ống nghiệm được lắc đều và ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 517 nm.
- Xác định khả năng kháng oxy hóa DPPH (mg AAE/ 100g chất khô)
Xác định % ức chế DPPH
Trong đó: Ao: Độ hấp thu quang của mẫu đối chứng
Am: Độ hấp thụ quang của mẫu thử
Xác định hàm lượng kháng oxy hóa
DPPH (mg TE/ 100g mẫu khô) = 𝑎 × 𝑉 × 𝐷 ×100
Trong đó: a: Nồng độ trolox (giá trị x) từ đường chuẩn (mg/ml)
V: Thể tích dịch trích (ml) D: Hệ số pha loãng
M: Khối lượng mẫu (g) DW: Hàm lượng chất khô của mẫu thử (%)
Hình 3 6: Phương trình đường chuẩn DPPH y = 338.44x R² = 0.9965
Nồng độ Trolox (mg/ml) Đường chuẩn DPPH
3.5.5 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Phương pháp đáp ứng bề mặt được áp dụng để tối ưu hóa quá trình trích ly đồng thời polyphenol và polysaccharide Nghiên cứu tập trung vào ba yếu tố độc lập: pH (X1), nhiệt độ xử lý enzyme (X2) và thời gian xử lý enzyme (X3), cùng với thời gian vi sóng (X4) Các thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp Box-Behnken, bao gồm tổng cộng 27 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả.
Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm tối ưu hóa được thực hiện với sự hỗ trợ của phần mềm Expert Design 11.0, trong khi dữ liệu được phân tích và thống kê bằng Minitab 19 Biểu đồ được tạo ra thông qua Microsoft Excel 2016, và mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo độ chính xác.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly đồng thời polyphenol và
polysaccharide từ vỏ quả măng cụt
4.1.1 Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm đến quá trình trích ly đồng thời polyphenol và polysaccharide từ vỏ quả măng cụt
Trong nghiên cứu này, pH của dung dịch đệm đã được thay đổi với 3 mức giá trị là 4,
Dung dịch đệm có pH = 5 cho hàm lượng TPC và PS cao nhất, lần lượt đạt 87.50 ± 0.37 (mg GAE/g mẫu) và 33.38 ± 1.51 (%), sau đó giảm mạnh ở pH = 6 Điều này được giải thích bởi enzyme Cellulase Onozuka R-10 có giá trị pH tối ưu trong khoảng 4-5 Hình 4.1 và Hình 4.2 minh họa sự ảnh hưởng của pH dung dịch đệm đến quá trình trích ly đồng thời polyphenol và polysaccharide, do đó pH tối ưu cho mô hình tối ưu hóa là pH = 5.
Hàm lượng polyphenol tổng (mgGAE/ g mẫu) pH dung dịch đệm
Hình 4 1: Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm đến hàm lượng polyphenol tổng
Các ký tự abc khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p