Luận văn thạc sĩ nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than do bacillus anthracis ở quy mô phòng thí nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Ngọc Bảo NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH THAN DO Bacillus anthracis Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Ngọc Bảo NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH THAN DO Bacillus anthracis Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM Chun ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đoàn Trọng Tuyên TS Lê Thu Hà Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Ngọc Bảo NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH THAN DO Bacillus anthracis Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM Chun ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62420107 CHỨNG NHẬN CHỈNH SỬA Tập Thể Hƣớng Dẫn Chủ Tịch Hội Đồng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu đề tài luận án phần số liệu đề án nghiên cứu có tên “Nghiên cứu tuyển chọn, sản xuất vắc xin than qui mơ phịng thí nghiệm đánh giá tính an tồn, sinh miễn dịch động vật thực nghiệm” tơi thực Kết cơng trình thành nghiên cứu tập thể mà người trực tiếp thực Tơi tồn thành viên nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng phần công việc làm đề tài viết luận án để bảo vệ lấy tiến sĩ Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Bảo LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội Viện Y học Dự phòng Quân đội tạo điều kiện giúp tơi hồn thành luận án Tiến sĩ Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Đồn Trọng Tun – Phó Viện trưởng Viện Vệ Sinh Phịng Dịch Qn Đội - Người thầy hướng dẫn, ln tận tình bảo, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm trực tiếp sát cánh suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Xuân Thành - nguyên Viện trưởng Viện Y học Dự Phòng Quân Đội, Chủ nhiệm đề án nghiên cứu cấp Bộ Quốc phòng, PGS TS Đào Xuân VinhViện trưởng Viện vắc xin Pasteur Đà Lạt, PGS TS Ngơ Đình Quang Bính Viện CNSH - người thầy trực tiếp hướng dẫn làm việc với suốt thời gian tham gia đề án thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Thu Hà tập thể khoa Vi Sinh y học-Viện Y học Dự phòng Quân đội bạn bè đồng nghiệp động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo thuộc Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội truyền đạt kiến thức dìu dắt tơi suốt q trình học tập trường Cuối cùng, tơi xin dành tình cảm sâu sắc cảm ơn gia đình ln động viên, khích lệ chia sẻ giúp tơi hồn thành tốt q trình học tập, công việc suốt thời gian qua Nguyễn Ngọc Bảo MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 12 CHƢƠNG 14 TỔNG QUAN 14 1.1 Một số đặc điểm dịch tễ học lâm sàng bệnh than (Anthrax) 14 1.1.1 Đặc điểm lưu hành bệnh than giới 14 1.1.2 Đặc điểm lưu hành bệnh than Việt Nam 18 1.1.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh than 20 1.1.4 Dự phòng điều trị bệnh than .22 1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn than B anthracis 23 1.2.1 Phân loại 23 1.2.2 Hình thể 24 1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng vi khuẩn than 26 1.2.4 Khả đề kháng phương thức tồn vi khuẩn than .27 1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn than 30 1.2.6 Độc tố vi khuẩn than 35 1.2.7 Cấu trúc hệ thống gene B anthracis 38 1.2.8 Đặc điểm chủng B anthracis dự tuyển sản xuất vắc xin 42 1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin phịng bệnh than 43 1.4 Một số mơ hình động vật dùng thử nghiệm vắc xin than 48 CHƢƠNG 51 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu: 51 2.2 Vật liệu nghiên cứu 51 2.2.1 Sinh phẩm, hoá chất nghiên cứu 51 2.2.3 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 53 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 54 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn chủng sản xuất vắc xin chủng vi khuẩn than gây bệnh làm chủng thử thách .55 2.3.2 Quy trình kỹ thuật sản xuất vắc xin 56 2.3.3 Phương pháp đánh giá tính an tồn tính sinh miễn dịch vắc xin phòng bệnh than 64 2.3.4 Quy trình đơng khơ vắc xin phịng bệnh than 73 2.3.5 Xử lý số liệu 74 CHƢƠNG 75 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .75 3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG SẢN XUẤT VẮC XIN VÀ CHỦNG THỬ THÁCH 75 3.1.1 Kết phân lập định danh vi khuẩn than từ loại mẫu khác 75 3.1.2 Kết phát B anthracis yếu tố độc lực kỹ thuật PCR 78 3.1.3 Kết gây bệnh thực nghiệm chủng B anthracis chuột nhắt trắng 85 3.1.4 Kết đánh giá chủng dự tuyển vắc xin BaVCM1167 86 3.2 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN THAN 95 3.2.1 Một số kết nghiên cứu sản xuất vắc xin hấp phụ phòng bệnh than (VHP) 95 3.2.2 Sản xuất vắc xin phòng bệnh than sống giảm độc lực Công ty Vắc xin Sinh phẩm Pasteur Đà Lạt: 105 3.3 ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN, VÀ SINH MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN VHP VÀ TTB TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 107 3.3.1 Kiểm tra tiêu chuẩn an tồn khơng đặc hiệu vắc xin thành phẩm 107 3.3.2 Tính an tồn tính sinh miễn dịch vắc xin .107 3.3.3 Đánh giá hiệu lực bảo vệ hai vắc xin chuột lang .126 KẾT LUẬN 139 KIẾN NGHỊ .140 Danh mục cơng trình nghiên cứu liên quan đến luận án .143 Tài liệu tham khảo 144 Phụ lục DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Aa Amino acids Axít amin AVA Anthrax Vaccine Absorbed Vắc xin hấp phụ phòng bệnh than AC Adenylate Cyclase ADP Adenosin diphosphate ATP Adenosin Triphosphate B anthracis/ Ba Bacillus anthracis BHI Brain heart infusion bp base pair CA Casamino Acid CaM Calmodulin cAMP dH2O Cyclic Adenosin monophosphate Centers for Disease Control Trung tâm phòng ngừa and Prevention kiểm soát dịch bệnh Cortex Lytic Enzymes Enzym thủy phân vỏ lõi bào tử Colony-Forming Unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc deionized water Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Edema Factor Yếu tố gây phù nề CDC ClEs CFU EDTA EF ELISA FAO FDA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Food Agricultural Organisation Food and Drug ADN Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn enzyme Tổ chức nông lương thực giới Cục quản lý Thực phẩm GMT Administration Geometric mean titres HPR Horseradish peroxidase kDa Kilo Dalton KN - KT Dược phẩm Hoa Kỳ Hiệu giá trung bình nhân Kháng nguyên – kháng thể LB Lauria Betani LF Lethal Factor Yếu tố gây chết LD50 Lethal dose 50 % Liều gây chết 50 % MAPK, MAPKK MPA Mitogen-activated protein kinases, Mitogen-activated protein kinases kinases Meat Pepton Agar Thạch pepton thịt MPB Meat Pepton Broth Canh thang pepton thịt NA Nutrient Agar Thạch dinh dưỡng OD Optical Density Mật độ quang ORF Open Reading Frame Khung đọc mở OIE PA World Organization Animal Health Protective Antigen PCR PVDF RNA Polymerase Chains Reaction phản ứng chuỗi trùng hợp Polyvinylidene fluoride Ribonucleic Acid ARN SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate PolyAcrylamide Gel Electrophogesis Standard deviation Độ lệch chuẩn SD Xm for Tổ chức thú y giới Kháng nguyên bảo vệ Trung bình cộng TAE Tris – Acetate EDTA TBS Tris-buffered saline TMB 3,3′,5,5′- Đệm trì pH - So sánh mức độ tƣơng đồng vùng gene pagA chủng BaVCM1167 với chủng 4NS: Tỉ lệ tương đồng hai chủng 99,64% - So sánh mức độ tƣơng đồng vùng gene pagA chủng BaVCM1167 với chủng 1C3: Tỉ lệ tương đồng hai chủng 99,64% - So sánh chủng BaVCM1167 (màu vàng) với chủng ngân hàng gene NCBI: 42 chủng than đăng ngân hàng gene giới chủng đăng ký từ VN chủng phân lập tuyển chọn luận án (4NS, 1C3, Ba1167, Ba168) Phụ lục 3.3.1 Kiểm tra tiêu chuẩn an tồn khơng đặc hiệu vaccine thành phẩm 3.3.1.1 Yếu tố vật lý - Vaccine hấp phụ: + Bóc nhãn lọ đựng vaccine, nhìn đánh giá mắt thường: vaccine đóng lọ thủy tinh trắng, vaccine đông khô tạo thành bánh xốp, màu trắng, bong, không teo, không chảy nước + Cho 6ml nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch màu đồng nhất, không vẩn cặn - Vaccine tồn tế bào: Lọ Vaccine phịng bệnh than đơng khơ có màu trắng, xốp, bong ra, không bị chảy nước 3.3.1.2 Kiểm tra pH vaccine - Vaccine hấp phụ: Hút dung dịch nhỏ lên giấy quỳ so màu với thang màu kết cho thấy khoảng màu pH=7,0 - Vaccine tồn tế bào: Các lơ vaccine phịng bệnh than đơng khơ có giá trị pH đạt 6,8 – 7,5 3.3.1.3 Độ vơ trùng • Vaccine hấp phụ: Cho 6ml nước muối sinh lý vô trùng vào lọ vaccine, lắc Tiến hành lấy 0,5 ml cho vào môi trường thạch máu, thạch dinh dưỡng thạch sabouraud Lấy que cấy ria huyền dịch đĩa thạch, ủ đĩa cấy nhiệt độ 37oC/ 24 + Kết vi khuẩn hiếu khí: âm tính + Kết vi khuẩn tan huyết: âm tính + Kết nấm men, nấm mốc: âm tính • Vaccine tồn tế bào: Hình 3.23: Kết đánh giá tạp khuẩn vaccine tồn tế bào Kiểm định độ vơ trùng vaccine: vaccine sống toàn tế bào cấy thạch dinh dưỡng, thạch TCBS, sabouraud cho thấy, có khuẩn lạc B anthracis đặc trưng, không thấy khuẩn lạc khác nấm men Kiểm tra độ khiết chủng thử thách 4NS từ ống chủng đông khơ, kết cho thấy chủng nhất, khơng có tạp khuẩn Kết kiểm tra vô trùng vaccine HP cho kết âm tính với test thử vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn gây tan huyết, nấm Vaccine đạt tiêu an toàn với vaccine hấp phụ Phụ lục Kết theo dõi nhiệt độ phản ứng chỗ thỏ sau tiêm 02 loại vắc xin, so sánh với nhóm chứng nhóm tiếp nhận plascebo Mã số thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ Vắc xin toàn tế bào Thỏ Thỏ 10 Thỏ 11 Thỏ 12 Thỏ 13 Thỏ 14 Thỏ 15 chứng placebo Thỏ 16 Thỏ 17 Thỏ 18 Thỏ 19 Thỏ 20 Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Sáng chiều Trƣớc tiêm (17/9/12) (18/9/12) 37,8 38,2 39 39,1 38,8 38 38,2 38,1 39,1 38,9 38,9 39 39,5 38,9 38,9 39 38,9 39 39,1 39 37,5 38,2 38,9 38,5 38 39 39 39 38 38.5 38.2 38 39,1 39 39,2 39,3 38,2 38,5 39,1 39,2 39,2 38,9 39,2 39 37,6 38,1 38 38,2 38,9 38,9 39 39 38,7 39 39 39 39 39 38,9 39,2 38,2 39 38,1 38,1 39 38,5 38,8 39 38,8 38,5 38,2 38 38,1 38,5 38,4 38,8 39 39 38,2 38,5 Sau tiêm (19/9/12) (20/9/12) 39 39,1 39,4 38,2 38,4 38,3 39 39,4 39,2 38,1 38,5 38,4 39,5 38,9 39 39 38,9 39 38,9 39 39 39 39 39 39,2 39,1 39 38,8 38,5 38,5 39,1 39,1 39 39,3 38,5 39 38,5 38,5 38,6 39,2 39,2 39,2 39 39 38,9 39,5 38,5 38,8 38,8 38,7 38,6 39,6 38,2 39,2 39 38,9 38,9 38,9 39 38,7 To thay Vết tiêm (21/9/12) đổi 39,4 Bình 0,7 thường 38,2 Bình 0,0 thường 39 Bình 0,2 thường 38,1 Bình -0,8 thường 39,5 Bình 0,2 thường 39 Bình 0,7 thường 38,9 Bình 0,2 thường 39 Bình 0,8 thường 39 Bình -0,1 thường 38,5 Bình -0,2 thường 39,1 Bình 0,0 thường 39,3 Bình 1,1 thường 38,5 Bình -0,4 thường 39.2 Bình 0,3 thường 39 Bình -0,1 thường 39,5 Bình 0,7 thường 38,8 Bình -0,1 thường 39,6 Bình 0,8 thường 38,6 Bình 0,4 thường 39 Bình 0,2 thường PHỤ LỤC CÁC HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Ni cấy phân lập, nhuộm soi vk than, giữ chủng a b c Hình ảnh vi khuẩn than (a) phân lập vi khuẩn than mơi trường thạch máu; (b)Hình thể, tính chất bắt màu nhuộm Gram cách xếp vi khuẩn than; (c) Chủng đông khô Định danh vi khuẩn than định danh API 50CHB Tính chất sinh vật hóa học vi khuẩn than định danh API 50CH B/E API 20E Thử nghiệm phân biệt B anthracis với thành viên khác nhóm B cereus A Phản ứng catalase B Phản ứng khử nitrat C Phản ứng sinh D Phản ứng lên men glucose kị khí E Khả dung huyết mơi trường thạch máu cừu Minh họa vài phản ứng sinh lý, sinh hóa B anthracis so với thành viên nhóm B Cereus Ba: B anthracis; Bc: B cereus; Bt: B thuringiensis; Bme: B megaterium; Bmi: B mycoides Lên men kị khí sản xuất vắc xin hấp phụ Hệ thống lên men kị khí sản xuất protein PA vi khuẩn Bacillus anthracis Tiêm gây miễn dịch, đo nhiệt độ, lấy máu tim chuột lang Đánh giá an toàn vắc xin, đánh giá LD50, đánh giá thử thách Hình ảnh kiểm tra kháng nguyên PA với kháng thể kháng PA thỏ kDa 95 72 234 kDa 83 Hình 3.45: ết western blot huyết sau thực gây đáp ứng miễn dịch thỏ Để khẳng định protein vị trí 83 Kda PA, sử dụng phương pháp Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng thioredoxin đánh dấu HPR (Hình 3.18) kháng thể kháng PA thỏ (Hình 3.19) Cả phản ứng lai phát kháng thể anti-rabbit IgG-HPR Kết cho thấy có vạch (98 kDa) tương đương với kích thước protein tái tổ hợp theo tính tốn lý thuyết Như vậy, dựa kết Western blot cho phép kết luận protein có trọng lượng khoảng 98 kDa protein dung hợp Thioredoxin-PA-Histag kDa k D a 95 72 55 Hình 3.24: Phản ứng protein PA tái tổ hợp gắn Thioredoxin với kháng thể kháng Thioredoxin màng lai PVDF Giếng Thang chuẩn protein kDa 170 130 9 5 k D a Hình 3.25: Phản ứng protein PA tái tổ hợp gắn Thioredoxin với kháng thể kháng PA màng lai PVDF Giếng 7: Thang protein chuẩn (Fermentas) Giếng 8: Đối chứng (Huyết thỏ trước gây miễn dịch) Hình ảnh hủy chuột: hấp khử trùng thiêu hủy động vật thí nghiệm Vắc xin tồn tế bào đơng khơ giấy chứng nhận kết kiểm định vắc xin Vaccine TTB đông khô nồng độ 0,5 x 109 bào tử Vắc xin hấp phụ đông khô giáy chứng nhận kết kiểmdđịnh vắc xin Vaccine AVA đông khô ... PA với chủng gây bệnh địa [79], [111] 1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than Trong bối cảnh nay, nghiên cứu sản xuất vắc xin phịng bệnh than khơng để dự phịng bệnh tự nhiên mà... anthracis 38 1.2.8 Đặc điểm chủng B anthracis dự tuyển sản xuất vắc xin 42 1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than 43 1.4 Một số mơ hình động vật dùng thử nghiệm vắc xin. .. chọn chủng vi khuẩn than để sản xuất vắc xin số chủng than gây bệnh đầy đủ độc lực Việt Nam để đánh giá hiệu lực vắc xin Sản xuất vắc xin phịng bệnh than quy mơ phịng thí nghiệm Đánh giá tính