QUAN
Tổng quan về bệnh ung thƣ phổi không phải tế bào nhỏ
1.1.1.Đại cương về ung thư phổi
Ung thư phổi, hay còn gọi là khối u ác tính ở đường hô hấp, là một loại ung thư bắt nguồn từ phổi Bệnh xảy ra khi khối u ác tính hình thành và phát triển nhanh chóng, dẫn đến việc xâm lấn và chèn ép các cơ quan lân cận.
Ung thư phổi nguyên phát là loại ung thư bắt đầu hình thành trong phổi, trong khi ung thư phổi thứ phát là ung thư lan từ các bộ phận khác trong cơ thể đến phổi Có hai dạng chính của ung thư phổi nguyên phát, được phân loại dựa trên loại tế bào mà ung thư phát triển.
● Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ – dạng phổ biến nhất, chiếm khoảng
Khoảng 80 đến 85 trong số 100 trường hợp ung thư phổi có thể được phân loại thành ba loại chính: ung thư biểu mô tế bào vảy, ung thư biểu mô tuyến và ung thư biểu mô tế bào lớn.
● Ung thư phổi tế bào nhỏ – một dạng ít phổ biến hơn thường lây lan nhanh hơn ung thư phổi không phải tế bào nhỏ[1]
Ung thư phổi là một trong những loại ung thư phổ biến và là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn cầu, với khoảng 2.2 triệu ca mắc mới và 935 nghìn ca tử vong trong năm 2020 Tỷ lệ mắc ung thư phổi ở nam giới cao gấp đôi so với nữ giới, và các nước đang phát triển ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh cao hơn so với các nước phát triển.
Năm 2020, Việt Nam ghi nhận khoảng 26,262 ca mắc mới và 23,797 ca tử vong do ung thư, trong đó ung thư phổi có tỷ lệ tử vong đứng thứ hai, chỉ sau ung thư vú Tỷ lệ mắc ung thư phổi cao nhất ở những người từ 45 tuổi trở lên Đối với nam giới, ung thư phổi là nguyên nhân tử vong đứng thứ hai sau ung thư gan, trong khi ở nữ giới, con số này đứng thứ hai sau ung thư vú.
Chẩn đoán sớm ung thư phổi là phương pháp hiệu quả nhất để giảm tỷ lệ tử vong do căn bệnh này Các yếu tố tiên lượng quan trọng bao gồm giai đoạn bệnh, phương pháp điều trị và tình trạng sức khỏe của bệnh nhân.
Tỷ lệ sống 5 năm của bệnh nhân ung thư phổi phụ thuộc chủ yếu vào tình trạng bệnh hiện tại Đặc biệt, ở giai đoạn khu trú, tỷ lệ sống trên 5 năm của người bệnh có khả năng cao hơn.
Khi ung thư lan đến các hạch bạch huyết lân cận, tỷ lệ sống trên 5 năm của bệnh nhân giảm xuống còn 25% Nếu xuất hiện di căn xa, tỷ lệ sống trên 5 năm chỉ còn khoảng 4%.
1.1.2.Nguyên nhân-Yếu tố nguy cơ
Ung thư phổi không tế bào nhỏ được gây ra bởi nhiều nguyên nhân và yếu tố nguy cơ dưới đây:
Thuốc lá là nguyên nhân chính gây ung thư phổi, với ước tính 80 - 90% ca mắc bệnh liên quan đến việc hút thuốc Nguy cơ ung thư phổi tăng theo thời gian và lượng thuốc lá tiêu thụ; một người hút một gói thuốc mỗi ngày có nguy cơ mắc ung thư phổi gấp 20 lần so với người không hút thuốc Ngoài ra, hút thuốc thụ động cũng làm tăng nguy cơ, với những người sống cùng nhà với người hút thuốc có nguy cơ mắc ung thư phổi cao hơn 30% so với những người không sống trong môi trường này.
• Tiếp xúc amiăng: người hút thuốc có tiếp xúc amiăng có nguy cơ cao gấp
90 lần người không tiếp xúc
• Bụi phóng xạ và radon: làm tăng nguy cơ ung thư phổi, người tiếp xúc với mức độ radon cao tại nhà ở để mắc ung thư phổi
Nhiễm siêu vi bướu nhú ở người (HPV) được xác định là nguyên nhân gây ung thư phổi, với gần 25% trường hợp ung thư phổi ở người không hút thuốc có liên quan đến HPV Chứng đa bướu nhú tái diễn (RRP) có thể dẫn đến ho, tắc nghẽn hô hấp mạn tính và thoái hóa ác tính Nhiễm HPV typ 16/18 thường đi kèm với đột biến gen p53.
Di truyền đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của ung thư, trong đó một số đột biến di truyền, như đột biến T790M, có liên quan đến ung thư biểu mô tuyến phổi.
• Ô nhiễm không khí: khói bụi trong không khí ô nhiễm có thể làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi, đặc biệt là ung thư biểu mô tuyến[1], [4], [5]
Tỷ lệ tử vong do ung thư phổi cao chủ yếu do bệnh thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, vì vậy cần nâng cao hiệu quả tầm soát và phát hiện sớm Gần đây, chụp cắt lớp điện toán xoắn ốc năng lượng thấp đã được phê duyệt như một phương pháp tầm soát cho những người có nguy cơ cao, đặc biệt là những người hút thuốc lá với lịch sử trên 30 gói/năm.
1.1.3.Điều trị ung thƣ phổi
Phẫu thuật là phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn sớm, khi các khối u còn nhỏ, chưa di căn và chưa ảnh hưởng đến sức khỏe Điều này cho phép bệnh nhân có khả năng đáp ứng tốt với điều trị.
Sau phẫu thuật, khả năng chữa khỏi bệnh ung thư phổi được cải thiện đáng kể, đồng thời tỷ lệ sống sót của bệnh nhân sau 5 năm cũng cao hơn Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện sớm bệnh ung thư phổi vẫn còn rất thấp.
Xạ trị là phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn II và III, khi không thể thực hiện phẫu thuật Phương pháp này sử dụng các máy chiếu tia năng lượng cao như tia X và tia gamma để tiêu diệt các tế bào ung thư.
Tổng quan về thụ thể EGFR
1.2.1.Sơ lƣợc về thụ thể EGFR
Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) là một thành viên của siêu họ ERBB, thuộc nhóm thụ thể tyrosine kinase (RTK), là các protein xuyên màng được kích hoạt khi gắn với yếu tố tăng trưởng peptid của họ protein EGF.
Họ ERBB của tyrosine kinase thụ thể (RTK) bao gồm bốn thụ thể riêng biệt: EGFR (ErbB-1/HER1), ErbB-2 (neu, HER2), ErbB-3 (HER3) và ErbB-4 (HER4) Tất cả các protein trong họ này đều có miền liên kết phối tử ngoại bào, miền xuyên màng kỵ nước và miền chứa tyrosine kinase tế bào chất Miền tyrosine kinase nội bào của các thụ thể ErbB được bảo tồn cao, với miền ngoại bào được chia thành bốn miền khác nhau Miền tyrosine kinase bao gồm một thùy N và một thùy C, trong đó ATP liên kết với khe hở giữa hai thùy này Cuối cùng, miền điều hòa đầu cuối C chứa một số gốc tyrosine được phosphoryl hóa khi liên kết với phối tử.
Hình 1.1.Cấu trúc protein EGFR (A), kích hoạt (B) và giảm dần bằng liên kết phối tử
Mười một phối tử liên kết với họ thụ thể ERBB được phân loại thành ba nhóm: (a) phối tử đặc hiệu với EGFR như EGF, yếu tố tăng trưởng biến đổi-a, amphiregulin và epigen; (b) phối tử liên kết với cả EGFR và ERBB 4 như betacellulin, EGF gắn với heparin và epiregulin; và (c) neuregulin (NRG), liên kết với ERBB 3 và ERBB 4, trong đó NRG1 và NRG2 liên kết với cả ERBB 3 và ERBB 4, còn NRG3 và NRG4 chỉ liên kết với ERBB 4 Mặc dù có sự dư thừa giữa các phối tử, EGF liên kết với heparin là phối tử duy nhất không có ở chuột bị loại, dẫn đến tử vong sau sinh do vấn đề tim và phổi Chuột thiếu các phối tử EGF khác hoặc cả ba phối tử amphiregulin, EGF và yếu tố tăng trưởng biến đổi-a vẫn khả thi Các phối tử này được tổng hợp dưới dạng protein xuyên màng và phối tử hòa tan được giải phóng vào môi trường ngoại bào qua quá trình phân giải protein, trung gian bởi các protein ADAM, là metalloproteinase neo màng.
Hình 1.2.Các protein EGFR và ERBB và các con đường xuôi dòng của chúng
Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì ban đầu được Stanley Cohen phân lập vào năm
Vào năm 1962, một loại protein chiết xuất từ tuyến dưới hàm của chuột đã được phát hiện, giúp thúc đẩy quá trình mọc răng cửa và mở mí mắt ở động vật sơ sinh, được gọi là "yếu tố nắp răng" trước khi được đổi tên thành EGF do khả năng kích thích sự tăng sinh của tế bào biểu mô Năm 1972, trình tự axit amin của EGF đã được xác định, và vào năm 1975, sự hiện diện của thụ thể EGF (EGFR) đã được chứng minh khi EGF liên kết đặc biệt với bề mặt của nguyên bào sợi Thụ thể EGFR là một glycoprotein có trọng lượng phân tử 170kDa, cho thấy sự tăng phosphoryl hóa khi kết hợp với EGF trong dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào vảy A431 Năm 1980, phát hiện rằng protein biến đổi của virus Rous sarcoma, v-src, có hoạt tính tyrosine-phosphoryl hóa đã dẫn đến việc nhận ra EGFR là một tyrosine kinase được kích hoạt thông qua liên kết với EGF Đến năm 1984, cDNA của EGFR người đã được xác định.
Một mức độ tương đồng cao giữa trình tự axit amin của EGFR và v-erbB, một gen gây ung thư từ vi rút tạo hồng cầu ở gia cầm, đã được phát hiện.
1.2.2.Sự biểu hiện quá mức của EGFR và bệnh lý ung thƣ phổi không phải tế bào nhỏ
Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) là loại ung thư phổi phổ biến nhất, chiếm khoảng 85% tổng số ca ung thư phổi, và được chia thành ba loại chính: ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô vảy và ung thư biểu mô tế bào lớn Ung thư biểu mô tuyến là loại phổ biến nhất, chiếm khoảng 40%, tiếp theo là ung thư biểu mô vảy với 25-30%, và ung thư biểu mô tế bào lớn chiếm 10% NSCLC là một khối u ác tính không đồng nhất với nhiều đột biến gen, và trong những năm gần đây, sự phát triển của liệu pháp miễn dịch và nhắm mục tiêu đã cải thiện đáng kể việc quản lý bệnh Các phương pháp điều trị chủ yếu cho NSCLC bao gồm phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, liệu pháp nhắm mục tiêu và liệu pháp miễn dịch, trong đó phẫu thuật là lựa chọn hàng đầu cho các trường hợp có thể cắt bỏ Đối với giai đoạn I và II, một số bệnh nhân giai đoạn IIIA có thể thực hiện phẫu thuật cắt bỏ, trong khi giai đoạn III của NSCLC, ảnh hưởng đến khoảng 20% bệnh nhân, có phương pháp điều trị khác nhau tùy thuộc vào gánh nặng khối u và triệu chứng Phẫu thuật cho NSCLC giai đoạn III hiện đang gây tranh cãi.
Vào tháng 4 năm 2004, các nhà nghiên cứu tại Boston và sau đó ở New York đã phát hiện ra rằng có sự hiện diện của các đột biến kích hoạt trong gen EGFR.
Nghiên cứu cho thấy 10% bệnh nhân ung thư phổi không phải tế bào nhỏ có khối u với đột biến EGFR rất nhạy cảm với EGFR-TKIs Điều này giải thích tại sao những bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến, đặc biệt là nữ giới, không hút thuốc và có nguồn gốc Đông Á, lại có phản ứng tích cực hơn với EGFR-TKIs, do tỷ lệ đột biến EGFR cao hơn ở nhóm này Theo dữ liệu y học, tỷ lệ đột biến EGFR được ghi nhận trong 559 trường hợp ở 2880 bệnh nhân ung thư phổi Đặc biệt, các đột biến EGFR trong miền tyrosine kinase chủ yếu chỉ xuất hiện ở ung thư phổi, không thấy ở các loại khối u khác.
Tỷ lệ đột biến EGFR trong ung thư phổi ở bệnh nhân không hút thuốc cao hơn so với những người có tiền sử hút thuốc Tần suất đột biến EGFR có mối liên hệ nghịch với tổng lượng thuốc lá hút, nhưng không có nghĩa là hút thuốc ngăn ngừa đột biến này Thay vào đó, điều này gợi ý rằng đột biến EGFR có thể do các chất gây ung thư khác ngoài khói thuốc lá, và mối tương quan tiêu cực giữa đột biến EGFR và liều lượng thuốc lá là do sự pha loãng số lượng khối u chứa đột biến EGFR khi số lượng khối u chứa EGFR hoang dã tăng lên.
1.2.3.Các thuốc ức chế thụ thể EGFR
Nhiều phương pháp đã được phát triển để tác động vào EGFR, nhằm can thiệp vào các hiệu ứng tế bào do EGFR trung gian Hai loại phương pháp này đã được nghiên cứu một cách sâu rộng cho đến nay.
Các kháng thể đơn dòng trực tiếp chống lại miền thụ thể ngoại bào và các hợp chất phân tử nhỏ can thiệp vào hoạt động tyrosine kinase của EGFR nội bào mang lại cơ chế hoạt động và hồ sơ độc tính khác biệt so với các phương pháp điều trị truyền thống như hóa trị liệu và xạ trị Điều này tạo ra một nền tảng lý tưởng để đánh giá sự kết hợp của các tác nhân này với các phương pháp gây độc tế bào, nhằm đạt được hiệu quả chống ung thư cộng hưởng hoặc hiệp đồng.
Kháng thể đơn dòng có tính đặc hiệu cao hơn đối với EGFR so với các hợp chất phân tử nhỏ và có thể ức chế thụ thể với nồng độ thấp hơn Tuy nhiên, chúng cần được tiêm tĩnh mạch, trong khi các chất ức chế phân tử nhỏ có thể sử dụng qua đường uống Một vấn đề khác là kháng thể đơn dòng có thể gây ra phản ứng miễn dịch, làm giảm hiệu quả của liệu pháp tiếp theo Ngoài ra, kháng thể đơn dòng có thể kém hiệu quả hoặc không hiệu quả đối với các dạng EGFR đã thay đổi, chẳng hạn như thụ thể vIII đột biến, và có thể không nhận diện được các dạng trình bày biến thể của miền ngoại bào của thụ thể.
Một số kháng thể đơn dòng có thể kể đến trong điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ như IMC-C225,ABX-EGF,ICR-62 và EMD-72000
IMC-C225 (cetuximab, Erbitux) là một kháng thể đơn dòng kháng EGFR đã trải qua nhiều nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng Các nghiên cứu từ những năm 1980 đã chỉ ra rằng kháng thể đơn dòng ở chuột có khả năng ngăn chặn các phối tử tự nhiên kết nối với EGFR, từ đó ức chế sự kích hoạt tyrosine kinase của thụ thể và gây tác dụng chống tăng sinh trên nhiều dòng tế bào khối u ở người IMC-C225 là một kháng thể đơn dòng khảm chuột-người, được thiết kế để giảm thiểu phản ứng miễn dịch đối với kháng thể đơn dòng của chuột bằng cách kết hợp các phần của kháng thể chuột với vùng xác định tính bổ thể của globulin miễn dịch người.
ABX-EGF là một kháng thể đơn dòng được phát triển để tương thích hoàn toàn với cơ thể người, có khả năng gắn kết mạnh mẽ với EGFR Nồng độ ức chế 50% của ABX-EGF đạt khoảng 3nmol/L.
Nó đã được chứng minh là ngăn ngừa sự hình thành khối u rắn, cũng như tiêu diệt các khối u lớn, đã hình thành trong xenograft khối u ở người ở chuột trần
ICR-62 và EMD-72000, hai kháng thể đơn dòng của chuột, đã chứng minh hiệu quả chống tăng sinh in vitro trên các dòng tế bào ung thư đầu và cổ tế bào vảy Tuy nhiên, chỉ có 1 trong số 16 bệnh nhân điều trị bằng EMD-72000 cho thấy phản ứng tích cực.
Tổng quan về các hợp chất alkaloid
Alkaloid là một nhóm lớn các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc từ axit amin, được tìm thấy trong tự nhiên trên toàn cầu Chúng bao gồm nhiều nguyên tố và phân tử sinh học khác nhau, đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học.
Alkaloid là các hợp chất vòng chứa nitơ, được phân loại dựa trên nguồn gốc axit amin như L-phenylalanine, L-tyrosine, và L-lysine Chúng có hoạt tính sinh học đa dạng, mặc dù một số có tác dụng hạn chế Nitơ trong alkaloid thường đến từ axit amin, tạo thành vòng dị vòng Alkaloid có thể tồn tại dưới dạng tự do, muối hoặc N-oxit trong cây Ngoài cacbon, hydro và nitơ, hầu hết các alkaloid còn chứa oxy và được chia thành các nhóm chính như pyrrolidine, pyridine, và indole.
Hình 1.4.Cấu trúc của các nhóm alkaloid chính
Các hợp chất alkaloid đóng vai trò quan trọng trong y học nhờ khả năng tác động trực tiếp lên hệ thần kinh trung ương của con người và ảnh hưởng đến axit nucleic Chúng được xem là những hợp chất tiềm năng có giá trị trong việc phát triển các liệu pháp điều trị mới.
DNA (Deoxy Ribonucleic acid) và RNA (Ribonucleic acid) có vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu tính thấm của màng và protein, từ đó nhiều alkaloid được ứng dụng làm hợp chất có hoạt tính dược lý trong y học Alkaloid kích thích hệ thống thần kinh trung ương, dẫn đến việc chúng được sử dụng làm chất kích thích và thuốc thần kinh Hơn nữa, các hợp chất alkaloid còn có khả năng điều trị nhiều bệnh lý khác nhau như ung thư, trầm cảm và sốt rét Các chất chuyển hóa thực vật thuộc nhóm alkaloid mang lại nhiều tác dụng dược lý như kháng khuẩn, giảm đau, chống đông máu, trị mụn và chống oxy hóa.
Tổng quan về nghiên cứu in silicon
Thuật ngữ "in silico" đề cập đến các thí nghiệm được thực hiện bằng máy tính, thường liên quan đến sinh học, và được biết đến hơn các phương pháp in vivo và in vitro Mặc dù lịch sử chính xác của thuật ngữ này chưa được xác định rõ ràng, một số nhà nghiên cứu đã khẳng định vai trò của họ trong việc hình thành nó Một trong những ví dụ sớm nhất về việc sử dụng từ "in silico" có thể được tìm thấy trong các công trình của Sieburg.
Danchin et al (1990, 1991) đã nhấn mạnh tiềm năng của các công cụ tính toán trong hóa học, sinh học và dược học Trong cuốn sách của mình năm 2002, Danchin mô tả rằng informatics là một công cụ hữu ích cho việc khám phá và phân tích các chức năng sinh học Ông tin tưởng vào khả năng của phương pháp tính toán, hay còn gọi là silico, như một phần bổ sung quan trọng cho các thử nghiệm in vivo và in vitro.
Dược lý in silico, hay còn gọi là trị liệu máy tính, là một lĩnh vực phát triển nhanh chóng toàn cầu, sử dụng phần mềm để thu thập và phân tích dữ liệu sinh học và y tế từ nhiều nguồn khác nhau Lĩnh vực này tập trung vào việc tạo ra các mô hình và mô phỏng tính toán, giúp đưa ra dự đoán, đề xuất giả thuyết, và cung cấp những khám phá mới trong y học và phương pháp điều trị.
Mục đích chính của việc lắp ghép phân tử là dự đoán cấu trúc phức tạp của thụ thể phối tử thông qua các phương pháp tính toán Quá trình lắp ghép này diễn ra qua hai bước liên quan: đầu tiên là lấy mẫu sự phù hợp của phối tử.
Chúng tôi đã phân tích 15 vị trí hoạt động của protein và đánh giá sự phù hợp của chúng thông qua chức năng tính điểm Các thuật toán lấy mẫu lý tưởng nên có khả năng tái tạo chế độ liên kết thử nghiệm, đồng thời chức năng tính điểm cần xếp hạng các tuân thủ cao nhất trong số tất cả các sự phù hợp được tạo ra Từ hai khía cạnh này, bài viết cung cấp cái nhìn tổng quan ngắn gọn về lý thuyết lắp ghép cơ bản.
Chức năng tính điểm nhằm phân biệt giữa các tư thế đúng và sai, cũng như giữa chất kết dính và hợp chất không hoạt động trong thời gian hợp lý Các chức năng này ước tính ái lực liên kết giữa protein và phối tử, áp dụng nhiều giả định và đơn giản hóa khác nhau Hàm tính điểm có thể được phân loại thành ba loại: dựa trên trường lực, theo kinh nghiệm và dựa trên tri thức.
Docking là kỹ thuật máy tính tối ưu hóa sự tương thích giữa phối tử và protein, nhằm đạt cấu trúc tối ưu với năng lượng tự do thấp nhất Tương tác giữa phối tử và đích thường là do lực không liên kết hoặc tương tác cộng hóa trị Quy trình docking phân tử mô phỏng cấu trúc phức hợp phối tử-thụ thể, với chất nhận thường là protein hoặc axit nucleic, trong khi phối tử là phân tử nhỏ hoặc protein khác Đây là một trong những phương pháp phổ biến nhất trong phát minh thuốc dựa trên cấu trúc, nhờ vào độ chính xác cao trong việc dự đoán cấu trúc của các phối tử trong vị trí liên kết đích.
Docking phân tử nhằm dự đoán cấu trúc phức hợp phối tử-thụ thể thông qua các phương pháp tính toán Quá trình này thường diễn ra qua hai bước chính: đầu tiên, lấy mẫu sự tương thích của phối tử tại vị trí hoạt động của protein bằng các thuật toán; tiếp theo, xếp hạng các sự tương thích này thông qua hàm tính điểm.
Nhiều thuật toán lấy mẫu đã được phát triển và ứng dụng phổ biến trong phần mềm docking phân tử Trong số đó, thuật toán so khớp (MA) dựa trên nguyên tắc khoảng cách giữa các nhóm chức trong phân tử protein và phối tử, cùng với phương pháp xây dựng tăng dần, là những phương pháp quan trọng giúp cải thiện hiệu quả của quá trình docking.
Phương pháp IC đưa phối tử vào vị trí hoạt động của protein bằng cách phân mảnh và thêm dần các mảnh Trong khi đó, phương pháp Monte Carlo (MC) tạo ra các tư thế của phối tử thông qua chuyển động quay liên kết và tịnh tiến thân cố định Các thuật toán di truyền (GA) dựa trên thuyết tiến hóa của Darwin, tạo ra một tập các tư thế của phối tử thông qua quá trình đột biến và trao đổi chéo Cuối cùng, mô phỏng động lực học phân tử (MD) dự đoán sự di chuyển của từng nguyên tử trong trường của các nguyên tử còn lại theo thời gian, cho thấy tính linh hoạt của cả phối tử và protein một cách hiệu quả hơn so với các thuật toán khác.
Hàm tính điểm là phương pháp toán học quan trọng để ước tính ái lực liên kết, giúp tối ưu hóa hợp chất dẫn đường từ kết quả sàng lọc ảo và tìm phối tử có ái lực cao nhất so với đích Độ chính xác của hàm có thể được xác thực qua các bài kiểm tra sàng lọc docking, nếu nó loại trừ các yếu tố dương tính giả và phù hợp với dữ liệu thực nghiệm Nhiều phương pháp có thể ước tính ái lực liên kết giữa protein và phối tử từ cấu trúc 3D của phức hợp nhị phân, sử dụng tọa độ nguyên tử làm đầu vào Các hàm tính điểm ước tính năng lượng tự do của liên kết hoặc hằng số liên kết, với năng lượng tự do của phức hợp protein-phối tử được xác định bởi hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔG), bao gồm các tương tác như Van der Waals, liên kết kị nước, liên kết Hydro, liên kết cộng hóa trị và liên kết tĩnh điện Độ chính xác tăng lên với số lượng tham số hóa lý, nhưng thời gian tính toán sẽ lâu hơn nếu số lượng biến lớn, do đó, cần cân bằng giữa độ chính xác và tốc độ để đạt hiệu quả khi làm việc với các cơ sở dữ liệu lớn.
Cấu trúc các phối tử có thể được lấy từ các hệ thống dữ liệu như ZINC và PubChem Nếu không có sẵn, chúng ta có thể sử dụng phần mềm chuyên dụng như ChemDraw hoặc ChemSketch để xây dựng cấu trúc phối tử Sau khi tạo được cấu trúc 3D, sử dụng phần mềm Chimera và Avogadro để xử lý phối tử, bao gồm chỉnh sửa điện tích, gắn trường lực, tối ưu hóa năng lượng và tạo file pdbqt nhằm chuẩn bị cho quá trình docking.
Cấu trúc 3D của protein có thể được tìm thấy trên ngân hàng dữ liệu protein tại “http://www.rcsb.org” Nếu không có sẵn cấu trúc protein, chúng ta có thể sử dụng phương pháp mô hình hóa tương đồng để xây dựng nó Sau khi hoàn thành cấu trúc 3D, cần chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking bằng cách sử dụng phần mềm chuyên dụng, bao gồm việc loại bỏ nước và phối tử (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực và tạo file pdbqt.
Trước khi thực hiện mô phỏng docking, việc xác định kích thước vùng tìm kiếm (grid box) là rất quan trọng Vùng tìm kiếm cần được cân nhắc để không quá lớn, tránh lãng phí thời gian và giảm độ chính xác, cũng như không quá nhỏ để đảm bảo phần mềm có thể tìm kiếm một khu vực có ý nghĩa Thông thường, vùng tìm kiếm được đặt tại trung tâm hoạt động của protein Khi tiến hành docking, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm và xác định cấu trúc có năng lượng thấp nhất Các tương tác giữa các cấu trúc thu được sẽ được phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng như MOE, Pymol, và Discovery Studio.
1.4.2.Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc
Hầu hết các ứng cử viên thuốc thất bại trong thử nghiệm lâm sàng do không đáp ứng tiêu chí về hiệu quả và độc tính Năm 1997, Christopher Lipinski và các cộng sự đã phát triển bộ quy tắc số 5 (Rules of 5 - RO5) cho các hợp chất giống thuốc, chỉ ra rằng thuốc uống thường có đặc tính hóa lý và cấu trúc trong một phạm vi giá trị nhất định Một dược chất đường uống không được vi phạm quá 2 trong 5 tiêu chí của quy tắc này.
- Trọng lượng phân tử: MW < 500 Dalton
- Số lượng nhóm cho liên kết hydro (Số lượng các nhóm –NH và –OH):
- Số lượng nhóm nhận liên kết hydro (Bao gồm nguyên tử O và N):
- Hệ số phân bố octanol/nước: LogP < 5
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Cấu trúc protein của thụ thể EGFR đã được xác định thông qua phương pháp tinh thể tia X Dữ liệu này được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein (Protein Data Bank) với mã số 6DUK và có độ phân giải đạt 2.2 Å.
Hình 2.1.Hình ảnh 3D của protein 6DUK
Cấu trúc phối tử bao gồm các hợp chất tự nhiên và tổng hợp được lấy từ cơ sở dữ liệu PubChem, nơi cung cấp thông tin miễn phí về các hợp chất hóa học PubChem là cơ sở dữ liệu lớn nhất thế giới, do Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia thuộc Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ duy trì.
Thiết bị sử dụng : Máy tính Dell Inspiron 3576 -Hệ điều hành Window 11
Phần mềm: Các phần mềm và công cụ sử dụng trong nghiên cứu được mua hoặc tải từ các nhà phát triển (trang web) bao gồm:
- MGL tools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu/)
- Autodock Vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu/)
- UCSF Chimera 1.15 (https://www.cgl.ucsf.edu/)
- Discovery Studio 2021 Client (https://discover.3ds.com/)
- Công cụ online pkCSM (http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/)
Bước 1 :Sàng lọc các hợp chất tự nhiên và tổng hợp có khả năng ức chế thụ thể EGFR bằng phương pháp docking phân tử
Bước 2: Tiến hành nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc của các hợp chất có kết quả sàng lọc docking phân tử tốt nhất, dựa vào các thông số hóa lý của chúng.
Bước 3: Nghiên cứu các đặc tính dược động học và độc tính của các hợp chất đáp ứng tiêu chí giống thuốc, từ đó lựa chọn các hợp chất tiềm năng để phát triển thành thuốc.
2.3.1.Sàng lọc bằng phương pháp docking phân tử
Re-dock phối tử đồng kết tinh của protein
Trong phức hợp EGFR (pdb: 6DUK) có chứa phối tử tự nhiên, đóng vai trò là chất ức chế thụ thể EGFR Do đó, việc tái dock phối tử đồng kết tinh là một phương pháp hiệu quả để xác nhận lại tính chất của phức hợp này.
Quá trình docking là một bước quan trọng trong nghiên cứu cấu trúc EGFR Nếu sự khác biệt vị trí của EGFR trước và sau khi re-dock không đáng kể (RMSD < 1,5 Å), điều này chứng tỏ quy trình docking đã thực hiện chính xác Điểm số docking của ligand đồng kết tinh cũng được sử dụng để lựa chọn các hợp chất ức chế EGFR hiệu quả Để thực hiện re-dock, cần tuân theo các bước cụ thể.
Bước 1: Tách ligand đồng kết tinh ra khỏi phức hợp EGFR nhờ phần mềm Discovery Studio 2021 Client, xây dựng file pdbqt
Bước 3: Sử dụng phần mềm Autodock để tiến hành dock ligand đã tách ra vào protein Bước 4: Sử dụng phần mềm Discovery Studio để biểu diễn phức hợp protein-ligand, loại bỏ protein và các phân tử không cần thiết, chỉ giữ lại cấu hình ligand có kết quả tốt nhất.
Bước 5: Tính toán RMSD giữa ligand đồng kết tinh khi được tách ra và sau khi thực hiện re-dock bằng phần mềm Chimera
Cấu trúc tinh thể của EGFR được tải về từ Protein Data Bank (pdb: 6DUK, độ phân giải 1.9 Å) Sử dụng phần mềm Discovery Studio 2021 Client, các loại phân tử nước, ligand đồng kết tinh và các phân tử nền được thêm vào Sau đó, hydro được thêm vào và tối ưu hóa các hydro phân cực, gắn trường lực Kollman và cuối cùng là xây dựng file pdbqt bằng phần mềm Autodock Tools 1.5.6.
Các ligand được tải về từ cơ sở dữ liệu PubChem đã được tối ưu hóa năng lượng bằng phần mềm Avogadro, sử dụng phương pháp Gradient liên hợp (Conjugate Gradients) Sau đó, các ligand này được chuyển đổi sang định dạng file pdbqt thông qua phần mềm Autodock Tools.
Tiến hành docking bằng phần mềm Autodock với kích thước hộp tìm kiếm 40x44x40 Å, khoảng cách giữa các ô lưới 0,375 Å và tọa độ trung tâm xB,148, y,049, z=-63,352, dựa trên vị trí hoạt động của thụ thể EGFR theo các acid amin quan trọng.
Phần mềm Autodock giúp xác định cấu hình liên kết tối ưu thông qua việc đánh giá năng lượng tự do liên kết ΔG và số lượng tương tác vật lý Kết quả của quá trình này cung cấp thông tin quan trọng cho nghiên cứu và phát triển trong lĩnh vực hóa học và sinh học phân tử.
22 docking được đánh giá thông qua 3 tiêu chí là điểm số docking, khả năng tương tác và RMSD (độ lệch bình phương trung bình gốc)
Trong mô phỏng docking, năng lượng liên kết thấp hơn cho thấy sự tương đồng với trạng thái tự nhiên của phức hợp Hàm tính điểm của thuật toán docking dựa trên các tham số và hệ số theo lý thuyết xác định Các năng lượng được tính toán bao gồm năng lượng nội tại của phối tử, năng lượng tự do xoắn và các tương tác giữa các phân tử như năng lượng liên kết Van der Waals, năng lượng liên kết hydro, năng lượng từ de-solvat và năng lượng tĩnh điện Mỗi loại tương tác được gán một miền giá trị, từ đó phản ánh khả năng tương tác mạnh hay yếu của phối tử với enzyme.
Quy trình docking được áp dụng để sàng lọc các hợp chất alkaloid từ cơ sở dữ liệu PubChem, sau khi kết quả re-dock của phối tử tự nhiên chứng minh tính hợp lý của quy trình Kết quả protein docking sẽ được lựa chọn dựa trên các tiêu chí đã được xác định.
1 Điểm số docking thấp hơn kết quả re-dock chất đối chứng dương
2 Cấu dạng có RMSD thấp nhất
3 Tạo liên kết tốt với các axit amin tại vị trí hoạt động
Phân tích tương tác của các phối tử với cấu trúc tinh thể của EGFR được thực hiện bằng phần mềm Discovery Studio, cung cấp hình ảnh trực quan 2D và 3D Công cụ này giúp xác định mối liên hệ giữa phối tử và các axit amin tại trung tâm hoạt động của protein.
2.3.2 Nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc
Quy tắc Lipinski 5 là một công cụ quan trọng trong việc so sánh các hợp chất có đặc tính tương tự như thuốc sau khi thực hiện quá trình docking Để một hợp chất có thể phát triển thành thuốc dùng đường uống, nó phải đáp ứng ít nhất 3 trong 5 tiêu chí của quy tắc này, nhằm đảm bảo tính khả thi và hiệu quả trong quá trình phát triển thuốc.
- Trọng lượng phân tử: MW < 500 Dalton
- Số lượng nhóm cho liên kết hydro (Số lượng các nhóm –NH và –OH): HBD < 5
- Số lượng nhóm nhận liên kết hydro (Bao gồm nguyên tử O và N):
- Hệ số phân bố octanol/nước: LogP < 5
QUẢ
3.1.1 Đánh giá quy trình docking
Trước khi tiến hành sàng lọc các hợp chất, cần re-dock phối tử đồng kết tinh vào vị trí hoạt động của mục tiêu để xác định độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) Việc đánh giá sự tương đồng về cấu dạng thông qua phần mềm Chimera cho thấy giá trị RMSD đạt 0.659 Å, nhỏ hơn 1.5 Å, chứng tỏ kết quả docking phân tử vào mục tiêu là đáng tin cậy.
Hình 3.1.RMSD của phối tử tự nhiên của thụ thể 6DUK trước và sau docking
Kết quả docking của phối tử tự nhiên cho thấy năng lượng liên kết G = -13.3 kcal/mol Phối tử này tạo liên kết hydro với các acid amin GLU-749, GLU-865, ASP-855, LYS-745, PHE-856, đồng thời hình thành các liên kết pi-alkyl và pi-sulfur với các acid amin MET-790, LEU-777, MET-766, ILE-759, LEU-861, LEU-858, VAL-726, ALA-743 (Hình 3.2).
Hình 3.2.Minh họa 2 chiều tương tác của phối tử đồng kết tinh vào vị trí hoạt động của protein
3.2.Tìm kiếm các hợp chất tiềm năng từ kết quả docking
Tiến hành docking 50 hợp chất vào vị trí hoạt động của thụ thể EGFR tại tọa độ xB,148,y,049,z=-63,352 với kích thước hộp tìm kiếm 40x44x40 A nhằm sàng lọc các phân tử ức chế thụ thể EGFR Kết quả được trình bày chi tiết trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1.Kết quả mô phỏng docking
STT Tên hợp chất Cấu trúc PubChem
Năng lượng liên kết(Kcal/mol )
Dựa trên kết quả từ bảng 3.1, so sánh với năng lượng liên kết của 50 chất với đối chứng dương (-8.7 Kcal/mol), đã xác định được 6 hợp chất có điểm docking tốt nhất, cho thấy khả năng ức chế mục tiêu đích hiệu quả.
3.3 Sàng lọc các hợp chất giống thuốc
Sử dụng công cụ trực tuyến pkCSM để tính toán các thông số theo quy tắc 5 Lipinski Bảng 3.2 trình bày kết quả các thông số quy tắc 5 Lipinski của 6 hợp chất đã được sàng lọc thông qua mô phỏng docking.
Tên hợp chất Phân tử khối(