Khóa luận tổng hợp pha rắn, đánh giá tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và gây tan máu của peptid mastoparan c có nguồn gốc từ nọc ong vespa crabro

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  TRẦN THỊ KHÁNH HUYỀN TỔNG HỢP PHA RẮN, ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM VÀ GÂY TAN MÁU CỦA PEPTID MASTOPARAN C CÓ NGUỒN GỐC TỪ NỌC ONG VESPA CRABRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC - - TRẦN THỊ KHÁNH HUYỀN TỔNG HỢP PHA RẮN, ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM VÀ GÂY TAN MÁU CỦA PEPTID MASTOPARAN C CÓ NGUỒN GỐC TỪ NỌC ONG VESPA CRABRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) KHÓA: QH.2018.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH TS LƯƠNG XUÂN HUY Hà Nội – 2023 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Thanh Bình, TS Lương Xuân Huy Ths Bùi Thị Phương Hải, người tận tâm hướng dẫn, hết lòng bảo giúp đỡ em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành đề tài khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc đến giảng viên thuộc Bộ mơn Hóa Dược, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội (ĐHQGHN) thầy cô khoa Dược trường Đại học Phenikaa giúp đỡ em nhiều q trình thực hồn thành đề tài Em xin gửi lời tri ân sâu sắc đến tập thể quý thầy cô Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN Giám hiệu Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em năm học qua, tạo điều kiện tốt cho em suốt thời gian học tập trường Bên cạnh đó, em muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè người thân yêu ủng hộ, động viên giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Hội đồng đánh giá đóng góp ý kiến, giúp em hồn thiện khóa luận Em cảm kích trân trọng giúp đỡ Quý thầy cô! Nghiên cứu tiến hành khuôn khổ đề tài QG.22.67 “Tổng hợp pha rắn, đánh giá tác dụng kháng khuẩn độ bền enzyme tiêu hóa số peptid cải tiến từ Mastoparan C” Đại học Quốc gia Hà Nội Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2023 Sinh viên Trần Thị Khánh Huyền DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AMP Antimicrobial peptides Peptid kháng khuẩn B.subtilis Bacillus subtilis Bacillus subtilis Boc tert-butoxycarbonyl tert-butoxycarbonyl C.albicans Candida albicans Candida albicans CD Circular Dichroism Quang phổ lưỡng sắc tròn COMU 1-[(1-(Cyano-2-ethoxy-2 oxoethylideneaminooxy) dimethylaminomorpholino)] uronium hexafluorophosphate 1-[(1-(Cyano-2-ethoxy-2 oxoethylideneaminooxy) dimethylaminomorpholino)] uronium hexafluorophosphat DAD Diode Array Detector Đầu dò mảng Diode DCM Dichloromethane Dichloromethan DIPEA N,N-Diisopropylethylamine N,N-Diisopropylethylamin DMF Dimethylformamide Dimethylformamid E.coli Escherichia coli Escherichia coli Fmoc Fluoren-9 ylmethyloxycarbonyl Fluoren-9ylmethyloxycarbonyl HPLC High-performance liquid chromatography Sắc kí lỏng hiệu cao K.pneumonia Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia LC-MS m/z Liquid chromatography–mass spectrometry Mass to charge Sắc ký lỏng ghép khối phổ Khối lượng điện tích MBC Minimum bactericidal concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBEC Minimum biofilm eradication concentration Nồng độ loại bỏ biofilm tối thiểu MBHA 4-methylbenzhydrylamine 4-methylbenzhydrylamin Minimum biofilm inhibitory Nồng độ ức chế biofilm tối concentration thiểu MIC Minimal inhibitory concentration Nồng độ kìm khuẩn tối thiểu MP-C Mastoparan C Mastoparan C P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa S.aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus SDS Natri dodecyl sulfate Natri dodecyl sulfat SPPS Peptid Solid Phase Synthesis Tổng hợp peptid pha rắn TFA Trifluoroaceticacid Trifluoroaceticacid TIS Triisopropylsilane Triisopropylsilan PBS Phosphate-buffered saline Đệm phosphat MBIC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMINO ACID Chữ viết tắt Tên viết tắt Tên Tiếng anh A Ala Alanine I Ile Isoleucine K Lys Lysine L Leu Leucine N Asn Asparagine V Val Valine DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng biofilm Mastoparan C số chủng vi sinh vật 12 Bảng 1.2 MIC Melitin Mastoparan M chủng Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans 13 Bảng 1.3 Nồng độ ức chế 50% Mastoparan C số dòng tế bào ung thư .14 Bảng 3.1 Nguyên liệu tổng hợp Mastoparan C .26 Bảng 3.2 Ba bước lặp lại nhiều lần tổng hợp Mastoparan C .27 Bảng 3.3 Chương trình tinh chế peptid sắc kí lỏng hiệu cao ghép đàu dò mảng Diode 30 Bảng 3.4 Chương trình phân tích peptid sắc kí lỏng khối phổ 32 Bảng 3.5 So sánh giá trị m/z thực nghiệm lý thuyết Mastoparan C 33 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng sinh Mastoparan C số chủng vi sinh vật 34 Bảng 4.1 Các peptid thiết kế thông số peptid 37 Bảng 4.2 MIC Mastoparan C, peptid dẫn xuất Mastoparan C số kháng sinh chủng vi gram dương ( Staphylococcus aureus Bacillus subtilis) gram âm( Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumonia) 40 Bảng 4.3 Giá trị GM, MHC TI Mastoparan C peptid dẫn xuất Mastoparan C 43 Bảng 4.4 Hoạt tính chống lại số vi khuẩn vi nấm hai loại mastopran 44 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian ba chiều peptid kháng khuẩn Hình 1.2 Cấu trúc bậc Mastoparan C 10 Hình 1.3 Cấu trúc xoắn α Mastoparan C biểu diễn theo chiều ngang 11 Hình 1.4 Cấu trúc xoắn α Mastoparan C biểu diễn theo chiều dọc 12 Hình 1.5 Quy trình tổng hợp dipeptid sử dụng phương pháp tổng hợp peptid pha rắn với giá mang rắn sử dụng polystyren liên kết ngang gắn thêm clorometyl 19 Hình 1.6 Bình phản ứng tổng hợp pha rắn 19 Hình 2.1 Máy lắc HY-5 ORBITAL SHAKER 21 Hình 2.2 Hệ thống hỗ trợ lọc hút chân không (Vaccum Manifold): máy hút chân không(a), cột phản ứng (b), bệ phản ứng(c) .21 Hình 2.3 Phương pháp tổng hợp pha rắn Mastoparan C sử dụng Rink Amide MBHA resin 22 Hình 2.4 Nguyên tắc hoạt động thuốc thử Kaiser 23 Hình 3.1 Theo dõi phản ứng tổng hợp Mastoparan C thuốc thử Kaiser: Chuỗi peptid sau gắn acid amin mới, lúc chưa xử lý loại Fmoc (A) xử lý loại Fmoc (B) 30 Hình 3.2 Sắc ký đồ Mastoparan C bước sóng 220 nm sau tinh chế 31 Hình 3.3 Phổ khối Mastoparan C sau tinh chế .33 Hình 3.4 Quang phổ lưỡng sắc trịn Mastoparan C mơi trường mô màng tế bào SDS 10% .34 Hình 3.5 Hoạt tính gây tan máu Mastoparan C hồng cầu người35 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tình trạng kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh 1.1.1 Kháng thuốc vi khuẩn 1.1.2 Kháng thuốc virus 1.1.3 Kháng thuốc vi nấm 1.1.4 Kháng thuốc kí sinh trùng .5 1.2 Peptid kháng khuẩn 1.2.1 Nguồn gốc peptid kháng khuẩn 1.2.2 Cấu trúc peptid kháng khuẩn 1.2.3 Tác dụng sinh học peptid kháng khuẩn 1.3 Mastoparan C 1.3.1 Nguồn gốc Mastoparan C 1.3.2 Cấu trúc Mastoparan C .9 1.3.3 Hoạt tính sinh học 12 1.3.4 Sự ổn định với dịch sinh học 15 1.3.5 Liên quan cấu trúc-tác dụng 16 1.3.6 Những thách thức trình phát triển Mastoparan C 17 1.3.7 Tổng hợp pha rắn 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.1 Dung mơi, hóa chất .20 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp tổng hợp Mastoparan C 21 2.2.2 Tinh chế kiểm tra độ tinh peptid 23 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc bậc Mastoparan C 24 2.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc bậc peptid Mastoparan C 24 2.2.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm peptid Mastoparan C 24 2.2.6 Phương pháp đánh giá tác dụng gây tan máu peptid Mastoparan C .24 CHƯƠNG KẾT QUẢ 26 3.1 Tổng hợp Mastoparan C 26 3.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu tổng hợp .26 3.1.2 Trình tự tiến hành 26 3.2 Tinh chế sản phẩm 30 3.3 Phân tích peptid sắc kí lỏng ghép khối phổ 31 3.4 Phân tích peptid quang phổ lưỡng sắc tròn 33 3.5 Sơ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Mastoparan C 34 3.6 Sơ đánh giá hoạt tính gây tan máu hồng cầu người Mastoparan C 34 CHƯƠNG BÀN LUẬN 36 4.1 Tổng hợp tinh chế Mastoparan C 36 4.2 Cấu trúc bậc Mastoparan C 39 4.3 Cấu trúc bậc Mastoparan C 39 4.4 Đánh giá hoạt sinh học Mastoparan C 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ LỤC Phụ lục Quá trình tổng hợp Mastoparan C theo phương pháp tổng hợp peptid pha rắn Phụ lục Bài báo “Potentialities of Antimicrobial Peptid Mastoparan C Isolated the European Hornet Vespa Crabro in Drug Discovery”-Bui Thi Phuong Hai, Trinh Thi Kim Anh, Tran Thi Khanh Huyen, Luong Xuan Huy, Dang Thi Ngan, Bui Thi Thuong, Nguyen Van Khanh, Nguyen Thanh Hai, Nguyen Thi Thanh Binh – Tạp chí Khoa học Y Dược Đại học Quốc Gia Hà Nội DOI: https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4489 Abstract Exploring the potential of natural bioactive peptid is becoming more and more important for new drug discovery First isolated from the European wasp Vespa crabro, the antimicrobial peptid Mastoparan C was found in higher content than many other molecules in the Mastoparan family In addition to the mast cell degranulation that is similar to some components in insect venom, this compound possesses remarkable biological activities such as broad-spectrum antibacterial and antifungal, inhibiting the proliferation of many human cancer cell lines However, unfortunately, Mastoparan C has the notable side effect of causing mammalian hemolysis By investigating its structure-activity relationships, this review pointed out some suggestions to overcome the disadvantages of this potential peptid and thereby support further in-depth study in the drug discovery field Keywords: Mastoparan C, antimicrobial peptid, biological activity, structureactivity relationships Phụ lục Đề tài “Tổng hợp pha rắn, đánh giá tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm gây tan máu peptid Mastoparan C có nguồn gốc từ nọc ong Vespa crabro”-Trần Thị Khánh Huyền, Bùi Thị Phương Hải, Lương Xuân Huy, Nguyễn Thị Thanh Bình Hội nghị Khoa học Cơng nghệ tuổi trẻ 2023 Đại học Y dược- Đại học Quốc Gia Hà Nội Tóm tắt Mastoparan C (MP-C) peptid kháng khuẩn phân lập từ nọc ong bắp cày châu Âu Vespa crabro Hợp chất sở hữu hoạt tính sinh học đáng ý kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư phổ rộng Tuy nhiên, MPC lại có tác dụng phụ khả gây tán huyết động vật có vú Nhằm tạo tiền đề cho nghiên cứu peptid nhiều tiềm này, tiến hành tổng hợp MP-C kỹ thuật tổng hợp peptid pha rắn Sản phẩm thu sau tinh chế có độ tinh khiết cao (99%), hiệu suất đạt 28% MP-C có cấu trúc xoắn alpha môi trường mô màng tế bào chứa 10% SDS Ở nồng độ 6,4 µM, MP-C ức chế bốn chủng vi sinh vật bao gồm Gram dương, Gram âm vi nấm Hoạt tính tăng dần theo thứ tự Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans Escherichia coli Thử nghiệm hồng cầu người cho thấy, nồng độ thấp (6,4 µM), MP-C khơng gây tan máu Trong đó, nồng độ cao gấp 10 lần (64 µM), MP-C gây tan máu với tỷ lệ 44,5% Từ khóa: Mastoparan C, tổng hợp peptid pha rắn, kháng khuẩn, kháng nấm, tan máu