Nghiên cứu đột biến gen cdh1 (e cadherin) trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HƢƠNG NGHIªN CøU §éT BIÕN GEN CDH1 (E - cadherin) TR£N BƯNH NHÂN UNG THƯ Dạ DàY LAN TỏA DI TRUYềN LUN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC ại Đ c họ HÀ NỘI – 2020 Y H ội N LV TS BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** NGUYN TH THANH HNG NGHIêN CứU ĐộT BIếN GEN CDH1 (E - cadherin) TRÊN BệNH NHÂN UNG THƯ Dạ DàY LAN TáA DI TRUN Chun ngành : Hóa sinh y học Mã số : 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung ại Đ c họ HÀ NỘI - 2020 Y H ội N LV TS MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Ung thư dày lan tỏa di truyền 1.1.1 Lịch sử phát dịch tễ học 1.1.2 Các yếu tố nguy 1.1.3 Đặc điểm lâm sàng 12 1.1.4 Giải phẫu bệnh 13 1.1.5 Chẩn đoán ung thư dày lan tỏa di truyền 17 1.1.6 Chẩn đoán giai đoạn ung thư dày 18 1.1.7 Điều trị tiên lượng 20 1.2 Vai trò gen CDH1 ung thư dày lan tỏa di truyền 22 1.2.1 Cấu trúc chức gen CDH1 22 1.2.2 Cơ chế gây bệnh gen CDH1 ung thư dày lan tỏa di truyền 25 1.2.3 Đặc điểm di truyền ung thư dày lan tỏa di truyền 28 1.2.4 Tình hình nghiên cứu ung thư dày lan tỏa di truyền đột biến gen CDH1 giới Việt Nam 30 1.2.5 Quản lý bệnh ung thư dày lan tỏa di truyền đột biến gen CDH1 32 1.3 Các phương pháp phát đột biến gen CDH1 36 1.3.1 Khuếch đại gen kỹ thuật PCR 37 1.3.2 Kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger 37 1.3.3 Dự đoán khả gây bệnh đột biến gen CDH1 phần mềm phân tích tin sinh học 38 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 ại Đ 2.1 Đối tượng nghiên cứu 40 c họ 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 41 Y H ội N LV TS 2.3 Phương pháp nghiên cứu 41 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: 41 2.3.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 41 2.3.3 Phương pháp thu thập mẫu 42 2.3.4 Các biến số nghiên cứu 43 2.3.5 Sơ đồ nghiên cứu 45 2.3.6 Phương tiện nghiên cứu 46 2.3.7 Quy trình kỹ thuật phân tích đột biến gen CDH1 48 2.3.8 Thử nghiệm Clo-Test chẩn đoán nhiễm H Pylori 51 2.3.9 Quy trình kỹ thuật nhuộm hóa mơ miễn dịch 52 2.4 Xử lý phân tích số liệu 53 2.5 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 53 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 55 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 55 3.1.1 Đặc điểm tuổi, giới, tiền sử bệnh yếu tố nguy 55 3.1.2 Đặc điểm lâm sàng 58 3.1.3 Đặc điểm tổn thương dày qua nội soi 60 3.1.4 Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM 61 3.2 Kết phân tích gen CDH1 đối tượng nghiên cứu 61 3.2.1 Kết tách chiết DNA phản ứng PCR khuếch đại exon gen CDH1 61 3.2.2 Kết phát đột biến SNP gen CDH1 62 3.2.3 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng đối tượng nghiên cứu mang đột biến SNP gen CDH1 72 ại Đ c họ Y H ội N LV TS 3.3 Xác định đột biến gen CDH1 thành viên gia đình bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 79 3.3.1 Phả hệ kết phát đột biến gen CDH1 thành viên gia đình 79 3.3.2 Đặc điểm phả hệ thành viên gia đình mang đột biến gen CDH1 87 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 91 4.1 Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu 91 4.2 Đột biến gen CDH1 bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền 101 4.3 Đột biến gen CDH1 thành viên gia đình bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 120 KẾT LUẬN 134 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ại Đ c họ Y H ội N LV TS DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dày Tổ chức Y tế Thế giới năm 2010 so sánh với phân loại Lauren 15 Bảng 1.2 Phân loại TNM ung thư dày theo AJCC 8th 2017 19 Bảng 1.3 Phân loại giai đoạn bệnh UTDD theo TNM 20 Bảng 1.4 Ý nghĩa phương pháp đánh giá đột biến gen CDH1 37 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 49 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 49 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự 50 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR cho giải trình tự 50 Bảng 2.5 Quy trình xử lý tiêu hóa mơ miễn dịch 52 Bảng 3.1 Phân loại đối tượng nghiên cứu theo tiêu chuẩn IGCLC 2015 55 Bảng 3.2 Phân bố tuổi giới bệnh nhân tham gia nghiên cứu 56 Bảng 3.3 Mối liên quan tuổi phát bệnh với giới tính 56 Bảng 3.4 Tiền sử cá nhân, gia đình số yếu tố nguy 57 Bảng 3.5 Lý vào viện đối tượng nghiên cứu 58 Bảng 3.6 Thời gian xuất triệu chứng đến vào viện 59 Bảng 3.7 Đặc điểm tổn thương dày qua nội soi 60 Bảng 3.8 Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM 61 Bảng 3.9 Các SNP tìm thấy nghiên cứu 63 Bảng 3.10 Đột biến SNP gen CDH1 tìm bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền 64 Bảng 3.11 Dự đoán khả gây bệnh đột biến sai nghĩa 70 Bảng 3.12 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 73 ại Đ Bảng 3.13 Đặc điểm nội soi mô bệnh học bệnh nhân mang đột biến 74 họ c Bảng 3.14 Phân bố SNP bệnh nhân tham gia nghiên cứu 77 Y H ội N LV TS Bảng 3.15 Đặc điểm lâm sàng số yếu tố nguy 77 Bảng 3.16 Đặc điểm phả hệ mang đột biến gen nghiên cứu 87 Bảng 3.17 Tỷ lệ mang đột biến gen CDH1 phả hệ gia đình 88 Bảng 3.18 Đặc điểm nội soi mô bệnh học thành viên gia đình mang đột biến gen CDH1 89 ại Đ c họ Y H ội N LV TS ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dày (UTDD) loại ung thư thường gặp, có ảnh hưởng to lớn đến sức khỏe cộng đồng Theo thống kê Globocan 2018, UTDD loại ung thư phổ biến thứ nguyên nhân gây tử vong thứ hai giới [1] Hầu hết UTDD không di truyền, nhiên khoảng 10% trường hợp UTDD có tính chất gia đình, UTDD lan tỏa di truyền chiếm 1-3% [2] Ung thư dày lan tỏa di truyền bệnh lý di truyền gặp, đặc trưng mô bệnh học tế bào ung thư biệt hóa, xâm lấn lan tỏa lớp niêm mạc nên khó phát sớm Biểu lâm sàng UTDD lan tỏa di truyền bệnh thường khởi phát tuổi trẻ (tuổi trung bình phát 38), tiến triển nhanh, tiên lượng xấu tỷ lệ tử vong cao, nhiên phát bệnh giai đoạn sớm tỷ lệ sống năm tăng lên 90% [3] Trong chế bệnh sinh UTDD lan tỏa việc kiểm sốt độ bám dính tính di động tế bào yếu tố quan trọng trình tạo thành tiến triển khối u Gen CDH1 quy định tổng hợp protein E-cadherin có vai trị quan trọng việc bám dính liên kết tế bào phụ thuộc canxi, trì phân hóa kiến trúc bình thường biểu mô [4] Khi xảy đột biến gen CDH1, dẫn đến suy giảm chức E-cadherin làm giảm khả bám dính tế bào, gây nên hình thái bất thường cấu trúc biểu mô phân cực tế bào Nhiều nghiên cứu rằng, việc bám dính tế bào với tế bào điều kiện tiên dẫn đến xâm lấn di tế bào ung thư [5] Đột biến gen CDH1 phát vào năm 1998 Guilford, thơng qua ại Đ phân tích đột biến thành viên mắc UTDD lan tỏa khởi phát sớm c họ gia đình người Maori (New Zealand) [6] Mặc dù, có vài nghiên Y H ội N LV TS cứu giới số gen có liên quan đến UTDD lan tỏa di truyền CTNNA1, BRCA2, MAP3K6…tuy nhiên, vai trò đột biến gen nói chưa chắn số lượng mẫu nghiên cứu khơng đủ để xác định mức độ phổ biến mức độ thâm nhập gen [7] Tỷ lệ phát đột biến gen CDH1 chiếm 30 – 40% gia đình chẩn đốn UTDD lan tỏa di truyền [6] Vì vậy, việc xác định đột biến gen UTDD lan tỏa di truyền giới hạn gen CDH1 Đặc điểm di truyền bệnh theo chế di truyền gen trội nhiễm sắc thể thường, cá thể gia đình có bố mẹ mang đột biến gen có 50% hội nhận đột biến gen từ bố mẹ Vì vậy, việc sàng lọc phát sớm thành viên gia đình bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 chưa biểu bệnh cần thiết Từ đó, có biện pháp phịng bệnh đưa can thiệp điều trị sớm hiệu Tại Việt Nam, nghiên cứu đột biến gen CDH1 bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền, xác định đột biến thành viên gia đình có nguy cao cịn mẻ Với lý đề tài “Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền” thực với mục tiêu: Phân tích đột biến gen CDH1 đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền Xác định đột biến gen CDH1 thành viên gia đình bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền mang đột biến gen CDH1 ại Đ c họ Y H ội N LV TS Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Ung thƣ dày lan tỏa di truyền 1.1.1 Lịch sử phát dịch tễ học Hiệp hội tiêu hóa Mỹ báo cáo vào năm 1994 gia đình có thành viên bị UTDD xảy lứa tuổi từ 31 – 65 tuổi, vịng hệ [8] Gia đình có cặp sinh đơi giống nhau, hai bị chết UTDD Kết giải phẫu bệnh thành viên gia đình thấy tế bào ung thư hình nhẫn niêm mạc dày Đây báo cáo gia đình có thành viên bị UTDD, sở di truyền tượng chưa biết rõ vào thời điểm Năm 1998, Guilford cộng xác định đột biến gen CDH1 nguyên nhân chủ yếu gây ung thư dày lan tỏa di truyền [9] Nghiên cứu thực ba gia đình người Maori New Zealand, với nhiều trường hợp khởi phát ung thư dày sớm, đa hệ Phân tích di truyền cho thấy có liên quan đáng kể với E-cadherin, protein mã hoá gen CDH1, có vai trị quan trọng việc bám dính tế bào trì tồn vẹn biểu mô Phát giúp xác định đột biến gen CDH1 gia đình có nhiều thành viên bị UTDD lan tỏa [10] Một nghiên cứu thực gia đình bị chi phối ung thư dày lan tỏa ung thư vú thùy Các đột biến dị hợp tìm thấy gen CDH1 phân bố rải rác khắp gen Các bệnh nhân bị đột biến gen CDH1 thường khơng có triệu chứng thời điểm chẩn đoán, tế bào ung thư phát triển âm thầm niêm mạc dày, khơng hình thành khối u nên khó phát sớm, chẩn đoán thường muộn [10] ại Đ Khoảng 10 – 30% trường hợp UTDD cho thấy có tính chất gia đình, c họ có – 3% gây hội chứng ung thư dày lan tỏa di truyền Y H ội N LV TS