Đối tượng - nội dung - phương phápnghiên cứu
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
+ Gà mái giống Isa Brown 16 tuần tuổi
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú Y-Khoa thú y-Ngô Xuân Quảng-Trâu Quỳ-Gia Lâm-Hà Nội.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của gà trước và sau khi tiêm vaccine Newcaste.
- Đánh giá mối tương quan hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết thanh và trong lòng đỏ trứng gà.
- Nghiên cứu tách chiết kháng thể IgY đặc hiệu cho virus Newcastle từ lòng đỏ trứng gà.
- Nghiên cứu ứng dụng kháng thể tinh khiết trong phòng và điều trị bệnh Newcastle trên gà tại trại gà có dịch Newcastle
Vật liệu nghiên cứu
- Vaccine Newcastle: Vaccine vô hoạt nhũ dầu COR4+IB+ND+EDS của công ty Intervet.
- Virus cường độc vô hoạt Newcastle (do Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú Y-Khoa thú y-Học viện Nông nghiệp Việt Nam) phân lập từ thực địa.
- Kháng nguyên chuẩn Newcastle (được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú Y-Khoa Thú Y-Học viện Nông nghiệp Việt Nam).
- Gà hậu bị (khỏe mạnh về lâm sàng) giống gà Isa Brown 16 tuần tuổi.
- Trang thiết bị, hóa chất thí nghiệm dùng trong chẩn đoán, xét nghiệm Newcastle của Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y-Khoa Thú Y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Các nguyên vật liệu khác: chuồng nuôi, thức ăn nước uống cho gà.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp gây miễn dịch trên gà
Gà sau khi bắt về được chia thành các lô khác nhau (2 lô thí nghiệm và 1 lô đối chứng: Lô TN I gồm 10 con gà Isa Brown được tiêm vaccine Newcastle kết hợp với virus cường độc vô hoạt; lô TN II gồm 10 con gà Isa Brown được tiêm vaccine Newcastle và lô ĐC gồm 5 con gà Isa Brown không tiêm vaccine, nuôi chung với lô gà thí nghiệm), chăm sóc và theo dõi sức khỏe trong vòng 1 tuần. Trước khi tiêm vaccine, tiến hành lấy máu để kiểm tra hàm lượng kháng thể của gà đã có trước đó. Đường đưa thuốc: tiêm bắp là đường đưa được dùng thường xuyên nhất đối với hầu hết các loại thuốc và vaccine Thuốc đưa qua đường tiêm bắp được hấp thu vào máu nhanh hơn qua da do hệ thống mạch máu dày đặc trong cơ và sự co duỗi của cơ khi hoạt động giúp thuốc lưu thông tốt hơn.
Vị trí tiêm bắp: tiêm ở vị trí cơ ức.
Bảng 3.1 Quy trình gây miễn dịch cho gà bằng vaccine sau khi bắt về
Tuần Vaccine Phòng bệnh Nước Liều Cách tuổi pha dùng dùng
Nobilis Sổ mũi truyền nhiễm+
Cor4+IB+ND+ EDS chứng giảm đẻ ml/con cơ
Nobilis Sổ mũi truyền nhiễm+
Cor4+IB+ND+ EDS chứng giảm đẻ ml/con cơ
23 Nobilis Sổ mũi truyền nhiễm+
Cor4+IB+ND+ EDS ml/con cơ trứng giảm đẻ Tiêm virus cường độc vô hoạt cho gà ở lô TN I lần 1, Lô
Tiêm virus cường độc vô hoạt cho gà ở lô TN I lần 2, Lô
3.4.2 Phương pháp lấy và bảo quản huyết thanh
Phương pháp lấy máu gà
Vị trí: lấy máu ở tĩnh mạch cánh Đây là phương pháp tốt và đơn giản nhất đối với gà, gà tây và với hầu hết các loại gia cầm khác nuôi trong điều kiện tự nhiên Bộc lộ cánh, dùng cồn 70° để sát trùng chỗ lấy máu rồi tiến hành lấy máu.
Máu gà sau khi lấy xong để ở tủ ấm 37°C 1 giờ rồi để ở 4°C , sau 1-2 giờ lấy ra chắt huyết thanh Huyết thanh được chắt ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 5 phút Nếu huyết thanh sau khi chắt xong chưa làm ngay thì bảo quản huyết thanh ở tủ âm 20°C.
3.4.3 Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể và độ dài đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vaccine bằng phản ứng HI
Sử dụng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA) để xác định sự có mặt của virus và phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI) để xác định hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết thanh của gà.
3.4.3.1 Phản ứng HI (phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà) với huyết thanh, lòng đỏ trứng và sản phẩm IgY
Nguyên lý của phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HI: Đối với gà mắc bệnh Newcastle hoặc đã được tiêm phòng vaccine Newcastle thì trong huyết thanh gà có kháng thể đặc hiệu chống lại virus Newcastle, kháng thể trung hòa virus làm cho nó mất khả năng ngưng kết hồng cầu gà. a Nguyên liệu:
- Đĩa ngưng kết 96 giếng đáy chữ V hoặc chữ U.
- Kháng nguyên chuẩn Newcastle (được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Khoa Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam) b
Cách pha và chuẩn bị các nguyên liệu
- Cách pha dung dịch PBS 1X từ dung dịch PBS 10X: pha theo tỷ lệ 1 PBS10X : 9 nước cất.
Ví dụ: Lấy 900 ml nước cất cho vào bình thủy tinh sạch, sau đó cho 100 ml dung dịch PBS 10X rồi lắc đều.
- Cách chuẩn bị huyễn dịch hồng cầu gà 1%
Gà lấy máu là gà khỏe mạnh, âm tính với kháng thể Newcastle Nuôi gà ở chuồng an toàn dịch bệnh, dùng để lấy máu thường xuyên.
Vị trí lấy máu: Lấy máu ở vị trí tĩnh mạch cánh, sát trùng vị trí lấy máu bằng bông cồn 70°.
Dùng xi lanh 5ml hút khoảng 0.2 ml dung dịch chống đông Natricitrat 5%, rồi dùng xi lanh lấy 3-4ml máu gà.
Rửa hồng cầu: Chuyển máu chống đông vào ống fancol 15 bổ sung thêm dung dịch PBS 1X đến vạch 10ml, lắc nhẹ Ly tâm ở 1500 vòng trong 5 phút, loại bỏ huyễn dịch ở trên Lặp lại như trên từ 2 đến 3 lần Sau lần ly tâm cuối cùng, bỏ huyễn dịch phía trên thu hồng cầu phía dưới sử dụng để pha loãng. Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% Ví dụ: 1ml hồng cầu đặc với 99 ml dung dịch PBS 1X Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ từ 4°C-8°C Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong một tuần, nếu huyễn dịch hồng cầu bị dung huyết phải loại bỏ Hồng cầu đã rửa nếu không dùng hết, cần cho nước muối sinh lý hoặc PBS 1X vào bảo quản, khi cần ly tâm lại để dùng. c Trình tự tiến hành phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI
Xác định lại hiệu giá của kháng nguyên chuẩn Newcastle bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu- HA ( Hemagglutination test)
Nguyên lý của phản ứng HA:
Trên bề mặt của virus Newcastle có kháng nguyên HN có khả năng gắn với thụ thể của hồng cầu gây ngưng kết hồng cầu, ta có thể quan sát được hiện tượng này bằng mắt thường.
+ Đĩa 96 giếng đáy chữ V hoặc chữ U
+ Bộ dụng cụ pipette, đầu tipe….
Bảng 3.2 Trình tự tiến hành phản ứng HA
Trộn đều, chuyển 25 àl từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 11
0 nguyờn (àl) rồi hỳt bỏ 25 àl
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 gà (àl) Độ pha loãng KN
Dựng đĩa 96 giếng, đỏy chữ V hoặc chữ U Bổ sung 25 àl PBS từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 12 Thờm 25 àl khỏng nguyờn vào giếng thứ nhất
Pha loãng kháng nguyên: Trộn đều kháng nguyên với PBS ở giếng thứ nhất, hỳt 25 àl chuyển sang giếng thứ hai rồi trộn đều bằng pipet, hỳt 25 àl chuyển sang giếng thứ 3 trộn đều, tiếp tục làm như vậy cho đến giếng thứ 11, hút bỏ 25 àl ở giếng thứ 11 Giếng 12 chỉ cú PBS để làm đối chứng hồng cầu.
Nhỏ thờm 25 àl PBS vào tất cả cỏc giếng.
Thờm hồng cầu: Cho vào mỗi giếng 25àl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ 1 phỳt. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng Sau 30 phút đọc kết quả, không nên đọc kết quả sau quá 30 phút.
+ Phản ứng dương tính: Có hạt ngưng kết lấm chấm.
+ Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn.
Cách pha và chuẩn độ kháng nguyên 4HA(thống nhất cách đánh dấu đầu mục cùng loại)
Ví dụ: Hiệu giá kháng nguyên trong phản ứng HA là 1/256 thì 4HA bằng 1/256×4=1/64.
- Pha 4HA gồm 1 phần kháng nuyên và 63 phần PBS 1x Chuẩn độ kháng nguyên 4HA bằng phản ứng HA.
- Cách chuẩn độ kháng nguyên 4HA:
Bảng 3.3 Trình tự phản ứng HA để chuẩn độ 4 HA
4HA (àl) 25 Trộn đều, chuyển 25àl từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 4 rồi hỳt bỏ 25àl 0
Dựng đĩa 96 giếng, đỏy chữ U hoặc chữ V Bổ sung 25àl PBS từ giếng thứ
1 đến giếng thứ 5 Thờm 25 àl khỏng nguyờn 4HA đó pha vào giếng thứ nhất, trộn đều với PBS ở giếng thứ 1, hỳt 25 àl chuyển sang giếng thứ 2 trộn đều, hỳt
25 àl chuyển sang giếng thứ 3 trộn đều Tiếp tục làm như vậy đến giếng thứ 4, hỳt bỏ 25 àl ở giếng thứ 4 Giếng thứ 5 chỉ cú PBS để làm đối chứng hồng cầu.
Nhỏ thờm 25 àl PBS vào tất cả cỏc giếng rồi thờm vào mỗi giếng 25 àl hồng cầu gà 1% Để ở nhiệt độ phòng sau 30 phút đọc kết quả.
- Kết quả: Nếu kết quả ngưng kết đến giếng thứ 2, như vậy là kháng nguyên pha đạt Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 (hoặc hơn) là kháng nguyên pha đặc Ngược lại , nếu ngưng kết chỉ ở giếng đầu tiên thì kháng nguyên pha loãng Dựa vào kết quả đó để bổ sung thêm kháng nguyên hoặc PBS để có kháng nguyên 4HA chuẩn.
Cách tiến hành phản ứng HI
Bảng 3.4 Trình tự tiến hành phản ứng HI để đánh giá kháng thể chủ động của gà sau khi gây miễn dịch
Huyết 25 Trộn đều, chuyển 25 àl từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11 rồi hỳt 0 thanh bỏ 25 àl
Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng
Dựng đĩa 96 giếng, đỏy chữ U hoặc chữ V, cho 25àl PBS vào mỗi giếng từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 12.
Cho 25 àl huyết thanh cần kiểm tra vào giếng thứ 1 Pha loóng huyết thanh: trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng thứ 1, rồi hỳt 25 àl chuyển sang giếng thứ
2 trộn đều, hỳt 25 àl chuyển sang giếng thứ 3 tiếp tục làm như vậy đến giếng thứ
11, rồi hỳt bỏ 25 àl đi ở giếng thứ 11.
Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ giếng thứ 1 đến giếng thứ
11, mỗi giếng 25 àl Giếng 12 cho thờm 25 àl PBS.
Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Cách tiến hành phản ứng HI thông qua lòng đỏ trứng pha loãng
Pha loãng lòng đỏ trứng:
Tiến hành đập trứng nhẹ nhàng tách lấy phần lòng đỏ sau khi đã loại bỏ hoàn toàn phần lòng trắng Xé nhẹ màng lòng đỏ, thu lòng đỏ vào ống fancol 50, rồi dựng pipet lấy khoảng 100 àl lũng đỏ ra ống ependoft 1,5 ml để pha loóng Ta sẽ pha loóng lũng đỏ 5 lần, như vậy hỳt thờm 400àl PBS 1x vào ống ependoft 1,5 ml đã có lòng đỏ rồi vontex đều.
Bảng 3.5 Trình tự tiến hành phản ứng HI để đánh giá kháng thể thụ động chuyền qua lòng đỏ trứng
Trộn đều, chuyển 25 àl từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11 rồi trứng đã 25 0 pha loóng hỳt bỏ 25 àl
Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng
Hồng cầu 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 gà (àl) Độ pha loãng
Dựng đĩa 96 giếng, đỏy chữ U hoặc chữ V, cho PBS vào mỗi giếng 25àl từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 12.
Cho 25 àl lũng đỏ trứng đó pha loóng cần kiểm tra vào giếng thứ 1 Pha
Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ giếng thứ 1 đến giếng thứ
11, mỗi giếng 25 àl Giếng 12 cho thờm 25 àl PBS.
Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Cho vào mỗi giếng 25 àl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ 1 phỳt, để ở nhiệt độ phòng Sau 30 phút đọc kết quả ( không đọc muộn hơn 30 phút).
- Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể tương ứng Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng cao nhất có hiện tượng ức chế ngưng kết hoàn toàn.
- Phản ứng âm tính: Có hạt ngưng kết lấm tấm Chứng tỏ không có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể trong phản ứng.
Hiệu giá HI của mẫu được tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Đánh giá phản ứng: Thông qua hiệu giá của phản ứng người ta đánh giá mức độ miễn dịch của đàn gà Hiệu giá phản ứng từ 1/8 trở lên được coi là có khả năng bảo hộ với bệnh Newcastle Hiệu giá HI càng cao thì gà có mức độ miễn dịch càng mạnh.
Hình 3.1 Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI
Theo quy định 1362/ KTY-DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn:
- Ngưỡng bảo hộ, hiệu giá (HI) = 4 log2
- Kháng thể cao, hiệu giá (HI)>4 log2
- Không được bảo hộ, hiệu giá (HI)
