TỔNG QUAN
Tổng quan về vật liệu micro/nano
Công nghệ micro đề cập đến các công nghệ có kích thước nhỏ, thường là ở cấp độ micromet (một phần triệu mét) hoặc nhỏ hơn Nó tập trung vào các quá trình vật lý và hóa học, cũng như việc sản xuất và thao tác với các cấu trúc và vật liệu có kích thước micromet.
Công nghệ micro là một lĩnh vực đa dạng với nhiều đặc điểm nổi bật, mang lại nhiều lợi ích và ứng dụng mới Một trong những ưu điểm chính của công nghệ này là khả năng thu nhỏ kích thước, cải thiện tính chất, chức năng và độ tin cậy Nhờ đó, công nghệ micro trở thành một giải pháp ưu việt cho các ngành khoa học, góp phần vào việc nghiên cứu và ứng dụng sâu rộng trong cuộc sống hiện đại.
1.1.2 Khoa học nano và công nghệ nano
Khoa học nano là một lĩnh vực nghiên cứu mới, tập trung vào các cấu trúc và phân tử có kích thước từ vài đến vài trăm nanomet Ngành khoa học này liên quan đến nhiều lĩnh vực khác nhau như hóa học, sinh học, vật lý, khoa học vật liệu và kỹ thuật, mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghệ và y tế.
Công nghệ nano, theo Tổ chức Sáng kiến Công nghệ Nano Quốc gia Hoa Kỳ (NNI), được định nghĩa là một lĩnh vực khoa học, kỹ thuật và công nghệ hoạt động ở quy mô nano.
Công nghệ nano, với kích thước vật liệu từ 1 đến 100 nm, mang đến những hiện tượng độc đáo, cho phép ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như hóa học, vật lý, sinh học, y học, kỹ thuật và điện tử Nó bao gồm cả sản xuất và ứng dụng các vật liệu nano, mở ra tiềm năng lớn cho sự phát triển công nghệ hiện đại.
Khoa học nano và công nghệ nano đang trở thành những xu hướng tiên tiến trong khoa học hiện đại, mở ra những kỷ nguyên mới với nhiều ứng dụng thiết thực trong đời sống con người Công nghệ này hứa hẹn sẽ mang đến giải pháp cho nhiều vấn đề hiện tại mà chúng ta vẫn chưa tìm ra lời giải.
Vật liệu nano là những vật liệu có cấu trúc như hạt, sợi, ống, tấm mỏng hay mạng lưới với kích thước nano, có thể tồn tại ở dạng rắn, lỏng hoặc khí Tương tự, vật liệu micro có kích thước từ vài micromet đến vài trăm micromet.
Khi các vật liệu được thu nhỏ đến kích thước nano, tính chất của chúng có thể thay đổi đáng kể so với kích thước lớn hơn Điều này mở ra cơ hội cho các ứng dụng mới và đột phá trong khoa học và cuộc sống con người.
1.1.4 Vật liệu Periodic mesoporous organosilicas (PMO)
1.1.4.1 Sự ra đời của PMOs
Sau nhiều nỗ lực cải tiến chức năng của vật liệu silica xốp, vào năm 1999, ba nhóm nghiên cứu đã độc lập phát triển vật liệu tổng hợp nano hữu cơ - vô cơ mới gọi là Silica hữu cơ xốp rỗng cấu trúc tuần hoàn (PMO) Trong PMO, các nhóm hữu cơ nằm trong thành kênh đóng vai trò cầu nối giữa các trung tâm Si, cho phép điều chỉnh các đặc tính bề mặt như tính ưa nước, kỵ nước và khả năng liên kết với các phân tử khách Vật liệu này không chỉ bảo vệ bề mặt khỏi tấn công mà còn cải thiện các đặc tính khối như tính cơ học và quang học PMO duy trì các chức năng cơ bản của silica trung tính như diện tích bề mặt và thể tích lỗ cao, đồng thời có kích thước lỗ có thể điều chỉnh và cấu trúc trung gian có trật tự cao Đặc biệt, PMO thể hiện tính ổn định cơ học cao nhờ sự kết hợp của nhiều chất hữu cơ trong khung Hiện nay, PMO được xem là vật liệu nano hứa hẹn cho nhiều ứng dụng tiềm năng như xúc tác, sắc ký, điện tử, hấp phụ kim loại, và y sinh.
1.1.4.2 Cấu trúc và tính chất của vật liệu PMO
Vật liệu nano/micro PMO là silic hữu cơ có cấu trúc lỗ xốp tuần hoàn, với kích thước hạt từ nanomet đến micromet và kích thước lỗ cũng ở cấp độ nanomet Chúng bao gồm hai thành phần chính: khung và lỗ rỗng.
Hình 1.1 Cấu trúc vật liệu PMO [10]
Vật liệu nano/micro PMO được xác định bởi các thông số quan trọng như diện tích bề mặt riêng, thể tích lỗ và kích thước lỗ Những thông số này được đo và tính toán thông qua đường đẳng nhiệt hấp phụ khí nitơ, giúp đánh giá tính chất của vật liệu một cách chính xác.
Kích thước lỗ xốp được xác định bởi khoảng cách giữa hai cạnh của rãnh hoặc đường kính của lỗ Theo tiêu chuẩn IUPAC, lỗ xốp được phân loại thành ba loại: micropore (dưới 2 nm), mesopore (từ 2-50 nm) và macropore (trên 50 nm) Đối với PMO, lỗ xốp thuộc loại mesopore với kích thước từ 2-50 nm.
Diện tích bề mặt riêng, tính bằng m²/g, là chỉ số quan trọng cho khả năng hấp phụ của vật liệu PMO thường có diện tích bề mặt cao hơn so với các vật liệu silica khác, với giá trị cao nhất được ghi nhận là 1880 m²/g, tuy nhiên vẫn thấp hơn so với các loại vật liệu xốp như cacbon vi xốp (2000 - 5000 m²/g) Diện tích bề mặt này chịu ảnh hưởng bởi mức độ trùng hợp của vật liệu, phụ thuộc vào các yếu tố như pH của dung môi và tỷ lệ các chất phản ứng.
1.1.4.3 Một số phương pháp tổng hợp vật liệu PMO
Vật liệu nano được chế tạo chủ yếu bằng hai phương pháp: phương pháp từ trên xuống (top-down) và phương pháp từ dưới lên (bottom-up) Phương pháp từ trên xuống tạo ra hạt nano từ kích thước lớn hơn thông qua các kỹ thuật như nghiền, nghiền bi năng lượng cao, in thạch bản, lắng đọng pha hơi hóa học (CVD) và lắng đọng pha hơi vật lý (PVD) Ngược lại, phương pháp từ dưới lên hình thành hạt nano từ các nguyên tử thông qua các con đường hóa học như sol-gel, thủy nhiệt và đồng kết tủa Bên cạnh đó, tổng hợp vật liệu nano còn được phân loại theo các con đường vật lý, hóa học, cơ học và sinh học.
Hình 1.2 Các phương pháp chế tạo vật liệu nano [12]
Vật liệu PMO thường được tổng hợp thông qua phương pháp sol-gel, một kỹ thuật hiệu quả cho việc tạo ra các hạt nano Phương pháp sol-gel mang lại nhiều ưu điểm nổi bật, giúp cải thiện chất lượng và tính chất của vật liệu.
Tổng quan về các lo ại protein sử dụng trong nghiên cứu
Trypsin, được phát hiện bởi Wilhelm Kühne vào năm 1876, là một enzyme tiêu hóa quan trọng giúp phân giải protein trong hệ tiêu hóa của động vật có xương sống Enzyme này hoạt động chủ yếu ở phần đầu ruột non, nơi nó cắt các chuỗi axit amin thành các peptide nhỏ hơn Trypsin tồn tại dưới dạng tiền enzyme Trypsinogen, được tiết ra bởi tuyến tụy và hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ khoảng 37°C và pH từ 7-8 Để bảo quản Trypsin trong nghiên cứu, người ta thường lưu trữ ở nhiệt độ -20°C và pH 3 nhằm ngăn chặn sự tự phân giải, và enzyme sẽ hoạt động trở lại bình thường khi pH được điều chỉnh về 8 Ngày nay, Trypsin còn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều quy trình công nghệ sinh học.
Hình 1.7 Cấu trúc phân tử Trypsin (PDB:1AVW) [18]
1.2.2 Albumin huyết thanh bò - Bovine serum albumin (BSA)
Albumin là một nhóm protein hình cầu, trong đó albumin huyết thanh là loại phổ biến nhất Albumin huyết thanh có mặt ở động vật có xương sống sơ khai và tồn tại trong huyết tương của tất cả các loài động vật có vú Cấu trúc đặc trưng của albumin huyết thanh đóng vai trò quan trọng trong nhiều chức năng sinh học.
Một bộ cầu disulfide được bảo tồn duy trì cấu trúc, và bất kỳ sự thay đổi nào trong trình tự đều có mối tương quan cao với sự tiến hóa của loài.
Albumin huyết thanh bò (BSA) là một trong những protein phổ biến nhất trong thực hành phòng thí nghiệm, thường được dùng thay thế albumin huyết thanh người (HSA) trong nhiều thí nghiệm BSA được ưa chuộng nhờ khả năng tiếp cận dễ dàng, độ ổn định cao, khả năng liên kết với các phối tử khác nhau và tính tương đồng với huyết thanh người.
BSA (bovine serum albumin) là một protein lưỡng tính, có nhóm -NH2 và -COOH trong cấu trúc phân tử, cho phép nó có điện tích khác nhau ở các pH khác nhau Điểm đẳng điện của BSA là pI = 4,7, nghĩa là protein này mang điện tích dương khi pH < 4,7 và điện tích âm khi pH > 4,7 pH có ảnh hưởng lớn đến sự hấp phụ của BSA, với sự hấp phụ cực đại xảy ra tại điểm đẳng điện của nó.
Hình 1.8 Cấu trúc phân tử BSA (PDB: 3V03) [20]
Tình hình nghiên cứu vật liệu micro/nano ứng dụng cố định enzyme
1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Với sự tiến bộ của khoa học và công nghệ, nghiên cứu ứng dụng công nghệ micro/nano đang được chú trọng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, điện tử, thực phẩm, mỹ phẩm và y sinh học Một trong những ứng dụng nổi bật của vật liệu micro/nano là sử dụng làm chất nền để cố định enzyme, điều này đang thu hút sự quan tâm và thúc đẩy phát triển trên toàn cầu.
Trong những năm gần đây, cố định enzyme đã trở thành một phương pháp ưu việt để nâng cao các đặc tính của enzyme Nghiên cứu của Jakup Zadarta và cộng sự đã chỉ ra rằng việc cố định enzyme có thể cải thiện hiệu suất và độ ổn định của chúng, mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp và nghiên cứu.
Nghiên cứu của Francisco và cộng sự đã chỉ ra những lợi ích nổi bật của việc cố định enzyme, cùng với các loại vật liệu phổ biến được áp dụng trên toàn cầu Việc sử dụng vật liệu micro/nano trong quá trình này ngày càng được chú trọng, với các nghiên cứu của Meryam Sardar và Sahar Zahirinejad đã chứng minh hiệu quả cao của vật liệu nano trong việc cố định enzyme.
Trong tương lai gần, các enzyme cố định trên vật liệu sẽ được ứng dụng rộng rãi nhờ vào những tiến bộ khoa học mới nhất, mang lại lợi ích to lớn cho các ngành khoa học và cải thiện đời sống con người.
1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
So với thế giới, Việt Nam phát triển muộn hơn và có ít thành tựu hơn trong lĩnh vực nghiên cứu vật liệu micro/nano Tuy nhiên, trong thập kỷ qua, nghiên cứu và ứng dụng các vật liệu này đã được chú trọng và phát triển nhanh chóng Nhờ vào sự nỗ lực không ngừng của các viện nghiên cứu, trường đại học và các nhà khoa học, Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể trong lĩnh vực này.
Trong những năm gần đây, Việt Nam đã ghi nhận những thành tựu đáng kể trong nghiên cứu cố định enzyme, nhờ vào công trình của nhóm Phạm Xuân Núi và Bùi Xuân Đông Những nghiên cứu này chứng tỏ rằng nước ta đang hội nhập và theo kịp xu hướng toàn cầu Mặc dù còn nhiều thách thức phía trước, nhưng những thành công này sẽ là động lực cho các nhà khoa học tiếp tục phát triển lĩnh vực này.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Vật liệu micro/nano PMO chứa các nhóm carboxyl –COOH, bao gồm hai dạng chính: vật liệu microPMO gắn nhóm carboxyl –COOH (MPC) và vật liệu nanoPMO có gắn nhóm carboxyl –COOH (NPC).
Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Từ tháng 2 năm 2022 đến tháng 4 năm 2023, Khoa Công nghệ Nông nghiệp thuộc trường Đại học Công nghệ - ĐHQGHN và Bộ môn Y Dược học cơ sở của trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN đã tiến hành các hoạt động nghiên cứu và giảng dạy quan trọng.
Quy trình nghiên cứu
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu
2.3.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
The research utilized various chemicals, including Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) from Bio Basic, Canada, and multiple silane compounds from Johnson Matthey, USA, such as 1,2-Bis(triethoxysilyl)ethane (BTEE), 1,2-Bis(trimethoxysilyl)ethane (BTME), and (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) The study focused on evaluating the results of Trypsin attachment to the material, determining the amount of Trypsin bound, and optimizing the process for the binding of Trypsin to micro/nano PMO materials.
Tổng hợp vật liệu micro/nano PMO - COOH
The article lists various chemical reagents and their sources, including 20% ammonia solution from Merck (Germany), sodium hydroxide from Bio Basic (Canada), and bovine serum albumin (BSA) also from Bio Basic (Canada) Other notable chemicals include sodium biphosphate, sodium chloride from Bio Basic (Canada), 96% ethanol from Xilong Scientific (China), and hydrochloric acid (37%) from Xilong Scientific (China) Additionally, it mentions succinic anhydride from DUKSAN (South Korea), trypsin from India, and MES from Bioreagents (USA) Other reagents include sodium phosphate dibasic and monobasic from Bio Basic (Canada), Coomassie Brilliant Blue G-250 from Singma (USA), dithiothreitol from Singma (USA), iodoacetamide from Merck (Germany), PBS from Singma (USA), and phosphoric acid from Singma (USA).
Các dụng cụ nghiên cứu cần thiết bao gồm thìa cân, giấy cân, bộ pipet với các kích cỡ 10 μL, 100 μL và 1000 μL, ống Falcon 15 mL cùng với giá đựng tương ứng Ngoài ra, cần có giá đựng ống Eppendorf với các kích cỡ 1,5 mL và 2 mL, ống Eppendorf 1,5 mL, đầu côn phù hợp với pipette, găng tay, giấy thấm, giấy lọc, phễu lọc, bình định mức 50 mL và 100 mL, cùng với khay 96 giếng.
Các thiết bị nghiên cứu bao gồm: Cân phân tích A&D GR-200 (Nhật Bản), Máy ly tâm MiniSpin® plus (Đức), mini-rotator Bio RS-24 (Anh), Nanodrop ND 8000 (Mỹ), Tủ lạnh Sanaky (Nhật Bản), Tủ lạnh âm sâu Sysmedical (Trung Quốc), Máy đo pH cầm tay Oakiton (Nhật Bản), Bể điều nhiệt Thermo Scientific (Mỹ), và Máy quang phổ vi bản Epoch 2 (Mỹ).
2.3.3 Phương pháp tổng hợp vật liệu
Vật liệu PMO được tổng hợp thông qua phương pháp sol-gel trong dung dịch nước, bao gồm quá trình thủy phân và ngưng tụ silic hữu cơ dưới sự xúc tác của base hoặc acid.
Quy trình tổng hợp vật liệu trong nghiên cứu này dựa trên công trình của Lê Thị Trà Giang, người đã thành công trong việc tổng hợp và đánh giá loại vật liệu PMO Nguyên liệu chính để tổng hợp PMO bao gồm các tiền chất silic hữu cơ như 1,2-Bis(trimethoxysilyl)ethane (BTME), 1,2-Bis(triethoxysilyl)ethane (BTEE), 3-(Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) và Succinic acid anhydride (SAA) Bên cạnh đó, chất hoạt động bề mặt Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) đóng vai trò là chất định hướng cấu trúc, tạo khuôn trong quá trình tổng hợp PMO.
15 microPMO carboxylic và nanoPMO cacboxylic đều được tổng hợp tương ứng từ microPMO amin
Tiếp tục sử dụng vật liệu PMO amin để tổng hợp PMO carboxylic Ta dùng SAA để làm biến đổi bề mặt có chứa nhóm amin thành nhóm cacboxyl
Chuẩn bị ba dung dịch SAA với nồng độ 10 mg/ml và pH = 6 Hòa tan 50 mg vật liệu PMO amin vào 2,5 ml dung dịch SAA 10 mg/ml và để phản ứng diễn ra trong 2 giờ Sau đó, lọc và thu chất rắn, rửa bằng nước khử ion cho đến khi đạt pH trung tính Cuối cùng, sấy ở 45°C cho đến khi khối lượng không đổi và bảo quản trong ống nghiệm kín ở 25°C.
Sau khi tổng hợp, các vật liệu sẽ được kiểm tra để xác định các đặc điểm hình thái, diện tích bề mặt, thể tích và kích thước lỗ Khi vật liệu đạt tiêu chuẩn, sẽ tiến hành khảo sát khả năng gắn kết các protein/peptide.
2.3.4 Thử nghiệm gắn enzyme Trypsin lên vật liệu PMO carboxylic
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng Trypsin cùng với các vật liệu micro PMO cacboxylic (MPC) và nano PMO cacboxylic (NPC) Mục tiêu của thí nghiệm là xác định điều kiện tối ưu nhất để gắn Trypsin.
2.3.4.1 Thực nghiệm: Xác định khả năng gắn kết Trypsin với vật liệu MPC/NPC theo các quy trình phản ứng
Theo nhiều nghiên cứu, việc cố định protein lên vật liệu nano đã trở nên phổ biến Có nhiều phương pháp gắn protein, trong đó nghiên cứu của Guobin Xu và cộng sự đã so sánh 10 phương pháp cố định Trypsin và α-amylase Hầu hết các nghiên cứu về cố định Trypsin đều sử dụng chất xúc tác như 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) và N-hydroxysuccinimide (NHS) Dựa trên các nghiên cứu này, thí nghiệm hiện tại sẽ áp dụng 2 quy trình gắn Trypsin được sử dụng rộng rãi nhất.
Protein Trypsin được cố định trên bề mặt cacboxyl thông qua phương pháp hóa học, sử dụng EDC để kích hoạt nhóm –COOH Sau khi kích hoạt, nhóm –COOH dễ dàng tạo liên kết peptit với gốc NH2 của Trypsin Hai mẫu vật liệu PMO: MPC và NPC được sử dụng để gắn kết với Trypsin theo hai quy trình khác nhau.
Hình 2.2 Quy trình gắn Trypsin lên vật liệu PMO - quy trình 1
Cân 10mg vật liệu cho vào ống eppendorf.
Thờm 500 àl dd MES, lắc đều, ly tõm loại bỏ dịch.
Bổ sung 400 àl dd đệm MES.
Bổ sung 50 àl dd EDC 40 mg/ml, lắc đều trong 5 phỳt.
Bổ sung 50 àl dd Trypsin 50 mg/ml.
Lắc nhẹ, để phản ứng ở 25 o C trong 2h.
Ly tâm, thu lại dịch tan đem đo UV-VIS để tính lượng Trypsin dư.
Mẫu sau khi ly tõm rửa với axit axetic pH 3 Thờm 500 àl axit axetic pH 3 vào mẫu để bảo quản.
Hình 2.3 Quy trình gắn Trypsin lên vật liệu PMO - quy trình 2
Tiến hành thí nghiệm cố định Trypsin theo hai quy trình song song, sau đó đo độ hấp thụ UV-VIS của dịch tan ở bước sóng 280 nm Kết quả thu được sẽ được tính toán hiệu suất để đánh giá hiệu quả và xác định quy trình tối ưu hơn.
2.3.4.2 Thực nghiệm: Xác định khả năng gắn kết Trypsin với vật liệu MPC/NPC theo nhiệt độ phản ứng
Vật liệu PMO bao gồm hai mẫu là MPC và NPC, được gắn kết với Trypsin theo hai quy trình ở nhiệt độ 4 oC và 25 oC Phản ứng ở 4 oC diễn ra trong tủ lạnh của phòng thí nghiệm, trong khi phản ứng ở 25 oC được thực hiện ở nhiệt độ phòng thí nghiệm có điều hòa Sau 2 giờ, các phản ứng sẽ được đánh giá để xác định hiệu quả của quá trình gắn kết.
Cân 10mg vật liệu cho vào ống eppendorf.
Thờm 500 àl dd MES, lắc đều, ly tõm loại bỏ dịch.
Nhỏ 450 àl dd MES, 50 àl EDC (40 mg/ml) lờn vật liệu Đảo trong 15 phỳt ở nhiệt độ phòng.
Bổ sung 50 àl dd EDC 40 mg/ml, lắc đều trong 5 phỳt.
Ly tâm, loại bỏ dịch tan trên vật liệu.
Bổ sung 450àl dd MES, 50 àl dung dịch Trypsin 50mg/ml vào vật liệu.
Lắc nhẹ, để phản ứng ở 25 o C trong 2 h.
Ly tâm, thu lại dịch tan đo UV-VIS để tính lượng Trypsin dư.
Mẫu sau khi ly tõm được rửa với axit axetic pH 3 Thờm 500 àl axit axetic pH 3 vào mẫu để bảo quản.
18 kết thúc thí nghiệm, ly tâm các mẫu thu dịch tan và đo độ hấp hấp thụ UV-VIS ở bước sóng 280 nm
2.3.4.3 Thực nghiệm: Xác định khả năng gắn kết Trypsin với vật liệu MPC theo thời gian phản ứng
Dựa trên kết quả thí nghiệm trước đó, chúng tôi tiếp tục khảo sát thời gian phản ứng của vật liệu MPC theo quy trình 1 Vật liệu MPC được gắn kết Trypsin theo quy trình đã nêu, nhưng được thực hiện với các mốc thời gian khác nhau.
2, 4, 6h Tại các thời điểm kết thúc, ly tâm các mẫu thu dịch tan và đo độ hấp thụ UV- VIS ở bước sóng 280 nm
2.3.4.4 Thực nghiệm: xác định khả năng gắn kết Trypsin với vật liệu MPC theo nồng độ phản ứng
Thí nghiệm này nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Trypsin trong quá trình gắn kết đến lượng Trypsin gắn lên vật liệu và hiệu suất của quá trình Thực hiện với MPC theo quy trình 1 ở nhiệt độ 25°C trong 2 giờ, điều chỉnh thể tích đệm và thể tích Trypsin thành các mẫu với nồng độ 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml và 20 mg/ml Sau 2 giờ, các mẫu được ly tâm để thu dịch tan và đo độ hấp thụ UV-VIS ở bước sóng 280 nm, sử dụng dung dịch Trypsin với nồng độ tương ứng làm chứng.
2.3.5 Thử nghiệm thủy phân BSA bằng vật Trypsin gắn trên vật liệu PMO
2.3.5.1 Tối ưu quy trình phản ứng thủy phân BSA bằng Trypsin
Quy trình phản ứng thủy phân BSA bằng enzyme Trypsin:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu phản ứng
Lấy 0.25ml BSA nồng độ 20 mg/ml trong đệm PBS 1X(pH 7) vào ống eppendorf
Thêm vào 0,25 ml dd DTT (Dithiothreitol), giữ ở 56 o C trong 1h để giảm liên kết đisunfua
Thêm vào 0,5 ml dd IAA (Iodoacetamide), để trong tối, giữ ở nhiệt độ phòng trong 1h để alkyl hóa
Bước 2: Tiến hành phản ứng
Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
2.4.1 Xác định hình thái bằng kính hiển vi điện tử phát xạ trường FESEM Để xác định hình thái học và kích thước chính xác của các vật liệu cần phân tích mẫu qua kính hiển vi điện tử phát xạ trường FESEM trên thiết bị Hitachi S4800 tại Viện Khoa học vật liệu, Viện hàn lâm khoa học Việt Nam Kính hiển vi điện tử phát xạ trường là loại kính hiển vi có độ phân giải cực cao cho phép phân tích các mẫu có kích thước từ 1nm trở nên với độ sắc nét cao
Nguyên lý hoạt động của thiết bị dựa trên việc phóng chùm điện tử từ súng điện tử, với đầu nhọn làm từ volfram phủ Zirconi dioxide (ZrO2) Chùm điện tử này được gia tốc trong điện trường và đi qua hệ thống thấu kính từ, sau đó quét trên bề mặt mẫu thông qua các cuộn quét tĩnh điện.
Nguyên lý tạo ảnh trong FESEM dựa trên sự tương tác giữa chùm điện tử và mẫu vật, dẫn đến việc phát ra các bức xạ như điện tử thứ cấp và điện tử tán xạ ngược Điện tử thứ cấp, được ghi nhận bởi ống nhân quang nhấp nháy, có năng lượng thấp và chủ yếu phát ra từ bề mặt mẫu, tạo ra ảnh hai chiều Trong khi đó, điện tử tán xạ ngược có năng lượng cao và phụ thuộc vào thành phần hóa học của bề mặt mẫu, cho phép phân tích độ tương phản hóa học trong mẫu.
2.4.2 Phương pháp đo phổ hấp thụ UV-vis
Nanodrop là thiết bị đo phổ hấp thụ UV-vis, cho phép phân tích chính xác lượng mẫu rất nhỏ mà không cần cuvet Nguyên lý hoạt động của Nanodrop dựa trên sự hấp thụ quang của một giọt mẫu, được thực hiện thông qua hai đầu sợi quang.
Cơ chế hoạt động của thiết bị đo bắt đầu bằng việc nhỏ một lượng mẫu nhỏ (khoảng 1-3 µl) trực tiếp vào vị trí đo Sau đó, hạ đầu đo xuống vị trí mẫu và thả nhẹ để tạo khoảng cách nhỏ Nhờ sức căng bề mặt, cột chất lỏng của mẫu được kéo lên và giữ ở vị trí giữa hai sợi quang Ánh sáng từ nguồn thông qua sợi quang bên trên chiếu xuống cột chất lỏng và được xác định bởi phổ kế bên trong, với thời gian đo nhanh chóng dưới 10 giây Kết quả phổ đo và các phân tích được hiển thị trên màn hình máy tính Sau khi hoàn thành phép đo, nâng tay cầm lên và dùng giấy chuyên dụng để thấm sạch mẫu ở cả đầu đo và vị trí nhỏ mẫu.
Trong nghiên cứu này, thiết bị đo Nanodrop ND 8000 (Thermo Scientific) được sử dụng để đo nồng độ Trypsin trong dung dịch
2.4.3 Phương pháp đo Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FTIR)
Phương pháp phân tích FTIR, hay quang phổ FTIR, là kỹ thuật phân tích quan trọng giúp xác định các vật liệu hữu cơ và cao phân tử Phương pháp này sử dụng ánh sáng hồng ngoại để quét các mẫu thử, từ đó phân tích và quan sát các đặc tính hóa học của chúng.
Thiết bị phân tích hoạt động bằng cách gửi bức xạ hồng ngoại từ một mẫu, trong đó một phần bức xạ bị hấp thụ và phần còn lại được truyền đi Bức xạ hấp thụ được chuyển đổi thành năng lượng quay hoặc dao động bởi các phân tử trong mẫu Tín hiệu thu được từ máy dò phản ánh dấu vân tay phân tử của mẫu, với mỗi phân tử hoặc cấu trúc hóa học tạo ra một dấu vân tay phổ độc đáo, khiến nó trở thành công cụ hiệu quả cho việc nhận dạng hóa học.
Trong nghiên cứu này, mẫu được gửi đi đo FTIR ở tại khoa Hóa – trường Đại học Sư phạm
2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu xác định lượng Trypsin đã gắn kết
Dữ liệu thu thập từ thiết bị đo quang phổ huỳnh quang Nanodrop được nhập và lưu trữ trong phần mềm Microsoft Excel 2016 Để tính toán trung bình cộng của các lần đo, phép toán hàm AVERAGE được sử dụng Kết quả cuối cùng được trình bày dưới dạng đồ thị thông qua các chức năng vẽ đồ thị của Microsoft Excel.
Từ kết quả đó, tiến hành xác định lượng protein bị hấp phụ vào vật liệu bằng phương pháp sau:
Khối lượng protein bị hấp phụ (m) tại thời điểm bất kỳ (t) được tính dựa theo hai phương trình sau: Định luật Lambert-Beer: A = .C.d
Trong đó: A là độ hấp thụ
là hệ số hấp thụ mol (l.cm-1/mol)
C là nồng độ chất (mol/l) d là độ dài đường truyền qua mẫu (cm) Khối lượng: m = C.V
Trong đó: m là khối lượng c hất (g)
C là nồng độ chất (mg/ml)
V là thể tích dung dịch (ml)
Từ hai công thức trên ta tính được hiệu suất Trypsin được gắn trong 1(g) vật liệu:
𝐶 0 (1) Trong đó: q t : Hiệu suất gắn Trypsin lên vật liệu
C 0 : Nồng độ của mẫu chứng Trypsin (mg/ml)
C t : Nồng độ của dung dịch tại thời điểm t (mg/ml)
C 0 , C t được tính dựa vào phương trình đường chuẩn protein theo nồng độ
Số liệu tính toán được làm tròn đến chữ số thập phân thứ hai
KẾT QUẢ
Kết quả tổng hợp vật liệu MPC và NPC
Sau khi tổng hợp, vật liệu thu được có dạng bột xốp trắng, mịn Hình thái học của các vật liệu MPC và NPC được phân tích bằng kính hiển vi điện tử phát xạ trường (FESEM), cho thấy kích thước và hình thái đạt yêu cầu, sẵn sàng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1 Ảnh FESEM của mẫu vật liệu NPC (trái) và MPC (phải)
Kết quả gắn Trypsin lên vật liệu PMO
3.2.1 Xây dựng đường chuẩn nồng độ Trypsin Đo nồng độ Trypsin bằng máy đo quang phổ huỳnh quang Nanopdrop với 5 điểm nồng độ lần lượt là: 10, 5; 2; 1; 0,5 mg/mL Kết quả thu được trong bảng 3.1 dưới đây
Bảng 3.1 Kết quả đo quang nồng độ Trypsin tại 5 điểm nồng độ
Nồng độ Trypsin ban đầu
Với các kết quả đo được từ các điểm nồng độ, ta tiến hành vẽ đồ thị và dựng đường chuẩn cho nồng độ Trypsin
Hình 3.2 Đường chuẩn nồng độ Trypsin
Nhận xét: Đường chuẩn nồng độ Trypsin xây dựng được là: y = 0,1936x + 0,01
Với R² = 0,9987, đường chuẩn này đáng tin cậy và có thể áp dụng vào các tính toán sau này
3.2.2 Kết quả gắn Trypsin lê vật liệu PMO
Vật liệu NPC/MPC mang nhóm –COOH, sau khi được xúc tác bởi EDC, hình thành các liên kết peptit với enzyme Trypsin, tạo ra sự gắn kết đặc hiệu Trong quá trình ủ, Trypsin có thể bị hấp phụ và giữ lại bởi các lỗ xốp của vật liệu PMO, dẫn đến các gắn kết không đặc hiệu.
Hiệu suất gắn Trypsin lên vật liệu được tính toán dựa trên phương trình đường chuẩn của Trypsin và công thức (1) Độ hấp thụ quang của Trypsin được xác định bằng máy Nanodrop 8000.
3.2.2.1 Kết quả gắn Trypsin theo các quy trình khác nhau
Sau một thời gian, Trypsin đã được hấp phụ vào vật liệu PMO, dẫn đến phản ứng giữa gốc –COOH của PMO và gốc –NH2 của Trypsin Kết quả là nồng độ Trypsin trong dung dịch giảm, với sự giảm này tương ứng với từng quy trình của từng loại vật liệu, thể hiện qua phương trình y = 0,1936x + 0,01 và hệ số xác định R² = 0,9987.
Nồng độ Trypsin ban đầu (mg/ml)
Hình 3.3 Độ hấp thụ quang dung dịch Trypsin sau phản ứng với vật liệu MPC theo
Hình 3.4 Độ hấp thụ quang dung dịch Trypsin sau phản ứng với vật liệu NPC theo
Hình 3.5 Hiệu suất gắn Trypsin lên vật liệu PMO theo 2 quy trình phản ứng
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng quy trình 1 có hiệu suất cao hơn quy trình 2 trong cùng điều kiện nhiệt độ, với sự chênh lệch đáng kể Bên cạnh đó, hiệu suất gắn của vật liệu MPC vượt trội hơn so với vật liệu NPC, và sự chênh lệch hiệu suất giữa các quy trình cũng cao hơn khi sử dụng vật liệu MPC.
Do đó, chúng ta ưu tiên sử dụng quy trình 1 cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo 3.2.2.2 Kết quả gắn Trypsin theo các nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến các phản ứng hóa học trong thí nghiệm Khi thực hiện thí nghiệm ở hai điều kiện nhiệt độ khác nhau, chúng ta nhận thấy rõ ràng sự khác biệt trong kết quả.
Hình 3.6 Độ hấp thụ quang dung dịch Trypsin sau phản ứng với vật liệu MPC theo
Hình 3.7 Độ hấp thụ quang dung dịch Trypsin sau phản ứng với vật liệu NPC theo
Hình 3.8 Hiệu suất gắn Trypsin ở 2 nhiệt độ khác nhau
Kết quả cho thấy hiệu suất gắn kết cao hơn ở nhiệt độ phòng (25 o C), với sự chênh lệch đáng kể ở vật liệu MPC và thấp hơn ở vật liệu NPC.
Kết quả cho thấy vật liệu MPC vượt trội hơn trong việc gắn cố định enzyme Trypsin Vì vậy, các thí nghiệm tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa với vật liệu MPC 3.2.2.3 Kết quả gắn Trypsin theo các thời gian khác nhau.
Khi cho phản ứng gắn cố định Trypsin với các mốc thời gian khác nhau, chúng ta thu được những kết quả khác nhau:
Hình 3.9 Độ hấp thụ quang dung dịch Trypsin sau phản ứng với vật liệu MPC theo thời gian
Hình 3.10 Hiệu suất gắn Trypsin theo thời gian
Theo kết quả thu được, hiệu suất gắn Trypsin tăng dần theo thời gian, với mức tăng nhanh trong 2 giờ đầu đạt 31,99% Sau đó, hiệu suất tạm đạt đỉnh và chững lại ở 4 giờ, tiếp tục tăng chậm ở các khoảng thời gian dài hơn Thời gian dài hơn không làm tăng hiệu suất đáng kể so với 2 giờ, vì vậy các thí nghiệm tiếp theo sẽ được tiến hành trong 2 giờ.
3.2.2.4 Kết quả gắn Trypsin ở các nồng độ khác nhau
Nồng độ khác nhau của Trypsin ảnh hưởng đến lượng Trypsin gắn vào vật liệu, dẫn đến sự khác biệt trong kết quả Kết quả cho thấy có mối quan hệ tỷ lệ nghịch giữa khối lượng Trypsin gắn lên vật liệu và hiệu suất của quá trình.
Hi ệu suất chung Hi ệu suất gắn đặc hiệu
Hình 3.11 Hiệu suất và lượng Trypsin gắn lên vật liệu theo các nồng độ khác nhau
Kết quả cho thấy hiệu suất gắn kết cao nhất đạt được với nồng độ Trypsin thấp nhất là 2 mg/ml Khi nồng độ Trypsin trong dung dịch tăng, lượng Trypsin gắn lên vật liệu PMO cũng tăng theo, tuy nhiên hiệu suất gắn kết lại giảm dần So sánh cho thấy, lượng Trypsin gắn lên vật liệu ở nồng độ 10 mg/ml là cao.
Ở nồng độ 2 mg/ml, Trypsin cho hiệu suất khoảng 20%, trong khi ở nồng độ 5 mg/ml, hiệu suất gần gấp đôi nhưng lại giảm 10% so với nồng độ 2 mg/ml Tại nồng độ 20 mg/ml, khối lượng Trypsin gắn được rất cao, tuy nhiên, lượng Trypsin mất đi cũng lớn, điều này không phù hợp cho các thí nghiệm sau này.
3.2.2.5 Kiểm tra kết quả gắn Trypsin bằng FTIR Đem mẫu thử nghiệm đi đo FTIR, đã cho thấy sự dịch chuyển peak từ 1554,63 cm -1 sang 1558,48 cm -1 Điều này cho thấy đã có sự biến đổi từ liên kết nhóm chức – COOH sang một liên kết với nhóm phân tử khác
Lư ợn g Tr yp si n đã g ắn (m g)
Nồng độ dung dịch Trypsin (mg/ml) lượng trypsin gắn Hi ệu suất
Hình 3.12 Phổ FTIR vật liệu MPC chưa có gắn kết với Trypsin
Hình 3.13 Phổ FTIR vật liệu MPC sau khi gắn kết với Trypsin
Kết quả thủy phân BSA bằng Trypsin gắn trên vật liệu PMO
3.3.1 Xây dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp Bradford Đo nồng độ BSA bằng phương pháp Bradford với 5 điểm nồng độ lần lượt là: 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 mg/mL Kết quả thu được trong bảng 3.2 dưới đây:
Bảng 3.2 Kết quả đo nồng độ BSA tại 5 điểm nồng độ bằng pp Bradford
Nồng độ BSA ban đầu
(mg/mL) Độ hấp thụ quang
Với các kết quả đo được từ các điểm nồng độ, ta tiến hành vẽ đồ thị và dựng đường chuẩn cho nồng độ BSA
Hình 3.14 Đường chuẩn nồng độ BSA
Nhận xét: Đường chuẩn nồng độ BSA xây dựng được là: y = 0,0284x + 0,0132
Với R² = 0,9919, đường chuẩn này là đáng tin cậy và có thể dùng cho các tính toán sau này
3.3.2 Kết quả thủy phân BSA bằng Trypsin gắn trên vật liệu PMO
3.3.2.1 Tối ưu quy trình phản ứng thủy phân BSA bằng Trypsin
Kết quả thủy phân BSA bằng Trypsin theo thời gian: y = 0,0284x + 0,0132 R² = 0,9919
0 2 4 6 8 10 12 Đ ộ hấ p th ụ qu an g A bs
Nồng độ BSA (mg/ml)
Hình 3.15 Nồng độ BSA theo thời gian phản ứng
Nồng độ BSA giảm dần khi phản ứng với Trypsin theo thời gian Cụ thể, với tỷ lệ khối lượng Trypsin:BSA là 1:2,5, sau 3 giờ phản ứng, nồng độ BSA gần như đạt mức 0.
Kết quả thủy phân BSA bằng Trypsin theo nhiệt độ:
Hình 3.16 Nồng độ BSA theo các nhiệt độ phản ứng
Nhận xét: Theo kết quả trên, phản ứng thủy phân BSA bằng Trypsin xảy ra nhanh nhất ở điều kiện 50 o C, chậm nhất ở điều kiện nhiệt độ phòng
Kết quả thủy phân BSA bằng Trypsin theo các tỷ lệ khác nhau:
Hình 3.17 Nồng độ BSA khi thủy phân bằng các tỷ lệ Trypsin khác nhau
Nhận xét cho thấy rằng khi sử dụng 5 μl Trypsin, thời gian thủy phân BSA diễn ra chậm và kéo dài nhất Trong khi đó, với lượng Trypsin từ 10-20 μl, thời gian và tốc độ phản ứng tương đương nhau Đặc biệt, khi sử dụng 40-80 μl Trypsin, tốc độ phản ứng diễn ra rất nhanh, hầu như hoàn tất trong vòng 30 phút đầu.
3.3.2.2 Kết quả thủy phân BSA bằng Trypsin gắn trên vật liệu PMO
Kết quả gắn Trypsin lên vật liệu MPC trước khi tiến hành thủy phân BSA:
Bảng 3.3 Kết quả gắn Trypsin lên MPC trước khi thủy phân BSA
Tổng lượng Trypsin trong 10 mg vật liệu (mg) 0,56 ± 0,03 0,69±0,04
Lượng Trypsin gắn đặc hiệu trong
Tổng lượng Trypsin có trong 10mg vật liệu dao động từ 0,56-0,69 mg, tương ứng với 56-69 μl Trypsin nồng độ 10mg/ml Lượng Trypsin gắn đặc hiệu vào vật liệu ghi nhận là 0,24-0,27 mg, tương đương với 24-27 μl dung dịch Trypsin nồng độ 10 mg/ml.
Kết quả thủy phân BSA bằng Trypsin gắn trên vật liệu MPC:
5 àL 10 àL 20 àL 40 àL 80 àL
Bảng 3.4 Kết quả thủy phân BSA bằng Trypsin gắn trên MPC
Nồng độ BSA ban đầu 1,05±0,05
Nồng độ BSA tại 15p (mg/ml) 0,21±0,01 0,10± 0,01
Nồng độ BSA tại 30p (mg/ml) 0,01 0,00
Nghiên cứu của Trương Thị Trang [32] cho thấy vật liệu MPC có khả năng hấp phụ BSA với nồng độ ban đầu 1,05 mg/ml, trong đó lượng BSA hấp phụ được là 0,93 mg trên 1g vật liệu, tương đương 0,0093 mg trong 10 mg vật liệu thử nghiệm Giá trị này được coi là không đáng kể và có thể bỏ qua.
Tốc độ phản ứng thủy phân BSA của Trypsin gắn trên vật liệu MPC diễn ra rất nhanh chóng Trong 15 phút đầu tiên, hầu hết lượng BSA đã bị phân cắt, và sau 30 phút, lượng BSA gần như không còn được phát hiện.
BÀN LUẬN
Về kết quả gắn Trypsin lên vật liệu PMO
Từ kết quả thu được, ta nhận thấy được có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình cố định enzyme này
Ảnh hưởng của quy trình lên phản ứng gắn kết
Quy trình 1 thể hiện hiệu suất cao hơn so với quy trình 2, đồng thời mang lại sự đơn giản và thuận tiện trong thực hiện, giúp tiết kiệm thời gian và giảm thiểu sai sót Mặc dù quy trình 2 có nhiều bước hơn và các giai đoạn rõ ràng, nhưng hiệu quả lại thấp hơn Sự khác biệt cơ bản giữa hai quy trình là ở quy trình 2, dung EDC được loại bỏ sau khi hoạt hóa các nhóm chức –COOH, trong khi ở quy trình 1, EDC vẫn duy trì trong suốt quá trình phản ứng, dẫn đến các gốc –COOH được hoạt hóa ổn định và phản ứng tốt hơn.
Quy trình 1 với ít thao tác giúp giảm thiểu sai sót và nhầm lẫn, từ đó giảm sai số trong các thao tác, làm cho phản ứng trở nên thuận tiện và trôi chảy hơn.
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình phản ứng
So sánh các kết quả cho thấy Trypsin gắn kết lên các vật liệu MPC, NPC ở nhiệt độ 25 o C có hiệu suất gắn kết cao hơn so với 4 o C, cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đến phản ứng Nhiệt độ cao hơn thúc đẩy phản ứng nhanh hơn, phù hợp với quy luật tự nhiên rằng nhiệt độ tăng thường đi kèm với tốc độ phản ứng tăng Tuy nhiên, cần lưu ý không tăng nhiệt độ quá cao vì Trypsin là phân tử sinh học, nhiệt độ quá cao có thể làm biến tính và hỏng cấu trúc của nó Do đó, 25 o C là điều kiện tối ưu cho thí nghiệm, đảm bảo hiệu suất phản ứng mà không làm hỏng cấu trúc phân tử Trypsin Kết quả này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đây như của Zhang, Cao và Chase cùng Yang.
Quá trình phản ứng ở nhiệt độ 25 o C cho phép thực hiện thao tác khuấy đảo liên tục, trong khi ở nhiệt độ 4 o C thì không Điều này có thể là nguyên nhân chính dẫn đến hiệu suất phản ứng cao hơn ở 25 o C.
Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình phản ứng
Theo dõi nồng độ Trypsin trong dịch phản ứng cho thấy lượng Trypsin gắn kết trên các vật liệu phụ thuộc vào thời gian Lượng Trypsin mất đi khỏi dung dịch gia tăng nhanh chóng, đạt đỉnh tạm thời ở 2 giờ Hiệu suất ổn định tạm thời trong khoảng từ 2 đến 4 giờ, sau đó tiếp tục tăng nhẹ ở 6 và 8 giờ Điều này cho thấy thời gian tối ưu cho quy trình có thể đạt được trong khoảng từ 2 đến 4 giờ.
Kết quả cho thấy lượng Trypsin trong dung dịch tiếp tục giảm sau 4 giờ, với thời gian càng dài thì lượng Trypsin mất đi càng nhiều Điều này có thể do thời gian dài tạo ra thêm các liên kết giữa vật liệu và phân tử Trypsin Tuy nhiên, cũng không loại trừ khả năng rằng việc phản ứng kéo dài có thể khiến các phân tử Trypsin tự do gặp nhau và phân giải, dẫn đến giảm nồng độ Trypsin trong dung dịch.
Ảnh hưởng của nồng độ Trypsin lên quá trình phản ứng
Kết quả thử nghiệm cho thấy nồng độ 2 mg/ml mang lại hiệu suất gắn kết cao nhất trong quy trình phản ứng.
Nghiên cứu cho thấy rằng việc tăng nồng độ Trypsin có thể làm tăng lượng Trypsin gắn lên vật liệu PMO, nhưng không tương ứng với hiệu suất, thậm chí còn làm giảm hiệu suất của quá trình Hiện tượng giảm hiệu suất dẫn đến lãng phí không cần thiết, điều này cần được chú ý trong các thí nghiệm Do đó, cần lựa chọn nồng độ enzyme phù hợp để đảm bảo lượng enzyme gắn lên vật liệu đạt yêu cầu với hiệu suất tối ưu Trong nghiên cứu này, nồng độ 10 mg được chọn để đảm bảo lượng Trypsin gắn lên vật liệu cao nhằm đánh giá hoạt tính của enzyme, với mức hao hụt có thể chấp nhận.
Kết quả phân tích mẫu vật liệu PMO gắn Trypsin bằng FTIR
Kết quả phân tích mẫu vật liệu sau khi gắn enzyme cho thấy sự mất đi của peak 1554,63 đại diện cho nhóm chức –COOH, đồng thời xuất hiện peak mới 1558,48, khẳng định sự gắn kết của nhóm phân tử/nhóm chức mới vào vật liệu PMO Điều này chứng tỏ quy trình phản ứng diễn ra hiệu quả và việc gắn enzyme Trypsin lên vật liệu đã thành công.
Về kết quả thủy phân BSA bằng Trypsin gắn trên vật liệu PMO
Quy trình thủy phân BSA được tối ưu để nhằm mục đích đánh giá khả năng thủy phân của Trypsin sau khi được cố định
Kết quả quy trình thủy phân BSA bằng Trypsin
Trong thí nghiệm này, thời gian thủy phân BSA diễn ra nhanh chóng, chỉ từ 2,5 đến 3 giờ, trái ngược với nhiều nghiên cứu khác có thời gian thủy phân kéo dài đến 6 giờ hoặc hơn Nguyên nhân có thể là do tỷ lệ enzyme:protein (w:w) trong thí nghiệm này cao (1:2,5), trong khi các thí nghiệm như của Arrutia và cộng sự chỉ sử dụng tỷ lệ enzyme:protein (w:w) từ 1:50 đến 1:200, dẫn đến thời gian thủy phân kéo dài hơn 6 giờ.
Theo đồ thị 13, tốc độ thủy phân của Trypsin đạt đỉnh ở 50 o C, điều này không phù hợp với tính chất của enzyme này Nhiều nghiên cứu trên thế giới, bao gồm nghiên cứu của Deng và cộng sự cũng như nghiên cứu của Rio và cộng sự, đã chỉ ra những khác biệt trong điều kiện tối ưu cho hoạt động của Trypsin.
Quá trình thủy phân của Trypsin diễn ra mạnh nhất ở nhiệt độ 37°C Tuy nhiên, kết quả có thể bị sai lệch do sự không đồng bộ giữa nhiệt độ thực tế trong ống phản ứng và nhiệt độ cài đặt ở bể điều nhiệt Để đảm bảo tính khách quan, thí nghiệm được thực hiện tại 37°C theo các nghiên cứu quốc tế.
Việc tăng lượng enzyme Trypsin từ 40-80 μL (nồng độ 10mg/ml) đã dẫn đến việc rút ngắn đáng kể thời gian phản ứng, như thể hiện trong đồ thị 14.
Kết quả cho thấy thời gian thủy phân của Trypsin gắn trên vật liệu MPC ước tính khoảng 30 phút, tương tự như thời gian của 38 ứng, nhờ vào lượng enzyme được gắn lên cũng nằm trong khoảng thời gian này.
Kết quả thủy phân BSA bằng Trypsin gắn trên vật liệu PMO
Theo bảng 3.4, thời gian thủy phân BSA của Trypsin gắn trên vật liệu MPC dao động từ 15-30 phút, tương ứng với tổng lượng enzyme gắn từ 0,56-0,69 mg (56-69 μl Trypsin nồng độ 10mg/ml) Kết quả này cho thấy Trypsin cố định lên PMO vẫn duy trì hoạt tính và thậm chí có phần vượt trội Điều này chứng tỏ tiềm năng lớn của vật liệu PMO trong việc cố định enzyme.