(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu sản xuất vắc xin nhược độc dịch tả lợn trên tế bào bằng công nghệ microcarrier tại công ty hanvet

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMN NÔNG NGHIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMP VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMT NAM ĐẶNG THÙY CHINH NGHIÊN CỨU SẢN SUẤT VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC DỊCHU SẢN SUẤT VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC DỊCHN SUẤT VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC DỊCHT VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC DỊCHC XIN NHƯỢC ĐỘC DỊCHC ĐỘC DỊCHC DỊCHCH TẢN SUẤT VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC DỊCH LỢC ĐỘC DỊCHN TRÊN TẾ BÀO BẰNG CÔNG NGHỆ BÀO BẰNG CÔNG NGHỆNG CÔNG NGHỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM MICROCARRIER TẠI CÔNG TY HANVETI CÔNG TY HANVET Ngành: Thú y Mã số:: 8640101 Người hướng dẫn khoa học:i hướng dẫn khoa học:ng dẫn khoa học:n khoa học:c: PGS.TS Nguyễn Bá Hiênn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2020 Tác giả luận văn Đặng Thùy Chinh i LỜI CẢM ƠN Cho đến tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Nhân dịp tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc tới thầy, cô giáo Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc chân thành đến thầy cô hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên môn Vi sinh vật truyền nhiễm – Khoa Thú y – Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, người tận tình hướng dẫn suốt thời gian nghiên cứu hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị em bạn bè đồng nghiệp công ty TNHH Dược Hanvet tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Cuối xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh, chị em người động viên, giúp đỡ tơi để tơi hồn thành tốt luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2020 Tác giả luận văn Đặng Thùy Chinh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn .ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích yếu luận văn x Thesis abstract .xi Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu Phần Tổng quan tài liệu .3 2.1 Tình hình dịch bệnh giới nước 2.1.1 Tình hình dịch bệnh giới .3 2.1.2 Tình hình dịch bệnh Việt Nam 2.2 Bệnh dịch tả lợn .5 2.2.1 Vi rút dịch tả lợn 2.2.2 Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh DTL 2.2.3 Triệu chứng bệnh tích bệnh DTL .11 2.3 Tổng quan sản xuất vắc xin .14 2.3.1 Lịch sử hình thành phát triển vắc xin .14 2.3.2 Sơ lược loại vắc xin giới 14 2.3.3 Một số loại vắc xin DTL 16 2.4 Tổng quan nuôi cấy tế bào .18 2.4.1 Một số đặc điểm tế bào động vật 18 2.4.2 Thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy tế bào .18 2.4.3 Điều kiện nuôi cấy tế bào 20 2.4.4 Sự tạp nhiễm cách hạn chế 20 2.4.5 Sự sinh trưởng tế bào động vật nuôi cấy 20 2.5 Hệ thống Microcarrier .21 iii 2.5.1 Lý lựa chọn phương pháp nuôi cấy Microcarrier .21 2.5.2 Sự phát triển hạt chất mang 24 2.5.3 Một số ứng dụng Microcarrier 25 Phần Nội dung - vật liệu - phương pháp nghiên cứu .28 3.1 Nội dung nghiên cứu 28 3.1.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình ni cấy tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 28 3.1.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình gây nhiễm Vi rút tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 28 3.1.3 Đánh giá số tiêu vắc xin DTL sau thu hoạch 28 3.2 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 28 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu 28 3.3 Địa điểm nghiên cứu 30 3.4 Thời gian nghiên cứu 30 3.5 Phương pháp nghiên cứu 30 3.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào 31 3.5.2 Phương pháp gây nhiễm 36 3.5.3 Phương pháp đánh giá số tiêu vắc xin DTL sau đông khô 40 3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu .43 Phần Kết thảo luận .44 4.1 Nghiên cứu quy trình ni cấy tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 44 4.1.1 Nghiên cứu tốc độ khuấy lưu lượng khí 44 4.1.2 Nghiên cứu số lượng đầu vào tế bào .49 4.1.3 Xác định mơi trường ni cấy pH thích hợp cho tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 4.1.4 51 Xác định đường cong sinh trưởng tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 55 4.2 Nghiên cứu quy trình gây nhiễm vi rút dịch tả lợn Microcarrier 57 4.2.1 Xác định mơi trường trì sau gây nhiễm vi rút pH môi trường trì 57 4.2.2 Xác định liều gây nhiễm (MOI) cho vi rút DTL .59 iv 4.2.3 Xác định đường cong sinh trưởng vi rút DTL 60 4.3 Đánh giá số tiêu vắc xin dịch tả lợn sau đông khô 62 4.3.1 Tính an tồn vắc xin lợn 62 4.3.2 Xác định tính sinh miễn dịch vắc xin DTL 63 Phần Kết luận kiến nghị 68 5.1 Kết luận 68 5.2 Kiến nghị .68 Tài liệu tham khảo .69 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CPE Cyto Pathogenic Effect CSF Classical Swine Fever CSFV Classical Swine Fever Vi rút DMEM Dulbecco’s Modified MEM Medium DO Dissolved Oxygen DTL Dịch Tả Lợn EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FBS Fetal Bovine Serum KS Kháng sinh LH Lactalbumin Hydrolysate M199 Medium 199 MEM Minimum essential medium MOI Multiplicity of infection NSSS Năng suất sinh sản PBS Phosphate Buffered Saline pH Hydrogen power PK 15 Pig Kidney 15 TB Tế bào TCID50 50% Tisue culture infective dose TE Trypsin – EDTA vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Kiểm tra độc lực vi rút DTL Bảng 2.2 Một số ứng dụng Microcarrier ngành sản xuất vắc xin .26 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp 31 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định tốc độ khuấy thích hợp 31 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm xác định lưu lượng khí bình ni .32 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm xác định lượng tế bào tối ưu cho ni cấy 32 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm xác định mơi trường ni cấy .33 Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm xác định pH tối ưu cho nuôi cấy 33 Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy .36 Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm xác định pH tối ưu cho nuôi cấy 37 Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm xác định liều gây nhiễm thích hợp 37 Bảng 3.10 Bố trí thí nghiệm kiểm tra tính an toàn vắc xin DTL lợn 40 Bảng 3.11 Bố trí thí nghiệm kiểm tra tính sinh miễn dịch vắc xin DTL 40 Bảng 4.1 Kết theo dõi điều chỉnh tốc độ khuấy 44 Bảng 4.2 Mức độ bám tế bào PK 15 vào hạt Cytodex giá trị DO khác 46 Bảng 4.3 Kết theo dõi suất sinh sản tế bào sau 48h nuôi cấy .47 Bảng 4.4 Kết điều chỉnh lưu lượng khí cấp vào mơi trường ni 48 Bảng 4.5 Kết xác định số lượng tế bào PK 15 thích hợp cho ni cấy 49 Bảng 4.6 Khả bám phát triển tế bào PK 15 loại môi trường 52 Bảng 4.7 Bảng suất tế bào PK 15 loại môi trường thời điểm 72h nuôi cấy 52 Bảng 4.8 Kết xác định tỉ lệ hạt có tế bào bám sau ni cấy 24h với điều kiện pH khác Bảng 4.9 53 Kết xác định điều kiện pH thích hợp cho nuôi cấy tế bào PK 15 thời điểm 72h nuôi cấy 54 Bảng 4.10 Kết số lượng tế bào PK 15 theo thời gian nuôi cấy Microcarrier 55 Bảng 4.11 Kết xác định hiệu giá vi rút DTL loại môi trường nhiễm 57 Bảng 4.12 Kết hiệu giá vi rút Dịch tả lợn điều kiện pH khác 58 Bảng 4.13 Kết hiệu giá vi rút liều gây nhiễm (MOI) 59 vii Bảng 4.14 Kết hiệu giá vi rút DTL qua thời điểm thu hoạch .60 Bảng 4.15 Biểu lâm sàng lợn sau tiêm vắc xin DTL nhược độc .63 Bảng 4.16 Biến động kháng thể lợn tiêm vi rút DTL nhược độc xác định ELISA 63 Bảng 4.17 Hiệu giá kháng thể trung hòa lợn tiêm vắc xin DTL nhược độc viii 64 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc vi rút DTL Hình 2.2 Hình ảnh trình tế bào tách biệt với sản phẩm tiết 22 Hình 3.1 Hệ thống Bioreactor – Bioflo 320 30 Hình 3.2 Mơ hình nhân số lượng tế bào cho ni cấy Microcarrier .34 Hình 3.3 Buồng đếm tế bào 35 Hình 4.1 (1) Bình ni có bọt, (2) bình ni cấy khơng có bọt 45 Hình 4.2 Lấy mẫu theo dõi suất nhân tế bào PK 15 46 Hình 4.3 Năng suất sinh sản tế bào giá trị OD khác .47 Hình 4.4 Hệ thống khí vào hệ thống Microcarrier 49 Hình 4.5 Năng suất sinh sản tế bào PK 15 theo mật độ tế bào đầu vào khác 50 Hình 4.6 Hình ảnh tế bào PK 15 Microcarrier 51 Hình 4.7 Năng suất sinh sản tế bào môi trường nuôi 53 Hình 4.8 Năng suất sinh sản tế bào nuôi cấy pH khác 54 Hình 4.9 Đường cong sinh trưởng tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier .55 Hình 4.10 Đồ thị thể hiệu giá trung bình (3 lơ) loại mơi trường trì .58 Hình 4.11 Hiệu giá vi rút theo liều gây nhiễm khác 59 Hình 4.12 Đường cong sinh trưởng vi rút DTL 61 Hình 4.13 Hình ảnh nhuộm IFA vi rút DTL 61 Hình 4.14 So sánh hiệu suất nuôi cấy vi rút hệ thống Microcarrier Tflask 62 Hình 4.15 Đồ thị biến động kháng thể lợn tiêm vi rút DTL .64 Hình 4.16 Biến động kháng thể trung hịa lợn sau tiêm vắc xin DTL tế bào 65 Hình 4.17 Bệnh tích lợn cơng cường độc 67 ix