TỔNG QUAN
Tổng quan về ngũ vị tử Ngọc Linh
According to botanical research, the Southern Five-Flavored Fruit, also known as Ngọc Linh Five-Flavored Fruit, is scientifically classified as Schisandra sphenanthera Rehder et Wills.
Vị trí phân loại của cây Ngũ vị tử Ngọc Linh được thể hiện như sau: [3], [4]
Lớp Hai lá mầm (Dicotyledones)
Phân lớp Hoàng liên (Rancunulidae)
Chi Ngũ vị tử (Schisandra)
Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera Rehder et Wills.) là cây leo thân gỗ dài từ 3 đến 5 mét, có hệ rễ chùm nông và lan rộng Toàn bộ cây không có lông, lá non có lông nhỏ mềm thưa thớt Thân cành có nốt sần và cành non hơi có cạnh Lá mọc so le, hình trứng đảo, với kích thước trung bình dài 5-11 cm và rộng 3-7 cm, mép lá có răng cưa thô Hoa đơn tính, màu vàng trắng, có mùi thơm, mọc ở nách lá với cuống dài 2-4 cm Cánh hoa có từ 5-9 cánh, màu cam, hình trứng đảo, kích thước 6-12 x 5-8 mm Quả mọng khi chín có màu hồng sau đó chuyển sang đỏ sẫm, hình cầu dạng trứng.
10 kính 5-7 mm Hạt tròn màu vàng, hình thận dài 4 mm, rộng 3,8 mm, rốn hạt hình chữ V, vỏ hạt lưng có vân sần sùi [4], [6]
Ngũ vị tử Ngọc Linh chủ yếu được tìm thấy tại hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, tập trung ở các khu vực có sinh thái rừng cây bụi, rừng thứ sinh và rừng thông đã qua khai thác Tại Kon Tum, Ngũ vị tử phân bố ở các huyện Ngọc Lây, Đak Tô, Tu-mơ-rông và Konplông, trong khi ở Quảng Nam, loài này chủ yếu xuất hiện ở khu vực nam Trà My.
Ngũ vị tử Ngọc Linh chứa tinh dầu có mùi chanh với thành phần chính là 30% secquiterpen, 20% aldehyd và aceton Quả của nó chứa 11% acid citric, 7% acid malic, 0,8% acid tartaric và vitamin C Hạt của ngũ vị tử Ngọc Linh có khoảng 34% chất béo.
Các dẫn chất Lignan là thành phần chính trong quả của Ngũ vị tử, được phân thành năm loại bao gồm:
2,5-diaryltetrahydrofuran lignan (loại E)(21-23) [9] Hàm lượng của nhóm lignan trong quả Ngũ vị tử giao động tử 7,2- 19,2 % [8], [9]
Ba triterpen được phân lập từ quả của Ngũ vị tử là schizandronic acid (ganwuweizic acid) (24), anwuweizic acid (25) và schisanol (26) [9]
Năm 2019, Nguyen Thi Mai và các cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất nortriterpenoid (27-32) và 5 lignan (33-37) [10]
Hình 1.1 Cấu trúc lignan của dibenzocyclooctadien
Hình 1.2 Cấu trúc của 5 lignan khác
Hình 1.3 Cấu trúc của 3 triterpene trong quả của Ngũ vị tử
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của 6 notriterpenoid và 5 lignan được phân lập từ Ngũ vị tử
Bảng 1.1 Các hợp chất được phân lập từ Ngũ vị tử Ngọc Linh
Các hợp chất nhóm lignan
Các hợp chất nhóm triterpene
1.1.5 Tác dụng của Ngũ vị tử
1.1.5.1 Tác dụng theo Y học cổ truyền
Ngũ vị tử, theo Dược điển Việt Nam, có vị chua, mặn, tính ấm và quy kinh phế, thận Loại thảo dược này có tác dụng liễm phế chỉ ho, sinh tân chỉ hàn, bổ thận cố tinh, chỉ tả và an thần Ngũ vị tử chủ trị các bệnh như ho lâu ngày, hư suyễn, mộng tinh, di tinh, hoạt tinh, đái dầm và niệu tan Tuy nhiên, cần kiêng kị khi đang bị cảm sốt cao, lên sởi hoặc sốt phát ban Trong Đông Y Trung Quốc, ngũ vị tử được coi là thuốc bổ thận, thường được sử dụng cho những người mệt nhọc, uể oải và để chữa ho, liệt dương.
Một số bài thuốc có chứa Ngũ vị tử:
Để chữa trị tình trạng thận dương hư di tả, có thể sử dụng bài thuốc gồm Ngũ vị tử 6g, Phá cố chỉ 12g, Nhục đậu khấu và Ngô thù du mỗi vị 4g Các thành phần này cần được tán nhỏ và luyện thành viên hoàn với đại táo và sinh khương Liều dùng là 10g mỗi lần, ngày uống một lần.
Để chữa suy nhược cơ thể do phế hư, bạn có thể sử dụng bài thuốc gồm các vị thuốc sau: Ngũ vị tử 10g, thục địa 12g, tử uyển 12g, tang bạch bi 12g, đảng sâm 10g và hoảng ki 10g Sắc tất cả các vị thuốc này để uống mỗi ngày một thang.
+ Chữa hen suyễn ở người già: Ngũ vị tử 10g; mạch môn 16g; sa sâm; ngưu tất mỗi vị 12g Sắc uống ngày 1 thang [5]
- Tác dụng bảo vệ gan
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh polysaccaride từ các loài thuộc chi
Schisandra trong đó Ngũ vị tử có tác dụng bảo vệ gan [11], [12]
Ngũ vị tử đã được chứng minh có khả năng bảo vệ gan thông qua các thử nghiệm độc tế bào in vitro với CCl4 và D-galactosamin Gormisin A, một lignan chiết xuất từ quả Ngũ vị tử, có tác dụng ức chế sự gia tăng hoạt độ AST (Aspartate aminotransferase) và ALT (Alanine aminotransferase), đồng thời có xu hướng bảo vệ mô tế bào gan.
Năm 2006, Choi Young-Whan và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về ảnh hưởng của polysaccharide từ Ngũ vị tử trên mô hình chuột mắc bệnh viêm gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD) với liều lượng 100 mg/kg/ngày trong 12 tuần Kết quả cho thấy, các chỉ số TG (Triglycerid), TC (Total cholesterol), LDL (Low density lipoprotein cholesterol), ALT và AST lần lượt giảm 31,3%; 28,3%; 42,8%; 20,1% và 15,5%, trong khi HDL (High density lipoprotein cholesterol) trong huyết thanh tăng 26,9%.
Lignans, particularly dibenzocyclooctadiene lignans, have been extensively studied, especially those derived from the fruits of Schisandra chinensis and Schisandra neglecta Key compounds include Deoxyschizandrin, gomisin A, schizandrin C, schisanhenol, and gomisin.
J, and schisandrene dã dược báo cáo cho thấy các đặc tính chống oxy hóa mạnh, làm giảm hoạt độ ALT, AST trong huyết thanh [13]
- Tác dụng trên tuần hoàn
Ngũ vị tử Ngọc Linh có hoạt tính chống đông máu, cho thấy hiệu quả trong các thử nghiệm in vitro Lignan từ Ngũ vị tử có khả năng đối kháng với yếu tố hoạt hóa tiểu cầu, yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong nhiều tác dụng trên cơ thể như hạ huyết áp, cải thiện độ thẩm thấu của mao mạch, điều trị viêm cấp, hen suyễn và loét dạ dày.
Nghiên cứu của Drake và Ephimova (1949, 1954) đã chỉ ra rằng khi tiêm vào mạch máu với liều nhỏ và trung bình (0,2 - 0,5mg/kg thể trọng), thuốc có tác dụng làm tăng cường hệ thống tim mạch ở động vật máu nóng, nâng cao huyết áp và tăng biên độ co bóp của tim.
- Tác dụng trên thần kinh
Nghiên cứu của Ephimova cho thấy ngũ vị tử có tác dụng tích cực đối với khả năng kích thích của hệ thống thần kinh cơ ở người từ 18-54 tuổi Kết quả cho thấy 11 trên 13 người tham gia đã cải thiện khả năng kích thích thần kinh cơ và chức năng hệ thần kinh ngoại vi được tăng cường Liều tối ưu cho người trưởng thành là 5g.
- Tác dụng chống oxy hóa
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các hợp chất polysaccharide trong quả Ngũ vị tử Ngọc Linh có tác dụng chống oxy hóa Bên cạnh đó, các hợp chất polyphenol như flavonoid, acid phenolic và lignan cũng được ghi nhận là có khả năng chống oxy hóa hiệu quả.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra schisandrin B (một chất thuộc nhóm lignan) đóng vai trò thiết yếu trong việc bảo vệ gan, chống oxy hóa và ung thư
- Tác dụng chống ung thư
Polysaccharid từ Ngũ vị tử đã được chứng minh là có khả năng chống lại tế bào ung thư cả trong môi trường sống (in vivo) và trong phòng thí nghiệm (in vitro) Nhiều polysaccharid này có tác dụng điều hòa miễn dịch mà không gây độc tế bào đáng kể.
Tổng quan về xơ gan
Xơ gan (cirrhosis) là bệnh lý mạn tính gây tổn thương lan tỏa ở tiểu thuỷ gan, đặc trưng bởi quá trình xơ hóa (fibrosis) và sự đảo lộn cấu trúc của các tiểu thùy cùng mạch máu trong gan Hình thái học của xơ gan xảy ra do ba quá trình đồng thời hoặc nối tiếp: viêm và hoại tử tế bào nhu mô gan, sự tăng sinh xơ của tổ chức liên kết tạo sẹo, và sự hình thành các hạt tái tạo từ tế bào gan còn nguyên vẹn, dẫn đến sự hình thành các u, cục trong nhu mô gan.
Xơ gan có thể xuất phát từ nhiều nguyên nhân khác nhau, trong đó viêm gan B, C và lạm dụng rượu là những nguyên nhân phổ biến nhất Tại các quốc gia phát triển, phần lớn trường hợp xơ gan thường liên quan đến viêm gan nhiễm mỡ do nghiện rượu hoặc viêm gan.
C Tổn thương ống mật cũng có thể gây xơ gan như tắc nghẽn ống mật cơ học, xơ hóa đường mật nguyên phát Bên cạnh đó, nhiều trường hợp xơ gan không rõ nguyên nhân, có thể do các bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu gây ra
Ngoài các nguyên nhân phổ biến, xơ gan còn có thể do viêm gan tự miễn, các bệnh di truyền như xơ hóa nang và thiếu alpha-1 antitrypsin Ngoài ra, việc tiếp xúc với thuốc, chất độc và hóa chất như methotrexat và isoniazid, cũng như nhiễm kí sinh trùng như sán máng và sán lá gan, cũng góp phần vào sự phát triển của xơ gan Cuối cùng, các rối loạn chuyển hóa như rối loạn chuyển hóa đồng và nhiễm sắc tổ sắt cũng là những yếu tố quan trọng cần lưu ý.
Xơ hóa gan là một quá trình liên quan đến sự thay đổi đáng kể về số lượng và thành phần của cấu trúc nền ECM (Extracellular Matrix) Trong giai đoạn tiến triển, lượng ECM trong gan tăng gấp 6 lần so với bình thường, bao gồm collagen (typ I, II và IV), fibronectin, undulin, elastin, laminin, hyaluronan và proteoglycan ECM được sản xuất chủ yếu bởi tế bào hình sao (HSC) trong mô gan tổn thương, cùng với sự đóng góp từ một số loại tế bào trung mô khác nhau.
Trong gan bình thường, các tế bào hình sao cư trú ở khoang Disse và dự trữ vitamin A Tuy nhiên, sau tổn thương mạn tính, các tế bào hình sao này được kích hoạt và chuyển đổi thành nguyên bào sợi cơ (MFB) Các MFB, được hình thành từ quá trình chuyên dạng biểu mô-trung mô và có nguồn gốc từ tủy xương, di chuyển đến các vùng mô cần sửa chữa, tiết ra collagen và chất nền ngoại bào, dẫn đến xơ hóa gan.
Hoạt hóa tế bào hình sao đóng vai trò quan trọng trong xơ hóa gan, được kích hoạt bởi nhiều yếu tố như cytokine, đặc biệt là TGF-B, yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu, và các gốc oxy hoạt động (ROS) Quá trình này diễn ra qua hai giai đoạn chính: giai đoạn khởi đầu (hay còn gọi là giai đoạn tiền viêm) và giai đoạn duy trì.
Trong giai đoạn khởi đầu, tế bào hình sao có thể bị kích thích bởi các tế bào lân cận như tế bào nội mô, tế bào Kupffer, tế bào gan và tiểu cầu Tế bào nội mô tham gia vào việc chuyển đổi yếu tố tăng trưởng TGF-0 sang dạng hoạt hóa, góp phần gây xơ hóa Tiểu cầu cũng cung cấp các yếu tố tăng trưởng như PDGF, TGF-B1 và yếu tố tăng trưởng biểu bì, đóng vai trò quan trọng trong quá trình này Tế bào Kupffer kích thích hoạt hóa tế bào hình sao, tăng tổng hợp chất nền và giải phóng retinoid thông qua hoạt động của cytokin và các gốc oxy hoạt động Khi tế bào gan bị phá hủy, chúng giải phóng các gốc oxy và chất trung gian gây xơ, kích thích hoạt hóa HSC và hoạt tính gây xơ hóa của nguyên bào sợi cơ Giai đoạn duy trì có ít nhất 7 thay đổi quan trọng: (1) tăng sinh, (2) hóa ứng động, (3) gây xơ hóa.
Sự co bóp và thoái biến chất nền, cùng với việc mất retinoid, hóa hướng động bạch cầu và giải phóng cytokine, đều góp phần làm tăng lắng đọng chất nền ngoại bào Những thay đổi này dẫn đến hình thành và tiến triển xơ gan.
Dựa vào triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng
Xơ gan là giai đoạn cuối cùng của các bệnh gan mạn tính, bắt đầu với giai đoạn xơ gan còn bù không có triệu chứng Sau đó, bệnh tiến triển nhanh chóng, dẫn đến giai đoạn xơ gan mất bù, nơi xuất hiện các biến chứng của TALTMC và suy chức năng gan.
Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân xơ gan còn bù thường không rõ ràng và không đặc hiệu, bao gồm mệt mỏi, chán ăn, khó tiêu, và đau tức hạ sườn phải thoáng qua Mặc dù bệnh nhân vẫn có khả năng làm việc bình thường, nhưng điều này dẫn đến việc họ ít khi đi khám để được chẩn đoán sớm Khi khám kỹ, có thể nhận thấy da và niêm mạc có màu vàng nhạt, xuất hiện sao mạch ở cổ, ngực, và lòng bàn tay có màu son, cùng với gan to và chắc.
Xơ gan còn bù có thể kéo dài nhiều năm mà bệnh nhân vẫn có thể sinh hoạt và làm việc bình thường Tuy nhiên, khi bệnh tiến triển, áp lực tĩnh mạch cửa tăng và chức năng gan suy giảm, dẫn đến các biến chứng như cổ trướng, chảy máu tiêu hóa, bệnh não gan và vàng da Sự xuất hiện của bất kỳ biến chứng nào trong số này là dấu hiệu cho thấy xơ gan đã chuyển từ giai đoạn còn bù sang giai đoạn mất bù Do đó, xơ gan mất bù thường có biểu hiện lâm sàng nặng nề với ba hội chứng chính: suy tế bào gan, tăng áp lực tĩnh mạch cửa và thay đổi hình thái gan.
Hội chứng suy tế bào gan:
Sức khỏe bệnh nhân suy giảm, với triệu chứng cơ bắp teo nhẽo, mệt mỏi thường xuyên và thậm chí có cơn mệt lả Khả năng lao động trí óc và thể chất giảm sút, dẫn đến giảm khả năng tập trung tư tưởng.
Rối loạn tiêu hóa thường biểu hiện qua cảm giác sợ ăn, đầy bụng chướng hơi và khó tiêu, đặc biệt là khi tiêu thụ thực phẩm nhiều mỡ Ngoài ra, tình trạng này còn đi kèm với việc đại tiện phân lỏng, nát nhiều lần.
+ Giảm khả năng tình dục: nam giới ham muốn tình dục giảm, thậm chí liệt dương, tinh hoàn teo nhỏ, phụ nữ rối loạn kinh nguyệt hoặc mất kinh
Niêm mạc thường có màu vàng với nhiều mức độ khác nhau, có thể xuất hiện màu xám, kèm theo nhiều đám xuất huyết dưới da và hiện tượng sao mạch Bàn tay có thể có màu son, trong khi hai chi dưới thường bị phù mềm, trong khi nửa trên cơ thể lại gầy gò.
Hội chứng tăng áp lực tĩnh mạch cửa:
+ Cổ trưởng tự do ở các mức độ khác nhau
+ Tuần hoàn bàng hệ cửa – chủ
Mô hình gây xơ gan và đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên thực nghiệm
Các mô hình gây xơ gan trên động vật đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ để nghiên cứu xơ hóa gan và tác dụng của các tác nhân chống xơ hóa Những mô hình này rất quan trọng trong việc hiểu biết về cơ chế bệnh sinh và phát triển các liệu pháp điều trị xơ gan Đến nay, nhiều mô hình xơ gan đã được xây dựng trên các loài như chuột, chuột cống, thỏ và lợn, nhằm mô phỏng quá trình xơ hóa và xơ gan ở người Bài viết này sẽ đề cập đến một số mô hình gây xơ hóa gan thường được áp dụng trên động vật thực nghiệm.
1.3.1 Gây xơ gan bằng các tác nhân hóa học
Các tác nhân hóa học như CCl4, thioacetamid, dimethylnitrosamin, diethylnitrosamin, dioxin, natri asenat và ethanol thường gây tổn thương trực tiếp đến tế bào gan, dẫn đến hoại tử và kích hoạt phản ứng viêm Những tác nhân này kích thích một loạt quá trình phức tạp, góp phần vào sự phát triển của xơ hóa và xơ gan.
Nhóm mô hình này rất phổ biến do độ lặp lại cao, nhưng khó kiểm soát khi tác nhân gây xơ hóa được đưa vào tự do qua thức ăn hoặc nước uống Quá trình hấp thu và chuyển hóa các tác nhân này cũng bị ảnh hưởng Sử dụng các tác nhân hóa học khác nhau sẽ tạo ra sự khác biệt về thời gian gây xơ hóa, thời gian phát triển thành xơ gan và vị trí tổn thương điển hình của từng mô hình.
1.3.1.1 Gây xơ gan bằng carbon tetraclorid
Carbon tetrachlorid (CCl4) là một chất gây xơ hóa phổ biến, thường được sử dụng trong các nghiên cứu về xơ gan trên động vật gặm nhấm Chất này cũng là mô hình chính trong đề tài nghiên cứu.
Mô hình gây xơ gan bằng carbon tetraclorid (CCl4) tương tự như quá trình hình thành xơ gan do tiếp xúc với các tác nhân độc hại ở người Trong cơ thể, CCl4 được chuyển hóa thành gốc tự do •CCl3 nhờ hệ thống enzym CYP450 (CYP2E1), và gốc •CCl3 này sẽ phản ứng với các acid, góp phần vào sự phát triển của xơ gan.
Quá trình peroxy hóa lipid diễn ra khi các gốc tự do như •CCl3 và •OOCCl3 tấn công các acid béo không no, dẫn đến rối loạn chức năng tế bào và giảm tổng hợp protein Sự tấn công này có thể gây hoại tử tế bào gan tại trung tâm tiểu thủy, kích hoạt phản ứng làm lành vết thương của cơ thể, bao gồm sự tăng sinh của các tế bào nhu mô và phi nhu mô để thay thế tế bào hoại tử, cùng với sự tham gia của tế bào thực bào và tế bào miễn dịch Tuy nhiên, nếu tổn thương gan tiếp tục kéo dài, quá trình tái sinh không đủ để phục hồi, dẫn đến sự tích tụ xơ hóa do các tế bào gan bị thay thế bởi chất nền ngoại bào, chủ yếu là collagen.
CCl4 thường gây xơ hóa rõ rệt sau 2-4 tuần phơi nhiễm, với xơ hóa nghiêm trọng xuất hiện sau 5-7 tuần và xơ gan sau 8-10 tuần Xơ gan nốt nhỏ, tăng áp lực tĩnh mạch cửa và cổ trướng thường xảy ra sau 10-20 tuần Thời gian hình thành xơ hóa và tiến triển thành xơ gan phụ thuộc vào liều lượng, đường dùng và loại động vật thí nghiệm Tiêm màng bụng là phương pháp phổ biến nhờ tính thuận tiện và dung nạp tốt, nhưng có thể gây viêm phúc mạc mạn tính Đường uống được tranh luận về hiệu quả, với một số tác giả cho rằng có tỉ lệ lặp lại xơ hóa cao, trong khi những người khác lo ngại về tỉ lệ tử vong cao Tiêm dưới da giúp giảm tỉ lệ tử vong nhưng có thể gây u hạt tại chỗ Ngoài ra, đường hít cũng được sử dụng để gây xơ hóa gan, với ưu điểm không xâm lấn và không gây phản ứng viêm tại chỗ.
Tiêm dưới da và tiêm màng bụng là hai phương pháp quan trọng trong y học, nhưng để thực hiện chúng, cần có dụng cụ chuyên biệt và kinh nghiệm nhất định.
Để tăng độc tính của CCl4, một số nghiên cứu đã sử dụng CCl4 kết hợp với chất cảm ứng enzym CYP2E1 bằng cách thêm phenobarbital vào nước uống Enzym CYP2E1 được cảm ứng giúp tăng tốc độ hình thành xơ hóa, rút ngắn thời gian mô hình Tuy nhiên, phương pháp này cũng làm tăng tỷ lệ tử vong ở động vật Mặc dù tổn thương ngoài gan là tối thiểu do CYP2E1 chủ yếu tồn tại trong gan, tình trạng viêm và hoại tử vẫn có thể xảy ra tại vị trí tiêm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của động vật thí nghiệm.
Thời gian giữa liều CCl4 cuối cùng và việc giết động vật thí nghiệm để lấy mẫu nghiên cứu là yếu tố quan trọng Nếu giết chuột quá sớm, viêm và hoại tử sẽ chiếm ưu thế, trong khi nếu quá muộn (sau 3 ngày), quá trình phục hồi sẽ trở thành chủ đạo Do đó, khoảng thời gian 48 đến 72 giờ sau liều CCl4 cuối cùng được coi là thời điểm tối ưu để tiến hành thu mẫu xét nghiệm.
1.3.2 Gây xơ gan bằng phương pháp thắt ống dẫn một
Mô hình gãy xơ hóa gan và xơ gan đã được nghiên cứu lần đầu tiên trên chuột cống trắng bằng phương pháp thắt ống dẫn mặt vào năm 1996 bởi Rodríguez-Garay và cộng sự Đến năm 1999, mô hình này được áp dụng cho chuột nhắt trắng bởi Miyoshi H và cộng sự Chuột cống trắng được xem là đối tượng lý tưởng cho mô hình này do cơ thể chúng không có túi mật.
Khi thắt ống dẫn mật, các biến chứng như tắc nghẽn ống mật, viêm, tăng tiết cytokine và ứ mật xảy ra, dẫn đến tăng áp lực đường mật Sự tăng sinh tế bào biểu mô đường mật diễn ra, gây ra sự phát triển tiểu quản mặt và kèm theo viêm, xơ hóa ở khoảng cửa Ngoài tế bào hình sao, nguyên bào sợi ở khoảng cửa cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình xơ hóa trong mô hình này.
Mô hình thất ống dẫn mật cho thấy xơ hóa phát triển sau vài tuần, với rối loạn huyết động và cổ trướng thường xuất hiện sau 6-8 tuần Nguyên nhân tử vong trong giai đoạn đầu thường liên quan đến rò rỉ mật, vỡ u nang ống mặt hoặc túi mặt ở chuột nhắt trắng Mặc dù tỉ lệ tử vong cao (>20% và thường xảy ra sau tuần thứ 4) là một hạn chế lớn, mô hình này vẫn có giá trị trong các nghiên cứu ngắn hạn về xơ gan do ứ mật.
1.3.3 Gây xơ gan bằng phương pháp miễn dịch
Gây xơ gan bằng huyết thanh dị chủng
Các kháng nguyên phổ biến bao gồm huyết thanh lợn và ngựa, albumin lòng trắng trứng, gamma globulin người và globulin huyết thanh lợn Trong số đó, tiêm phúc mạc huyết thanh lợn được coi là phương pháp hiệu quả nhất.
Khi tiêm huyết thanh dị chủng dưới da (thường 2 lần/tuần), xơ hóa phát triển sau 5 tuần và có thể tiến triển thành xơ gan sau khoảng 10 tuần, với mức độ xơ hóa phụ thuộc vào chủng động vật thí nghiệm Về mặt mô bệnh học, sự thay đổi được đặc trưng bởi thâm nhiễm bạch cầu đơn nhân, tăng sinh xơ ở khoảng cửa, và hình thành các vách ngăn nối giữa khoảng cửa và các tĩnh mạch trung tâm Trong mô hình này, viêm là tổn thương nổi bật với sự xâm nhập của bạch cầu ái toan và tế bào mast vào nhu mô gan Mô hình này thường được sử dụng để nghiên cứu vai trò của các đại thực bào, tế bào hình sao và các nguyên bào sợi trong quá trình xơ hóa gan.
Gây xơ gan bằng cách tiêm dưới da ấu trùng sán máng (Schistosomis mansoni)
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Viên nang Ngũ vị tử (NVT) là sản phẩm được bào chế từ cao chiết giàu lignan, cung cấp bởi khoa Hóa phân tích của Viện Dược liệu.
Phương tiện nghiên cứu
Chuột cống trắng chủng Wistar, khỏe mạnh và đạt tiêu chuẩn thí nghiệm với trọng lượng từ 150 – 170 gram, được cung cấp bởi Ban Chăn nuôi, Học Viện Quân y 103 Thức ăn tiêu chuẩn cho chuột được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương Trong suốt 7 ngày trước khi nghiên cứu và trong thời gian thực nghiệm, chuột được chăm sóc trong môi trường phòng thí nghiệm với nhiệt độ ổn định 22 ± 1 o C, chế độ ăn uống đầy đủ và chu kỳ sáng tối 12h/12h (sáng từ 7:00 – 19:00).
2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
Máy định lượng sinh hóa Humalyser 2000 của Human (Đức)
Máy ly tâm Mikro 22 R của hãng Hettich (Đức)
Máy ly tâm Allegra-X-15R Centriguge (BECKMAN COULTER)
Máy nghiền đồng thể Tissulyser II (Đức)
Máy li tâm labofuge 400 (Đức)
Máy dọc Elisa HumanReader HS (Human)
Máy đo quang phổ UV mini 1240 (Shimadzu)
Bếp cách thủy GFL (Đức)
Dụng cụ cần thiết cho các thí nghiệm trong lĩnh vực Dược lý, Hóa sinh và Hóa phân tích bao gồm kim cong đầu tày, kim tiêm 1m cùng với các dụng cụ thông thường khác từ bộ môn Tiêu chuẩn của Viện Dược liệu.
Các hóa chất albumin; Cholesterol, Creatinin, LDL; SGOT; SGPT; Các bộ KIT định lượng; Triglycerid; Urea chuẩn
Cell Pack phục vụ các xét nghiệm sinh hóa, huyết học.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Đánh giá tác dụng chống xơ gan của viên nang Ngũ vị tử trên thực nghiệm
- Chuẩn bị mẫu nghiên cứu:
Cao NVT với các mức liều 121 mg/kg, 242 mg/kg và 363 mg/kg được pha trong dung dịch CMC 0,5% Silymarin được pha trong CMC 0,5% với mức liều
110 mg/kg Chuột được uống với thể tích là 1 mL/100 gram
Chuột cống trắng Wistar nặng từ 150 – 170 gram được sử dụng để tạo mô hình xơ gan thông qua việc tiêm phúc mạc carbon tetraclorid (CCl4) 30% pha trong dầu olive với liều 0,2 ml/100 gram chuột, thực hiện 2 lần mỗi tuần trong 12 tuần Mẫu nghiên cứu và thuốc tham chiếu Silymarin được cho uống hàng ngày vào lúc 9:00, bắt đầu từ tuần thứ 5 sau khi tiêm CCl4 và kéo dài cho đến khi kết thúc thí nghiệm.
Chuột cống trắng được chia thành 6 lô:
+ Lô sinh lý: chuột được uống CMC 0,5% (dung môi pha mẫu nghiên cứu)
Trong nghiên cứu này, chuột được tiêm CCl4 hai lần mỗi tuần trong vòng 12 tuần Bắt đầu từ tuần thứ 5 sau khi tiêm CCl4, chuột được cho uống CMC 0,5% và tiếp tục cho đến khi kết thúc thí nghiệm.
Chuột trong thí nghiệm được tiêm CCl4 hai lần mỗi tuần trong vòng 12 tuần Từ tuần thứ 5, chúng được uống silymarin với liều 110 mg/kg và tiếp tục cho đến khi kết thúc thí nghiệm.
+ Lô điều trị NVT liều 121 mg/kg: chuột được tiêm CCl4 2 lần/ tuần, trong
12 và được uống NVT liều 121 mg/kg, bắt đầu từ tuần thứ 5 sau khi tiêm CCl4 và liên tục cho đến khi kết thúc thí nghiệm
+ Lô điều trị NVT liều 242 mg/kg: chuột được tiêm CCl4 2 lần/ tuần, trong
12 và được uống NVT liều 242 mg/kg, bắt đầu từ tuần thứ 5 sau khi tiêm CCl4 và liên tục cho đến khi kết thúc thí nghiệm
+ Lô điều trị NVT liều 363 mg/kg: chuột được tiêm CCl4 2 lần/ tuần, trong
12 và được uống NVT liều 363 mg/kg, bắt đầu từ tuần thứ 5 sau khi tiêm CCl4 và liên tục cho đến khi kết thúc thí nghiệm
* Các chỉ tiêu đánh giá
- Tình trạng chung, thể trọng của chuột: Trọng lượng chuột được theo dõi trước nghiên cứu và sau nghiên cứu
- Đánh giá số lượng sống/ chết: sau khi điều trị theo thời gian
- Xét nghiệm huyết học và sinh hoá:
Huyết học đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá sức khỏe, bao gồm số lượng bạch cầu, số lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố Những chỉ số này giúp xác định mức độ tổn thương gan và chức năng gan thông qua các hội chứng liên quan.
+ Hội chứng hủy hoại tế bào gan thông qua định lượng hoạt độ các enzym trong máu: ALT, AST
+ Hội chứng ứ mật thông qua định lượng bilirubin toàn phần
+ Hội chứng suy tế bào gan thông qua định lượng albumin và cholesterol toàn phần
- Mô bệnh học: Hình ảnh vi thể gan chuột; phân tích hình ảnh mô bệnh học tổn thương gan sau khi uống viên nang Ngũ vị tử
2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp t - test Student
Số liệu được biểu diễn dưới dạng : MEAN + SD
Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả đánh giá tác dụng điều trị xơ của viên nang Ngũ vị tử trên thực nghiệm
3.1.1 Ảnh hưởng của viên nang Ngũ vị tử đến chỉ số trọng lượng của chuột và trọng lượng gan
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của Viên nang Ngũ vị tử đối với trọng lượng cơ thể chuột
Lô Tên lô n Trọng lượng chuột trước khi điều trị (gram)
Trọng lượng chuột sau khi điều trị (gram)
3 Lô điều trị NVT (121 mg/kg) 8 177,8 ± 9,9 283,9 ± 27,0
4 Lô điều trị NVT (242 mg/kg) 7 183,1 ± 10,3 269,0 ± 16,8
5 Lô điều trị NVT (liều 363 mg/kg) 8 188,4 ± 5,2 275,0 ± 15,2
6 Lô điều trị Silymarin (110 mg/kg) 7 191,9 ± 5,6 289,1 ± 20,2
Nhận xét: Kết quả bảng 3.1 cho thấy:
Sau 12 tuần điều trị, trọng lượng của chuột ở cả 4 nhóm điều trị (bao gồm NVT và silymarin) cùng với nhóm chứng bệnh lý đều có sự gia tăng so với mức trước điều trị, với p < 0,05 cho thấy kết quả đạt ý nghĩa thống kê.
- Không có sự khác biệt về trọng lượng chuột ở 3 lô điều trị bằng NVT và lô điều trị bằng silymarin so với lô chứng bệnh lý (p > 0,05)
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của NVT đến trọng lượng tương đối của gan chuột trên mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng CCl 4
Lô Tên lô n Trọng lượng tương đối của gan chuột (g/100 gram thể trọng)
3 Lô điều trị NVT (121 mg/kg) 8 3,8 ± 0,2 #
4 Lô điều trị NVT (242 mg/kg) 7 4,3 ± 0,2 #
5 Lô điều trị NVT (liều 363 mg/kg) 8 4,3 ± 0,1 #
6 Lô điều trị Silymarin (110 mg/kg) 7 3,6 ± 0,1* #
Ghi chú: *p < 0,05 so với lô chứng bệnh lý; # p < 0,05 so với lô chứng sinh lý
Nhận xét: Kết quả bảng 3.2 cho thấy
Trọng lượng gan chuột trong lô chứng bệnh lý và các lô điều trị bằng NVT sau khi gây độc bằng CCL4 đều tăng đáng kể so với lô chứng sinh lý (p < 0.05).
Trọng lượng tương đối của gan chuột trong nhóm điều trị bằng silymarin sau khi gây độc bằng CCL4 đã tăng lên so với nhóm chứng sinh lý, tuy nhiên sự khác biệt này không đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Trọng lượng gan chuột ở nhóm điều trị bằng silymarin 110 mg/kg giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng bệnh lý (p < 0,05) Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm này và ba nhóm điều trị NVT (p > 0,05).
Liều điều trị NVT 121 mg/kg dẫn đến trọng lượng gan của chuột nhỏ hơn so với lô chứng bệnh lý, tuy nhiên, sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê.
Hình ảnh đại thể gan
Hình 3.1 Cấu trúc đại thể gan thuộc các nhóm
A Nhóm sinh lý D Nhóm điều trị NVT 121 mg/kg
B Nhóm chứng bệnh lý E Nhóm điều trị NVT 242 mg/kg
C Nhóm điều trị silymarin F Nhóm điều trị NVT 363 mg/kg
Cấu trúc đại thể của gan trong bệnh lý mất đi sự nhẵn bóng thường xuất hiện với các nốt nhỏ li ti, sần sùi và màu gan nhạt Trong các nhóm điều trị, gan có màu bóng hơn và ít thấy các nốt, cho thấy sự cải thiện trong tình trạng gan.
3.1.2 Ảnh hưởng của viên nang Ngũ vị tử đến các chỉ số sinh hóa máu
3.1.1.1 Kết quả đo hoạt độ AST
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của NVT lên hoạt độ AST trong huyết thanh chuột
% ức chế so với lô chứng bệnh lý
3 Lô điều trị NVT (121 mg/kg) 8 211,4 ± 23,4 42,3
4 Lô điều trị NVT (242 mg/kg) 7 191,9 ± 14,9* 47,7
5 Lô điều trị NVT (liều 363 mg/kg) 8 151,4 ± 27,7* 58,7
6 Lô điều trị Silymarin (110 mg/kg) 7 165,0 ± 12,4* 55,0
Ghi chú: *p < 0,05 so với lô chứng bệnh lý
Nhận xét: Kết quả bảng 3.3 cho thấy
- Hoạt độ AST ở lô chứng bệnh lý xơ gan gây bởi CCl4 tăng cao rõ rệt so với lô chứng sinh lý (xấp xỉ 3 lần) (p < 0,05)
Viên nang Ngũ vị tử liều 121 mg/kg đã được sử dụng để điều trị chuột, dẫn đến sự giảm 42,3% hoạt độ AST so với nhóm chứng bệnh lý; tuy nhiên, sự khác biệt này không đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Viên nang Ngũ vị tử với liều 242 mg/kg đã cho thấy hiệu quả trong việc giảm hoạt độ AST ở chuột, với mức giảm đạt 47,7% so với nhóm chứng bệnh lý, và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Viên nang Ngũ vị tử với liều 363 mg/kg đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc giảm hoạt độ AST ở chuột, với mức giảm đạt 58,7% so với nhóm chứng bệnh lý, có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Chuột được điều trị bằng silymarin với liều 110 mg/kg cho thấy sự giảm đáng kể hoạt độ AST, giảm 50,0% so với nhóm chứng bệnh lý, với ý nghĩa thống kê p < 0,05.
3.1.1.2 Kết quả đo hoạt độ ALT
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của NVT lên hoạt độ ALT trong huyết thanh chuột
% ức chế so với lô chứng bệnh lý
3 Lô điều trị NVT (121 mg/kg) 8 152,3 ± 29,8 48,8
4 Lô điều trị NVT (242 mg/kg) 7 90,9 ± 7,1* 69,3
5 Lô điều trị NVT (liều 363 mg/kg) 8 92,3 ± 31,2* 68,9
6 Lô điều trị Silymarin (110 mg/kg) 7 97,7 ± 17,4* 67,2
Ghi chú: *p < 0,05 so với lô chứng bệnh lý
Nhận xét: Kết quả bảng 3.4 cho thấy
- Hoạt độ ALT ở lô chứng bệnh lý (gây độc bằng CCl4) tăng cao rõ rệt so với lô chứng sinh lý (xấp xỉ 6 lần) (p < 0,05)
Viên nang Ngũ vị tử với liều 121 mg/kg đã được sử dụng để điều trị chuột, cho thấy sự giảm 48,8% hoạt độ ALT so với nhóm chứng bệnh lý, tuy nhiên sự khác biệt này không đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Việc điều trị chuột bằng viên nang Ngũ vị tử với liều 242 mg/kg đã cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc giảm hoạt động ALT, với mức giảm lên tới 69,3% Kết quả này có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng bệnh lý (p < 0,05).
Việc điều trị chuột bằng viên nang Ngũ vị tử với liều 363 mg/kg đã dẫn đến sự giảm đáng kể hoạt độ ALT, cụ thể là giảm 68,9%, và kết quả này có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng bệnh lý (p < 0,05).
- Chuột được điều trị bằng silymarin làm giảm rõ rệt hoạt độ ALT (giảm 67,2%) đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý (p < 0,05)
3.1.1.3 Các chỉ số sinh hóa máu khác
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của NVT lên chỉ số albumin huyết thanh và protein toàn phần gan
Lô Tên lô n Albumin huyết thanh (g/L)
3 Lô điều trị NVT (121 mg/kg) 8 27,6 ± 1,2* 55,5 ± 3,9
4 Lô điều trị NVT (242 mg/kg) 7 30,1 ± 0,5* 55,8 ± 1,8
5 Lô điều trị NVT (liều 363 mg/kg) 8 28,0 ± 0,4* 65,6 ± 3,0 #
6 Lô điều trị Silymarin (110 mg/kg) 7 27,4 ± 0,5* 58,6 ± 3,1 #
(Chú thích: # p < 0,05 so với lô chứng bệnh lý; *p < 0,05 so với lô chứng sinh lý)
Nhận xét: Từ bảng 3.5 ta thấy
Nồng độ albumin trong huyết thanh của chuột ở nhóm chứng bệnh lý và các nhóm điều trị đều giảm đáng kể so với nhóm chứng sinh lý (p < 0,05) Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về nồng độ albumin trong huyết thanh giữa các nhóm điều trị bằng NVT ở cả ba mức liều và silymarin (liều 110 mg/kg) so với nhóm chứng bệnh lý.
Nồng độ albumin trong gan chuột ở lô chứng bệnh lý giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với lô chứng sinh lý Cả cao NVT và silymarin đều có tác dụng phục hồi mức độ albumin giảm trong gan chuột xơ gan, đạt ý nghĩa thống kê ở liều 363 mg/kg NVT và 110 mg/kg silymarin (p < 0,05).
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của NVT lên chỉ cholesterol, bilirubin và triglyceride
3 Lô điều trị NVT (121 mg/kg) 8 39,9 ± 2,6 8,9 ± 0,2 # 106,8 ± 13,6
4 Lô điều trị NVT (242 mg/kg) 7 48,7 ± 3,7 8,7 ± 0,5 # 100,1 ± 13,5
5 Lô điều trị NVT (liều 363 mg/kg) 8 34,0 ± 2,0* 8,7 ± 0,4 # 91,8 ± 15,0
6 Lô điều trị Silymarin (110 mg/kg) 7 40,3 ± 3,0 8,7 ± 0,5 # 89,8 ± 6,5
(Chú thích: # p < 0,05 so với lô chứng sinh lý; *p < 0,05 so với lô chứng bệnh lý)
Nhận xét: Từ bảng 3.6 ta thấy
- Nồng độ cholesterol, triglycerid, và bilirubin huyết thanh chuột ở lô chứng bệnh lý tăng rõ rệt so với lô chứng sinh lý, đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
- Tuy nhiên, chỉ có liều 363 mg/kg NVT là có tác dụng làm giảm rõ rệt nồng độ cholesterol huyết thanh so với lô chứng bệnh lý (p < 0,05)
Tác dụng điều trị bệnh xơ gan của viên nang Ngũ vị tử trên thực nghiệm
4.1.1 Bàn luận về mô hình nghiên cứu
Mô hình gây xơ gan trên thực nghiệm đã được nghiên cứu rộng rãi cả trong nước và quốc tế, với nhiều phương pháp như sử dụng ethanol, carbon tetrachlorid, thiocetamid, dimethylnitrosamin, chế độ ăn thiếu methionin cholin, chế độ ăn giàu chất béo, thắt ống dẫn mật, và gây xơ hóa gan bằng virus viêm gan Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn mô hình xơ gan bằng carbon tetrachlorid (CCl4) trên chuột để đánh giá tác dụng chống xơ gan của Ngũ vị tử Ngọc Linh, do CCl4 là chất gây độc phổ biến trong các nghiên cứu về xơ hóa gan và có tính tương đồng với xơ gan do nhiễm độc gan mạn tính ở người.
CCl4 trong cơ thể chủ yếu được chuyển hóa qua CYP2E1 thành gốc tự do tricloromethyl (CCl3*), dẫn đến hoại tử tế bào gan thông qua haloalkyl hóa và peroxy hóa lipid Gốc tự do này kích hoạt tế bào Kupffer sản sinh các chất gây viêm như leukotriene, interleukin, TNF-α, và TGF-β Sự kết hợp giữa TGF-β và hoại tử tế bào gan liên tục do CCl3* gây ra kích thích hoạt hóa tế bào hình sao trong gan (HSCs), dẫn đến sự hình thành mô sợi và xơ hóa gan Mô hình gây xơ gan bằng CCl4 có thể thực hiện trên chuột cống trắng và chuột nhắt trắng.
CCl4 có thể được sử dụng qua các phương pháp tiêm dưới da, đường uống và tiêm phúc mạc màng bụng Trong đó, tiêm phúc mạc màng bụng là phương pháp phổ biến nhất nhờ vào những lợi ích như tỷ lệ chuột chết thấp và khả năng gây xơ gan rõ ràng Do đó, chúng tôi đã chọn phương pháp tiêm phúc mạc màng bụng CCl4 cho nghiên cứu này.