TỔNG QUAN
Tổng quan về tinh bột hạt tam giác mạch (Fagopyrum esculentum)
2.1.1 Phân loại về khoa học
Hạt tam giác mạch, thuộc họ Polygonaceae, thường được xếp vào nhóm ngũ cốc Trên toàn cầu, có hai loại chính là tam giác mạch thông thường (Fagopyrum esculentum) và tam giác mạch chua (Fagopyrum tataricum) (Peiyou Qin và cộng sự, 2010) Hạt tam giác mạch thông thường được phân loại khoa học cụ thể.
1Bảng 2.1 Phân loại hạt kiều mạch thông thường theo khoa học
Phân loại Tên khoa học
1Hình 2.1 Cây tam giác mạch thông thường (Fagopyrum esculentum)
2.1.2 Phân bố và đặc điểm sinh thái
Cây tam giác mạch, được thuần hóa và trồng lần đầu ở Đông Nam Á khoảng 6000 năm trước Công Nguyên, đã lan rộng ra Trung Á, Tây Tạng, Trung Đông và châu Âu Đây là một trong những loại cây trồng sớm nhất mà người châu Âu giới thiệu đến Bắc Mỹ Việc phân tán cây tam giác mạch toàn cầu hoàn tất vào năm 2006, và từ đó, việc trồng trọt và sản xuất hạt tam giác mạch đã không ngừng phát triển, theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp (FAOSTAT).
2019), các nước sản xuất hạt kiều mạch với số lượng lớn bao gồm: Nga, Trung Quốc, Ukraine, Hoa Kỳ… trong đó có Việt Nam
Tam giác mạch là cây trồng ngắn ngày, phát triển tốt trên đất bạc màu hoặc đất chua, thường được gieo hạt vào cuối mùa ở vùng khí hậu nóng để nở hoa khi thời tiết mát mẻ Cây có hệ thống rễ phân nhánh, với rễ chính ăn sâu vào đất ẩm, và chiều cao từ 75 – 125 cm Thời gian sinh trưởng của cây từ 10 – 12 tuần, thích hợp trồng ở các khu vực có vĩ độ cao hoặc phía bắc Hạt tam giác mạch có hình tứ diện, trong khi hoa thường có màu trắng, hồng hoặc vàng.
2.1.3 Thành phần dinh dưỡng của hạt tam giác mạch
Thành phần dinh dưỡng của hạt tam giác mạch thông thường được trình bày ở
Bảng 2.2 theo nghiên cứu của Peiyou Qin và cộng sựnăm 2010.
2Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng của hạt tam giác mạch thông thường
STT Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng (%)
Nội nhũ hạt tam giác mạch chủ yếu bao gồm tinh bột, protein, chất béo, xơ và tro (Zheng và cộng sự, 1998; Steadman và cộng sự, 2001; Bonafaccia và cộng sự, 2003) Tinh bột tam giác mạch có hình dạng cầu và đa giác, với kích thước hạt dao động từ 2-14 μm (Qian và cộng sự, 1998; Zheng và cộng sự, 1998; Qian và Kuhn, 1999), nhỏ hơn từ 1.6-2.4 lần so với kích thước hạt tinh bột bắp và lúa mì, dẫn đến hiệu suất thu hồi tinh bột hạt tam giác mạch thấp hơn trong quy trình chiết tách ướt (Zheng và cộng sự, 1998) Nhiệt độ hồ hóa của tinh bột này nằm trong khoảng 77.3-85.8 °C (Zheng và cộng sự, 1998; Yoshimoto và cộng sự).
2004) Sự chênh lệch nhiệt độ này có thể là do sự khác biệt về giống loài và địa điểm gieo trồng.
Tổng quan về nano tinh bột (Starch nanoparticles)
Hạt nano tinh bột là các hạt có kích thước nhỏ hơn 1000 nm nhưng lớn hơn một phân tử đơn lẻ (Campelo và cộng sự, 2020) Một số nghiên cứu cũng yêu cầu kích thước hạt nano tinh bột không vượt quá 300 nm (Sun Q và cộng sự, 2014).
2.2.2 Tính chất của nano tinh bột a Hình thái và sự phân bố kích thước hạt
Hình thái, cấu trúc và kích thước của nano tinh bột có thể được xác định bằng các kỹ thuật như kính hiển vi điện tử quét và kính hiển vi điện tử truyền qua (Sun, 2018) Kích thước và hình thái của nano tinh bột thay đổi tùy thuộc vào điều kiện, phương pháp xác định và nguồn gốc thực vật (Alcázar-Alay và cộng sự).
Theo nhiều nghiên cứu, hình thái của nano tinh bột có thể có dạng tròn, phẳng, elip hoặc không đều, với bề mặt nứt và xốp, và kích thước phân bố không đồng đều, trung bình từ 30 nm đến hơn 250 nm Kích thước hạt tinh bột càng nhỏ thì hạt nano tinh bột tạo ra sẽ càng nhỏ và được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác nhau.
Mức độ kết tinh của nano tinh bột là tỷ lệ giữa khối lượng các miền tinh thể và tổng khối lượng của nó Yếu tố này chịu ảnh hưởng bởi tỷ lệ amylopectin, độ dài chuỗi, kích thước tinh thể, hướng của chuỗi xoắn kép trong vùng tinh thể, và mức độ tương tác giữa các chuỗi xoắn kép (Suriya và cộng sự, 2018; Kumari và cộng sự, 2020; Dufresne).
Cấu trúc tinh thể của SNPs được xác định thông qua phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) và được phân loại thành các loại như A, B, C và V (7 và cộng sự, 2014).
2Hình 2.2 Giản đồ tán xạ tia X các dạng tinh thể của tinh bột (Katsumi và cộng sự,
2015) Cấu trúc tinh thể loại A là cấu trúc điển hình của tinh bột ngũ cốc, ví dụ: ngô, lúa mì, gạo… (Katsumi và cộng sự, 2015)
Cấu trúc tinh thể loại B là đặc trưng của tinh bột có hàm lượng amylose cao, thường xuất hiện trong củ, quả và thân cây, như tinh bột từ khoai tây, chuối, dong riềng và cao lương (Katsumi và cộng sự, 2015).
Cấu trúc tinh thể loại C là sự kết hợp giữa loại A và B, thường được tìm thấy trong tinh bột chiết xuất từ cây họ đậu hoặc rễ cây như hạt đậu và củ sắn (Katsumi và cộng sự, 2015) Trong khi đó, cấu trúc tinh thể loại V hình thành từ sự kết hợp giữa amylose và lipid (Da Silva và cộng sự, 2017; Dufresne, 2014) Các mẫu nano tinh bột được tạo ra từ quá trình kết tủa nano cho thấy độ kết tinh loại V, với cấu trúc xoắn ốc đơn giữa amylose và ethanol Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2021) cùng với Sun và cộng sự (2014) chỉ ra rằng nano tinh bột, khi được xử lý bằng enzyme và sau đó kết tinh lại, có độ kết tinh tăng lên và sở hữu cấu trúc tinh thể loại B và V.
Tính chất biến đổi nhiệt của nano tinh bột được xác định qua phương pháp đo nhiệt lượng quét vi sai và phân tích nhiệt lượng, giúp xác định điều kiện ứng dụng trong công nghiệp Hạt nano tinh bột sắn tạo ra bằng phương pháp siêu âm có độ ổn định nhiệt thấp hơn so với tinh bột tự nhiên, đồng thời giảm nhiệt độ hồ hóa do sự suy yếu của các liên kết hydro trong vùng vô định hình (Da Silva và cộng sự, 2017) Việc kết hợp xử lý enzyme và sau đó kết tinh lại giúp giảm độ ổn định nhiệt của nano tinh bột (Sun và cộng sự, 2014) Phương pháp kết tủa cho thấy nano tinh bột tạo ra có nhiệt độ hồ hóa giảm do cấu trúc xoắn ốc đơn dễ bị phân hủy hơn so với tinh bột tự nhiên (Qin và cộng sự, 2016).
Theo nghiên cứu của Winarti và cộng sự, nano tinh bột từ củ dong riềng được sản xuất bằng phương pháp kết tủa với butanol đã cho thấy sự gia tăng đáng kể về thể tích trương nở (từ 5.28 đến 7.92 g/g) và độ hòa tan (từ 9.43 đến 16.89%) so với tinh bột tự nhiên.
Năm 2009, nghiên cứu của Szymońska và cộng sự đã chỉ ra rằng nano tinh bột từ khoai tây và sắn được sản xuất qua phương pháp xử lý cơ học có sự gia tăng đáng kể về thể tích trương nở, đồng thời cũng ảnh hưởng đến độ tiêu hóa của sản phẩm.
Quá trình tiêu hóa tinh bột là phức tạp, bao gồm sự khuếch tán enzyme, hấp thụ enzyme lên vật liệu và các điều kiện thủy phân Nano tinh bột có khả năng tiêu hóa cao hơn tinh bột tự nhiên do diện tích tiếp xúc lớn hơn (Li và cộng sự, 2014) Theo Suriya và cộng sự, khả năng tiêu hóa của nano tinh bột tăng 41.29 – 43.24% khi thủy phân với pullulanase và kết tinh lại trong 12-24 giờ Tuy nhiên, khả năng tiêu hóa này còn phụ thuộc vào nguồn tinh bột, kích thước hạt, độ kết tinh và tỷ lệ amylose – amylopectin (Ding và cộng sự, 2016).
2.2.3 Ứng dụng của nano tinh bột
Hiện nay, nano tinh bột đang được nghiên cứu rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, với các ứng dụng nổi bật như tạo màng ăn được, ổn định hệ nhũ tương và phát triển vật liệu đóng gói cho các hợp chất có hoạt tính sinh học.
Nano tinh bột được thêm vào màng polymer thực vật để nâng cao tính chất cơ học và khả năng chịu nhiệt Sự bổ sung này cũng đã được chứng minh là giúp giảm thiểu một số yếu tố không mong muốn trong quá trình sử dụng.
Tính thấm nước của các màng giúp hạn chế sự hút ẩm và tăng cường độ bền, cho phép chúng chịu được các tác động cơ học mạnh hơn (Santana JS và cộng sự, 2019; Condés MC và cộng sự, 2018) Tuy nhiên, nhũ tương trong thực phẩm thường gặp khó khăn trong việc duy trì tính ổn định trong quá trình vận chuyển và bảo quản, dẫn đến việc sử dụng nhiều phụ gia để khắc phục vấn đề này Việc áp dụng nano tinh bột để ổn định hệ nhũ tương được coi là một giải pháp xanh, phù hợp với xu hướng tiêu dùng hiện đại chú trọng đến sức khỏe Đặc biệt, nồng độ và kích thước của các hạt nano tinh bột càng nhỏ thì khả năng ổn định hệ nhũ tương càng cao (Shao P và cộng sự, 2018; Lu X và cộng sự, 2018).
Nano tinh bột được ứng dụng trong công nghệ bao gói như một vật liệu mới, đóng vai trò là chất mang cho các hợp chất có hoạt tính sinh học Được tạo ra từ tinh bột chuối xanh qua phương pháp kết tủa với acetone và ethanol, nano tinh bột cho kết quả đóng gói β-carotene đạt trên 95% (Santoyo-Aleman và cộng sự, 2019) Việc bao gói này còn giúp kiểm soát sự giải phóng β-carotene trong các mô hình tiêu hóa mô phỏng, cho thấy tiềm năng lớn trong việc đóng gói và vận chuyển các hợp chất có hoạt tính sinh học Nghiên cứu của Ahmad và cộng sự cũng chỉ ra rằng SNPs từ tinh bột thân hoa sen và hạt dẻ nước có khả năng đóng gói và bảo vệ catechin hiệu quả trước sự tấn công của enzyme trong quá trình tiêu hóa mô phỏng.
Các phương pháp tạo ra nano tinh bột
Các tinh thể nano hoặc hạt nano tinh bột được sản xuất nhằm ổn định hệ nhũ tương trong các chất nền polyme, cải thiện đặc tính cơ học và mang các hợp chất có hoạt tính sinh học Có ba phương pháp chính để tạo ra hạt nano tinh bột: (1) kết tủa, (2) kết hợp hình thành phức hợp và thủy phân bằng enzyme, và (3) vi lỏng hóa Mỗi phương pháp này dẫn đến các hạt nano tinh bột với đặc tính và độ kết tinh khác nhau.
2.3.1 Phương pháp thủy phân a Thủy phân bằng acid
Phương pháp thủy phân bằng acid là phương pháp thực hiện ở nhiệt độ thấp (36 –
Nhiệt độ 40°C được sử dụng cùng với acid (HCl và H2SO4) để tiến hành quá trình thủy phân tinh bột Kết quả thu được là hạt nano tinh bột với kích thước, hiệu suất thu hồi và hình dạng khác nhau Đặc tính hình thái của các hạt nano này phụ thuộc vào nguồn gốc thực vật của tinh bột.
10 độ cứng của nó và tỷ lệ phần trăm amylose và amylopectin (Gerard, 2002; Jayakody và Hoover 2002)
- Quá trình thủy phân bằng HCl với nồng độ 2.2N: thời gian thủy phân hơn 15 ngày, hiệu suất thu hồi nano 0.5% (Gerard, 2002; Jayakody và Hoover 2002)
Quá trình thủy phân tinh bột bằng H2SO4 nồng độ 3.16M kéo dài từ 5 đến 7 ngày, đạt hiệu suất thu hồi nano chỉ 15.7% (Gerard, 2002; Jayakody và Hoover, 2002) Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản và có khả năng ngăn chặn quá trình hồ hóa tinh bột, đồng thời phá vỡ cấu trúc tinh bột Tuy nhiên, nhược điểm lớn là hiệu suất thu hồi nano tinh bột thấp và thời gian thủy phân dài, điều này làm giảm khả năng ứng dụng của nano trong việc ổn định vật liệu (Sandhu và cộng sự, 2017).
Phương pháp thủy phân tinh bột bằng enzyme sử dụng các enzyme như α-amylase, glucoamylase và pullulanase để đạt hiệu quả cao trong việc phân hủy tinh bột (Hassan và cộng sự, 2022) Theo Qiu và cộng sự (2019), enzyme pullulanase đóng vai trò quan trọng trong việc cắt các liên kết α-1,6-glycosidic của amylopectin, trong khi α-amylase cắt các liên kết α-1,4-glycosidic trong chuỗi amylose và amylopectin Quá trình này dẫn đến sự thay đổi kích thước hạt tinh bột, cho phép điều chỉnh mức độ thủy phân enzyme phù hợp (Sun và cộng sự, 2014; Kim và cộng sự, 2008; Foresti và cộng sự, 2014) Nano tinh bột thu được từ phương pháp này đạt khoảng 55%, thường kết hợp với các kỹ thuật như siêu âm thủy phân enzyme (Lin và cộng sự, 2020) và thủy phân enzyme kết tinh lại (Wang và cộng sự, 2021; Suriya và cộng sự, 2018).
Phương pháp này có nhiều ưu điểm, bao gồm tính thân thiện với môi trường, hiệu suất thủy phân tinh bột và thu hồi nano cao Thời gian thủy phân ngắn và khả năng kiểm soát kích thước của các hạt nano tinh bột cũng là những điểm mạnh nổi bật.
Nhược điểm của tinh thể nano tinh bột là độ bền kém so với những tinh thể nano được tạo ra từ quá trình thủy phân bằng acid Bên cạnh đó, enzyme có giá thành cao và không phổ biến tại Việt Nam Phương pháp thủy phân kết hợp giữa acid và enzyme cũng cần được xem xét kỹ lưỡng.
Phương pháp kết hợp thủy phân bằng acid và enzyme, đặc biệt là amylase, giúp giảm thời gian thủy phân Trong đó, β-amylase tỏ ra hiệu quả hơn α-amylase trong việc sản xuất tinh bột vi xốp với độ kết tinh nguyên vẹn Quá trình tiền xử lý bằng enzyme tạo điều kiện cho axit tiếp cận các hạt, dễ dàng thủy phân ở các vùng vô định hình Phương pháp này tuân theo cấu hình động học hai giai đoạn, với việc xử lý trước 2 giờ giúp giảm thời gian thủy phân từ 24 giờ xuống còn 6 giờ mà vẫn đạt được mức độ thủy phân tương tự Nghiên cứu của LeCorre và cộng sự (2012) cũng cho thấy thời gian thủy phân giảm từ 120 giờ xuống 45 giờ sau 2 giờ tiền xử lý bằng enzym Ưu điểm của phương pháp này là giảm thời gian thủy phân so với phương pháp thủy phân bằng acid, nhưng nhược điểm là chi phí cao.
2.3.2 Phương pháp tạo kết tủa
Phương pháp kết tủa là một kỹ thuật phổ biến để tổng hợp hạt nano tinh bột vô định hình Trong quy trình này, tinh bột được hồ hóa và sau đó kết tủa bằng các dung môi như etanol, propanol, isopropanol hoặc butanol Kim và Lim (2009) đã sử dụng phương pháp này để tạo ra tinh thể nano tinh bột thông qua việc hình thành phức hợp và sau đó thủy phân bằng enzyme nhằm duy trì độ kết tinh Quá trình thủy phân với α-amylase trong 60 phút giúp loại bỏ chất nền xung quanh các tiểu cầu, tạo ra các hạt nano hình cầu hoặc hình bầu dục có kích thước đồng đều (10–20 nm) Chin và cộng sự (2011) đã áp dụng công nghệ kết tủa nano để tổng hợp các hạt nano tinh bột bằng cách sử dụng dung dịch tinh bột trong etanol tuyệt đối, với NaOH/urê làm dung môi hòa tan Huyền phù được khuấy nhẹ và ly tâm để thu được hạt nano tinh bột Ma và cộng sự (2008) mô tả quy trình tổng hợp hạt nano tinh bột bằng cách kết tủa tinh bột tiền hồ hóa theo liên kết ngang, sử dụng ethanol làm chất kết tủa.
50–100 nm được hình thành Ưu điểm: tạo ra hạt nano có hình dạng và kích thước có thể kiểm soát được
Nhược điểm: hiệu suất thu hồi nano tinh bột thấp phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm
2.3.3 Phương pháp vật lý a Phương pháp ép đùn
Phương pháp ép đùn là một kỹ thuật phổ biến trong ngành công nghệ thực phẩm, giúp tạo ra hạt nano tinh bột thông qua quá trình tinh bột tiếp xúc với áp suất, nhiệt độ và lực cắt cao Lai và Kokini (1990) đã chỉ ra rằng quá trình hồ hóa không hoàn toàn xảy ra do lượng nước hạn chế trong quá trình ép đùn Năm 2000, Giezen et al đã thành công trong việc sử dụng máy đùn trục vít đôi để thu hồi nano với kích thước nhỏ hơn 400 nm Tương tự, Song (2011) đã áp dụng phương pháp ép đùn với tác nhân liên kết ngang, đạt được kích thước hạt khoảng 160 nm Phương pháp này không chỉ thân thiện với môi trường mà còn không sử dụng hóa chất, mang lại hạt nano tinh bột có kích thước nhỏ và chất lượng cao.
Nhược điểm: Yêu cầu áp suất, nhiệt độ và lực cắt cao b Phương pháp siêu âm
Phương pháp tạo nano tinh bột sử dụng sóng âm thanh với tần số 15–20 kHz, nằm ngoài phạm vi nghe của con người Đầu dò áp điện hoặc từ tính tạo ra rung động năng lượng cao, được chuyển giao cho đầu dò tiếp xúc với chất lỏng Nghiên cứu của Haaj et al (2013) cho thấy việc sử dụng huyền phù tinh bột ngô sáp với siêu âm trong 75 phút ở 80°C đã tạo ra hạt nano tinh bột có kích thước khoảng 30–100 nm Hiệu quả của siêu âm đối với tinh bột phụ thuộc vào nhiều yếu tố như công suất siêu âm, nhiệt độ, thời gian xử lý, nồng độ tinh bột và nguồn gốc thực vật (Zuo, 2009) Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng công suất 24 kHz trong 75 phút và tăng thời gian xử lý siêu âm dẫn đến kích thước hạt giảm (Bel Haaj et al., 2013).
Trong số các phương pháp vật lý để thu được SNPs, siêu âm nổi bật với năng suất tối ưu gần 100%, vượt trội hơn so với các phương pháp vật lý khác, bao gồm cả quá trình thủy.
Phương pháp thủy phân axit đang trở nên phổ biến trong tương lai nhờ vào khả năng hòa tan một phần vật liệu hiệu quả Ưu điểm của phương pháp này bao gồm thời gian xử lý nhanh, năng suất cao và không cần sử dụng thuốc thử hóa học, đồng thời quy trình cũng tương đối đơn giản và không yêu cầu các bước tinh chế (Bel Haaj và cộng sự, 2013; Remanan và cộng sự, 2021).
Phương pháp này có nhược điểm là tiêu tốn nhiều năng lượng, có thể làm biến dạng cấu trúc tinh thể, và phụ thuộc vào góc nhiễu xạ của tia X Ngoài ra, nó cũng gặp khó khăn khi làm việc với các cấu trúc vô định hình hoặc kết tinh kém ở cấp độ nano (Bel Haaj và cộng sự, 2013; Remanan và cộng sự, 2021).
Kết luận, các phương pháp tạo nano tinh bột được đề cập đều nhằm mục tiêu giảm thời gian, nâng cao hiệu quả, tiết kiệm chi phí và dễ dàng áp dụng quy mô sản xuất Trong số đó, phương pháp xử lý enzyme nổi bật với nhiều triển vọng, không cần thiết bị chuyên dụng, quy trình thực hiện đơn giản, chi phí thấp, thân thiện với môi trường và hạn chế ô nhiễm mẫu nhờ tính chọn lọc cao của enzyme (Campelo và cộng sự, 2020).
Tổng quan về pullulanase (EC 3.2.1.41)
Enzyme pullulanase là một exoenzyme thủy phân tinh bột, được sản xuất dưới dạng lipoprotein ngoại bào bởi thực vật, vi khuẩn và ít phổ biến hơn là nấm mốc Enzyme này hoạt động hiệu quả nhất trong khoảng pH 4-6 và nhiệt độ 55-65 oC Pullulanase chủ yếu được chiết xuất từ Aspergillus oryzae và Aspergillus usamii, và không thể tách rời khỏi amylases Ngoài ra, enzyme này cũng có thể được chiết xuất từ men bia.
- Loại I cắt liên kết α-1,6-glycosidic trong amylopectin, dextrins, pullulan
- Loại II ít đặc hiệu hơn, có thể cắt liên kết α-1,4-glycosidic và α-1,6-glycosidic trong tinh bột và dextrins
Enzyme loại III là enzyme phân nhánh, có khả năng cắt liên kết α-1,6-glycosidic nhưng không tác động đến liên kết α-1,4-glycosidic, do đó rất thích hợp để phân tách amylopection (Tomasik và cộng sự, 2012).
Khoai tây và đậu tằm là nguồn thực vật phổ biến cung cấp enzyme pullulanase, với khả năng tạo ra maltose, maltotetraose và một lượng nhỏ maltohexaose từ β-dextrins ngô sáp Trong khi đó, pullulanase từ ngô lại cho hàm lượng maltohexaose cao hơn Enzyme này, khi được tinh sạch hoàn toàn từ mạch nha, thể hiện hoạt tính cao Ngoài ra, gạo cũng là một nguồn cung cấp pullulanase, và nghiên cứu cho thấy pullulanase thực vật có thể hoạt động mạnh mẽ hơn so với pullulanase vi khuẩn, như được so sánh giữa pullulanase từ lúa và Arthrobacter aerogenes.
Các pullulanase của vi khuẩn thường bền nhiệt, đặc biệt là từ các chi Clostridium, Thermoanaerobacter và Thermobacteroides Chúng không chỉ phân cắt các liên kết α-1,6-glycosidic mà còn cả các liên kết α-1,4-glycosidic, như pullulanase từ Bacillus sp 3183 Pullulanase từ B subtilis có khả năng chịu nhiệt, trong khi pullulanase từ B acidopullulyticus lại bị phân hủy ở 60 °C sau 1 giờ hoạt động ở pH tối ưu 5 Chủng Thermus Aquacus YT-1 sản xuất pullulanase hoạt động tốt ở pH 6.4 và có thể chịu được 85 °C trong 10 giờ, với khả năng ổn định nhiệt tăng cường nhờ các ion Ca2+ Enzyme từ Thermococcus litoralis và Pyrococcus furiosus vẫn duy trì hoạt động ở nhiệt độ lên đến 130–140 °C, nhưng không thủy phân maltohexaose và các oligosaccharide thấp hơn Cladosporium resinae sản xuất exopullulanase (exo-1,6-α-glucanase) có khả năng phân cắt liên kết α-1,6-glycosidic vượt trội so với pullulanase từ A niger.
Tổng quan về Glucoamylase (EC 3.2.1.3)
Glucoamylase là enzyme phân tách các liên kết α-1,4-glycosidic của amylose và amylopectin, cũng như liên kết α-1,6-glycosidic của amylopectin để tạo ra glucose Nguồn gốc của glucoamylase, có thể từ nấm mốc, men, hoặc ruột của người và động vật, ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thu hồi enzyme này Cây củ cải đường cũng là một nguồn glucoamylase phong phú Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của glucoamylase nằm trong khoảng 40-60°C, cao hơn so với alpha amylase của nấm, thường hoạt động hiệu quả ở 30-50°C Độ pH tối ưu cho glucoamylase trong khoảng nhiệt độ này là từ 3.6 đến 6.5.
Theo nghiên cứu của Sills và cộng sự (1983), hầu hết các sinh vật sản xuất glucoamylase cũng đồng thời tiết ra alpha amylase, và việc chỉ tiết ra một loại glucoamylase là điều hiếm gặp.
Glucoamylase có thể được chia thành 2 loại:
- Enzyme chuyển hóa hoàn toàn tinh bột thành glucose
- Enzyme chuyển hóa không hoàn toàn những cơ chất này thành glucose (Fleming,
Glucoamylase đã được phân lập từ các loài vi khuẩn như B firmus947 và B stearothermophilus, cùng với 131 loài Clostridium khác nhau Enzyme glucoamylase từ B firmus có khả năng thủy phân tinh bột từ khoai tây, ngô và lúa mì ở nhiệt độ 37°C, chủ yếu tạo ra glucose, cùng với một lượng nhỏ maltose, maltotriose và maltotetraose (Wijbeng và cộng sự, 1991).
Có hai dạng glucoamylase được phân lập từ A niger; một dạng dễ dàng hấp phụ vào tinh bột ngô phụ thuộc vào pH, cường độ ion và nhiệt độ, trong khi dạng còn lại hấp phụ yếu và không phụ thuộc vào các yếu tố này A niger là chủng nấm phổ biến nhất tiết glucoamylase, với điều kiện hoạt động tối ưu ở pH 4.5 và nhiệt độ 70 °C Enzyme này được ổn định bởi tinh bột, glycerol và alditols, trong khi các cation đa hóa trị có tác dụng kích thích enzyme, ngược lại với cation hóa trị một và hai sẽ ức chế chúng Khi glucoamylase được ủ với dung dịch glucose đậm đặc, một lượng nhỏ isomaltose được hình thành do quá trình nghịch đảo Ngoài ra, Cladosporium resinae cũng tạo ra alpha amylase, exopullulanase và hai loại glucoamylase.
Glucoamylase ngoại bào tạo ra từ Schwanniomyces alluvius có pH tối ưu là 5.0 ở
50 o C có khảnăng thủy phân tinh bột hòa tan và pullulan thành glucose (Wilson và cộng sự,
Glucoamylase được phân lập từ Schwanniomyces castelli có hoạt tính thấp hơn so với glucoamylase từ Endomycopsis fibuligera và A oryzae Enzyme này có khả năng phân tách các liên kết glucosid α-1,4-glycosidic và α-1,6-glycosidic, trong đó hoạt tính đối với liên kết α-1,4-glycosidic cao hơn so với các liên kết khác.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, hóa chất
Hạt tam giác mạch (Fagopyrum esculentum) được mua từ Công ty cổ phần phát triển Dũng Hà (quận 12, Tp HCM) dạng hạt khô
Pullulanase (EC 3.2.1.42): enzyme dạng lỏng được sản xuất bởi Novozymes Corp và phân phối bởi Sigma-Aldrich
Glucoamylase (EC 3.2.1.3): enzyme dạng lỏng được sản xuất bởi công ty Angel yeast và phân phối bởi International Food
Hóa chất thí nghiệm tại cửa hàng Hóa Nam (TP Hồ Chí Minh) được nhập khẩu từ Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam, đảm bảo độ tinh khiết lên đến 99%.
Quy trình sản xuất tinh bột và nano tinh bột từ hạt tam giác mạch
3.2.1 Quy trình sản xuất tinh bột tam giác mạch
Quy trình phân tách tinh bột được thực hiện theo cách của Chel-Guerrero và cộng sự
(2016) với một vài sửa đổi:
Sơ đồ quy trình công nghệ
3Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tạo tinh bột tam giác mạch
Tinh bột tam giác mạch
Để chuẩn bị hạt tam giác mạch, trước tiên bạn cần rửa sạch hạt với nước để loại bỏ bụi và cát Sau đó, ngâm hạt trong nước trong 24 giờ, nhớ thay nước mỗi 8 giờ và rửa lại hạt để loại bỏ vỏ và mầm.
Sau khi rửa sạch, hạt được để ráo nước và xay với dung dịch NaHSO3 0,3% theo tỉ lệ 1:2 Sử dụng rây với kích thước lỗ 0.8mm để loại bỏ bã và xơ Tiến hành lắng trong 8 giờ, sau đó thay nước cất để loại bỏ NaHSO3 và thêm nước cất vào hỗn hợp Quá trình thay nước được lặp lại 3 lần sau mỗi 8 giờ.
Ly tâm dung dịch tinh bột 5000 rpm, thời gian 10 phút thu phần tinh bột, sấy ở
55 0 C trong 10 giờ Tiến hành nghiền tinh bột và sử dụng rây có kích thước lỗ lọc 0.154 mm để rây mịn tinh bột
3.2.2 Quy trình thu nhận hạt nano tinh bột theo phương pháp xử lý với enzyme Quy trình phân tách hạt nano tinh bột được thực hiện dựa theo phương pháp của Yacheng Hao và cộng sự, 2018 với một số sửa đổi:
Hồ hóa Làm nguội Thủy phân Bất hoạt enzyme
Ly tâm lần 1 Enzyme t0 phút
Kết tủa nano tinh bột
Ly tâm lần 2 Sấy thăng hoa
Nano tinh bột tam giác n= 3000 rpm t= 10 phút
4Hình 3.2 Sơ đồ quy trình tạo nano tinh bột theo phương pháp xử lý enzyme Thuyết minh quy trình
Cân 1g tinh bột và 40ml dung dịch đệm acetate với nồng độ 0.1M và pH=5 vào erlen, sau đó đun cách thủy trong 30 phút (Daryl và cộng sự, 1984) Cuối cùng, làm nguội mẫu về 55 độ C.
Để tiến hành thủy phân mẫu bằng glucoamylase, enzyme được thêm vào dung dịch mẫu với các nồng độ khác nhau là 1100, 1500 và 1800 U/g Quá trình khảo sát được thực hiện bằng máy lắc ổn nhiệt, trong đó thời gian thủy phân được kiểm tra ở các mốc 2 giờ, 3 giờ và 4 giờ, tất cả đều ở nhiệt độ thủy phân cố định.
Để thực hiện thủy phân mẫu bằng enzyme pullulanase, cần cho enzyme vào dung dịch mẫu với các nồng độ khác nhau (100, 120, 140 U/g) Sau đó, sử dụng máy lắc ổn nhiệt để khảo sát thời gian thủy phân trong khoảng 2, 3 và 4 giờ, với nhiệt độ thủy phân được giữ cố định.
Để thực hiện thủy phân mẫu bằng hỗn hợp glucoamylase và pullulanase, cần cho hỗn hợp này vào dung dịch mẫu với các nồng độ glucoamylase và pullulanase theo các tỉ lệ khác nhau Sử dụng máy lắc ổn nhiệt, tiến hành khảo sát thời gian thủy phân trong 3 giờ ở nhiệt độ cố định 55°C.
Để bất hoạt enzyme trong dung dịch tinh bột đã thủy phân, tiến hành đun cách thủy trong 30 phút và để nguội Sau đó, thực hiện ly tâm dung dịch ở tốc độ 3000 rpm trong 10 phút để thu được phần dung dịch.
Chuẩn bị 40ml dung dịch cồn 96 độ với tỉ lệ cồn và dung dịch đệm là 1:1 trong erlen, sau đó khuấy từ với tốc độ cao trong 1 giờ để tạo kết tủa nano Cuối cùng, tiến hành ly tâm ở tốc độ 6000 rpm.
Nội dung nghiên cứu
Thí nghiệm 1 trong nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucoamylase và thời gian thủy phân đến tính chất của hạt nano tinh bột Kết quả từ thí nghiệm sẽ giúp hiểu rõ hơn về mối quan hệ giữa các yếu tố này và chất lượng của hạt nano tinh bột, từ đó tối ưu hóa quy trình sản xuất.
Thí nghiệm này nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân đến đặc tính của hạt nano tinh bột Mục tiêu là xác định điều kiện tối ưu để áp dụng glucoamylase trong quá trình thủy phân chế biến nano tinh bột.
Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ glucoamylase và thời gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột
Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ pullulanase và thời gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột
Khảo sát sự ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp hỗn hợp enzyme glucoamylase và pullulanase, thời gian thủy phân 3 giờ đến tính chất hạt nano tinh bột
Khảo sát hình thái, cấu trúc thành phần hóa học của tinh bột và nano tinh bột
- Hình thái hạt nano tinh bột
- Độ hòa tan và trương nở
Thủy phân các mẫu tinh bột hạt tam giác mạch được thực hiện ở nhiệt độ 55°C và pH 5.0, đây là điều kiện tối ưu đã được nghiên cứu trong nhiều bài báo về hoạt lực của glucoamylase (Javad và cộng sự, 2005) Quy trình chi tiết được mô tả trong Mục 3.2, với các nồng độ enzyme và thời gian thủy phân khác nhau được trình bày trong Bảng 3.1 Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác.
3Bảng 3.1 Điều kiện thí nghiệm của các mẫu trong thí nghiệm 1
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ pullulanase và thời gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột
Thí nghiệm nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ pullulanase và thời gian thủy phân đến tính chất của hạt nano tinh bột Mục tiêu là xác định điều kiện tối ưu để sử dụng pullulanase trong quá trình thủy phân chế tạo nano tinh bột.
Nghiên cứu của A Roy và cộng sự năm 2003 đã thực hiện thủy phân tinh bột hạt tam giác mạch ở nhiệt độ tối ưu 55 o C và pH 5.0 Quy trình thủy phân được mô tả chi tiết trong Mục 3.2, với các nồng độ enzyme và thời gian thủy phân khác nhau được trình bày rõ ràng.
Bảng 3.2 Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần
4Bảng 3.2 Điều kiện thí nghiệm của các mẫu trong thí nghiệm 2
3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp hỗn hợp enzyme glucoamylase và pullulanase, thời gian thủy phân 3 giờ đến tính chất hạt nano tinh bột
Nghiên cứu này nhằm khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp giữa hai loại enzyme glucoamylase và pullulanase trong quá trình thủy phân kéo dài 3 giờ đến các đặc tính của hạt nano tinh bột Mục tiêu là xác định tỉ lệ tối ưu cho việc sử dụng kết hợp hai enzyme này trong quá trình điều chế nano tinh bột.
Nghiên cứu của A Roy và cộng sự đã tiến hành thủy phân các mẫu tinh bột hạt tam giác mạch ở nhiệt độ 55°C và pH 5.0 trong thời gian 3 giờ.
2003 Quy trình đã trình bày ở Mục 3.2 với các nồng độ enzyme và thời gian thủy phân khác nhau được trình bày ở Bảng 3.3 Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần
5Bảng 3.3 Điều kiện thí nghiệm của các mẫu trong thí nghiệm 3
Các phương pháp phân tích
3.4.1 Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi nano tinh bột
Để thực hiện quá trình bất hoạt enzyme trong dung dịch tinh bột đã thủy phân, đầu tiên đun cách thủy trong 30 phút và để nguội Sau đó, ly tâm dung dịch ở 3000 rpm trong 10 phút để thu hồi phần dung dịch Tiếp theo, chuẩn bị 40ml dung dịch cồn 96 độ với tỉ lệ cồn và dung dịch đệm là 1:1 để kết tủa nano Cuối cùng, sấy dung dịch nano ở nhiệt độ 45 độ C bằng đĩa petri.
Hiệu suất thu hồi nano tinh bột được tính theo công thức:
H (%): hiệu suất thu hồi nano tinh bột thủy phân bằng enzyme mnano (g): khối lượng nano thu được sau khi sấy mtinh bột (g): khối lượng tinh bột ban đầu
3.4.2 Phương pháp xác định độhòa tan (Solubility) và độtrương nở (Swelling power) của hạt nano tinh bột Độ hòa tan (S) và độ trương nở (SP) của các mẫu nano tinh bột được xác định dựa trên nghiên cứu của Wenhao Li và cộng sự (2013) và có một số sửa đổi để phù hợp với điều kiện thí nghiệm
Để thực hiện thí nghiệm, cân 0.1g nano tinh bột vào ống ly tâm 15ml và thêm 10ml nước cất để tạo dung dịch huyền phù nano tinh bột 1% Sau đó, đưa mẫu vào bể điều nhiệt ở các mức 30°C và 90°C trong 30 phút Sau khi làm mát về nhiệt độ phòng, tiến hành ly tâm ở 2000rpm trong 10 phút Lấy phần rắn và phần dịch nổi, sau đó cho vào đĩa petri và sấy ở 105°C trong 3 giờ Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác Độ hòa tan và độ trương nở của các mẫu nano tinh bột sẽ được xác định theo các công thức phù hợp.
Trong đó: m nano hòa tan (g): khối lượng nano tinh bột hòa tan thu được sau khi sấy m tinh bột (g): khối lượng tinh bột ban đầu
S (%): độ hòa tan của nano tinh bột Độ trương nở (Swelling power):
Trong đó: m rắn (g): khối lượng phần rắn sau khi ly tâm m tinh bột (g): khối lượng tinh bột ban đầu
SP (%): Độ trương nở của nano tinh bột
3.4.3 Phương pháp phân tích cấu trúc hóa học của tinh bột và nano tinh bột
Khi bức xạ hồng ngoại (IR) đi qua mẫu, các liên kết và nhóm chức năng khác nhau sẽ hấp thụ các tần số khác nhau trong vùng hồng ngoại giữa (4000-400 cm-1).
Các phân tử có cấu trúc khác nhau tạo ra các quang phổ khác nhau, cho phép xác định và phân biệt các phân tử (Merck và cộng sự, 2012) Để thực hiện, mẫu tinh bột được nghiền mịn và đưa vào phần chứa mẫu, sau đó đầu dò ATR tiếp xúc và ép mẫu để tiến hành đo Mẫu được quét quang phổ trong khoảng 4000-400 cm-1 với độ phân giải 4 cm-1, và quy trình tương tự cũng được áp dụng cho mẫu nano tinh bột.
Kết quả: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Originlab (version 8.5.1) và đồ thị quang phổ thu được thông qua phần mềm Omnic (Thermo Scientific)
3.4.4 Phương pháp phân tích hình thái hạt nano tinh bột
Trong thiết bị kính hiển vi điện tử quét, chùm electron có năng lượng cao (100 – 30.000 eV) được hội tụ và quét theo kiểu raster Tín hiệu phát ra từ mẫu tại mỗi vị trí sẽ được thu thập bởi các máy dò, đồng bộ với vị trí của chùm tia Cường độ tín hiệu này được sử dụng để điều chỉnh các điểm ảnh tương ứng, và sau đó, các tín hiệu sẽ được kết hợp để tạo thành hình ảnh, với kích thước và phân bố điểm ảnh phụ thuộc vào kiểu quét được chọn (Qijie Chen và cộng sự, 2018).
Thông số: Thế gia tốc: 5 - 10kV, độphóng đại 3000 – 6000 lần
Kết quả: Hình ảnh thu được phản ánh hình thái của từng mẫu
3.4.5 Phương pháp xác định thế zeta và kích thước hạt nano tinh bột
Thế zeta và kích thước hạt của nano tinh bột được xác định bằng máy dò tán xạ ánh sáng động (DLS) (Malvern, Zetasizer Pro, xuất xứ từ Anh)
Để thực hiện đo kích thước hạt, mẫu cần được pha loãng với nước cất ở nồng độ 0.1%, tạo thành dung dịch huyền phù và sau đó bơm vào curvet Đối với việc đo diện thế zeta, mẫu cũng được pha loãng 0.1% với nước cất và cần được cân bằng trong 30 phút trước khi tiến hành đo.
3.4.6 Phương pháp xác định màu nano tinh bột
So sánh màu sắc và đánh độ trắng của các mẫu nano tinh bột từ hạt tam giác mạch Cách thực hiện
Các mẫu nano tinh bột được đo màu bằng máy sắc ký Minolta (CR-400, Minolta Camera Co., Osaka, Nhật Bản) Màu sắc của các mẫu được thể hiện qua giá trị L* (độ sáng) từ 0 (đen) đến 100 (trắng), giá trị a* (độ đỏ) từ +60 (đỏ) đến -60 (xanh lục) và giá trị b* (độ vàng) từ +60 (màu vàng) đến -60 (màu xanh lam) Mỗi mẫu được lặp lại phép đo 3 lần (Kurt và cộng sự, 2018).
3.4.7 Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Xử lý số liệu trung bình, độ lệch chuẩn và sai số được thực hiện bằng phần mềm Excel 2016 và Originlab (phiên bản 8.5.1) Phân tích phương sai ANOVA được thực hiện thông qua phần mềm SPSS (SPSS 20 for Windows, SPSS Inc, Chicago, IL, USA) Đồ thị quang phổ được thu thập nhờ phần mềm Omnic (Thermo Scientific).
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucoamylase và thời gian thủy phân đến tính ch ất hạt nano tinh bột
Glucoamylase là enzyme quan trọng trong quá trình sản xuất nano tinh bột, chủ yếu tác động vào các liên kết α-1,4-glycosidic và có khả năng phân cắt nhánh nhờ tác động chậm vào liên kết α-1,6-glycosidic Nghiên cứu này nhằm mục đích xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân đến tính chất của hạt nano tinh bột, từ đó tìm ra điều kiện tối ưu để sản xuất nano tinh bột từ tinh bột tam giác mạch Kết quả về kích thước và hiệu suất thu hồi của các mẫu tinh bột thủy phân bởi glucoamylase được trình bày trong Bảng 4.1.
6Bảng 4.1 Kích thước và hiệu suất thu hồi của các mẫu nano tinh bột thủy phân bởi glucoamylase ở các nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau
Thời gian thủy phân (giờ)
Bảng 4.1 cho thấy sự thay đổi kích thước và hiệu suất thu hồi nano của các mẫu tinh bột khi nồng độ enzyme và thời gian thủy phân tăng Kích thước của 9 mẫu có sự khác biệt đáng kể; khi nồng độ enzyme tăng từ 1100 đến 1800 U/g và thời gian thủy phân từ 2 đến 3 giờ, kích thước nano của tinh bột giảm dần Mẫu 3G500 có nồng độ enzyme
1800 U/g được thủy phân trong 3 giờlà có kích thước nhỏ nhất (150.9 nm), mẫu 2G300 có
Nồng độ 1100 U/g của enzyme glucoamylase được thủy phân trong 2 giờ cho kích thước lớn nhất là 393.9 nm Tuy nhiên, khi thời gian thủy phân tăng lên 3 đến 4 giờ, kích thước nano tinh bột lại gia tăng, với mẫu 4G500 (204 nm) lớn hơn mẫu 3G500 (150.9 nm) Nguyên nhân là do thời gian thủy phân kéo dài làm enzyme thủy phân thêm nhiều liên kết α-1,4-glycosidic và α-1,6-glycosidic, dẫn đến sự giảm kích thước phân tử và tạo ra các phân tử đường nhỏ hơn Khi đo phân bố kích thước hạt trong nước, các phân tử nhỏ này bị tan, chỉ còn lại các hạt có kích thước lớn hơn được đo.
Hiệu suất thu hồi nano tinh bột trong 9 điều kiện khảo sát cho thấy sự khác biệt rõ rệt Khi nồng độ enzyme tăng từ 1100 đến 1800 U/g và thời gian thủy phân kéo dài từ 2 đến 3 giờ, hiệu suất thu hồi nano tinh bột có xu hướng tăng Mẫu 3G500 với nồng độ 1800 U/g và thời gian thủy phân 3 giờ đạt hiệu suất cao nhất (11.82%), trong khi mẫu 2G300 với nồng độ 1090 U/g và thời gian 2 giờ có hiệu suất thấp nhất (4.35%) Tuy nhiên, khi thời gian thủy phân kéo dài từ 3 đến 4 giờ, hiệu suất thu hồi lại giảm, như trường hợp mẫu 4G500 (8.91%) so với mẫu 3G500 Nguyên nhân là do enzyme glucoamylase phân cắt quá nhiều, làm giảm kích thước phân tử nano tinh bột và tạo ra các phân tử đường, dẫn đến lượng cồn không đủ để kết tủa các phân tử có khối lượng phân tử thấp, từ đó giảm hiệu suất thu hồi Tổng thể, hiệu suất thu hồi nano tinh bột khi sử dụng glucoamylase ở các thời gian khác nhau là thấp, với mức cao nhất chỉ đạt 11.82%, do enzyme chủ yếu phân cắt liên kết α-1,4-glycosidic, khiến phần lớn tinh bột chuyển thành đường Xu hướng này cũng được xác nhận trong nhiều nghiên cứu trước đây.
4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ pullulanase và thời gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột
Pullulanase là enzyme phân nhánh, có khả năng xúc tác thủy phân tinh bột tại các liên kết α-1,6-glucosidic và một phần nhỏ liên kết α-1,4-glucosidic Mục tiêu của thí nghiệm này là nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ pullulanase và thời gian thủy phân đến tính chất của hạt nano tinh bột Qua đó, thí nghiệm nhằm xác định điều kiện tối ưu để sử dụng pullulanase trong việc sản xuất nano tinh bột từ tinh bột tam giác mạch Kết quả đo kích thước hạt nano sẽ được phân tích để đánh giá hiệu quả của quá trình này.
29 hiệu suất thu hồi của các mẫu nano tinh bột thủy phân bởi pullulanase được trình bày ở
7Bảng 4.2 Kích thước và hiệu suất thu hồi của các mẫu nano tinh bột thủy phân bởi pullulanase ở các nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau
Thời gian thủy phân (giờ)
Bảng 4.2 cho thấy sự thay đổi kích thước và hiệu suất của các mẫu nano tinh bột khi nồng độ enzyme và thời gian thủy phân tăng dần Kích thước của 9 mẫu thủy phân có sự khác biệt đáng kể; khi nồng độ enzyme tăng từ 100 U/g đến 140 U/g và thời gian thủy phân từ 2 đến 3 giờ, kích thước hạt nano tinh bột giảm dần Mẫu 2P100 thủy phân cho thấy sự thay đổi này rõ rệt.
Trong nghiên cứu, sau 2 giờ với nồng độ enzyme 100 (U/g tinh bột), kích thước hạt lớn nhất đạt 286.5 nm Mẫu 3P140 thủy phân trong 4 giờ với nồng độ enzyme 140 (U/g tinh bột) có kích thước nhỏ hơn, chỉ 123.7 nm Tuy nhiên, khi thời gian thủy phân tăng từ 3 lên 4 giờ, kích thước hạt có xu hướng tăng, mẫu 4P140 đạt kích thước 200.7 nm, lớn hơn so với mẫu 3P140 ở cùng nồng độ trong 3 giờ Nguyên nhân là do thời gian thủy phân dài khiến enzyme pullulanase tiếp tục cắt các liên kết α-1,6-glucosidic và α-1,4-glucosidic trong tinh bột, dẫn đến sự hình thành maltotriose và maltose (Hii và cộng sự, 2012) Do đó, trong quá trình đo phân bố kích thước trong nền nước, chỉ có thể đo được các phân tử nhỏ không tan trong nước, không đo được các phân tử tan trong nước.
Hiệu suất thu hồi nano tinh bột từ 9 mẫu thủy phân cho thấy sự khác biệt rõ rệt, tương tự như kích thước của chúng Sự thay đổi này xảy ra khi nồng độ enzyme được tăng từ 100 U/g đến 140 U/g và thời gian thủy phân được điều chỉnh.
Trong nghiên cứu về hiệu suất thu hồi nano tinh bột, thời gian thủy phân từ 2 đến 3 giờ cho thấy hiệu suất tăng dần Cụ thể, mẫu 2P100 thủy phân trong 2 giờ với nồng độ enzyme 100 (U/g tinh bột) đạt hiệu suất thu hồi thấp nhất là 48.83% Ngược lại, mẫu 4P140 thủy phân trong 3 giờ với nồng độ enzyme 140 (U/g) có hiệu suất thu hồi đạt 70.29% Tuy nhiên, khi thời gian thủy phân tăng từ 3 lên 4 giờ, hiệu suất thu hồi lại giảm, với mẫu 3P140 thủy phân 3 giờ có hiệu suất cao hơn 70.29% so với mẫu 4P140.
Thời gian thủy phân kéo dài 4 giờ (60.42%) đã dẫn đến việc pullulanase làm giảm kích thước phân tử nano tinh bột, tạo ra nhiều phân tử đường hơn Do đó, lượng cồn sử dụng không đủ để kết tủa các phân tử có khối lượng phân tử thấp, làm giảm lượng nano tinh bột thu được Hiệu suất thu hồi nano ở 4 giờ thấp hơn so với 3 giờ Theo nghiên cứu của Sun và cộng sự (2014), hiệu suất thu hồi nano tinh bột từ tinh bột ngô sáp xử lý bằng pullulanase đạt 85%, cho thấy hiệu suất thu hồi nano tinh bột rất cao khi sử dụng pullulanase.
Khảo sát sự ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp hỗn hợp enzyme glucoamylase và pullulanase, thời gian th ủy phân 3 giờ đến tính chất hạt nano tinh bột
và pullulanase, thời gian thủy phân 3 giờ đến tính chất hạt nano tinh bột
Từ kết quả của thí nghiệm 1 và 2, mẫu thủy phân bởi glucoamylase với nồng độ
Trong thí nghiệm, việc sử dụng 1800 U/g trong 3 giờ và mẫu thủy phân bằng pullulanase với nồng độ 140 U/g trong 3 giờ đã cho ra kích thước hạt nhỏ nhất và hiệu suất thu hồi cao nhất Do đó, nồng độ được giảm 50% và kết hợp cả hai enzyme để khảo sát trong thí nghiệm 3 Kết quả về kích thước và hiệu suất thu hồi của các mẫu tinh bột thủy phân kết hợp glucoamylase và pullulanase trong 3 giờ được trình bày chi tiết trong Bảng 4.3.
8Bảng 4.3 Kích thước và hiệu suất trung bình của các mẫu nano tinh bột thủy phân kết hợp glucoamylase và pullulanase trong thời gian 3 giờ
Thí nghiệm cho thấy sự thay đổi kích thước hạt nano tinh bột phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme glucoamylase và pullulanase Mẫu GP3-70 với nồng độ glucoamylase 550 U/g và pullulanase 70 U/g có kích thước nhỏ nhất (180.3 nm) và hiệu suất thu hồi lớn nhất (66.03%), trong khi mẫu GP5-50 với nồng độ glucoamylase 900 U/g và pullulanase 50 U/g có kích thước lớn nhất (416.4 nm) và hiệu suất thu hồi nhỏ nhất (43.83%) Kết quả cho thấy rằng mẫu có nồng độ pullulanase cao hơn glucoamylase sẽ đạt hiệu suất thu hồi cao hơn và kích thước hạt nhỏ hơn Nguyên nhân là do glucoamylase càng nhiều thì khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glycosidic càng cao, dẫn đến việc tạo ra nhiều phân tử đường và giảm lượng nano tinh bột thu được.
Sự gia tăng enzyme pullulanase dẫn đến khả năng phân cắt liên kết α-1,6-glycosidic cao hơn, trong khi khả năng phân cắt α-1,4-glycosidic lại chậm và ít hơn, do đó hạn chế quá trình thủy phân và tăng lượng nano tinh bột thu được Các thí nghiệm cho thấy việc sử dụng riêng lẻ enzyme glucoamylase không mang lại hiệu suất thu hồi cao và không phù hợp cho việc tạo nano tinh bột Ngược lại, enzyme pullulanase không chỉ giúp thủy phân hiệu quả mà còn tạo ra hạt nano tinh bột nhỏ với hiệu suất thu hồi cao.
32 hai loại enzyme glucoamylase và pullulanase không tạo ra mẫu nano tinh bột có kích thước
Khảo sát hình thái, cấu trúc và tính chất của hạt nano tinh bột
Dựa trên kết quả từ ba thí nghiệm, ba mẫu nano tinh bột có kích thước nhỏ nhất và hiệu suất thu hồi cao nhất (3G500, 3P140, GP3-70) sẽ được nghiên cứu các tính chất khác nhau như hình thái, cấu trúc hóa học, độ hòa tan, độ trương nở, màu sắc và hiệu thế zeta.
4.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hạt nano tinh bột
Trong phổ FTIR của bốn mẫu nano tinh bột và tinh bột tam giác mạch, có sự xuất hiện của một dải rộng từ 3000 đến 3600 cm -1, cho thấy sự hiện diện của nhóm liên kết O-H đặc trưng của tinh bột (Feng và cộng sự, 2018; Torrenegra M và cộng sự, 2018) Đỉnh hấp thụ mạnh trong khoảng 3290-3246 cm -1 được cho là do nhóm –OH kéo dài, và độ rộng của đỉnh này phản ánh mức độ hình thành của liên kết hydro trong phân tử (Ahmad và cộng sự).
Các dải hấp thụ đặc trưng trong glucose khan được quan sát tại các số sóng 2923 cm⁻¹, liên quan đến dao động kéo dài của CH2, cùng với các số sóng 1147, 1077 và 990 cm⁻¹, tương ứng với dao động kéo dài của liên kết CO và các nhóm COH, COC (Hebeish và cộng sự, 2018).
2014) Sự hấp thụ ở đỉnh 1417 cm -1 và 2925 cm -1 xuất hiện trong phổ FTIR tinh bột tam
33 giác mạch thể hiện nhóm liên kết CH và CH2 trong dải số sóng từ 1405 đến 1465 cm -1 và từ 2916 đến 2936 cm -1 (Mansuri M Tosif và cộng sự, 2021) Đỉnh đặc trưng tại 1643 cm -1 xuất hiện do sự hiện diện của nước liên kết trong tinh bột (Mudasir và cộng sự).
Sự hấp thụ tại đỉnh 1077 cm -1 cho thấy sự hiện diện của nhóm liên kết C-O trong C-O-C (Katherine Encalada và cộng sự, 2019) Đồng thời, dao động ở khoảng 2349 cm -1 đặc trưng cho liên kết O=C=O (Merch và cộng sự, 2012), có thể do thiết bị chưa loại bỏ hoàn toàn phổ hấp thụ của CO2 trong quá trình đo.
Các mẫu nano tinh bột sau thủy phân có phổ FTIR tương tự như mẫu tinh bột tam giác mạch, nhưng cho thấy sự tăng độ dốc tại các bước sóng 1400 cm-1 và 1200 cm-1 Điều này chứng tỏ rằng các liên kết α-1,6-glycosidic đã bị thủy phân bởi enzyme, dẫn đến sự gia tăng số lượng các nhóm methylene.
4.4.2 Khảo sát hình thái của hạt nano tinh bột
Hình thái và độ đồng nhất của kích thước hạt nano tinh bột là những yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả sử dụng của chúng Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá tác động của quá trình thủy phân lên hình thái và sự phân bố kích thước hạt nano tinh bột Hình thái của nano tinh bột đã được quan sát thông qua kính hiển vi điện tử, như thể hiện trong các hình 4.2a, 4.2b, và 4.2c.
7Hình 4.2a Kết quả chụp SEM của mẫu nano 3G500 thủy phân bằng Glucoamylase
8Hình 4.2b Kết quả chụp SEM của mẫu nano 3P140 thủy phân bằng Pullulanase
9Hình 4.2c Kết quả chụp SEM của mẫu nano GP3-70 thủy phân kết hợp glucoamylase và pullulanase
Kính hiển vi điện tử quét được sử dụng để phân tích hình thái của các hạt nano tinh bột, cho thấy hình dạng và kích thước không đồng đều Các mẫu hạt nano tinh bột đều có hình dạng đa giác, với mẫu thủy phân bởi pullulanase có nhiều góc nhọn hơn Độ xốp của cả ba mẫu tương đương và không bị đông tụ nhiều Hình chụp SEM cũng xác nhận sự đồng nhất với kết quả đo phân bố kích thước hạt được trình bày trong Bảng 4.1 và Bảng 4.2.
Bảng 4.3 Ởđộphóng đại 40000, đa số các hạt có kích thước nhỏ trong khoảng từ 130-200 nm tương ứng với kết quả DLS (mẫu 3G500– 150.9 nm, mẫu 3P140– 123.7 nm, mẫu GP3-
70 kết hợp glucoamylase và pullulanase –180.3 nm), cũng có một số ít hạt có kích thước lớn hơn khoảng 300 nm tuy nhiên không đáng kể
4.4.3 Khảo sát độ hòa tan (Solubility) và độ trương nở (Swelling power) của hạt nano tinh bột Độ hòa tan và trương nở là một trong những tính chất đáng được quan tâm của nano tinh bột Nó thể hiện sự tương tác giữa tinh bột với nước (Hoàng, 2007) và độ bền tương đối của liên kết bên trong nano tinh bột (Sharma và cộng sự, 2021) Độ hòa tan và trương nở của nano tinh bột là yếu tố đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cấu trúc của thực phẩm (Hoàng, 2007)
9Bảng 4.4 Kết quả độ hòa tan và trương nở của các mẫu nano tinh bột
Tính chất Mẫu Nhiệt độ ( 0 C)
Độ hòa tan và trương nở của nano tinh bột trong nước ở nhiệt độ phòng (30 °C) và nước nóng (90 °C) đã được khảo sát, với kết quả được trình bày trong Bảng 4.4 Kết quả cho thấy, khi nhiệt độ tăng lên, độ hòa tan của nano tinh bột cũng tăng đáng kể Mẫu tinh bột thô cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong khả năng hòa tan ở các nhiệt độ khác nhau.
Nghiên cứu cho thấy rằng nano bột có độ hòa tan tăng khi nhiệt độ nước tăng, với các mẫu nano tinh bột có độ hòa tan cao hơn so với mẫu tinh bột ở 30 và 90 độ C Điều này được giải thích bởi cấu trúc phân tử của nano tinh bột có mạch ngắn hơn, giúp quá trình hydrate hóa diễn ra dễ dàng hơn Khả năng hòa tan của tinh bột phụ thuộc vào quá trình thoát amylose, và liên kết phân tử hydro bên trong và bên ngoài yếu đi, tạo điều kiện cho nhiều nhóm hydroxyl tương tác với nước, từ đó tăng độ hòa tan Ngược lại, mẫu tinh bột thô có cấu trúc bên trong chặt chẽ hơn, hạn chế quá trình thoát amylose, dẫn đến độ hòa tan thấp hơn ở cả hai nhiệt độ 30 và 90 độ C.
Khi nhiệt độ tăng, độ trương nở của hạt tinh bột cũng tăng lên đáng kể do lực liên kết giữa các hạt yếu đi, tạo điều kiện cho nước dễ dàng xâm nhập vào cấu trúc bên trong của hạt (Jhan và cộng sự, 2021).
So với tinh bột tự nhiên, mẫu nano có khả năng trương nở cao hơn, phụ thuộc vào cấu trúc, trọng lượng phân tử, hàm lượng amylose và hình dạng hạt tinh bột (Shah và cộng sự, 2016) Khả năng trương nở tăng khi kích thước giảm, và quá trình xay nghiền làm phá vỡ cấu trúc tinh thể thành cấu trúc vô định hình, giảm liên kết giữa amylose và amylopectin, giúp nước dễ dàng thâm nhập vào bên trong cấu trúc hạt hơn (Ashwar và cộng sự).
4.4.4 Khảo sát màu của nano tinh bột
Màu sắc trong thực phẩm đóng vai trò quan trọng, với độ sáng cao thường được người tiêu dùng ưa chuộng hơn.
10Bảng 4.5 Kết quả các thông số màu của tinh bột và nano tinh bột tam giác mạch
Các giá trị đo màu được trình bày trong Bảng 4.5 cho thấy sự khác biệt đáng kể (p