TỔNG QUAN
Vai trò của gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền
Ung thư dạ dày giai đoạn sớm, theo Hiệp hội Ung thư dạ dày Nhật Bản, là khi khối u chỉ giới hạn trong lớp niêm mạc hoặc lớp dưới niêm mạc, bất kể có di căn hay không Tiên lượng của ung thư dạ dày thể lan tỏa trong giai đoạn này được báo cáo là tương đương hoặc tốt hơn so với các loại ung thư dạ dày khác Một nghiên cứu lớn với 1520 bệnh nhân cho thấy bệnh nhân mắc ung thư dạ dày thể lan tỏa có tỷ lệ sống tốt hơn so với những người mắc các dạng ung thư khác Ba nghiên cứu chỉ ra rằng tiên lượng của ung thư dạ dày thể lan tỏa tốt hơn so với các dạng khác trong giai đoạn sớm, trong khi hai nghiên cứu khác cho thấy tiên lượng của hai nhóm này là tương tự Kết quả này có thể được giải thích bởi việc khối u trong ung thư dạ dày thể lan tỏa thường bị giới hạn trong lớp niêm mạc và dưới niêm mạc, với ít hạch bạch huyết bị xâm lấn hơn so với các dạng ung thư không phải thể lan tỏa.
Tiên lƣợng ung thƣ dạ dày lan tỏa trong giai đoạn tiến triển
Tiên lượng sống trên 5 năm của ung thư dạ dày thể lan tỏa trong giai đoạn tiến triển thấp hơn đáng kể so với ung thư dạ dày không phải thể lan tỏa Mặc dù vậy, một số nghiên cứu nhỏ khác lại không tìm thấy sự khác biệt về tiên lượng giữa hai dạng này Do đó, tiên lượng cho ung thư dạ dày thể lan tỏa trong giai đoạn tiến triển vẫn chưa có sự thống nhất.
1.2 Vai trò của gen CDH1 trong ung thƣ dạ dày lan tỏa di truyền
1.2.1 Cấu trúc và chức năng của gen CDH1
Gen CDH1 nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể (NST) 16, tại vị trí
Gen CDH1, nằm tại vị trí 16q22.1, mã hóa cho E-cadherin, một glycoprotein có trọng lượng phân tử 120 kD Gen này bao gồm 16 exon trải dài trên một khu vực khoảng 100kb, với độ dài các exon dao động từ 114 đến 2251 bp và có 15 intron.
Hình 1.2 Hình ảnh gen CDH1 nằm trên nhánh dài NST 16, gồm 16 exon mã hóa cho các vùng protein tương ứng [79]
E-cadherin là một loại cadherin cổ điển, được phát hiện lần đầu tiên ở tủy sống bởi nhà khoa học Takeichi [80] , [4] Cấu trúc của E-cadherin gồm 3 phần: một miền ngoại bào lớn, một phân đoạn xuyên màng đơn và một miền tế bào chất ngắn [81] Miền ngoại bào lớn gồm 5 tiểu phần ngoại bào (EC) từ EC1 đến EC5 kết nối với nhau thông qua các ion Ca 2+ Mỗi EC gồm 110 acid amin, chia thành 7 chuỗi beta được sắp xếp theo kiểu sandwich – sandwich Vùng xuyên màng đơn được mã hóa dưới dạng các protein tiền thân chứa một chuỗi tín hiệu Trong khi đó miền nội bào là nơi là E-cadherin gắn với một bó sợi actin thông qua phức hợp protein gồm: -catenin và -catenin hoặc - catenin, trong đó - và -catenin chia sẻ vai trò tương đồng với nhau và liên kết với đầu tận C của E-cadherin [82] E-cadherin thường không biểu hiện cấu trúc chức năng cuối cùng của mình nếu không bắt cặp với cấu trúc gắn của nó [82] Đại học Y Hà Nội- LVTS
Hình 1.3 Vị trí của E-cadherin và vai trò trong kết dính tế bào [83]
CM: Màng tế bào; ED: Miền ngoại bào; ID: Miền nội bào;
AC: Actin cytoskeleton; AJ: Nối tiếp; 1: - catenin; 2: - catenin; 3: p120
E-cadherin là một phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc kết dính tế bào phụ thuộc canxi, duy trì sự phân hóa, kiến trúc bình thường của biểu mô và cân bằng nội mô [84] Chức năng của E-cadherin đòi hỏi một sự hợp tác tốt giữa miền tế bào chất của E-cadherin kết nối với sợi actin thông qua các catenin khác nhau (-, - và p120) và các liên kết canxi ở miền ngoại bào Suy giảm chức năng của E-cadherin sẽ làm suy giảm sự kết dính tế bào, gây nên những hình thái bất thường về kiến trúc biểu mô, mất phân cực tế bào và dẫn đến sự xâm lấn, di căn tới các mô lân cận
E-cadherin đóng vai trò quan trọng trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền, ảnh hưởng đến nhiều chức năng của tế bào như biệt hóa, tăng sinh, phát triển, di động và chết Các chức năng này được điều tiết thông qua các con đường tín hiệu như WNT, Rho GTPases và EGFR.
Hình 1.4 Các con đường sinh ung thư liên quan đến E-cadherin [85]
1.2.2 Cơ chế gây bệnh của gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền
1.2.2.1 Vai trò của E-cadherin trong ung thư
Kiểm soát độ bám dính và tính di động của tế bào là cơ chế quan trọng trong sự hình thành và tiến triển của khối u Suy giảm chức năng của E-cadherin làm giảm khả năng bám dính của tế bào, dẫn đến sự tăng sinh bất thường và thay đổi cấu trúc biểu mô, cũng như mất phân cực tế bào, từ đó tạo điều kiện cho sự xâm lấn.
E-cadherin là một protein ức chế khối u nổi bật Mất biểu hiện của E- cadherin cùng với quá trình chuyển đổi biểu mô – trung mô (EMT), xảy ra thường xuyên trong quá trình phát triển và di căn của ung thư [86] Mất E- cadherin gây mất kết dính tế bào - tế bào, cho phép các tế bào tách khỏi khối u chính, xâm nhập vào các mô xung quanh và di chuyển đến các tổ chức ở xa Tuy nhiên, trong một số trường hợp ung thư biểu mô vẫn di căn xa mặc dù chức năng của E-cadherin bình thường và quá trình biến đổi biểu mô – trung mô không bắt buộc là do di căn gây nên Hơn nữa, E-cadherin tham gia vào quá trình di chuyển của tế bào bất thường cùng các tế bào khác, tạo thuận lợi cho quá trình xâm lấn và di căn xa Đại học Y Hà Nội- LVTS
E-cadherin đóng vai trò quan trọng trong ung thư, không chỉ trong hình thành và di căn mà còn trong việc điều chỉnh tín hiệu nội bào, thúc đẩy sự phát triển khối u Sự kết dính tế bào qua trung gian có thể ảnh hưởng đến đường dẫn tín hiệu Wnt Khi E-cadherin mất chức năng, β-catenin tự do bị phosphoryl hóa bởi GSK-3β và phân hủy qua con đường ubiquitin-proteasome, hạn chế hậu quả của đột biến CDH1 và nguy cơ hình thành khối u Sự hình thành khối u xảy ra khi gen ức chế APC bị mất chức năng, β-catenin đột biến hoặc GSK-3β bị ức chế, dẫn đến sự tích tụ β-catenin trong tế bào chất β-catenin sau đó vào nhân, liên kết với các yếu tố phiên mã Tcf/Lef-1 và điều chỉnh biểu hiện của các gen mục tiêu như c-myc và cyclin D1 Nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng E-cadherin có thể hoạt động ở giai đoạn sớm trong quá trình phát triển khối u, đặc biệt trong ung thư dạ dày gia đình.
Trong hình 1.5, phức hợp cadherin-catenin và protein APC được mô tả Khi không có tín hiệu Wnt-1, GSK có mặt và -catenin (-cat) liên kết với cadherin hoặc protein APC.
Giảm chức năng catenin Đại học Y Hà Nội- LVTS
1.2.2.2 Vai trò của E-cadherin trong hoạt động di căn
Con đường Rho GTPase, đặc biệt là thông qua protein Cdc42, Rac1 và Rho
A là con đường quan trọng trong cơ chế di căn của tế bào ung thư
Hình 1.6 Con đường Rho-GTPase [89]
Protein Cdc42 liên quan đến filopodia, cấu trúc giàu actin giúp cảm nhận tín hiệu và xác định hướng di chuyển của tế bào Trong khi đó, protein Rac tương tác với lamellipodia, một cấu trúc actin khác, và protein Rho gây mất phân cực biểu mô ở tế bào u lành, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển đổi biểu mô – trung mô (EMT) ở các khối u ác tính.
Ba protein này tạo ra liên kết giữa tế bào và cấu trúc ngoài tế bào qua integrin
Sự thay đổi tín hiệu của hệ Rho GTPase có thể ảnh hưởng đến khả năng di chuyển, xâm lấn và di căn của tế bào, cũng như khả năng tăng sinh của chúng Tuy nhiên, cần có thêm nghiên cứu để làm rõ cơ chế liên kết giữa hệ Rho GTPase và E-cadherin.
Trong nghiên cứu của Petrova và cộng sự, nhóm đã chứng minh rằng vai trò của E-cadherin trong quá trình di căn chủ yếu phụ thuộc vào sự điều hòa của E-cadherin trên bề mặt ở trạng thái hoạt động, không phải do số lượng E-cadherin Họ đã sử dụng một kháng thể đơn dòng kích hoạt cho E-cadherin, được áp dụng trong các nghiên cứu trước đó, để xác định ảnh hưởng của nó đến mức độ di căn và cơ chế điều chỉnh liên quan.
Mất mối nối tế bào:RAC1, RHO, ROCK
Di chuyển: RHOA, ROCK, RAC1, CDC42
Nghiên cứu tại Đại học Y Hà Nội về mạch máu RHOC đã chỉ ra rằng mặc dù E-cadherin biểu hiện cao trong các tế bào khối u, quá trình di căn vẫn diễn ra Thực nghiệm trên động vật mang khối u cho thấy việc kích hoạt hoạt động kết dính của E-cadherin bằng mAb, không phụ thuộc vào số lượng, đã làm giảm đáng kể hoạt động di căn Điều này chứng tỏ rằng sự điều chỉnh hoạt động bám dính của E-cadherin có vai trò quan trọng trong quá trình di căn của tế bào khối u, liên quan đến đột biến gen.
CDH1 là yếu tố quan trọng trong ung thư dạ dày di truyền, với tỷ lệ khoảng 30% Nghiên cứu của Petrova chỉ ra mối liên quan giữa các đột biến sai nghĩa của gen CDH1 và bệnh ung thư dạ dày di truyền, ảnh hưởng đến cơ chế điều chỉnh bề mặt tế bào mà không làm giảm chức năng bám dính của E-cadherin Điều này cho thấy đột biến trong E-cadherin ở bề mặt tế bào có vai trò quan trọng trong sự tiến triển của ung thư Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng mất sự bám dính giữa các tế bào là điều kiện tiên quyết cho sự xâm nhập của tế bào ung thư và hình thành di căn.
Các phương pháp phát hiện đột biến gen CDH1
Để chẩn đoán bệnh, cần sử dụng các công cụ sinh học phân tử (SHPT) nhằm xác định chính xác các bất thường của hệ gen, đặc biệt là gen CDH1 Việc phát hiện đột biến và nguyên nhân gây bệnh từ gen CDH1 đòi hỏi một cách tiếp cận đa mô thức, tuy nhiên chưa có giải pháp tối ưu cho việc đánh giá tổng thể Mỗi phương pháp phân tích đều có ưu nhược điểm riêng, do đó cần lựa chọn phương pháp phù hợp dựa trên từng trường hợp cụ thể Các yếu tố cần cân nhắc bao gồm khả năng áp dụng, hạn chế của các phương pháp, khả năng kinh tế và tính chất nghiên cứu Ngoài ra, việc lựa chọn mẫu cũng cần được chú ý để đảm bảo nghiên cứu các đột biến một cách hiệu quả.
Các phương pháp phát hiện đột biến gen bao gồm PCR, sequencing thông thường, và có thể kết hợp với các kỹ thuật hiện đại như MLPA, NGS, qPCR, RT-PCR, multiplex sequencing, pyrosequencing và bisulfite sequencing Việc đánh giá loại đột biến, bao gồm sai nghĩa, mất đoạn hoặc vô nghĩa, là cần thiết Đặc biệt, những trường hợp đột biến mất đoạn thường liên quan đến nguy cơ cao mắc bệnh, do đó cần thực hiện các biện pháp theo dõi và điều trị dự phòng theo khuyến cáo.
Bảng 1.4 Ý nghĩa của các phương pháp đánh giá đột biến gen CDH1 [108]
Gene Phương pháp đánh giá Tỷ lệ mang đột biến gen
CDH1 Giải trình tự gen thông thường 30%-50%
Phân tích đột biến mất/thêm đoạn gene 4%
1.3.1 Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR là một kỹ thuật quan trọng trong lĩnh vực sinh học phân tử, cho phép khuếch đại DNA từ một lượng nhỏ ban đầu thành hàng triệu bản sao phục vụ cho phân tích và giải trình tự gen Phương pháp này sử dụng hai đoạn mồi, nucleotid tự do và enzym DNA polymerase bền nhiệt để khuếch đại đoạn gen PCR có độ chính xác cao khi khuếch đại lượng nhỏ DNA mẫu, thời gian thực hiện nhanh, chi phí thấp và dễ áp dụng, đặc biệt trong việc phát hiện đột biến gen CDH1 Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhược điểm như cần đoạn mồi đặc trưng và dễ bị nhiễm bẩn, đồng thời không hiệu quả trong việc phát hiện các đột biến mất đoạn hoặc nhân đoạn lớn, gặp trong 4-5% trường hợp chẩn đoán ung thư đại trực tràng di truyền.
1.3.2 Kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger
Giải trình tự gen trực tiếp là phương pháp đơn giản, bắt đầu bằng việc tách DNA sợi kép thành sợi đơn Sau đó, DNA được chia thành 4 ống nghiệm, mỗi ống chứa một đoạn mồi oligonucleotid, DNA polymerase và hỗn hợp 4 loại nucleotid dNTP cùng với một loại dideoxynucleotid có đánh dấu đồng vị phóng xạ Quá trình ghép đôi diễn ra cho đến khi ddNTP gắn vào, khiến quá trình giải trình tự dừng lại và tạo ra các đoạn DNA có độ dài khác nhau.
Mẫu DNA được đưa vào điện di trên gel Polyacrylamide hoặc Agarose để giải trình tự gen, mang lại nhiều ưu điểm như chi phí thấp, dễ thực hiện và khả năng phát hiện đột biến hiệu quả Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là thời gian hoàn thành lâu, có thể kéo dài đến vài ngày tùy thuộc vào chiều dài đoạn gen cần phân tích Đặc biệt, khi sử dụng mẫu mô từ vị trí khối u, độ đặc hiệu của phương pháp giảm, dẫn đến nguy cơ âm tính giả Dù vậy, nhờ vào chi phí hợp lý và tính phổ biến, phương pháp này vẫn là lựa chọn hàng đầu trong các nghiên cứu về gen CDH1 và các gen khác để phát hiện đột biến.
1.3.3 Dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến gen CDH1 bằng phần mềm phân tích tin sinh học (in silico)
Ngày nay, phần mềm phân tích tin sinh học (in silico) đang phát triển mạnh mẽ và được sử dụng phổ biến để hỗ trợ nghiên cứu di truyền, đặc biệt trong lĩnh vực ung thư Phương pháp này kết hợp nhiều ngành khác nhau, bao gồm dữ liệu phả hệ gia đình, xét nghiệm di truyền, phân tích in vitro và phân tích tin sinh học, nhằm đánh giá và dự đoán khả năng gây bệnh.
Phân tích in silico hiện đang được áp dụng để phân loại các biến thể gen mới thành lành tính hoặc gây bệnh Dự đoán từ các chương trình này có thể cung cấp thông tin về tác động của biến thể đối với cấu trúc và chức năng protein, cũng như mức độ bảo tồn của nucleotid giữa các loài và tính chất sinh hóa của sự thay thế acid amin Việc sử dụng nhiều phần mềm khác nhau để dự đoán khả năng gây bệnh là cần thiết, vì mỗi chương trình áp dụng các thuật toán riêng biệt, dẫn đến kết quả khác nhau Trong số các phần mềm phân tích in silico, SIFT, Polyphen 2 và Mutation Taster đã trở thành những công cụ tiêu chuẩn và phổ biến nhất trong lĩnh vực này.
SIFT là công cụ dự đoán tác động của việc thay thế acid amin đến chức năng protein dựa trên sự bảo tồn của trình tự acid amin qua tiến hóa Những acid amin được bảo tồn cao thường đóng vai trò quan trọng cho chức năng protein, trong khi acid amin có mức bảo tồn thấp có thể chịu đựng sự thay thế mà không làm ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng protein Điểm SIFT dao động từ 0 đến 1, và nếu giá trị dưới 0,05, sự thay thế acid amin được coi là không dung nạp hoặc có khả năng gây bệnh.
Polyphen 2 là công cụ tự động để dự đoán tác động của sự thay thế acid amin lên cấu trúc và chức năng của protein, dựa trên sự thay đổi về cấu trúc và so sánh để đánh giá hiệu quả về tính ổn định và chức năng của protein [114] Khả năng gây bệnh càng cao khi điểm đánh giá càng gần 1
Mutation Taster là ứng dụng phần mềm chuyên đánh giá khả năng gây bệnh của các biến đổi DNA Nó dự đoán tác động của các biến đổi acid amin đến cấu trúc và chức năng của protein.
Nghiên cứu của Yelskaya và cộng sự (2016), đã phát hiện một đột biến sai nghĩa c.1679C>G (p.T560R) ở một bệnh nhân bị UTDD lan tỏa di truyền
Khi phân tích đột biến theo phần mềm in silico bằng SIFT, Polyphen 2,
Mutation Taster đã xác định đây là một đột biến có khả năng gây hại Nghiên cứu in silico cho thấy đột biến này tạo ra một vị trí nối mới, dẫn đến việc xóa 32 nucleotide ở đầu 3’ của exon 11, gây ra mã kết thúc sớm và tạo ra một đột biến gây bệnh Kết quả nghiên cứu này nhấn mạnh sự tương đồng giữa phương pháp in silico và in vitro trong việc xác định khả năng gây bệnh.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ 10/2016 – 4/2020
- Địa điểm lấy mẫu: Bệnh viện K, bệnh viện Đại học Y Hà Nội, bệnh viện Việt Đức, bệnh viện Ung bướu Hà Nội, bệnh viện Lão khoa TW
- Địa điểm phân tích mẫu:
Phân tích gen được thực hiện tại Trung tâm Kiểm chuẩn và Đảm bảo chất lượng Xét nghiệm - Đại học Y Hà Nội, trong đó 32/45 mẫu được phân tích tại đây và 13/45 mẫu được phân tích tại Khoa Sinh học Ứng dụng, Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản, sử dụng cùng một phương pháp.
- Địa điểm làm hóa mô miễn dịch: Khoa Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Đại học Y Hà Nội
- Địa điểm nội soi tiêu hóa các thành viên gia đình mang đột biến: Khoa Thăm dò chức năng bệnh viện Lão Khoa TW.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang
Bệnh ung thư dạ dày lan tỏa di truyền là một bệnh hiếm gặp nên chúng tôi tiến hành lấy cỡ mẫu thuận tiện Đại học Y Hà Nội- LVTS
Trong nghiên cứu, đã thu thập được 45 bệnh nhân đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn và 36 thành viên từ 4 gia đình có đột biến gen CDH1 tham gia nghiên cứu.
2.3.3 Phương pháp thu thập mẫu
Lựa chọn bệnh nhân dựa trên tiêu chuẩn nghiên cứu là bước đầu tiên, tiếp theo là thực hiện phỏng vấn theo bộ câu hỏi của bệnh án nghiên cứu Sau đó, thông tin chẩn đoán, các xét nghiệm cận lâm sàng, kết quả nội soi và mô bệnh học của bệnh nhân sẽ được thu thập và ghi chép vào hồ sơ bệnh án Tất cả thông tin này sẽ được điền vào bệnh án nghiên cứu, mẫu bệnh án nghiên cứu có thể tham khảo trong phần phụ lục 2.
- Thu thập mẫu máu của bệnh nhân: Mỗi bệnh nhân được lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống chống đông EDTA
- Vận chuyển mẫu tới phòng nghiên cứu, mẫu được mã hóa và lưu ở tủ -20 C đến khi phân tích
- Các mẫu nghiên cứu được tiến hành phân tích, giải trình tự gen CDH1 để xác định đột biến
Khi bệnh nhân phát hiện có đột biến gen, việc lập phả hệ và thu thập mẫu máu (2ml máu tĩnh mạch vào ống chống đông EDTA) từ các thành viên gia đình trong vòng 3 thế hệ là rất quan trọng Sau đó, DNA sẽ được tách chiết và vùng đột biến sẽ được định vị dựa trên kết quả phân tích gen CDH1 của bệnh nhân trong mỗi gia đình, nhằm tiến hành phân tích gen cho các thành viên khác.
- Thu thập mẫu mô dạ dày đã được đúc parafin của bệnh nhân mang đột biến gen để làm hóa mô miễn dịch E-cadherin
Tiến hành nội soi dạ dày và thực hiện mô bệnh học cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân có đột biến gen Nghiên cứu này được thực hiện bởi Đại học Y Hà Nội - LVTS.
2.3.4 Các biến số nghiên cứu
Đặc điểm chung: Phỏng vấn theo bộ câu hỏi nghiên cứu
- Tiền sử bệnh lý dạ dày của cá nhân
Để đánh giá tiền sử nhiễm H.Pylori, cần khai thác thông tin từ hồ sơ bệnh án và kết quả chẩn đoán Bệnh nhân được coi là có tiền sử nhiễm H.Pylori nếu ít nhất một trong hai kết quả xét nghiệm dương tính Ngược lại, nếu cả hai kết quả đều âm tính, bệnh nhân sẽ không có tiền sử nhiễm H.Pylori.
Tiền sử gia đình về ung thư đại tràng và các loại ung thư khác là yếu tố quan trọng, đặc biệt khi có thành viên trong gia đình, như cha mẹ hoặc anh chị em, bị mắc bệnh này và đã được chẩn đoán tại bệnh viện Việc nắm rõ thông tin về tiền sử bệnh tật trong gia đình giúp nâng cao nhận thức và khả năng phòng ngừa ung thư hiệu quả hơn.
Tình trạng hút thuốc lá trong nghiên cứu được phân thành hai nhóm: nhóm người hút thuốc lá và nhóm không hút thuốc lá Theo định nghĩa của Trung tâm Y học Dự phòng Hoa Kỳ (CDC), người hút thuốc lá là những cá nhân đã từng tiêu thụ ít nhất 100 điếu thuốc trong suốt cuộc đời, trong khi người không hút thuốc là những người chưa bao giờ hút thuốc hoặc chỉ hút dưới 100 điếu.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), một đơn vị uống chứa 10 gam cồn tương đương với 1 chén rượu mạnh (40 độ, 30ml), 1 ly rượu vang (13,5 độ, 120ml) hoặc 2/3 chai bia hay 1 lon bia.
Tình trạng sử dụng đồ uống có cồn, bao gồm rượu và bia, được đánh giá qua bộ câu hỏi AUDIT C do Tổ chức Y tế Thế giới phát triển, nhằm sàng lọc nhanh tình trạng uống rượu Bộ câu hỏi này được chia thành hai nhóm, giúp xác định mức độ tiêu thụ và tác động của việc sử dụng đồ uống có cồn đối với sức khỏe.
Không sử dụng rượu hoặc sử dụng rượu hợp lý nếu tổng điểm AUDIT C:
+ Nam giới: 4 điểm + Nữ giới: 3 điểm
Sử dụng rượu ở mức độ có hại nếu tổng điểm AUDIT C:
+ Nam giới: > 4 điểm + Nữ giới: > 3 điểm Đại học Y Hà Nội- LVTS
Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân loại người uống rượu có hại là những người có tiền sử uống rượu, trong khi những bệnh nhân không uống rượu hoặc uống ở mức hợp lý được xem là không có tiền sử uống rượu.
Đặc điểm lâm sàng: Sử dụng hồ sơ bệnh án và bộ câu hỏi nghiên cứu
Đặc điểm về nội soi: Sử dụng hồ sơ bệnh án
- Kích thước tổn thương qua nội soi
Kết quả mô bệnh học của dạ dày: Sử dụng hồ sơ bệnh án
Ung thư thể lan tỏa bao gồm ung thư biểu mô tế bào nhẫn hoặc ung thư biểu mô kém biệt hóa, kém kết dính
Xếp loại TNM, giai đoạn theo AJCC 2017 (trang 20):
Xếp loại khối u nguyên phát (T) dựa vào độ xâm lấn vi thể
Xếp loại hạch bạch huyết (N) theo tình trạng di căn hạch vi thể Đánh giá di căn xa (M) theo lâm sàng, cận lâm sàng
Kết quả phân tích gen CDH1: làm thí nghiệm phân tích 16 exon và vùng nối exon – intron của gen CDH1
Kết quả phân tích hóa mô miễn dịch E-cadherin của các bệnh nhân mang đột biến
Lập phả hệ gia đình là bước đầu tiên trong việc nghiên cứu bệnh nhân mang đột biến gen Qua việc phỏng vấn bệnh nhân hoặc người thân, chúng ta xây dựng phả hệ trong vòng 3 thế hệ Đồng thời, thu thập 2ml máu tĩnh mạch từ các thành viên trong gia đình vào ống chống đông EDTA để tiến hành phân tích gen.
CDH1 tại vị trí đoạn gen mà bệnh nhân mang đột biến
Kết quả nội soi và sinh thiết mẫu dạ dày ngẫu nhiên từ các thành viên trong gia đình mang đột biến cho thấy tình trạng nhiễm H Pylori, được xác định qua phương pháp test urease trong quá trình nội soi Nghiên cứu này được thực hiện bởi Đại học Y Hà Nội.
Bệnh nhân được chẩn đoán UTDD lan tỏa di truyền theo tiêu chuẩn của IGCLC (2015)
- Phỏng vấn theo bộ câu hỏi nghiên cứu
Lập phả hệ và lấy mẫu máu của các thành viên gia đình
CDH1 của các thành viên Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến gen CDH1
Nhuộm hóa mô miễn dịch (E- cadherin)
Phân tích khả năng gây bệnh các đột biến tìm được Đặc điểm nội soi và mô bệnh học của các thành viên mang đột biến
Mục tiêu 2 Mục tiêu 1 Đại học Y Hà Nội- LVTS
- Ống lấy máu chống đông EDTA
- Pipet và đầu côn các loại thể tích
- Ống eppendorf thể tích 1,5 ml và 0,2 ml
- Tủ lạnh, tủ âm sâu (Sanyo), lò vi sóng, nồi hấp ướt, tủ sấy, cân điện tử
- Máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức), máy Voltex-Genie 2, máy ủ Thermomixer comfort
- Máy quang phổ kế đo nồng độ DNA Nano drop 2000C
- Máy PCR Mastercycler pro S của hãng Eppendorf (Đức)
- Máy điện di Consort EV243
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động Gel Doc-It2 Imager
- Máy Ventana BenchMark XT của hãng Roche
- Máy nội soi PENTAX i7010, ống soi mềm PENTAX EG27-I10
- Kìm sinh thiết Endoaccess để sinh thiết mẫu mô dạ dày
2.3.6.3 Hóa chất và sinh phẩm
Hóa chất tách chiết DNA
- Bộ kit tách DNA từ máu toàn phần: Exgene TM Blood SV Kit (Gene All, Korea)
Hóa chất dùng cho PCR
- Mồi phản ứng của 16 exon (trình tự mồi trong phần phụ lục 3)
Hóa chất dùng cho điện di
- Dung dịch đệm TAE 10X Đại học Y Hà Nội- LVTS
Hóa chất giải trình tự: sử dụng BigDye TM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
Hóa chất dùng làm hóa mô miễn dịch: VENTANA anti-E-cadherin (36) Mouse Monoclonal Primary Antibody
Thiết kế mồi là yếu tố quyết định thành công của nghiên cứu, với mục đích khuếch đại toàn bộ 16 exon của gen CDH1 và vùng lân cận Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng mồi tự thiết kế, với trình tự mồi cho các đoạn exon được thiết kế đặc hiệu với các vùng trình tự đích mong muốn Quá trình thiết kế mồi được thực hiện theo nguyên tắc chặt chẽ để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả.
Trình tự gen CDH1 được trích xuất từ dữ liệu FASTA trên NCBI bằng phần mềm CLC Main Workbench 8.1.2 của QIAGEN Phần mềm này cho phép hiển thị rõ ràng các vùng exon, vùng mã hóa protein (trình tự DNA mã hóa) và intron.
Nhóm nghiên cứu thiết kế các cặp mồi bao gồm cả exon và một phần intron liền kề, nhằm đảm bảo đáp ứng các yêu cầu về chiều dài của đoạn DNA đích.
(1) Có thể kiểm tra các đột biến ghép nối splicing cận kề nếu có
Xử lý và phân tích số liệu
- Số liệu được quản lý và xử lý bằng phần mềm SPSS16.0
- Sử dụng các test thống kê, mô tả bao gồm tần số, tỷ lệ phần trăm, kiểm định T-test, kiểm định Fisher's Exact-Test, kiểm định Chi-Square Test
Kết quả giải trình tự gen đã được xử lý bằng phần mềm BioEdit 7.2.6, ApE-A Plasmid Editor 2.0.3 và CLC Workbenches 8.0 Sau đó, các trình tự này được so sánh trên GeneBank để phát hiện các đột biến.
- Xác định đột biến mới và khả năng gây bệnh của đột biến bằng phần mềm phân tích tin sinh học Polyphen-2, SIFT và Mutation Taster
- Áp dụng phương pháp lập phả hệ và sử dụng các ký hiệu lập phả hệ theo đúng quy định.
Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
- Nghiên cứu được thông qua Hội đồng đạo đức của trường Đại học Y
Hà Nội theo quyết định số 198/HĐĐĐĐHYHN ngày 21 tháng 9 năm 2016 Đại học Y Hà Nội- LVTS
- Nghiên cứu lấy mẫu ở các cơ sở y tế đều được sự đồng ý của Phòng Kế hoạch tổng hợp Bệnh viện
Tất cả bệnh nhân tham gia nghiên cứu đều được thông tin đầy đủ về lợi ích, quyền lợi và các rủi ro có thể xảy ra Họ tham gia hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút lui bất cứ lúc nào Thông tin cá nhân của bệnh nhân được bảo mật tuyệt đối.
Việc tiến hành nghiên cứu tại Đại học Y Hà Nội được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu nghiên cứu, góp phần vào sự nghiệp khoa học và nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cho nhân dân.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả phân tích gen CDH1 của đối tượng nghiên cứu
3.1.4 Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM (UICC 2018)
Bảng 3.8 Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM
Phân tích kết quả mô bệnh học theo phân loại TNM cho thấy, tỷ lệ bệnh nhân giai đoạn II cao nhất với 35,5%, tiếp theo là giai đoạn III với 26,7%, và giai đoạn IV di căn xa chiếm 20% Trong khi đó, giai đoạn I có tỷ lệ thấp nhất, chỉ đạt 17,8%.
3.2 Kết quả phân tích gen CDH1 của đối tƣợng nghiên cứu
3.2.1 Kết quả tách chiết DNA và phản ứng PCR khuếch đại các exon của gen CDH1
Mẫu DNA của 45 bệnh nhân được tách chiết bằng bộ kit từ máu toàn phần, và sau khi tách chiết, nồng độ cùng độ tinh sạch của các mẫu DNA được kiểm tra bằng máy Nanodrop Kết quả cho thấy, tất cả các mẫu DNA đều có độ tinh sạch cao với tỷ số 260/280nm trong khoảng 1,7 – 2,0, đồng thời nồng độ DNA đạt yêu cầu để tiến hành các bước tiếp theo.
Sử dụng 16 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại toàn bộ 16 exon của gen
Sản phẩm PCR có kích thước dao động từ 242 đến 840 bp Sau khi khuếch đại, các sản phẩm này được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1,5% Hình ảnh minh họa từ Đại học Y Hà Nội - LVTS.
3.1 là hình ảnh minh họa kết quả PCR khuếch đại exon 9 và exon 13 của gen
Hình 3.1 Kết quả PCR exon 9 (A) và exon 13 (B) của gen CDH1, (-): chứng âm, (+): chứng dương, M: ladder thang chuẩn 100 bp
Sản phẩm PCR đạt được chỉ có một băng đặc hiệu rõ nét, không có sản phẩm phụ, cho thấy quá trình không bị nhiễm bẩn Mẫu đối chứng âm không có sản phẩm khuếch đại, xác nhận tính chính xác trong quy trình Các mẫu cần khuếch đại có kích thước tương ứng với mẫu chứng dương, đảm bảo tính đồng nhất Sản phẩm khuếch đại PCR sẵn sàng cho phản ứng giải trình tự tiếp theo nhằm phát hiện đột biến điểm.
3.2.2 Kết quả phát hiện đột biến và SNP của gen CDH1
Sau khi khuếch đại, sản phẩm PCR được giải trình tự để phát hiện đột biến và SNP trên gen CDH1 Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm và so sánh với trình tự trên GeneBank nhằm phát hiện các đột biến Nghiên cứu đã phát hiện 4 đột biến điểm và 11 SNP, được trình bày chi tiết trong các bảng dưới đây.
3.2.2.1 Các SNP của gen CDH1 được tìm thấy trong nghiên cứu
Bảng 3.9 Các SNP được tìm thấy trong nghiên cứu
Intron Thay đổi Nucleotid Thay đổi acid amin SNP n (%)
Bảng 3.9 cho thấy trong 45 bệnh nhân tham gia nghiên cứu, có 39/45 (86,67%) bệnh nhân mang SNP c.48+6C>T (rs3743674) tại intron 1 của gen CDH1 SNP c.2076T>C (rs1801552) tại exon 13 xuất hiện ở 82,22% bệnh nhân, trong khi SNP c.2253C>T (rs33964119) và c.2649+54C>T (rs1801026) chỉ xuất hiện ở 13,33% bệnh nhân Mọi bệnh nhân đều có ít nhất 1 SNP trên gen CDH1, và hơn 80% bệnh nhân mang từ 2 SNP trở lên.
Trong 11 SNP xuất hiện trong nghiên cứu thì có 2 SNP là c.1008+131delGinsATC (intron 7) và c.1712-54dupT (intron 11) chưa được công bố ở các nghiên cứu trước đó trên thế giới Có 6 bệnh nhân xuất hiện SNP mới c.1008+131delGinsATC và 1 bệnh nhân xuất hiện SNP mới c.1712-
54dupT Đại học Y Hà Nội- LVTS
3.2.2.2 Các đột biến gen CDH1 được tìm thấy trong nghiên cứu
Kết quả giải trình tự gen CDH1 cho thấy có 4 bệnh nhân mang đột biến, bao gồm: c.639 G>A (p.W213*) ở exon 5, c.1990 A>C (p.K664Q) ở exon 13, c.1298 A>G (p.D433G) ở exon 9 và c.1937-13 T>C ở intron 12 Tất cả 4 bệnh nhân này đều có các SNP kèm theo trên gen CDH1.
Bảng 3.10 Đột biến và SNP của gen CDH1 tìm được ở 4 bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền
Vị trí Thay đổi nucleotid
SNP Loại đột biến Đồng hợp/Dị hợp
B4 Intron 1 c.48+6 C>T - rs3743674 - Đồng hợp Đã công bố
Exon 5 c.639 G>A W213* - Vô nghĩa Dị hợp Mới
Exon 13 c.2076 T>C A692A rs1801552 - Dị hợp Đã công bố B151 Intron 1 c.48+6 C>T - rs3743674 - Đồng hợp Đã công bố
Exon 13 c.1990 A>C K664Q - Sai nghĩa Dị hợp Mới
Exon 13 c.2076 T>C A692A rs1801552 - Đồng hợp Đã công bố B532 Intron 1 c.48+6 C>T - rs3743674 - Đồng hợp Đã công bố
Exon 9 c.1298A>G D433G - Sai nghĩa Dị hợp Mới
Intron 11 c.1711+47G>A - rs35667437 - Dị hợp Đã công bố Exon 13 c.2076 T>C A692A rs1801552 - Dị hợp Đã công bố B732 Intron 1 c.48+6 C>T - rs3743674 - Đồng hợp Đã công bố
Intron 12 c.1937-13T>C - - Mối nối Dị hợp Đã công bố
Exon 13 c.2076 T>C A692A rs1801552 - Đồng hợp Đã công bố
Phần in đậm thể hiện các đột biến được phát hiện trong nghiên cứu
Nghiên cứu đã phát hiện 4/45 bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền có đột biến trên gen CDH1, bao gồm một đột biến vô nghĩa, hai đột biến sai nghĩa và một đột biến tại vị trí nối giữa intron với exon, tất cả đều ở dạng dị hợp tử Trong số này, có 3 đột biến mới chưa từng được công bố, trong khi đột biến c.1937-13T>C đã được công nhận và xác định là đột biến gây bệnh.
Bảng 3.10 chỉ ra rằng bốn bệnh nhân ngoài mang đột biến gen còn có một số SNP của gen CDH1 Cụ thể, bệnh nhân B532 có đột biến c.1298 A>G và SNP c.1008+131delGinsATC, cả hai đều chưa được công bố trước đây Bệnh nhân B732 mang đột biến c.1937-13 T>C, đã được xác nhận là đột biến gây bệnh, cùng với ba SNP đi kèm, trong đó có một SNP chưa được công bố là c.1008+131delGinsATC Hình ảnh giải trình tự của các SNP được trình bày trong phụ lục 5.
Hình 3.2 trình bày kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến c.639G>A của bệnh nhân B4 Hình (A) thể hiện GTT của đoạn gen bình thường, trong khi Hình (B) cho thấy GTT của đoạn gen có đột biến ở bệnh nhân Nguồn: Đại học Y Hà Nội - LVTS.
Hình ảnh giải trình tự cho thấy các đỉnh tương ứng với nucleotid rõ ràng, không có tín hiệu nhiễu Kết quả so sánh với Genebank chỉ ra rằng bệnh nhân mã số B4 có biến đổi nucleotid tại vị trí c.639 từ G thành A, với hai đỉnh sóng màu xanh lá cây (A) và màu đen (G) Biến đổi này làm thay đổi bộ ba mã hóa từ TGG thành TGA, dẫn đến mã kết thúc sớm UGA tại vị trí p.213, tạo ra một đột biến vô nghĩa trên exon 5 của gen CDH1.
Hình 3.3 Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến c.1298A>G của bệnh nhân B532 Hình (A) là hình ảnh GTT đoạn gen bình thường Hình
(B) là hình ảnh GTT đoạn gen mang đột biến của bệnh nhân
Hình ảnh giải trình tự cho thấy các đỉnh tương ứng với nucleotid rõ ràng, không có tín hiệu nhiễu Kết quả đối chiếu trên Genebank cho thấy bệnh nhân B532 có biến đổi tại vị trí c.1298 trên DNA, với nucleotid A chuyển thành G Tại vị trí này, exon 9 của bệnh nhân có hai đỉnh sóng màu xanh lá cây (A) và đen (G) Biến đổi này dẫn đến sự thay đổi acid amin từ aspartic (D) thành glycine (G) ở vị trí p.433 (p.D433G), là một đột biến sai nghĩa trong vùng mã hóa exon 9 của gen CDH1.
Hình 3.4 Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến c.1990A>C của bệnh nhân B151 Hình (A) là hình ảnh GTT đoạn gen bình thường Hình
(B) là hình ảnh GTT đoạn gen mang đột biến của bệnh nhân
Hình ảnh giải trình tự gen của bệnh nhân B151 cho thấy rõ ràng không có tín hiệu nhiễu Kết quả giải trình tự được đối chiếu với Genebank cho thấy có sự biến đổi tại vị trí c.1990 trên DNA, từ nucleotid A thành C, với hai đỉnh sóng tại exon 13 là đỉnh màu xanh dương (C) và đỉnh màu xanh lá cây (A) Biến đổi này dẫn đến sự thay đổi acid amin tại vị trí p.664 từ lysine (K) thành glutamin (Q), đánh dấu một đột biến sai nghĩa trong vùng mã hóa exon.
Đột biến vị trí nối c.1937-13T>C
Hình 3.5 Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến c.1937-13T>C của bệnh nhân B732 Hình (A) là hình ảnh GTT đoạn gen bình thường Hình
(B) là hình ảnh GTT đoạn gen mang đột biến của bệnh nhân
Hình ảnh giải trình tự gen của bệnh nhân B732 cho thấy rõ ràng không có tín hiệu nhiễu Kết quả cho thấy bệnh nhân có biến đổi tại vị trí c.1937-13 trên intron 12, với nucleotid T chuyển thành C, thể hiện qua hai đỉnh sóng màu xanh dương (C) và màu đỏ (T) Biến đổi này nằm tại vị trí nối giữa intron 12 và exon 13, là một đột biến đã được công bố và được xác định là gây bệnh.
Phân bố đột biến và SNP tìm đƣợc trong nghiên cứu
Hình 3.6 Phân bố đột biến và SNP trên gen CDH1 Các chữ và số màu đỏ biểu thị các đột biến,màu đen biểu thị SNP
Hình 3.6 là sơ đồ biểu diễn sự phân bố các đột biến và SNP của gen
CDH1 được phát hiện trong nghiên cứu này Sơ đồ đã chỉ rõ: Các đột biến và
BÀN LUẬN
Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu
Nghiên cứu về UTDD cho thấy độ tuổi mắc bệnh trung bình là 60, tuy nhiên, tại một số nước châu Á như Nhật Bản và Hàn Quốc, độ tuổi chẩn đoán lại sớm hơn do có chương trình sàng lọc UTDD rộng rãi Đặc biệt, theo tiêu chuẩn chẩn đoán của IGCLC năm 2015, UTDD lan tỏa di truyền được xác định khi bệnh nhân mắc trước 40 tuổi Trong nghiên cứu của chúng tôi, tuổi trung bình phát hiện bệnh là 34,89 ± 6,37, với độ tuổi từ 21 đến 52, chủ yếu dưới 40 Điều này phù hợp với tuổi khởi phát trung bình của UTDD lan tỏa di truyền trên thế giới là 38 tuổi, và phần lớn bệnh nhân mang đột biến xảy ra trước 40 tuổi.
Nghiên cứu của Pharoah và cộng sự (2001) cho thấy tỷ lệ mắc ung thư dạ dày di truyền (UTDD) ở những người mang đột biến gen CDH1 trong các gia đình có UTDD lan tỏa Trong 80 trường hợp được nghiên cứu, độ tuổi chẩn đoán trung bình là 40, với nữ giới có xu hướng chẩn đoán sớm hơn (39 tuổi) so với nam giới (42 tuổi).
Một nghiên cứu tại Hàn Quốc do tác giả Kim thực hiện đã khảo sát 23 bệnh nhân mắc UTDD lan tỏa di truyền, trong đó có 18 bệnh nhân dưới 40 tuổi và 5 bệnh nhân trên 40 tuổi Đáng chú ý, độ tuổi chẩn đoán bệnh cũng đều dưới 40 tuổi.
Nghiên cứu của Emma và cộng sự (2018) đã chỉ ra rằng giám sát nội soi trong ung thư dạ dày di truyền có liên quan đến tình trạng đột biến gen CDH1 Trong số 85 bệnh nhân tham gia nghiên cứu, độ tuổi trung bình là 38, trong đó nhóm mang đột biến CDH1 có độ tuổi trung bình là 33,5 (từ 26 đến 46 tuổi), trong khi nhóm không có đột biến có độ tuổi trung bình là 45 (từ 32 đến 57 tuổi).
Một nghiên cứu năm 2013 tại Trung Quốc đã phân tích 107 trường hợp ung thư đại trực tràng di căn và 60 trường hợp ung thư thể ruột Kết quả cho thấy tuổi trung bình khi phát hiện bệnh ở nhóm di căn là 66,87 ± 13,81 tuổi, trong khi ở nhóm thể ruột là 73,82 ± 9,76 tuổi Điều này cho thấy rằng nhóm di căn có tuổi phát hiện bệnh trẻ hơn so với nhóm thể ruột, mặc dù tuổi trung bình phát hiện bệnh trong nghiên cứu này cao hơn so với các nghiên cứu khác từ Đại học Y Hà Nội Sự khác biệt về tuổi phát hiện bệnh giữa hai nhóm là một điểm đáng chú ý trong nghiên cứu.
UTDD thể lan tỏa và thể ruột
Nhóm tuổi mắc UTDD lan tỏa di truyền trong nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với các nghiên cứu quốc tế Bệnh thường do đột biến gen, dẫn đến việc người mắc bệnh thường là trẻ tuổi Tuổi mắc bệnh cũng là một tiêu chuẩn chẩn đoán quan trọng và là đặc điểm lâm sàng nổi bật của UTDD lan tỏa di truyền.
UTDD là một bệnh lý ác tính có liên quan đến giới tính, với tỷ lệ mắc ở nam giới cao hơn nữ giới Tại các quốc gia phát triển, tỷ lệ chẩn đoán UTDD ở nam giới gấp 2,2 lần so với nữ giới, trong khi ở các nước đang phát triển, tỷ lệ này là 1,83.
Hàn Quốc ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh cao nhất, với 60 ca trên 100.000 nam giới và 25 ca trên 100.000 nữ giới mỗi năm.
Hiện tượng UTDD (ung thư đại trực tràng) có thể được giải thích là một bệnh đa nhân tố, trong đó sự thay đổi về địa lý và xu hướng thời gian đối với tỷ lệ mắc bệnh cho thấy rằng các yếu tố môi trường, lối sống và chế độ ăn uống là những nguyên nhân chính gây ra UTDD.
Trong ung thư đường tiêu hóa (UTDD), thể ruột thường gặp nhiều hơn ở nam giới và ở nhóm tuổi lớn, trong khi thể lan tỏa lại có tỷ lệ cao hơn ở nữ giới và thường xuất hiện ở người trẻ tuổi.
Một nghiên cứu tại Nhật Bản cho thấy thể ruột của UTDD thường gặp ở nam giới và người cao tuổi, trong khi thể lan tỏa phổ biến hơn ở phụ nữ trẻ (pT, c.2398delC và các đột biến tại vị trí nối như c.1008G>T, c.1137G>A, c.1679C>G [142].
Nghiên cứu của chúng tôi đã tiến hành trên 45 bệnh nhân được chẩn đoán mắc UTDD lan tỏa di truyền, trong đó thực hiện giải trình tự 16 exon của gen CDH1 Kết quả cho thấy có 4 đột biến được phát hiện tại exon 5, exon 9, intron 12 và exon 13 Các đột biến này đều nằm ở vùng ngoại bào, với các exon và intron liên quan đến cấu trúc protein của gen CDH1.
Mặc dù số lượng bệnh nhân và tỷ lệ phát hiện đột biến ở các nhóm EC1, EC3 và EC5 không cao, nhưng chúng vẫn phù hợp với các báo cáo về sự phân bố đột biến trên gen CDH1 Đột biến vô nghĩa c.639 G>A (W213*) là một trong những đột biến gây mất chức năng của gen CDH1, được xác định là nguyên nhân di truyền duy nhất gây bệnh UTDD lan tỏa di truyền, chiếm khoảng 30% Trong đó, các đột biến vô nghĩa chiếm 19,7%, dẫn đến sự mất hoàn toàn biểu hiện E-cadherin do sự xuất hiện của các mã kết thúc sớm.
Thiếu hụt E-cadherin làm suy yếu khả năng sống sót và các quá trình tế bào khác, dẫn đến mất kết dính tế bào và cho phép tế bào tách ra khỏi khối u, xâm nhập vào mô xung quanh và di chuyển đến các tổ chức xa Cấu trúc E-cadherin bao gồm miền ngoại bào với 5 tiểu phần (EC1 – EC5), miền xuyên màng và miền nội bào Miền ngoại bào lớn liên kết Ca2+ là yếu tố quan trọng cho sự kết dính tế bào Đột biến vô nghĩa c.639 G>A (W213*) gây ra mã kết thúc sớm UGA ở vị trí p.213 trên exon 5, ảnh hưởng đến EC1, dẫn đến không tổng hợp được cấu trúc protein E-cadherin, làm giảm hoặc mất chức năng của nó.
Bệnh nhân nam 28 tuổi mắc UTDD lan tỏa di truyền với đột biến vô nghĩa c.639 G>A (W213*) đã có tiền sử viêm dạ dày, sử dụng rượu và hút thuốc lá, nhưng không có tiền sử gia đình mắc bệnh Khoảng 4 tháng trước khi nhập viện, bệnh nhân xuất hiện đau vùng thượng vị, ăn uống kém, buồn nôn và giảm 4-5kg Khi vào viện, bệnh nhân được nội soi và sinh thiết dạ dày, phát hiện tổn thương sùi lớn hơn 3cm ở thân vị, dương tính với H Pylori, và kết quả mô bệnh học cho thấy ung thư biểu mô tế bào nhẫn Bệnh nhân được chẩn đoán mắc UTDD lan tỏa di truyền giai đoạn.
Bệnh nhân mắc bệnh giai đoạn IV với di căn hạch thượng đòn và đã tử vong sau 4 tháng kể từ khi phát hiện Phân tích gen CDH1 cho thấy có đột biến dị hợp tử c.639G>A (p.W213*), kèm theo kết quả hóa mô miễn dịch cho thấy sự giảm biểu hiện protein E-cadherin Ngoài đột biến gen CDH1, bệnh nhân còn có các yếu tố nguy cơ như tiền sử sử dụng rượu, hút thuốc lá và tình trạng nhiễm H pylori dương tính, những yếu tố này có mối liên quan đến sự phát triển của bệnh.
UTDD lan tỏa có yếu tố di truyền chưa rõ ràng nhưng là nguyên nhân chính gây ra bệnh, đặc biệt liên quan đến nhiễm H Pylori Đột biến gen CDH1 được phát hiện lần đầu bởi Guilford vào năm 1998 thông qua phân tích đột biến ở ba gia đình người Maori mắc UTDD lan tỏa khởi phát sớm tại New Zealand Trong số ba gia đình này, hai gia đình mang đột biến vô nghĩa c.2095C>T (p.Q699*) nằm trong vùng mã hóa của exon.
Mã kết thúc sớm được tạo ra tại vị trí p.699 và đột biến c.70G>T (p.E24*) nằm trong vùng mã hóa của exon 2, dẫn đến mã kết thúc sớm tại vị trí p.24 Cả hai đột biến này đều ở thể dị hợp tử và được xác định là đột biến gây bệnh.
Nghiên cứu của Ghaffari (2010) đã phát hiện một đột biến vô nghĩa tại exon 14 (c.2275G>T) trong một gia đình người Iran mắc UTDD lan tỏa di truyền, dẫn đến việc protein E-cadherin bị cắt ngắn và thiếu miền nội bào Đây là gia đình Iran đầu tiên được xác định mang đột biến gen CDH1 Trong khi đó, nghiên cứu của Enrique (2019) phát hiện một đột biến vô nghĩa mới ở exon 10 (c.1531C>T) trên một bệnh nhân 22 tuổi không có tiền sử gia đình mắc UTDD Đột biến này gây ra mã kết thúc sớm ở miền ngoại bào EC3 và được xác định là có liên quan đến bệnh lý, khi có 5 thành viên trong gia đình mang đột biến giống bệnh nhân, trong đó có em gái đã trải qua cắt dạ dày dự phòng và phát hiện ung thư biểu mô tế bào nhẫn Đáng chú ý, UTDD xuất hiện ở các thành viên trẻ tuổi, trong khi các thành viên lớn tuổi không có biểu hiện bệnh, cho thấy khả năng nhiễm vi khuẩn H pylori và yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng đến sự tiến triển của bệnh Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc xác định người mang đột biến trong các gia đình có UTDD lan tỏa di truyền với biểu hiện khởi phát bệnh sớm.
Nghiên cứu của Jeffrey và cộng sự (2007) đăng trên tạp chí Ngoại khoa, đã chỉ ra rằng việc cắt dạ dày dự phòng có thể có lợi cho những thành viên trong gia đình có người mắc ung thư dạ dày di truyền, đặc biệt là những người mang đột biến vô nghĩa c.1003C>T (R335*) ở exon.
Đột biến gen CDH1 ở các thành viên trong gia đình bệnh nhân mang đột biến gen CDH1
4.3.1 Phả hệ gia đình của các bệnh nhân mang đột biến gen CDH1
Cơ chế gây bệnh của ung thư đại trực tràng di truyền chủ yếu do đột biến gen trội trên nhiễm sắc thể thường, có khả năng di truyền cho thế hệ sau Việc lập phả hệ gia đình cho các bệnh nhân ung thư đại trực tràng di truyền là cần thiết, đặc biệt đối với những người mang đột biến gen.
Việc xét nghiệm gen CDH1 đóng vai trò quan trọng trong tư vấn, tiên lượng và phòng bệnh cho các thành viên trong gia đình Phân tích dữ liệu di truyền và phả hệ gia đình là cách tiếp cận đầu tiên để đánh giá đột biến sai nghĩa ở gen này Fitzgerald và Caldas khuyến nghị rằng trong trường hợp phát hiện đột biến sai nghĩa, ít nhất 4 thành viên trong gia đình của bệnh nhân cần được tiến hành sàng lọc di truyền để xác định xem có đột biến tương tự hay không.
Sau khi phát hiện đột biến gen CDH1 trên bệnh nhân cụ thể, chúng tôi đã tiến hành khuếch đại đoạn exon chứa đột biến này trên các thành viên có quan hệ huyết thống Nghiên cứu đã thu thập được 36 mẫu từ gia đình của 4 bệnh nhân mắc UTDD lan tỏa di truyền với đột biến gen CDH1.
Phả hệ gia đình bệnh nhân B4
Gia đình bệnh nhân B4 có 11 thành viên tham gia nghiên cứu, không có tiền sử UTDD, nhưng thế hệ ông bà có nhiều người mất không rõ nguyên nhân Tại thời điểm nghiên cứu, không ai trong gia đình phát hiện UTDD Bệnh nhân B4 mang đột biến dị hợp tử c.639G>A, tạo mã kết thúc sớm tại vị trí 213 (p.W213*), được phát hiện ở bố đẻ và bác ruột, cho thấy đây là đột biến di truyền từ thế hệ trước Mặc dù bố và bác đều mang đột biến, họ chưa có biểu hiện bệnh Bệnh nhân B4, 28 tuổi, có triệu chứng UTDD giai đoạn cuối và tử vong nhanh, trong khi bố (59 tuổi) và bác (65 tuổi) vẫn khỏe mạnh Thời gian tiến triển thành UTDD lan tỏa ở người mang đột biến CDH1 thường từ 35 đến 40 tuổi, cho thấy nguy cơ mắc bệnh cao trong gia đình.
Tỷ lệ phát triển ung thư dạ dày (UTDD) ở người mang đột biến gen CDH1 đạt 70% ở nam giới và 56% ở nữ giới khi đến tuổi 80 Tuy nhiên, tính thấm của gen CDH1 không hoàn toàn, nghĩa là không phải tất cả những người mang đột biến này đều sẽ tiến triển thành UTDD Do đó, có thể đưa ra các giả thuyết liên quan đến sự phát triển của bệnh.
Do sự giảm tính thấm của gen ở từng cá thể, bố đẻ và bác ruột của bệnh nhân mang đột biến gen nhưng chưa biểu hiện bệnh Yếu tố môi trường và nhiễm vi khuẩn H Pylori cũng có thể ảnh hưởng đến sự tiến triển của bệnh Bệnh nhân B4 có tuổi khởi phát bệnh sớm với các yếu tố nguy cơ như tiền sử sử dụng rượu, hút thuốc lá và nhiễm H Pylori dương tính Nghiên cứu của Enrique và cộng sự phát hiện đột biến vô nghĩa c.1531C>T tạo mã kết thúc sớm, là đột biến dị hợp tử chưa được công bố, cũng được tìm thấy ở 5 thành viên trong gia đình bệnh nhân Tất cả 5 người này, bao gồm em gái, mẹ đẻ, bà ngoại, một người cô và một người em họ, đều chưa bị UTDD khi làm xét nghiệm gen.
Vào tuổi 20, bệnh nhân trải qua phẫu thuật cắt dạ dày dự phòng, với mô bệnh học cho thấy sự hiện diện của ung thư biểu mô tế bào nhẫn (T1a), mặc dù không có triệu chứng lâm sàng nào liên quan đến dạ dày Đáng chú ý, mẹ và bà ngoại của bệnh nhân cũng không phát hiện bệnh sau khi thực hiện nội soi dạ dày và sinh thiết ngẫu nhiên Nghiên cứu này chỉ ra rằng đột biến gen CDH1 có liên quan đến sự phát triển của bệnh.
UTDD ở người trẻ tuổi có thể được di truyền từ bà ngoại và mẹ, tuy nhiên, do giảm tính thấm của gen CDH1, cả mẹ và bà ngoại đều mang đột biến gen mà không biểu hiện triệu chứng của bệnh UTDD.
Tại hội thảo của Hiệp hội Liên kết Ung thư Dạ dày Thế giới 2015, các chuyên gia đã thống nhất đưa ra khuyến cáo dành cho những người mang đột biến gen gây bệnh.
CDH1 nên được xem xét cho việc cắt dạ dày dự phòng Tuy nhiên, trước khi thực hiện phẫu thuật, cần tiến hành nội soi cơ bản để phát hiện các tổn thương nghi ngờ và thực hiện mô bệnh học là rất quan trọng.
Tại Việt Nam, nghiên cứu về ung thư dạ dày di truyền (UTDD) chủ yếu được thực hiện khi khối u đã xuất hiện, khiến cho việc cắt dạ dày dự phòng trở nên mới mẻ đối với những cá nhân trong gia đình có đột biến gen CDH1 nhưng chưa có biểu hiện bệnh Việc cắt dạ dày dự phòng còn đặt ra vấn đề y đức Do đó, trong trường hợp của bố và bác của bệnh nhân B4, cần thiết phải thực hiện giám sát lâm sàng và theo dõi định kỳ bằng nội soi dạ dày để phòng ngừa bệnh.
Phả hệ gia đình bệnh nhân B732
Gia đình bệnh nhân B732 gồm 4 thành viên tham gia nghiên cứu, trong đó mẹ, chị gái và cháu trai của bệnh nhân đều mang đột biến giống bệnh nhân tại gen CDH1, cụ thể là đột biến c.1937-13T>C trên intron 12 đã được xác nhận là đột biến gây bệnh Người mẹ đã di truyền đột biến cho hai con gái, và chị gái đã di truyền cho con trai mình Bệnh nhân nữ 34 tuổi mang mã số B732 đã phát triển bệnh ung thư dạ dày di truyền với triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng và qua đời sau 2 tháng phát hiện bệnh, mặc dù trước đó bệnh nhân có tiền sử bệnh lý về dạ dày.
Nghiên cứu của Kluijt và cộng sự (2012) cho thấy rằng trong 10 gia đình có đột biến gen CDH1 liên quan đến ung thư dạ dày di truyền (UTDD), một số thành viên không phát hiện bệnh dù mang đột biến Điều này có thể do tính thấm của gen khác nhau ở mỗi cá nhân Đặc biệt, trong gia đình B732, những người mang đột biến c.1937-13T>C cần có chiến lược quản lý y tế chặt chẽ, vì nguy cơ mắc UTDD lên đến 70% ở nữ giới và 68% nguy cơ ung thư vú ở tuổi 80 Do đó, việc nội soi dạ dày và kiểm tra vú định kỳ là cần thiết cho các thành viên nữ, và cần chú ý đến việc quản lý sức khỏe cho những người cháu từ 18 tuổi trở lên do tỷ lệ mắc bệnh cao.
Dưới 1% người dưới 18 tuổi mắc bệnh B732, do đó, việc áp dụng chiến lược điều trị và phòng ngừa cho các thành viên trong gia đình có đột biến là rất quan trọng Một trong những biện pháp cần xem xét là phẫu thuật cắt dạ dày dự phòng.
Phả hệ gia đình bệnh nhân B151
Bệnh nhân B151 mang đột biến sai nghĩa c.1990A>C (p.K664Q), dẫn đến sự thay đổi acid amin từ lysine (K) thành glutamin (Q) tại vị trí 664 trong exon 13, và đây là đột biến dị hợp tử Gia đình bệnh nhân B151 gồm 10 thành viên tham gia nghiên cứu, và tại thời điểm đó, không ai trong số họ phát hiện bệnh lý UTDD Tuy nhiên, tiền sử gia đình cho thấy bố đẻ của bệnh nhân đã qua đời vì UTDD ở tuổi 63.
Tiến hành phân tích gen CDH1 tại vị trí đột biến nằm trên exon 13 của
10 thành viên gia đình thì có 7/10 người mang đột biến giống với bệnh nhân, gồm 1 anh trai, 1 em gái, 2 người em họ, 2 người cháu và một người con trai