Khóa luận nghiên cứu tổng hợp silica cấu trúc rỗng định hướng ứng dụng gắn enzym thủy phân protein

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TRẦN XUÂN HUY NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP SILICA CẤU TRÚC RỖNG ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG GẮN ENZYM THỦY PHÂN PROTEIN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: TRẦN XUÂN HUY NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP SILICA CẤU TRÚC RỖNG ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG GẮN ENZYM THỦY PHÂN PROTEIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH.2018.Y Người hướng dẫn : TS LÊ THỊ HIÊN THS.BSNT LÊ THỊ MINH PHƯƠNG Hà Nội – 2023 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thành đánh dấu q trình học tập, rèn luyện em trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Trong trình nghiên cứu hồn thành khóa luận này, ngồi nỗ lực thân, em nhận nhiều giúp đỡ, bảo tận tình từ thầy cô trường Đại học Y Dược (ĐHQGHN) trường Đại học Công Nghệ (ĐHQGHN) Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Lê Thị Hiên Ths.BSNT Lê Thị Minh Phương - người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, giúp đỡ em kiến thức, kỹ suốt q trình hồn thành nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Vũ Thị Thơm, Ths.BS Vũ Vân Nga tạo điều kiện, cho phép em tham gia nghiên cứu khoa học từ sớm để tích lũy kinh nghiệm cho q trình hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến môn Y Dược học sở - trường Đại học Y Dược, khoa Công nghệ Nông nghiệp – trường Đại học Công Nghệ (ĐHQGHN) tạo điều kiện cho em thực khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn đề tài “Hợp tác nghiên cứu kỹ thuật định lượng số biomarker bệnh nhân bị bệnh võng mạc đái tháo đường” thuộc nhiệm vụ KHCN theo Nghị định thư Mã số: NĐT.69.CHN/19 bảo trợ cho nghiên cứu Bên cạnh đó, quan tâm, giúp đỡ gia đình, bạn bè người thân nguồn động lực lớn lao, tạo điều kiện tốt để em tập trung nghiên cứu hoàn thành đề tài Tuy có nhiều cố gắng, khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót Em kính mong q thầy cơ, gia đình bạn bè tiếp tục có ý kiến đóng góp, giúp đỡ để khóa luận hoàn thiện Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2023 Sinh viên Trần Xuân Huy DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết bò) PMO MicroPMO Periodic mesoporous organosilica (vật liệu Silica hữu xốp rỗng cấu trúc tuần hồn) Periodic mesoporous organosilica kích thước micromet NanoPMO Periodic mesoporous organosilica kích thước nanomet MPC Periodic mesoporous organosilica kích thước micromet có nhóm -COOH NPC Periodic mesoporous organosilica kích thước nanomet có nhóm – COOH EDC 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminopropyl) carbodiimide DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Mẫu thủy phân BSA Trypsin theo thời gian 19 Bảng 2.2 Mẫu thủy phân BSA Trypsin theo nhiệt độ 19 Bảng 2.3 Mẫu thủy phân BSA Trypsin theo nồng độ Trypsin 19 Bảng 3.1 Kết đo quang nồng độ Trypsin điểm nồng độ 23 Bảng 3.2 Kết đo nồng độ BSA điểm nồng độ pp Bradford 31 Bảng 3.3 Kết gắn Trypsin lên MPC trước thủy phân BSA 33 Bảng 3.4 Kết thủy phân BSA Trypsin gắn MPC 34 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc vật liệu PMO [10] Hình 1.2 Các phương pháp chế tạo vật liệu nano [12] .4 Hình 1.3 Bốn đường điều chế PMO [9] Hình 1.4 Các ứng dụng vật liệu PMO [1] .6 Hình 1.5 Ví dụ q trình tinh chế protein nhờ PMO [1] Hình 1.6 Phương pháp để cố định protein giá đỡ lực tương tác protein giá đỡ qua trình cố định protein [15] Hình 1.7 Cấu trúc phân tử Trypsin (PDB:1AVW) [18] 10 Hình 1.8 Cấu trúc phân tử BSA (PDB: 3V03) [20] 11 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 13 Hình 2.2 Quy trình gắn Trypsin lên vật liệu PMO - quy trình 16 Hình 2.3 Quy trình gắn Trypsin lên vật liệu PMO - quy trình 17 Hình 3.1 Ảnh FESEM mẫu vật liệu NPC (trái) MPC (phải) 23 Hình 3.2 Đường chuẩn nồng độ Trypsin 24 Hình 3.3 Độ hấp thụ quang dung dịch Trypsin sau phản ứng với vật liệu MPC theo quy trình 25 Hình 3.4 Độ hấp thụ quang dung dịch Trypsin sau phản ứng với vật liệu NPC theo quy trình 25 Hình 3.5 Hiệu suất gắn Trypsin lên vật liệu PMO theo quy trình phản ứng 26 Hình 3.6 Độ hấp thụ quang dung dịch Trypsin sau phản ứng với vật liệu MPC theo nhiệt độ khác 26 Hình 3.7 Độ hấp thụ quang dung dịch Trypsin sau phản ứng với vật liệu NPC theo nhiệt độ khác 27 Hình 3.8 Hiệu suất gắn Trypsin nhiệt độ khác 27 Hình 3.9 Độ hấp thụ quang dung dịch Trypsin sau phản ứng với vật liệu MPC theo thời gian 28 Hình 3.10 Hiệu suất gắn Trypsin theo thời gian 28 Hình 3.11 Hiệu suất lượng Trypsin gắn lên vật liệu theo nồng độ khác 29 Hình 3.12 Phổ FTIR vật liệu MPC chưa có gắn kết với Trypsin 30 Hình 3.13 Phổ FTIR vật liệu MPC sau gắn kết với Trypsin 30 Hình 3.14 Đường chuẩn nồng độ BSA 31 Hình 3.15 Nồng độ BSA theo thời gian phản ứng 32 Hình 3.16 Nồng độ BSA theo nhiệt độ phản ứng 32 Hình 3.17 Nồng độ BSA thủy phân tỷ lệ Trypsin khác 33 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vật liệu micro/nano 1.1.1 Công nghệ micro .2 1.1.2 Khoa học nano công nghệ nano 1.1.3 Vật liệu Micro/nano 1.1.4 Vật liệu Periodic mesoporous organosilicas (PMO) .3 1.1.5 Vật liệu PMO cố định enzyme .8 1.2 Tổng quan loại protein sử dụng nghiên cứu 10 1.2.1 Trypsin 10 1.2.2 Albumin huyết bò - Bovine serum albumin (BSA) 10 1.3 Tình hình nghiên cứu vật liệu micro/nano ứng dụng cố định enzyme 11 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 13 2.3 Quy trình nghiên cứu 13 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 13 2.3.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 13 2.3.3 Phương pháp tổng hợp vật liệu 14 2.3.4 Thử nghiệm gắn enzyme Trypsin lên vật liệu PMO carboxylic 15 2.3.5 Thử nghiệm thủy phân BSA vật Trypsin gắn vật liệu PMO 18 2.4 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 20 2.4.1 Xác định hình thái kính hiển vi điện tử phát xạ trường FESEM 20 2.4.2 Phương pháp đo phổ hấp thụ UV-vis 21 2.4.3 Phương pháp đo Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FTIR) 21 2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu xác định lượng Trypsin gắn kết 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ 23 3.1 Kết tổng hợp vật liệu MPC NPC 23 3.2 Kết gắn Trypsin lên vật liệu PMO 23 3.2.1 Xây dựng đường chuẩn nồng độ Trypsin 23 3.2.2 Kết gắn Trypsin lê vật liệu PMO 24 3.3 Kết thủy phân BSA Trypsin gắn vật liệu PMO 30 3.3.1 Xây dựng đường chuẩn nồng độ BSA phương pháp Bradford 30 3.3.2 Kết thủy phân BSA Trypsin gắn vật liệu PMO 31 CHƯƠNG BÀN LUẬN 35 4.1 Về kết gắn Trypsin lên vật liệu PMO 35 4.2 Về kết thủy phân BSA Trypsin gắn vật liệu PMO 37 KẾT LUẬN 39 ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Công nghệ nano lĩnh vực khoa học cơng nghệ phát triển nhanh chóng có tiềm lớn Trong tương lai có thêm nhiều sản phẩm thiết bị ứng dụng công nghệ nano, ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác y học nano, điện tử nano, sản xuất vật liệu sinh học, lượng sản phẩm tiêu dùng Trong y sinh học, loại công nghệ dần sử dụng rộng rãi mang thuốc, chẩn đoán điều trị bệnh Vật liệu nano hướng tập trung nghiên cứu có nhiều thành tựu Chúng vật liệu có kích thước quy mơ nano, tức từ đến 100 nanomet Các vật liệu có đặc tính khác so với loại vật liệu quy mô lớn Trong số loại vật liệu nano biết đến, vật liệu Silica hữu xốp rỗng cấu trúc tuần hoàn (PMO) sử dụng rộng rãi với cấu trúc có trật tự cao, kích thước lỗ rỗng phân bố đồng cầu hữu vào khung silica Những vật liệu có ưu điểm có khả điều chỉnh tính chất vật lý (hình thái, độ xốp) tính chất bề mặt (tính ưa nước/kỵ nước) độ ổn định học nhờ kết hợp gốc hữu chức khác vào thành lỗ rỗng chúng [1,2] Một ứng dụng vật liệu PMO mà kể đến làm chất để cố định enzyme Các enzyme sử dụng rộng rãi xúc tác sinh học hiệu hiệu suất cao tính chọn lọc hoạt động cao Tuy nhiên, số ứng dụng chúng bị cản trở thiếu tính ổn định, thời gian sử dụng khả phục hồi tái sử dụng [3,4] Việc cố định enzyme lên đế vật liệu nano PMO giúp thay đổi hạn chế enzyme sinh học Khi cố định cách thích hợp, enzyme tăng tính ổn định, tăng hoạt tính, khả thu hồi tái sử dụng [3–6] Nhằm tìm ứng dụng cho vật liệu PMO phương pháp thích hợp để gắn cố định enzyme lên vật liệu PMO, thực đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp silica cấu trúc rỗng định hướng ứng dụng gắn enzym thủy phân protein” với hai mục tiêu: Tổng hợp vật liệu Micro/nano PMO có nhóm Cacboxyl Thiết kế tối ưu quy trình gắn Trypsin – enzyme thủy phân protein – lên vật liệu PMO Đánh giá hoạt tính enzyme Trypsin sau gắn lên vật liệu PMO Bảng 3.2 Kết đo nồng độ BSA điểm nồng độ pp Bradford Nồng độ BSA ban đầu (mg/mL) Độ hấp thụ quang 0 0,625 0,03 ±0,001 1,25 0,05±0,002 2,5 0,09 ±0,005 0,17 ±0,008 10 0,29 ±0,015 Với kết đo từ điểm nồng độ, ta tiến hành vẽ đồ thị dựng đường chuẩn cho nồng độ BSA 0.35 y = 0,0284x + 0,0132 R² = 0,9919 Độ hấp thụ quang Abs 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 10 12 Nồng độ BSA (mg/ml) Hình 3.14 Đường chuẩn nồng độ BSA Nhận xét: Đường chuẩn nồng độ BSA xây dựng là: y = 0,0284x + 0,0132 Với R² = 0,9919, đường chuẩn đáng tin cậy dùng cho tính toán sau 3.3.2 Kết thủy phân BSA Trypsin gắn vật liệu PMO 3.3.2.1 Tối ưu quy trình phản ứng thủy phân BSA Trypsin Kết thủy phân BSA Trypsin theo thời gian: 31 Nồng độ (mg/ml) 2.5 1.5 0.5 0 0.5 1.5 2.5 3.5 Thời gian(h) Hình 3.15 Nồng độ BSA theo thời gian phản ứng Nhận xét: Nồng độ BSA giảm theo thời gian phản ứng với Trypsin Với tỷ lệ theo khối lượng Trypsin:BSA 1:2,5 sau 3h phản ứng, nồng độ BSA giảm xuống gần Kết thủy phân BSA Trypsin theo nhiệt độ: 2.5 Nồng độ BSA (mg/ml) 1.5 0.5 0 0.5 -0.5 1.5 2.5 Thời gian (h) 50°C 37°C 25°C Hình 3.16 Nồng độ BSA theo nhiệt độ phản ứng Nhận xét: Theo kết trên, phản ứng thủy phân BSA Trypsin xảy nhanh điều kiện 50 oC, chậm điều kiện nhiệt độ phòng Kết thủy phân BSA Trypsin theo tỷ lệ khác nhau: 32 Nồng độ BSA (mg/ml) 2.5 1.5 0.5 0 0.5 1.5 2.5 -0.5 Thời gian µL 10 µL 20 µL 40 µL 80 µL Hình 3.17 Nồng độ BSA thủy phân tỷ lệ Trypsin khác Nhận xét: Với lượng Trypsin μl, thời gian thủy phân BSA chậm vào kéo dài nhất.Với lượng Trypsin từ 10-20 μl, thời gian tốc độ phản ứng tương đương Với lượng Trypsin từ 40-80 μl, tốc độ phản ứng xảy nhanh, hoàn thành vòng 30 phút đầu 3.3.2.2 Kết thủy phân BSA Trypsin gắn vật liệu PMO Kết gắn Trypsin lên vật liệu MPC trước tiến hành thủy phân BSA: Bảng 3.3 Kết gắn Trypsin lên MPC trước thủy phân BSA Mẫu Tổng lượng Trypsin 10 mg vật liệu (mg) 0,56 ± 0,03 0,69±0,04 Lượng Trypsin gắn đặc hiệu 10mg vật liệu (mg) 0,24±0,01 0,27±0,01 Nhận xét: Tổng lượng Trypsin có 10mg vật liệu 0,56-0,69 mg, tương đương từ 56-69 μl Trypsin nồng độ 10mg/ml khảo sát Lượng Trypsin gắn đặc hiệu vào vật liệu 0,24-0,27 mg, tương đương từ 24-27 μl dung dịch Trypsin nồng độ 10 mg/ml khảo sát Kết thủy phân BSA Trypsin gắn vật liệu MPC: 33 Bảng 3.4 Kết thủy phân BSA Trypsin gắn MPC Mẫu Nồng độ BSA ban đầu 1,05 ±0,05 Nồng độ BSA 15p (mg/ml) 0,21±0,01 0,10± 0,01 Nồng độ BSA 30p (mg/ml) 0,01 0,00 Theo nghiên cứu Trương Thị Trang [32] khả hấp phụ BSA vật liệu MPC, với nồng độ BSA ban đầu 1,05 mg/ml, ta tính lượng BSA bị vật liệu hấp phụ 0.93 mg 1g vật liệu hay 0,0093 mg 10 mg vật liệu thí nghiệm Giá trị khơng đáng kể bỏ qua Nhận xét: Tốc độ phản ứng thủy phân BSA Trypsin gắn vật liệu MPC diễn nhanh Chỉ 15 phút đầu tiên, phần lớn lượng BSA bị phân cắt Tại thời điểm 30 phút, lượng BSA gần không phát 34 CHƯƠNG BÀN LUẬN Việc gắn kết enzyme thủy phân protein (ở Trypsin) với vật liệu PMO liên kết hóa học bền vững giúp cho enzyme bám lưu giữ chặt chẽ ổn định bề mặt vật liệu Phương pháp sử dụng EDC – chất xúc tác – để tạo liên kết peptid Trypsin vật liệu PMO carboxyl Quá trình diễn qua nhiều giai đoạn, bao gồm việc hoạt hóa đầu –COOH vật liệu PMO EDC, việc tạo liên kết đầu –COOH hoạt hóa đầu –NH2 Trypsin Trypsin sau gắn có liên kết chặt chẽ với vật liệu PMO làm giảm nồng độ Trypsin dung dịch Đo độ hấp phụ A280 dung dịch Trypsin sau phản ứng với máy quang phổ huỳnh quang Nanodrop cách nhỏ 3µL giọt mẫu Sau tiến hành tính tốn lượng protein bị gắn kết gam vật liệu Để phản ứng cho kết tốt nhất, nghiên cứu tiến hành thử nghiệm phản ứng với quy trình khác nhau, với nhiệt độ khác nhau, khoảng thời gian khác nhau, kèm theo nồng độ - lượng Trypsin khác Kết khảo sát cho quy trình kèm theo điều kiện tối ưu cho phản ứng gắn Trypsin lên vật liệu PMO để có hiệu suất tốt Sau xác định enzyme gắn thành công lên vật liệu PMO, tiến hành đánh giá hoạt tính chúng Enzyme Trypsin sau gắn cần phải giữ hoạt tính thủy phân protein thân nó, điều chứng minh việc cố định có ý nghĩa 4.1 Về kết gắn Trypsin lên vật liệu PMO Từ kết thu được, ta nhận thấy có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trình cố định enzyme  Ảnh hưởng quy trình lên phản ứng gắn kết Từ kết thực nghiệm cho thấy, quy trình cho thấy hiệu suất cao so với quy trình Ngồi việc hiệu suất cao hơn, quy trình giúp cho tiến hành đơn giản, hơn, thuận tiện hơn, tiết kiệm thời gian giảm thiều sai sót Quy trình nhiều bước với giai đoạn rõ ràng đem lại hiệu thấp Để giải thích cho kết này, ta thấy điểm khác quy trình quy trình quy trình , dung EDC sau làm nhiệm vụ hoạt hóa nhóm chức –COOH loại bỏ để tiến hành bước tạo liên kết với peptid Cịn với quy trình , EDC tiếp lại suốt trình phản ứng Điều dẫn đến gốc –COOH hoạt hóa ổn định, liên tục phản ứng tốt 35 Ngoài ra, việc quy trình với thao tác cịn giảm thiểu sai sót, hạn chế việc có nhầm lẫn, giảm sai số thao tác giúp cho phản ứng thuận tiện trôi chảy  Ảnh hưởng nhiệt độ lên trình phản ứng So sánh kết thu với nhau, ta thấy Trypsin gắn kết lên vật liệu MPC, NPC nhiệt độ 25 oC cho hiệu suất gắn kết cao so với điều kiện nhiệt độ 4oC Điều cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng định tới phản ứng Nhiệt độ cao tạo điều kiện cho phản ứng xảy nhanh Việc phù hợp với phản ứng hóa học tự nhiên, nhiệt độ tăng thường kéo theo tốc độ phản ứng tăng lên Tuy nhiên tăng nhiệt độ lên cao Trypsin phân tử sinh học, nhiệt độ tăng cao gây biến tính làm hỏng cấu trúc phân tử Trypsin Như 25 oC điều kiện phù hợp, dễ thực cho thí nghiệm, đảm bảo hiệu suất phản ứng tối ưng không phá hỏng cấu trúc phân tử Trypsin Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu thực nghiên cứu Zhang cộng [29], nghiên cứu Cao cộng [30] hay nghiên cứu Chase Yang [33] Mặt khác, trình phản ứng 25 oC thực thao tác khuấy đảo liên tục, nhiệt độ 4o C khơng Đây nguyên nhân dẫn đến hiệu suất 25o C cao  Ảnh hưởng thời gian lên trình phản ứng Theo dõi nồng độ Trypsin dịch phản ứng loại vật liệu với điều kiện phản ứng, ta thấy lượng Trypsin gắn kết lên vật liệu có phụ thuộc theo thời gian Lượng Trypsin khỏi dung dịch tăng nhanh đạt đỉnh tạm thời 2h Hiệu suất ổn định tạm thời khoảng từ - 4h quay trở lại tiếp tục tăng dần 6h 8h với lượng tăng thấp Điều cho ta thấy thời gian tối ưu cho quy trình đạt khoảng từ 2-4h Trong kết có tiếp tục gia tăng lượng Trypsin khỏi dung dịch sau 4h với thời gian dài lượng nhiều Đó thời gian dài giúp tạo thêm liên kết vật liệu với phân tử Trypsin Tuy nhiên, ta loại trừ khả thời gian phản ứng lâu, phân tử Trypsin tự gặp phân giải lẫn nhau, từ dẫn đến việc giảm nồng độ Trypsin dung dịch  Ảnh hưởng nồng độ Trypsin lên trình phản ứng Với việc thử nghiệm hiệu suất gắn kết phản ứng với nồng độ khác nhau, ta thấy nồng độ mg/ml nồng độ đạt hiệu suất cao cho quy trình 36 này, lượng Trypsin gắn lên lại Theo kết thí nghiệm, việc tăng lên nồng độ đem lại nhiều lượng Trypsin gắn vật liệu PMO, khơng kèm với hiệu suất tương ứng mà làm giảm hiệu suất trình Việc giảm hiệu suất dẫn đến việc hao phí nhiều hơn, điều không cần thiết cần coi trọng q trình thí nghiệm Do đó, tùy vào mục đích u cầu, chọn nồng độ enzyme phù hợp để đạt lượng enzyme gắn lên vật liệu vừa đủ với hiệu suất tốt Trong nghiên cứu này, với mục đích thử nghiệm hoạt tính Trypsin vật liệu cần lượng trypsin gắn lên vật liệu cao để đánh giá Do lựa chọn nồng độ 10 mg với lượng hao hụt chấp nhận  Kết phân tích mẫu vật liệu PMO gắn Trypsin FTIR Kết phân tích mẫu vật liệu sau trình gắn enzyme cho thấy có peak 1554,63 đại diện cho nhóm chức –COOH, bên cạnh đó, xuất peak 1558,48 rõ ràng giúp ta khẳng định có nhóm phân tử/nhóm chức gắn trực tiếp vào vật liệu PMO Qua đó, khẳng định quy trình phản ứng có hiệu việc gắn enzyme Trypsin lên vật liệu thành công 4.2 Về kết thủy phân BSA Trypsin gắn vật liệu PMO Quy trình thủy phân BSA tối ưu để nhằm mục đích đánh giá khả thủy phân Trypsin sau cố định  Kết quy trình thủy phân BSA Trypsin Trong thí nghiệm này, theo kết thu đồ thị 12, thời gian để thủy phân BSA diễn nhanh, diễn khoảng từ 2,5 đến 3h, nhiều nghiên cứu có thời gian thủy phân lâu, kéo dài đến 6h Điều giải thích tỷ lệ enzyme:protein (w:w) thí nghiệm lớn (1:2,5) Trong đó, thí nghiệm thí nghiệm Arrutia cộng [34], tỷ lệ enzyme:protein (w:w) từ 1:50 đến 1:200, kéo theo thời gian tiến hành kéo dài đến 6h Theo đồ thị 13, ta thấy tốc độ thủy phân Trypsin cao 50 oC, điều khơng phù hợp Với tính chất Trypsin [35] theo nhiều nghiên cứu giới, nghiên cứu Deng cộng [36] hay nghiên cứu Rio cộng [37] trình thủy phân Trypsin, nhiệt độ để trình thủy phân diễn mạnh 37 oC Kết thu sai lệch q trình điều nhiệt từ bể ơn nhiệt đến ống chứa phản ứng chưa tốt, dẫn đến nhiệt độ phản ứng thực tế nhiệt độ cài đặt bể điều nhiệt chưa đồng Nhằm đảm bảo tính khách quan, thí nghiệm tiến hành 37o C theo nghiên cứu giới Với việc tăng lượng enzyme Trypsin, theo đồ thị 14, thời gian phản ứng rút ngắn lại đáng kể Với lượng Trypsin từ 40-80 μL (nồng độ 10mg/ml), thời gian phản 37 ứng khoảng 30 phút Kết cho ta dự đoán thời gian thủy phân Trypsin gắn vật liệu MPC khoảng 30 phút lượng enzyme gắn lên nằm khoảng  Kết thủy phân BSA Trypsin gắn vật liệu PMO Theo kết bảng 3.4, ta thấy thời gian thủy phân BSA Trypsin gắn vật liệu MPC từ 15-30 phút Kết khớp với dự đoán tổng lượng enzyme gắn lên vật liệu từ 0,56-0,69 mg, tương đương từ 56-69 μl Trypsin nồng độ 10mg/ml Điều cho ta thấy Trypsin cố định lên đến PMO giữ hoạt tính, khơng mà hoạt tính cịn có phần vượt trội Từ kết khả quan cho thấy tiềm to lớn vật liệu PMO việc cố định enzyme 38 KẾT LUẬN Đã tổng hợp thành công vật liệu PMO cacboxyl đáp ứng đủ tiêu chuẩn để tiến hành thử nghiệm Việc cố định enzyme Trypsin lên vật liệu PMO hồn tồn khả quan thực để khắc phục hạn chế chúng Quy trình cố định tối ưu với quy trình nêu cho hiệu suất tốt Điều kiện tối ưu để phản ứng gắn kết Trypsin lên vật liệu PMO 25 oC hay nhiệt độ phịng thí nghiệm, phản ứng thời gian 2h cho khả cố định tối đa Nồng độ Trypsin cho trình cố định khuyến nghị 10 mg/ml khối lượng gắn cao lượng hao phí vừa phải Thời gian phản ứng lâu cho hiệu suất cao, nhiên, cần cân nhắc đến khả phân tử Trypsin tự phân cắt lẫn làm ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Việc tăng lên nồng độ Trypsin tăng lượng enzym gắn lên vật liệu, điều kèm theo hiệu suất giảm gây lãng phí khơng khuyến nghị Lựa chọn nồng độ hiệu suất phù hợp với nhu cầu thí nghiệm ĐỀ XUẤT Việc gắn Trypsin hay phân tử enzyme lên vật liệu PMO hứa hẹn đem lại nhiều hướng việc ứng dụng vật liệu PMO việc sử dụng enzyme Tiếp tục nghiên cứu đánh giá Trypsin sau gắn lên vật liệu PMO để hiểu rõ ưu điểm hạn chế q trình này, từ tìm ứng dụng cụ thể cho hướng 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Esquivel Merino MD, Van Der Voort P, Romero-Salguero F Designing advanced functional periodic mesoporous organosilicas for biomedical applications AIMS MATERIALS SCIENCE 2014;1(1):70-86 doi:10.3934/matersci.2014.1.70 Wan J, Qian K, Zhang J, et al Functionalized Periodic Mesoporous Organosilicas for Enhanced and Selective Peptide Enrichment Langmuir 2010;26(10):7444-7450 doi:10.1021/la9041698 Zdarta J, Meyer AS, Jesionowski T, Pinelo M A General Overview of Support Materials for Enzyme Immobilization: Characteristics, Properties, Practical Utility Catalysts 2018;8(2):92 Meryam Sardar RA Enzyme Immobilization: An Overview on Nanoparticles as Immobilization Matrix Biochem Anal Biochem 2015;04(02) doi:10.4172/2161-1009.1000178 Homaei AA, Sariri R, Vianello F, Stevanato R Enzyme immobilization: an update J Chem Biol 2013;6(4):185-205 doi:10.1007/s12154-013-0102-9 Garcia-Galan C, Berenguer-Murcia Á, Fernandez-Lafuente R, Rodrigues RC Potential of Different Enzyme Immobilization Strategies to Improve Enzyme Performance Advanced Synthesis & Catalysis 2011;353(16):2885-2904 Barth MAGD Janet L, ed Systems Engineering for Microscale and Nanoscale Technologies CRC Press; 2011 doi:10.1201/b11291 About Nanotechnology | National Nanotechnology Initiative Park SS, Santha Moorthy M, Ha CS Periodic mesoporous organosilicas for advanced applications doi:10.1038/am.2014.13 NPG Asia Materials 2014;6(4):e96-e96 10 Laskowski Ł, Laskowska M, Vila N, Schabikowski M, Walcarius A Mesoporous Silica-Based Materials for Electronics-Oriented Applications Molecules 2019;24(13):2395 11 Wei Y, Li X, Zhang R, et al Periodic Mesoporous Organosilica Nanocubes with Ultrahigh Surface Areas for Efficient CO2 Adsorption Scientific Reports 2016;6(1):20769 doi:10.1038/srep20769 12 Tulinski M, Jurczyk M Nanomaterials Synthesis Methods In: Metrology and Standardization of Nanotechnology John Wiley & Sons, Ltd; 2017:75-98 doi:10.1002/9783527800308.ch4 13 Livage J Sol-gel processes Current Opinion in Solid State and Materials Science 1997;2(2):132-138 14 Meconi GM, Ballard N, Asua JM, Zangi R Shedding light on the different behavior of ionic and nonionic surfactants in emulsion polymerization: from atomistic simulations to experimental observations Phys Chem Chem Phys 2017;19(47):31692-31705 15 Fried DI, Brieler FJ, Fröba M Designing Inorganic Porous Materials for Enzyme Adsorption and Applications in Biocatalysis ChemCatChem 2013;5(4):862-884 doi:10.1002/cctc.201200640 16 Vandermarliere E, Mueller M, Martens L Getting intimate with Trypsin, the leading protease in proteomics Mass Spectrometry Reviews 2013;32(6):453-465 17 Raoufinia R, Mota A, Keyhanvar N, Safari F, Shamekhi S, Abdolalizadeh J Overview of Albumin and Its Purification Methods Adv Pharm Bull 2016;6(4):495-507 18 Bank RPD RCSB PDB - 1AVW: COMPLEX PORCINE PANCREATIC TRYPSIN/SOYBEAN TRYPSIN INHIBITOR, ORTHORHOMBIC CRYSTAL FORM Accessed May 25, 2023 https://www.rcsb.org/structure/1AVW 19 Michnik A, Michalik K, Drzazga Z Stability of bovine serum albumin at different pH Journal of Thermal Analysis and Calorimetry 2005;80(2):399-406 20 Bank RPD RCSB PDB - 3V03: Crystal structure of Bovine Serum Albumin Accessed May 25, 2023 https://www.rcsb.org/structure/3V03 21 Almeida FLC, Prata AS, Forte MBS Enzyme immobilization: what have we learned in the past five years? Biofuels, Bioproducts and Biorefining 2022;16(2):587-608 doi:10.1002/bbb.2313 22 Zahirinejad S, Hemmati R, Homaei A, et al Nano-organic supports for enzyme immobilization: Scopes and perspectives Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2021;204:111774 doi:10.1016/j.colsurfb.2021.111774 23 Nui PX, Son NN, Cuc LT Tổng hợp đặc trưng xúc tác enzymlipase cố định trênnano từ tính ứng dụng cho q trình chuyển hóa biodiesel từ dầu đậu nành Petrovietnam Journal 2013;11:37-42 24 Xuân B ĐẶC TÍNH ENZYME LIPASE CỐ ĐỊNH TRÊN CHẤT MANG CHITOSAN-Fe3O4 BẰNG LIÊN KẾT ĐỒNG HÓA TRỊ Published online 2018 25 Nguyen VH Promising results of application-oriented basic research on nanomedicine in Vietnam Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering 2017;59(1):58-72 26 Croissant JG, Cattoën X, Man MWC, Durand JO, Khashab NM Syntheses and applications of periodic mesoporous organosilica nanoparticles Nanoscale 2015;7(48):20318-20334 27 Lê TTG Nghiên cứu tổng hợp vật liệu silic hữu siêu xốp kích thước micro/nano định hướng ứng dụng y sinh dược Published online 2022 Accessed May 25, 2023 http://repository.vnu.edu.vn/handle/VNU_123/142855 28 Xu G, Chen X, Hu J, Yang P, Yang D, Wei L Immobilization of Trypsin on graphene oxide for microwave-assisted on-plate proteolysis combined with MALDI-MS analysis Analyst 2012;137(12):2757 doi:10.1039/c2an35093a 29 Zhang L, Wang B, Wang S, Zhang W Recyclable Trypsin immobilized magnetic nanoparticles based on hydrophilic polyethylenimine modification and their proteolytic characteristics Anal Methods 2018;10(4):459-466 30 Cao Y, Wen L, Svec F, Tan T, Lv Y Magnetic AuNP@Fe O nanoparticles as reusable carriers for reversible enzyme immobilization Chemical Engineering Journal 2016;286:272-281 doi:10.1016/j.cej.2015.10.075 31 Pečová M, Šebela M, Marková Z, et al Thermostable Trypsin conjugates immobilized to biogenic magnetite show a high operational stability and remarkable reusability for protein digestion Nanotechnology 2013;24(12):125102 doi:10.1088/0957-4484/24/12/125102 32 Trương TT Thử nghiệm tương tác vật liệu micro/nano với protein Published online 2022 33 Chase HA, Yang Y Immobilization of enzymes on poly(vinyl alcohol)coated perfluorocarbon supports: comparison of techniques for the immobilization of Trypsin and α-amylase perfluorocarbons on poly(vinyl alcohol)-coated solid and liquid 34 Arrutia F, Puente Á, Riera FA, Menéndez C, González UA Influence of heat pre-treatment on BSA tryptic hydrolysis and peptide release Food Chemistry 2016;202:40-48 35 Rick W Trypsin In: Bergmeyer HU, ed Methods of Enzymatic Analysis (Second Edition) Academic Press; 1974:1013-1024 doi:10.1016/B978-0-12091302-2.50099-2 36 Deng Y, van der Veer F, Sforza S, Gruppen H, Wierenga PA Towards predicting protein hydrolysis by bovine Trypsin Process Biochemistry 2018;65:8192 37 Rio AR del, K Keppler J, M Boom R, M Janssen AE Protein acidification and hydrolysis by pepsin ensure efficient Trypsin-catalyzed hydrolysis Food & Function 2021;12(10):4570-4581 PHỤ LỤC Hình Quy trình tổng hợp vật liệu PMO amin (trái - nanoPMO, phải - microPMO) [27] Hình Quy trình tổng hợp vật liệu PMO carboxylic Bảng Tổng hợp tên mẫu thử dùng cho khóa luận Thời gian (h) Nhiệt độ (oC) STT Mẫu Mô tả Trypsin DC1 Đối chứng (dung dịch Trypsin) mg/ml DC2 (25.DC2.2) Đối chứng (dung dịch Trypsin vật liệu) mg/ml 25 25.DC2.4 Đối chứng mg/ml 25 25.DC2.6 Đối chứng mg/ml 25 25.DC2.8 Đối chứng mg/ml 25 4.DC1.4 Đối chứng mg/ml 4 25.p1.2 Quy trình mg/ml 25 25.p2.2 Quy trình mg/ml 25 25.p1.4 Quy trình mg/ml 25 10 25.p1.6 Quy trình mg/ml 25 11 25.p1.8 Quy trình mg/ml 25 12 4.p1.4 Quy trình mg/ml 4 13 25.p1-2 Quy trình mg/ml 25 14 25.p1-5 Quy trình mg/ml 25 15 25.p1-10 Quy trình 10 mg/ml 25 16 25.p1-20 Quy trình 20 mg/ml 25 17 25.DC2-2 Đối chứng 2 mg/ml 25 18 25 DC2-5 Đối chứng mg/ml 25 19 25 DC2-10 Đối chứng 10 mg/ml 25 20 25 DC2-20 Đối chứng 20 mg/ml 25 25