Nghiên cứu chọn lọc chủng tảo spirulina có năng suất và chất lượng cao từ suối nước nóng kim bôi hòa bình

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP PHẠM VĂN NHÃ NGHIÊN CỨU CHỌN LỌC CHỦNG TẢO SPIRULINA CÓ NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG CAO TỪ SUỐI NƯỚC NĨNG KIM BƠI - HỊA BÌNH CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪNKHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ THU HẰNG TS ĐỖ QUANG TRUNG Hà Nội, 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, Ngày tháng năm 2023 NGƯỜI CAM ĐOAN Phạm Văn Nhã ii LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi đến cô TS Nguyễn Thị Thu Hằng - Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh -Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học Lâm Nghiệp, người thầy khoa học định hướng trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS Đỗ Quang Trung, Viện Tài nguyên Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ trình làm luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học Lâm Nghiệp quan tâm giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Tôi xin cảm ơn Trung tâm Công nghệ sinh học IMC tạo điều kiện cho thực đề tài Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè ln bên động viên, khích lệ giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Mặc dù tơi có nhiều cố gắng hồn thiên luận văn nhiệt tình lực mình, nhiên khơng thể tránh khỏi nhiều thiếu sót, mong nhận đóng góp q thầy bạn để tơi hồn thiện luận văn tốt Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2023 TÁC GIẢ Phạm Văn Nhã iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm sinh học tảo xoắn Spirulina 1.1.2 Cấu tạo tế bào 1.1.3 Cấu trúc xoắn thay đổi cấu trúc môi trường 1.2 Phân loại, phân bố Spirulina 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Môi trường sống phân bố 1.3 Chu kỳ sinh trưởng sinh sản Spirulina 1.3.1 Chu kỳ sinh trưởng 1.3.2 Chu kỳ sinh sản 1.4 Khả quang hợp yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển Spirulina 11 1.4.1 Quá trình quang hợp 11 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển tảo Spirulina 11 1.5 Thành phần dinh dưỡng tảo 16 1.6 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 20 1.6.1 Tình hình nghiên cứu nước 20 1.6.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 21 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 23 iv 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 23 2.4 Vật liệu nghiên cứu 24 2.4.1 Hóa chất primer 24 2.4.2 Thiết bị 24 2.5 Phương pháp nghiên cứu 24 2.5.1 Thu thập mẫu nước chứa tảo Spirulina sp 24 2.5.2 Phân lập tảo xoắn Spirulina sp 25 2.5.3 Xác định mơi trường thích hợp cho ni cấy tảo xoắn 25 2.5.4 Khảo sát khả tạo sinh khối chủng tảo xoắn môi trường dinh dưỡng lỏng 28 2.5.5 Xác định suất hàm lượng protein tảo xoắn 28 2.5.6 Tách chiết DNA tổng số tảo xoắn 29 2.5.7 Khuyếch đại gen 16S rRNA tảo xoắn phản ứng PCR 30 2.5.8 Xác định trình tự gen 16S rRNA định danh chủng tảo xoắn 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Phân lập chủng tảo xoắn Spirulina sp 32 3.2 Xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho ni cấy tảo xoắn 34 3.3 Chọn lọc chủng tảo xoắn có chất lượng suất cao 37 3.3.1 Khảo sát khả tạo sinh khối chủng tảo xoắn 37 3.3.2 Xác định hàm lượng protein chủng tảo xoắn 42 3.4 Định danh chủng tảo xoắn phương pháp sinh học phân tử 43 3.4.1 Tách DNA tổng số 43 3.4.2 PCR nhân gen 16s rRNA 45 3.4.3 Định danh chủng tảo xoắn 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học tảo Spirulina (Clement, 1975) 16 Bảng 1.2 Thành phần vitamin tảo Spirulina (Santillen, 1982) 17 Bảng 1.3 Thành phần khoáng tảo Spirulina (Santillen, 1982) 17 Bảng 1.4 Thành phần acid amin tảo Spirulina (Santillen, 1982) 18 Bảng 2.1 Thành phần môi trường Hoagland, BBM, 1/2 Chu-10, BG-11 Zarrouk 26 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng Spirulina sp phân lập từ suối nước nóng Kim Bơi - Hịa Bình mơi trường Zarrouk 32 Bảng 3.2 Đặc điểm sinh trưởng chủng tảo xoắn môi trường dinh dưỡng khác 35 Bảng 3.3 Đặc điểm sinh trưởng chủng tảo xoắn nuôi cấy môi trường BBM Zarrouk lỏng 38 Bảng 3.4 Khối lượng khô trung bình hàm lượng protein chủng tảo xoắn sau 10 ngày nuôi cấy 42 Bảng 3.5 Kiểm tra nồng độ độ tinh RNA tổng số đo NanoDrop 43 Bảng 3.6 Mức độ tương đồng gen mã hóa 16S ribosomal RNA từ chủng KB1 so với trình tự tương đồng Ngân hàng gen NCBI 47 Bảng 3.7 Mức độ tương đồng gen mã hóa 16S ribosomal RNA từ chủng KB2 so với trình tự tương đồng Ngân hàng gen NCBI 49 Bảng 3.8 Mức độ tương đồng gen mã hóa 16S ribosomal RNA từ chủng KB3 so với trình tự tương đồng Ngân hàng gen NCBI 51 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.2 Lát cắt tế bào Spirulina platensis Hình 1.3 Mơ hình xếp vách tế bào Spirulina platensis Hình 1.4 Hai dạng xoắn tảo Spirulina (Vonshak, 1999) Hình 1.5 Năm pha sinh trưởng vi tảo Hình 1.6 Vịng đời tảo Spirulina platensis 10 Hình 3.1 Phân lập quan sát hình dạng chủng tảo xoắn kính hiển vi quang học (vật kính 10X) 33 Hình 3.2 Giá trị OD560nm chủng tảo xoắn nuôi môi trường BBM lỏng sau khoảng thời gian khác 39 Hình 3.3 Giá trị OD560nm chủng tảo xoắn nuôi môi trường Zarrouk lỏng sau khoảng thời gian khác 40 Hình 3.4 Các chủng tảo xoắn Spirulina sp sinh trưởng tạo huyền phù màu xanh lục môi trường Zarrouk 41 Hình 3.5 Điện di kiểm tra chất lượng mẫu DNA tổng số tách chiết từ tảo xoắn 44 Hình 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen 16S rRNA tảo xoắn .45 Hình 3.7 Trình tự nucleotide gen 16S rRNA chủng KB1 46 Hình 3.8 Trình tự nucleotide gen 16S rRNA chủng KB2 48 Hình 3.9 Trình tự nucleotide gen 16S rRNA chủng KB3 50 ĐẶT VẤN ĐỀ Tảo xoắn (tên khoa học Arthrospira platensis Spirulina platensis) Arthrospira chi thuộc nhóm vi khuẩn lam với cấu trúc dạng sợi xoắn đa bào, phân bố rộng (ở hầu hết thủy vực giới) Hiện nay, có lồi tảo xoắn thuộc chi Arthrospira ni trồng quy mô lớn nhiều quốc gia giới A maxima A platensis Tên gọi tảo xoắn Spirulina tên chung loài A maxima A platensis Spirulina chứa hàm lượng protein 60 - 70%, carbohydrate 13 - 16%, lipid - 8%, nhiều loại amino acid thiết yếu (lysine, methionine, phenylalanine, tryptophan…), vitamin (E, B6, B12…) chất khoáng (Cu, Zn, Mg, K, Fe…) Spirulina ứng dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm, dược phẩm hóa mỹ phẩm, chí cịn gọi loại siêu thực phẩm Các thực phẩm sản xuất từ nguyên liệu tảo Spirulina sp giàu dinh dưỡng, giàu sắc tố, có tác dụng tăng cường sức đề kháng, nâng cao khả miễn dịch, tăng sản xuất hồng cầu bạch cầu, bồi bổ sức khỏe, ức chế phát triển tế bào ung thư (Tang et al., 2011; Gubanenko et al., 2019; Belay et al., 2022) Theo số liệu Tổ chức Y tế giới WHO, tảo Spirulina platensis giúp người phịng chống 70% loại bệnh Chính vậy, tảo Spirulina platensis EC khuyến cáo, WHO Bộ Y tế nhiều quốc gia giới công nhận không nguồn thực phẩm mà giải pháp cho phòng điều trị bệnh kỷ 21 Trong số loài thuộc chi Arthrospira, hai loài A platensis A maxima phát hồ nhiệt đới cận nhiệt đới có pH kiềm với 3 2- nồng độ carbonate (CO ) bicarbonate (HCO-) cao (Habib et al., 2008) Loài A platensis phát châu Phi, châu Á Nam Mỹ, loài A maxima phát Trung Mỹ (Vonshak, 1997) Ở Việt Nam, nghiên cứu vi khuẩn lam chủ yếu tập trung vào việc nuôi để thu sinh khối tảo xoắn Spirulina Mặc dù phân bố tảo lam nhiều thuỷ vực nước Việt Nam đề cập, nhiên, nghiên cứu phân lập định danh loài thuộc chi Arthrospira cịn hạn chế Suối nước nóng Kim Bơi suối khống nóng tự nhiên (nhiệt độ nước 34 - 36ºC), thuộc xóm Mớ Đá, xã Hạ Bì, huyện Kim Bơi, tỉnh Hịa Bình Suối nước nóng Kim Bơi có khí hậu cận nhiệt đới, nên có xuất phổ biến vi khuẩn lam Với mong muốn phân lập chủng Spirulina nước suối để hướng tới mục tiêu khai thác, sử dụng nguồn gen tảo địa, ứng dụng làm thực phẩm chức năng, mỹ phẩm thức ăn nuôi trồng thủy sản, đề tài thực với nội dung: “Nghiên cứu chọn lọc chủng tảo Spirulina có suất chất lượng cao từ suối nước nóng Kim Bơi - Hịa Bình” Chương TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm sinh học tảo xoắn Spirulina 1.1.1 Đặc điểm hình thái Tên “Spirulina” xuất phát từ tiếng Latinh “helix” “spiral”, biểu hình dạng xoắn Spirulina tảo đa bào, dạng sợi, sống cộng sinh, tế bào phân biệt vách ngăn, dạng sợi xoắn hình lị xo khơng phân nhánh, số vịng xoắn lớn - vòng Đường kính xoắn khoảng 35 - 50 μm, bước xoắn 60 μm, chiều dài sợi tảo đạt 250 μm Các vách ngang chia sợi Spirulina thành nhiều tế bào riêng rẽ liên kết với cầu liên bào Sợi tảo Spirulina có khả chuyển động tự vận động theo kiểu trượt quanh trục sợi Hình 1.1 Các dạng hình thái tảo Spirulina (Nguồn: Zhau et al., 2013)