TỔNG QUAN
Tổng quan về vật liệu nano
1.1.1 Định nghĩa khoa học nano và vật lệu nano
Khoa học nano nghiên cứu và chế tạo vật chất ở quy mô nanomet, nơi các tính chất quan trọng như điện, quang, nhiệt và cơ học được xác định bởi sự lắp ráp của các phân tử và nguyên tử Ở kích thước nanomet, các tính chất này khác biệt so với cấp độ vĩ mô do ảnh hưởng của các hiệu ứng cơ học lượng tử.
Công nghệ nano ứng dụng khoa học nano để phát triển vật liệu và thành phần kích thước nano, mang lại sản phẩm hữu ích với các đặc tính nâng cao Công nghệ này cho phép thiết kế vật liệu tùy chỉnh, phát triển các thành phần điện tử nano, cảm biến mới và thuốc "thông minh", cũng như tạo ra giao diện giữa hệ thống điện tử và sinh học Vật liệu nano được tạo ra có cấu trúc hạt, sợi, ống hoặc tấm mỏng với kích thước từ 1 đến 100 nanomet.
1.1.2 Vật liệu Silic hữu cơ siêu xốp cấu trúc tuần hoàn (PMO)
1.1.2.1 Sự ra đời của vật liệu nano silica siêu xốp cấu trúc tuần hoàn
Vào năm 1999, ba nhóm nghiên cứu Inagaki, Ozin và Stein đã tiên phong phát triển một lớp vật liệu tổng hợp nano hữu cơ-vô cơ mới, được gọi là Silica hữu cơ siêu xốp cấu trúc tuần hoàn (PMO), với cấu trúc có trật tự cao và kích thước đồng đều Vật liệu này có các đơn vị hữu cơ phân bố đồng nhất trong khung silica, giúp cải thiện chức năng hóa bề mặt của vật liệu silica thông thường, mở rộng ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực như chất hấp phụ, chất cảm ứng, chất quét và cảm biến Đặc biệt, việc ghép các gốc hữu cơ trong các kênh silica tạo ra cầu nối giữa các nguyên tử silicon lân cận, làm tăng tính năng của vật liệu này so với các loại silica khác.
PMO cho phép điều chỉnh các đặc trưng như hiệu ứng bề mặt (tính ưa nước/tính kỵ nước) và các đặc tính vật lý (hình thái, độ xốp) cùng với ổn định cơ học nhờ sự liên kết của các nhóm chức hữu cơ trong lỗ rỗng Vật liệu lai vô cơ hữu cơ được tổng hợp thông qua phản ứng thủy phân và ngưng tụ, trong đó các nhóm hữu cơ liên kết cộng hóa trị với nguyên tử silic từ silic hữu cơ, nhờ vào quá trình tự lắp ráp của tác nhân định hướng cấu trúc.
1.1.2.2 Cấu trúc và tính chất của vật liệu silic hữu cơ siêu xốp cấu trúc tuần hoàn
Vật liệu silic hữu cơ cấu trúc lỗ xốp tuần hoàn là loại vật liệu xốp rỗng với kích thước hạt từ nanomet đến micromet và kích thước lỗ ở cấp độ nanomet Thành phần chính của vật liệu bao gồm lỗ rỗng và khung, trong đó khung hoặc lỗ rỗng chứa các thành phần vô cơ như polysilsesquioxan, được kết nối bằng các liên kết hữu cơ, gọi là cầu nối lai vô cơ – hữu cơ Các polysilsesquioxan này có thể được biểu diễn bằng công thức O1,5Si-R-SiO1,5, trong đó R đại diện cho nhóm bắc cầu hữu cơ, và mỗi nhóm hữu cơ được liên kết cộng hóa trị với hai hoặc nhiều nguyên tử silicon trong khung.
Những thông số đặc trưng của vật liệu PMO được xác định thông qua đường đẳng nhiệt hấp phụ nitơ, bao gồm diện tích bề mặt riêng, thể tích lỗ và kích thước lỗ Kích thước của lỗ xốp được tính bằng khoảng cách giữa hai cạnh của rãnh hoặc đường kính của lỗ xốp, thường nằm trong khoảng từ 2 đến 50 nm theo định nghĩa của IUPAC Diện tích bề mặt riêng của vật liệu PMO thường cao hơn so với các vật liệu silica khác, thể hiện khả năng hấp phụ vượt trội, và bị ảnh hưởng bởi mức độ trùng hợp của vật liệu, phụ thuộc vào các yếu tố như pH của dung môi và tỷ lệ các chất phản ứng.
Hình 1.1 Cấu trúc của vật liệu PMO[12, 16]
1.1.2.3 Các phương pháp tổng hợp silic hữu cơ siêu xốp
Vật liệu nano được chế tạo thông qua hai phương pháp chính: phương pháp từ trên xuống (top-down) và phương pháp từ dưới lên (bottom-up) Phương pháp từ trên xuống liên quan đến việc gia công cơ học các vật liệu khối để tạo ra các hạt mịn kích thước nano Ngược lại, phương pháp từ dưới lên xây dựng vật liệu nano bằng cách lắp ráp các hạt mịn thông qua quá trình tự lắp ráp hoặc kết tủa từ các nguyên tử có kích thước angstrom.
Có năm kỹ thuật chính trong sản xuất vật liệu, bao gồm nghiền, nghiền bi năng lượng cao, in thạch bản, hợp kim cơ học, lắng đọng pha hơi hóa học (CVD) và lắng đọng pha hơi vật lý (PVD) Phương pháp từ dưới lên chủ yếu được thực hiện qua các quy trình hóa học như sol-gel, thủy nhiệt, đồng kết tủa và epitaxy chùm phân tử, như được minh họa trong Hình 1.2.
Hình 1.2 Tổng hợp vật liệu nano qua phương pháp từ trên xuống và từ dưới lên[17]
Phương pháp sol-gel là kỹ thuật hóa ướt phổ biến để phát triển vật liệu nano, với xử lý nhiệt cần thiết cho độ kết tinh của các hạt nano Sol là dung dịch keo chứa các hạt rắn kỵ dung môi kích thước từ 1-100 nanomet, trong khi gel là hệ phân tán vi dị thể với mạng lưới pha rắn liên kết chặt chẽ trong pha lỏng Mạng lưới này hình thành từ sự không bền của các hạt sol do giảm tương tác đẩy hoặc biến đổi bề mặt hạt Quá trình sol-gel chuyển sol thành gel thông qua việc hình thành mạng lưới không gian trong môi trường lỏng Phương pháp này có nhiều ưu điểm, bao gồm tổng hợp vật liệu ở nhiệt độ thấp, chế tạo vật liệu lai hóa vô cơ - hữu cơ, dễ pha tạp, và tạo ra các hình dạng khác nhau như bột, khối, màng và sợi.
Cấu trúc nano/micro có khả năng điều chỉnh độ xốp và độ bền cơ học thông qua các phương pháp xử lý nhiệt và hóa chất, trong đó hóa chất sử dụng thường là không độc hại.
Quá trình tổng hợp vật liệu PMO diễn ra thông qua thủy phân và ngưng tụ silica hữu cơ trong dung dịch nước dưới sự xúc tác của base hoặc acid Một đặc điểm nổi bật của tổng hợp PMO là sự trùng hợp silica hữu cơ với cầu nối là một nhóm hữu cơ, thay vì sử dụng cầu nối giữa đầu chất và đuôi chất Nguyên liệu chính để tổng hợp PMO bao gồm tiền chất và chất hoạt động bề mặt Tiền chất silica hữu cơ có công thức chung là [(R1O)3Si]n – R, trong đó R là một nhóm hữu cơ và n ≥ 1, với R1 có thể là các đơn vị từ đơn giản như methylen, ethylen đến các đơn vị phức tạp hơn mang các nhóm chức khác nhau như thiol, nhóm bất đối, phức kim loại và dị vòng Chất hoạt động bề mặt đóng vai trò là chất định hướng cấu trúc, tạo khuôn trong quá trình tổng hợp PMO.
Bốn con đường để tổng hợp các PMO có cấu trúc khác nhau từ các tiền chất silic hữu cơ[10]
Hình 1.3 Những con đường tổng hợp PMO
Có 4 con đường tổng hợp PMO (1) một tiền chất, (2) hơn hai tiền chất với nhóm chức hữu cơ khác nhau, (3) tiền chất với nhóm hữu cơ lơ lửng và (4) biến đổi tiếp PMO khi vừa tổng hợp xong bởi một chất hóa học xử lý phân tử hữu cơ[10]
Trong quá trình tổng hợp, phản ứng silanolates diễn ra khi nhóm (- Si - O-) kết hợp với tiền chất, tạo thành liên kết siloxan cộng hóa trị (Si - O - Si) và tiếp tục ngưng tụ thành oligome lớn hơn Tiếp theo, phản ứng sol-gel hình thành khung silsesquioxane Cuối cùng, việc thêm chất hoạt động bề mặt dẫn đến việc tạo ra vật liệu xốp rỗng PMO.
Khi sử dụng CTAB để tạo khuôn, dưới nồng độ micelle tới hạn (CMC), các chất hoạt động bề mặt hấp phụ thành lớp đơn tại bề mặt phân cách giữa nước và không khí Khi nồng độ vượt quá CMC, chúng hình thành các mixen hình cầu Tiếp theo, với sự gia tăng nồng độ, các mixen này chuyển thành hình que và sau đó là hình lục giác Môi trường mà silica hữu cơ thủy phân và ngưng tụ tạo ra hiệu ứng khuôn do silanes tích điện âm (-Si - O-) bị hút vào micelle CTAB.
N + (CH3)3 tích điện dương, và sau đó, chất hoạt động bề mặt được loại bỏ qua quá trình chiết tách Quá trình tổng hợp và chiết xuất yêu cầu điều kiện nhiệt độ và pH phù hợp để đảm bảo tính ổn định hóa học của các cầu nối hữu cơ.
Hình 1.4 Cấu trúc và hình dạng của chất hoạt động bề mặt trong dung dịch nước phụ thuộc vào nồng độ chất hoạt động bề mặt[23]
Hình 1.5 Quá trình tổng hợp PMO từ tiền chất silic hữu cơ[24]
Ứng dụng của vật liệu silic hữu cơ siêu xốp trong y sinh
Các chất hữu cơ siêu xốp tuần hoàn rỗng (PMO) đang thu hút sự chú ý lớn nhờ vào diện tích bề mặt cao và kích thước lỗ xốp có thể điều chỉnh Với mật độ thấp, lỗ hổng lớn ở trung tâm và lớp vỏ mỏng thấm nước, chúng trở thành khung lai hữu cơ-vô cơ hứa hẹn trong lĩnh vực Y Sinh PMO có nhiều ứng dụng tiềm năng như hấp phụ, xúc tác, phân tách, làm giàu các phân tử sinh học và phân phối thuốc.
1.2.1 Vai trò phân phối thuốc
Mạng lưới silic hữu cơ trung mô được tổ chức tốt trong các vật liệu như organosilane và PMO cho phép kiểm soát quá trình hấp phụ và giải phóng thuốc một cách hiệu quả Việc sử dụng thuốc tiêm tĩnh mạch thường dẫn đến mất mát một số phân tử thuốc trước khi đến đích điều trị Để tối ưu hóa hệ thống phân phối nội bào, cần đảm bảo thuốc được giải phóng có kiểm soát tại vị trí mục tiêu, tránh tác dụng phụ nghiêm trọng cho tế bào khỏe mạnh Một vật liệu lý tưởng cần có khả năng cung cấp các tác nhân chống ung thư độc hại mà không giải phóng nhanh, đồng thời phải tương thích sinh học và kiểm soát tốc độ giải phóng Các chất mang nano lai nano silica hữu cơ cho thấy ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống nhờ khả năng hấp phụ lượng lớn thuốc và chỉ giải phóng tại các vị trí cụ thể Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vật liệu PMO có thể hấp phụ và phân phối thuốc, gen, và enzym dưới tác động của nhiều kích thích khác nhau như nhiệt độ, pH, ánh sáng, từ tính và siêu âm.
1.2.2 Cố định các phân tử sinh học
Việc cố định các phân tử sinh học như protein, enzyme, và peptide trên các giá đỡ rắn đã thu hút sự quan tâm lớn trong ứng dụng thực tế Hudson và cộng sự (2005) lần đầu tiên sử dụng PMO làm chất hỗ trợ cho quá trình cố định protein/enzym, giúp khắc phục vấn đề thiếu ổn định và khả năng tái sử dụng của enzyme Phương pháp cố định protein phổ biến bao gồm hấp phụ vật lý, gắn cộng hóa trị, và đóng gói/bẫy, trong đó hấp phụ vật lý được coi là đơn giản và hiệu quả nhất Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ bao gồm điều kiện thí nghiệm như nhiệt độ, pH, cường độ ion và đặc tính vật liệu như kích thước lỗ nano Chức năng hóa bề mặt silica xốp cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường tương tác với protein Nghiên cứu của Hudson cho thấy sự hấp phụ cytochrom c trên SBA-15 lớn hơn so với etan-PMO, chỉ ra rằng tương tác tĩnh điện trong SBA-15 mạnh hơn tính kỵ nước của etan-PMO Một nghiên cứu khác cho thấy khả năng hấp phụ cyt-c trên PMO kích thước lỗ lớn không vượt trội so với vật liệu silica tương tự, do sự phụ thuộc vào lực tĩnh điện và tính kỵ nước Ngoài ra, trong quá trình cố định lysozyme trên ethane-PMO, các tương tác tĩnh điện và kỵ nước giữa lysine và axit amin trong lysozyme cũng là yếu tố quyết định.
1.2.3 Tinh sạch làm giàu các phân tử sinh học
PMO đã được ứng dụng hiệu quả trong quy trình tinh chế protein trong ngành kỹ thuật sinh học, đặc biệt là để thu được các protein có hoạt tính sinh học từ các thể vùi Mặc dù nhiều protein có thể được tinh chế ở nồng độ thấp mà không cần hỗ trợ bên ngoài, nhưng khi nồng độ protein và chất biến tính cao, cần thiết phải phát triển quy trình hiệu quả để ngăn chặn sự hình thành các tập hợp protein không hoạt động Wu và cộng sự đã giới thiệu một phương pháp mới sử dụng PMO có cầu nối ethylene để tinh chế lysozyme Với đặc tính cấu trúc và bề mặt độc đáo, PMO này có khả năng bẫy các protein bị biến tính, giảm thiểu sự hình thành tập hợp và cho phép giải phóng các protein được đóng gói một cách có kiểm soát khi gặp kích thích trong bộ đệm tinh sạch.
Hình 1.7 Quá trình tinh chế protein được hỗ trợ bởi PMO[34]
PMO đóng vai trò quan trọng trong việc làm giàu peptide, giúp phát hiện và xác định các loại peptide có ý nghĩa trong khoa học đời sống Yang và cộng sự đã phát triển các PMO nhị phân với nhóm etan làm cầu nối và nhóm axit photphonic để thu giữ phosphopeptide một cách chọn lọc Kết quả cho thấy PMO cầu nối ethane và PMO chức năng amin có khả năng phát hiện peptide từ quá trình tiêu hóa albumin huyết thanh bò (BSA) tốt hơn so với vật liệu silica tinh khiết Với mật độ lỗ rỗng cao và diện tích bề mặt lớn, PMO có khả năng hấp phụ mạnh mẽ các phân tử sinh học nhỏ hơn kích thước lỗ, nhờ vào các nhóm hữu cơ kỵ nước phân bố đồng nhất trong khung cấu trúc của chúng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình hấp phụ peptide.
Mặt điện tích trái dấu của cả hai PMO giúp điều khiển tương tác tĩnh điện giữa peptide và chất hấp phụ, tạo ra vật liệu xốp có ái lực chọn lọc với peptide tích điện dương và âm, từ đó cải thiện khả năng làm giàu peptide của PMO.
1.2.4 Vai trò chất xúc tác sinh học
Vào năm 2008, Shakeri và cộng sự đã thực hiện cố định lipase, một enzyme quan trọng trong xúc tác sinh học, vào PMO, thu hút sự quan tâm của các ngành công nghiệp hóa chất và dược phẩm trong sản xuất sản phẩm tự nhiên Ethane-PMO cho thấy khả năng hấp phụ Rhizopus oryzae lipase (ROL) cao hơn SBA-15 nhờ vào các tương tác tĩnh điện và kỵ nước Các đặc điểm bề mặt của lipase, đặc biệt là các miền kỵ nước, tạo ra tương tác kỵ nước mạnh mẽ hơn với bề mặt PMO Sau khi cố định vào PMO, tính kỵ nước, chuyển động của nắp ROL và khả năng tiếp cận chất nền đến vị trí hoạt động đã dẫn đến hoạt động phản ứng cao hơn so với SBA-15 hoặc ROL tự do.
Quá trình kỵ nước của vật chủ là yếu tố quan trọng trong việc cố định chất xúc tác sinh học, nhưng đặc điểm cấu trúc và liên kết xốp cũng ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ và xúc tác sinh học Gần đây, enzyme heme horseradish peroxidase (HRP) đã được cố định trên silica mesoporous chức năng hóa Nghiên cứu của Zhu và cộng sự cho thấy vật liệu chứa urê và carbamothioic có hàm lượng C và N cao, hấp phụ HRP nhiều hơn (40 mg/g) nhờ vào tương tác kỵ nước giữa các nhóm propyl và miền kỵ nước của enzyme, cùng với các liên kết hydro giữa nhóm amin và nhóm cacboxyl trong enzym Kích thước lỗ rỗng và hình thái của PMO cũng ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ, đồng thời cải thiện hoạt tính xúc tác và tính ổn định của HRP cố định so với enzyme tự do.
Tình hình nghiên cứu vật liệu micro/nano ứng dụng trong y học
Vật liệu Silica hữu cơ siêu xốp cấu trúc tuần hoàn (PMO) với cấu trúc và tính chất đặc biệt luôn thu hút sự chú ý của các nhà khoa học Đây là vật liệu rắn xốp, có độ bền siêu việt, và việc khai thác tối đa tiềm năng của chúng vẫn là một thách thức lớn Sự phát triển và nghiên cứu về vật liệu này ngày càng gia tăng, đặc biệt trong lĩnh vực y học, nhấn mạnh tầm quan trọng của chúng trong các ứng dụng thực tiễn.
1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu tiên phong của ba nhóm Inagaki, Ozin, và Stein vào năm 1999 đã phát triển độc lập vật liệu PMO nano hữu cơ-vô cơ mới với cấu trúc có trật tự cao và kích thước đồng đều, mở đường cho các nghiên cứu sau này trong lĩnh vực y học Các nhóm nghiên cứu như Hudson (2005), Wei Y (2016), và Croissant (2018) đã tiếp tục khám phá ứng dụng của vật liệu PMO, cung cấp cái nhìn tổng quan về các phương pháp tổng hợp vật liệu siêu xốp PMO và chứng minh ứng dụng của chúng trong việc cố định và làm giàu các phân tử sinh học, làm chất xúc tác sinh học, và chất dẫn thuốc.
Vật liệu PMO, với kích thước lỗ nanomet và cấu trúc bề mặt độc đáo, đã chứng minh tiềm năng lớn trong nghiên cứu chuẩn bị mẫu sinh học và chẩn đoán Nghiên cứu gần đây cho thấy PMO có khả năng làm giàu có chọn lọc và phân tách các phân tử sinh học hiệu quả Năm 2011, Qian và cộng sự đã tổng hợp PMO trên nền silic hữu cơ siêu xốp, với cấu trúc tích hợp và kích thước lỗ đồng nhất khoảng 3 nm, cho phép thu giữ peptide từ các hệ thống sinh học phức tạp.
Năm 2012, Ling và cộng sự đã tổng hợp và chức năng hóa các hợp chất hữu cơ xốp định kỳ (PMO) với các nhóm amino, sử dụng cầu nối hữu cơ (CH2).
PMO được chức năng hóa bằng cách thay đổi đặc tính ưa nước/kỵ nước và điện tích ròng, cho phép hấp phụ và tinh chế có chọn lọc các protein với hình dạng và điểm đẳng điện khác nhau Kết quả thí nghiệm cho thấy albumin huyết thanh bò (BSA) hấp phụ nhanh hơn hemoglobin (Hb), trong khi lysozyme (Lys) không thể hấp phụ trên vật liệu PMO Khả năng hấp phụ của PMO biến đổi nhóm amin (PMO-(NH2)2) đối với BSA là 44,67 mg/g, trong khi đối với Hb trên PMO biến đổi nhóm carboxylic (PMO-(COOH)2) là 300,0 mg/g Sự tương tác giữa các thành phần trong hỗn hợp protein ảnh hưởng mạnh mẽ đến khả năng hấp phụ, và tốc độ hấp phụ của PMO-(NH2)2 chậm hơn so với PMO-(COOH)2.
1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, Viện sỹ Nguyễn Văn Hiệu đã phát động nghiên cứu về nano vào năm 1997 Đi sau thế giới không quá chậm, một số viện nghiên cứu, trường đại học đã có bước tiến khá dài với không ít sản phẩm nano bước chân ra thị trường Để đạt những kết quả có thể chia sẻ, so sánh với các phòng thí nghiệm tiên tiến trên thế giới, họ đã chọn những hướng nghiên cứu có thể tận dụng thành quả từ các nước phát triển và tối ưu hóa sản phẩm phù hợp với điều kiện Việt Nam
Năm 2021, NCS Mai Ngọc Xuân Đạt và các cộng sự đã thành công trong việc tổng hợp hạt nano silic hữu cơ trung tính định kỳ (PMO) mới, gọi là P4S, bằng cách kết hợp các liên kết tetrasulfide phân hủy sinh học và các gốc phenylene vào khung silica Các hạt nano P4S này hoàn toàn phân hủy sau hai tuần, trong khi PMO chứa ethane (E4S) phân hủy nhanh hơn và PMO chứa nhóm vô cơ (MCM-41) không phân hủy Cordycepin (Cor) được nạp vào P4S với lượng 731,52 mg/g và được giải phóng đều đặn hơn so với E4S và MCM-41 Tốc độ giải phóng của P4S thấp hơn đáng kể so với các vật liệu khác Khoảng 50%, hơn 70% và hơn 20% cordycepin được giải phóng từ liposome, hạt nano gelatin và hydrogel methacrylate axit hyaluronic liên kết ngang Cor@P4S duy trì tác dụng chống ung thư đối với dòng tế bào ung thư gan và ngăn chặn độc tính của Cor đối với tế bào bình thường Kết quả cho thấy P4S là chất mang nano đầy hứa hẹn để tăng cường dược tính của cordycepin.
Vào năm 2012, Phan Thị Hồng Thảo và cộng sự đã thành công trong việc tổng hợp các chất hỗ trợ silic hữu cơ siêu xốp cấu trúc tuần hoàn (PMO-SBA16) với kích thước lỗ rỗng từ 8 đến 10 nm, tạo thành một cấu trúc giống như cái lồng ba chiều Các nghiên cứu cho thấy vật liệu này phù hợp để cố định enzyme acylase DAAO và GL-7-ACA, mang lại hoạt động đặc hiệu cao Thí nghiệm về hoạt động và hấp phụ của enzyme cho thấy rằng thành phần khung của các chất hữu cơ xốp ảnh hưởng lớn đến khả năng hấp phụ và hoạt động của enzyme Nhiệt độ thủy nhiệt trong quá trình tổng hợp PMO cũng ảnh hưởng đến hình thái và kích thước lỗ rỗng, là yếu tố quan trọng trong việc duy trì hoạt động của enzyme Hy vọng rằng các vật liệu PMO với kích thước lỗ rỗng lớn và diện tích bề mặt đủ kỵ nước sẽ có khả năng hấp phụ nhiều enzyme khác.
Tổng quan về Angiotensin II
Angiotensin là một hormone peptide quan trọng trong hệ thống renin-angiotensin-aldosterone, đóng vai trò then chốt trong việc điều chỉnh thể tích và huyết áp Khi huyết áp giảm hoặc có tín hiệu từ hệ giao cảm đến thận, renin được tiết ra từ các tế bào cạnh cầu thận và enzym sẽ phân cắt renin thành angiotensin.
I, một decapeptit Angiotensin I tiếp tục được phân cắt thành một octapeptide, angiotensin II nhờ tác dụng của men chuyển angiotensin (ACE), chủ yếu ở lớp nội mạc phổi, mặc dù enzym này có trong lớp nội mô của các cơ quan khác bao gồm cả tim[43]
Angiotensin II là một chất vận mạch mạnh, tác động lên các thụ thể nội mô mạch máu Hai loại thụ thể Angiotensin II có trong tim và cơ trơn mạch máu chịu trách nhiệm truyền tín hiệu làm trung gian tác động co mạch của Angiotensin II là thụ thể Angiotensin I và II Tín hiệu của chúng dẫn đến sự phosphoryl hóa myosin phụ thuộc canxi, dẫn đến sự co cơ trơn mạch máu Sự co cơ trơn động mạch này chịu trách nhiệm làm tăng huyết áp Ngoài ra, Angiotensin II tương tác với các thụ thể AT tại các vị trí khác nhau trong nephron để kích thích tái hấp thu natri Angiotensin II cũng tác động lên vùng cầu thận của vỏ thượng thận để kích thích giải phóng aldosterone, một loại hormone steroid tác động lên thận để thúc đẩy quá trình giữ natri và nước[43] Cấu trúc phân tử của Angiotensin II là C50H71 N13O12 , thành phần hóa học chứa 8 gốc acid amin Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile (Hình 1.8) trọng lượng phân tử 1046,2 g/mol.
Hình 1.8 Thành phần hóa học và cấu trúc Angiotensin II [44]
Nồng độ bình thường của Angiotensin II trong máu động mạch là 2.4±1.2 (SD) mμg./l00 ml, trong khi mức tĩnh mạch thường thấp hơn 50–75% giá trị này Nồng độ Angiotensin II tăng rõ rệt đã được ghi nhận ở nhiều bệnh nhân tăng huyết áp, bao gồm cả nguyên phát và thứ phát do bệnh thận.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết bị, hóa chất, vật tư nghiên cứu
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu: Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) (Bio Basic, Canada); 1,2-Bis(triethoxysilyl)ethane (BTEE) (A Johnson Matthey, Mỹ); 1,2-Bis(trimethoxysilyl)ethane (BTME) (A Johnson
The article lists various chemical reagents and materials used in a specific application, including (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) from Johnson Matthey, a 20% ammonia solution from Merck, sodium hydroxide from Bio Basic, bovine serum albumin (BSA) also from Bio Basic, acetonitrile and trifloroacetic acid from Merck, sodium biphosphate and sodium dibiphosphate from Bio Basic, a 0.9% sodium chloride solution from Bio Basic, 96% ethanol from Xilong Scientific, 37% hydrochloric acid from Xilong Scientific, succinic anhydride from Duksan, and human angiotensin II from Singma.
The research utilized a variety of advanced equipment, including an Esco hotte, Electrothermal CMUT1000/CE round-bottom flask heater, Eppendorf Centrifuge 5804R and MiniSpin® plus centrifuges, A&D GR-200 analytical balance, MRC temperature-controlled bath, SH Scientific drying oven, Sanaky refrigerator, IKA magnetic stirrer, Thermo Scientific Nanodrop ND 8000 UV-vis spectrophotometer, Biosan Mini-rotator Bio RS-24 shaker, Hitachi S4800 field emission scanning electron microscope (FESEM), Shimadzu IR Prestige-21 infrared spectrometer, and Micromeritics 3Flex nitrogen adsorption analyzer.
2.1.3 Vật tư, dụng cụ thí nghiệm
Các vật tư, dụng cụ thí nghiệm sử dụng trong luận án: cốc có mỏ 50, 100, 250,
Bài viết này đề cập đến các dụng cụ thí nghiệm cần thiết bao gồm: bình cầu hai cổ dung tích 250 ml và 500 ml, nhiệt kế, ống đong có dung tích 20 ml, 50 ml và 100 ml, đũa thủy tinh, hệ thống sinh hàn, thẻ cồn, giấy cồn, và pipet với các đầu cụn 20 µl, 100 µl và 1000 µl.
5 ml; giấy quỳ tím; eppendoft 1,5 ml; parafilm; falcon 50 ml; vaselin
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp tổng hợp silic hữu cơ siêu xốp kích thước nanomet
2.2.1.1 Quy trình tổng hợp nano PMO trung tính
Tổng hợp theo quy trình của Qian[36], có thay đổi thời gian tinh sạch từ 16 giờ xuống 8 giờ Cụ thể như sau:
Hòa tan 1,2 g hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) vào 300 ml dung dịch NH3 20% trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 40ºC Tiếp theo, từ từ thêm 2 ml 1,2-Bis(triethoxysilyl)ethane (BTEE) vào dung dịch và duy trì hỗn hợp ở 40°C.
Sau 3 giờ, tiến hành lọc gạn thu chất rắn và rửa bằng nước khử ion cho đến khi đạt pH trung tính, sau đó để khô ở 25ºC trong không khí Bột thu được sẽ được tinh sạch bằng cách đun hồi lưu với 120 ml ethanol 96% và 6,75 ml HCl 37% trong 8 giờ Tiếp theo, lọc gạn tủa, rửa bằng nước khử ion đến khi đạt pH trung tính và sấy khô ở 45ºC cho đến khi khối lượng không đổi.
2.2.1.2 Quy trình tổng hợp nano PMO amin
Tổng hợp theo quy trình của Qian[36], có thay đổi thời gian tinh sạch từ 16 giờ xuống 8 giờ
Hòa tan 1,2 g CTAB vào 300 ml dung dịch NH3 20% ở nhiệt độ 40ºC trong bể ổn nhiệt Thêm 2 ml BTEE và 2 ml APTES, lắc đều sau mỗi lần thêm Giữ hỗn hợp ở 40ºC trong 3 giờ, sau đó lọc và rửa chất rắn bằng nước khử ion đến khi đạt pH trung tính Tiến hành tinh sạch bằng cách đun hồi lưu với 120 ml ethanol 96% và 6,75 ml HCl 37% trong 8 giờ, rồi lọc tủa, rửa lại với nước khử ion cho đến khi đạt pH trung tính và sấy khô ở 45ºC đến khối lượng không đổi.
2.2.1.3 Tổng hợp nano PMO carboxylic:
Tổng hợp dựa trên quy trình của Yue và tối ưu hóa quá trình tổng hợp với các nồng độ khác nhau của Succinic acid anhydride (SAA) Vật liệu nano PMO amin (NPA) được sử dụng để tổng hợp nano PMO carboxylic SAA được dùng để biến đổi bề mặt chứa nhóm amin thành nhóm cacboxyl Dung dịch SAA được chuẩn bị với nồng độ 1mg/ml và 10mg/ml, pH = 6 Tiến hành làm 3 mẫu đồng thời, trong đó mẫu 1 (NPC1) được hòa tan.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành chuẩn bị ba mẫu khác nhau với 50 mg NPA Mẫu 1 (NPC1) sử dụng 2,5 ml dung dịch SAA 1 mg/ml, mẫu 2 (NPC10) với dung dịch SAA 10 mg/ml, và mẫu 3 (NPC50) với dung dịch SAA 50 mg/ml Các phản ứng được thực hiện trong thời gian 2 giờ, sau đó chất rắn được lọc gạn thu lại.
19 rửa bằng nước khử ion đến khi về pH trung tính Sấy ở 45°C đến khối lượng không đổi Bảo quản trong ống nghiệm kín ở 25°C
2.2.2 Phương pháp tổng hợp silic hữu cơ siêu xốp kích thước micromet
2.2.2.1 Quy trình tổng hợp micro PMO trung tính
Quy trình tổng hợp micor PMO trung tính theo phương pháp của Qian bao gồm các bước sau: Hòa tan 1,29 g CTAB và 0,6 g NaOH trong 300 ml nước cất ở 25ºC, sau đó thêm 1,5 ml BTME vào dung dịch và khuấy liên tục trong 8 giờ Tiếp theo, giữ dung dịch ở 95ºC trong 24 giờ, sau đó lọc và rửa chất rắn bằng nước khử ion đến pH trung tính Cuối cùng, tinh sạch bằng cách đun hồi lưu với 120 ml ethanol 96% và 6,75 ml HCl 37% trong 8 giờ, lọc tủa, rửa và sấy khô ở 45ºC đến khối lượng không đổi.
2.2.2.2 Quy trình tổng hợp micro PMO amin
Quy trình tổng hợp micro PMO amin được thực hiện dựa trên phương pháp của Qian với một số biến đổi Đầu tiên, hòa tan 0,1g MPT vào 125 ml dung dịch NH3 20% trong bể điều nhiệt ở 40ºC Tiếp theo, từ từ thêm 0,125 ml APTES vào dung dịch, đồng thời lắc đều và duy trì hỗn hợp ở 40°C trong 3 giờ (MPA3) hoặc 5 giờ (MPA5) Sau khi hoàn tất, lọc gạn thu chất rắn, rửa bằng nước khử ion cho đến khi đạt pH trung tính và để khô ở 25ºC trong không khí Cuối cùng, bột thu được được tinh sạch bằng cách đun hồi lưu với 40 ml ethanol 96% và 2,25 ml HCl 37%.
Lọc gạn tủa và rửa bằng nước khử ion đến khi đạt pH trung tính, sau đó sấy ở 45°C cho đến khi khối lượng ổn định Cuối cùng, bảo quản sản phẩm trong ống nghiệm kín ở nhiệt độ 25°C.
2.2.2.3 Tổng hợp vật liệu Micro PMO carboxylic (MPC)
Tổng hợp micro PMO carboxylic được thực hiện bằng cách sử dụng vật liệu micro PMO amin (MPA) theo quy trình của Yue Đầu tiên, hòa tan 1,038g MPA3 vào 52ml dung dịch SAA có nồng độ 10mg/ml với pH = 6 Phản ứng được duy trì trong 2 giờ, sau đó tiến hành ly tâm và lọc để thu chất rắn Chất rắn được rửa bằng nước khử ion cho đến khi đạt pH trung tính, sau đó sấy ở 45°C cho đến khi khối lượng không đổi Cuối cùng, sản phẩm được bảo quản trong ống nghiệm kín ở nhiệt độ 25°C.
Phương pháp xác định tính chất đặc trưng của vật liệu
2.3.1 Phương pháp xác định hình thái học của vật liệu Để xác định hình thái học và kích thước chính xác của các vật liệu cần phân tích mẫu qua kính hiển vi điện tử phát xạ trường FESEM trên thiết bị Hitachi S4800
Kính hiển vi điện tử phát xạ trường tại Viện Khoa học vật liệu, Viện hàn lâm khoa học Việt Nam, là thiết bị có độ phân giải cực cao, cho phép phân tích các mẫu có kích thước từ 1nm trở lên với độ sắc nét cao Thiết bị này bao gồm các thành phần như súng điện tử, tụ kính, buồng tiêu bản, hệ thống đầu dò điện tử, hệ thống khuếch đại, máy tính và màn hình quan sát Chùm điện tử từ súng điện tử đi qua tụ kính và vật kính, sau đó quét toàn bộ bề mặt mẫu, tạo ra các tia khác nhau như điện tử thứ cấp, điện tử tán xạ ngược, điện tử Auger, tia huỳnh quang catot và tia X đặc trưng Hình ảnh hiển vi điện tử được thu nhận từ các điện tử thứ cấp và điện tử tán xạ ngược qua các đầu dò gắn bên sườn kính, trong khi tia X đặc trưng giúp phản ánh thành phần nguyên tố của mẫu nhờ vào bộ phân tích phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS).
2.3.2 Phương pháp xác định diện tích bề mặt riêng, thể tích lỗ rỗng, kích thước lỗ rỗng của vật liệu Đánh giá diện tích bề mặt và thể tích lỗ xốp bằng phương pháp hấp phụ - khử hấp phụ khí N2 bằng thiết bị đo 3Flex Phiên bản 3.02 (Micromeritics, Hoa Kỳ) tại Viện Khoa học vật liệu, Viện hàn lâm khoa học Việt Nam Phương pháp này dựa trên việc xác định lượng khí cần thiết để bao phủ bề mặt của một lớp đơn phân tử Lượng khí này được xác định từ đường cong hấp phụ đẳng nhiệt của nitơ ở nhiệt độ của nitơ lỏng (77,4 K) theo Brunauer, Emmett và Teller (mô hình BET) từ đó xác định diện tích bề mặt và thể tích lỗ xốp của vật liệu Lượng N2 hấp phụ ở một áp suất cho trước được xác định bằng phép đo thể tích hoặc khối lượng Để loại bỏ chất nhiễm bẩn bề mặt chất hấp phụ, mẫu được hút chân không và được gia nhiệt trong điều kiện thích hợp trước khi phép đo được thực hiện
2.3.3 Phương pháp xác định thành phần nhóm chức của vật liệu
Phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier (FTIR) là một phương pháp hóa lý cho phép ghi lại quang phổ hồng ngoại bằng cách đo sự dao động của các phân tử khi bị kích thích bởi bức xạ hồng ngoại Kỹ thuật này được sử dụng để phân tích định tính sự hiện diện của các liên kết hữu cơ và vô cơ trong mẫu vật liệu Phân tích phổ hồng ngoại giúp xác định vị trí, cường độ và hình dạng của các vân phổ, trong đó mẫu đo hấp thụ chọn lọc ánh sáng hồng ngoại, dẫn đến sự dao động của các phân tử trong hợp chất.
21 của các nguyên tử phụ thuộc vào hằng số lực của liên kết và khối lượng của chúng
Do đó các nhóm chức khác nhau có tần số hấp phụ khác nhau và nằm trong vùng từ
5000 - 200 cm -1 , vùng có ý nghĩa nằm trong khoảng 4000 - 400 cm -1
Tất cả các mẫu đã được phân tích bằng quang phổ hồng ngoại trên thiết bị IR Prestige-21 của Shimadzu, Nhật Bản Quy trình này được thực hiện tại Khoa Hóa, Đại học Sư phạm.
của các vật liệu PMO
KẾT QUẢ
3.1.1 Khối lượng các vật liệu PMO
Sau khi để khô, các vật liệu PMO thu được có màu trắng, bột, xốp, mịn
Hình 3.1 Cảm quan các vật liệu PMO sau khi sấy khô
NPT: nano PMO trung tính, NPA: nano PMO amin, NPC: nanoPMO cacboxyl, MPT: Micro PMO trung tính, MPA: micro PMO amin, MPC: micro PMO cacboxyl
Khối lượng các vật liệu PMO được tổng hợp được liệt kê trong Bảng 3.1
Bảng 3.1 Khối lượng các vật liệu PMO tổng hợp được
STT Mẫu Khối lượng (g) và thể tích nguyên liệu ban đầu (ml)
Khối lượng vật liệu tổng hợp được (g)
2 NPA 1,2g CTAB + 1 ml BTEE + 1 ml
MPT là mẫu microPMO trung tính, trong khi MPA3 và MPA5 là các mẫu microPMO amin với thời gian thủy phân APTES lần lượt là 3 giờ và 5 giờ MPC đại diện cho mẫu microPMO cacboxyl Đối với nanoPMO, NPT là mẫu trung tính, NPA là mẫu amin, và NPC1 là mẫu cacboxyl với nồng độ SAA là 1mg/ml NPC10 cũng là mẫu nanoPMO cacboxyl nhưng không nêu rõ nồng độ SAA.
10mg/ml: NPC50: Mẫu nanoPMO cacboxyl, nồng độ SAA là 50mg/ml
3.1.2.1 Thành phần nhóm chức vật liệu nanoPMO
Sự biến đổi hóa học của các PMO được phân tích thông qua phương pháp phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier (FTIR) Kết quả cho thấy trong phổ của bốn vật liệu nanoPMO: NPT, NPA1, NPA2 và NPA3, không có sự xuất hiện của các đỉnh đặc trưng cho dao động của CTAB tại các bước sóng 1470 cm -1, 1402 cm -1, 1626 cm -1, 2850 cm -1 và 2918 cm -1 (Hình 3.2).
Hình 3.2 Phổ FTIR của các mẫu nanoPMO
Mẫu nanoPMO trung tính được ký hiệu là NPT, trong khi mẫu nanoPMO amin được gọi là NPA Mẫu nanoPMO cacboxyl có ba loại với nồng độ SAA khác nhau: NPC1 với nồng độ 1mg/ml, NPC10 với nồng độ 10mg/ml và NPC50 với nồng độ 50mg/ml.
Các đỉnh hấp thụ quan trọng trong phổ hồng ngoại bao gồm 1412 cm -1 và 1270 cm -1, tương ứng với dao động của liên kết Si-CH2 Đỉnh 910 cm -1 phản ánh dao động của liên kết Si-O-H, trong khi các đỉnh 444 cm -1, 1033-1044 cm -1 và 1095 cm -1 liên quan đến dao động Si-O-Si Đỉnh 1167 cm -1 tương ứng với dao động Si-O-C, sẽ biến mất khi quá trình thủy phân hoàn tất Đặc biệt, đỉnh 1516 cm -1 xuất hiện trong phổ của các PMO amin nhưng không có mặt trong phổ của PMO trung tính NPT.
Nghiên cứu cho thấy rằng ở 26 cm-1, dao động của liên kết NH2 trong APTES đã thủy phân chứng tỏ sự hình thành các PMO có nhóm chức amin Đỉnh 1554 cm-1, chỉ xuất hiện trong phổ của nanoPMO carboxyl, tương ứng với dao động CO-NH, không có trong phổ của PMO trung tính NPT, cho thấy sự hình thành PMO có nhóm chức carboxylic Cường độ đỉnh hấp thụ này tăng dần từ NPC1, NPC10 đến NPC50, phù hợp với sự gia tăng nồng độ SAA tạo nhóm chức cacboxyl ở 1mg/ml, 10mg/ml và 50mg/ml NPC10 được xác định là PMO cacboxyl tối ưu nhất với nhiều nhóm chức cacboxyl nhất.
3.1.2.2 Thành phần nhóm chức vật liệu microPMO
Sự biến đổi hóa học của các PMO được xác định qua phương pháp FTIR, với đỉnh 1512 cm-1 xuất hiện trong phổ của microPMO amin MPA3 và MPA5, cho thấy sự hiện diện của liên kết NH2 trong APTES đã thủy phân Điều này chứng minh rằng các microPMO amin đã được tạo ra với nhóm chức amin trong cấu trúc Với thời gian tổng hợp lần lượt là 3 giờ và 5 giờ, MPA3 được xác định là vật liệu tối ưu nhờ thời gian tổng hợp ngắn hơn.
Hình 3.3 Phổ FTIR của các mẫu micro PMO amin MPA3, MPA5
MPA3: Mẫu microPMO amin, thời gian thủy phân APTES là 3 giờ; MPA5: Mẫu microPMO amin, thời gian thủy phân APTES là 5 giờ
Trong phổ của cả 3 vật liệu microPMO không xuất hiện các đỉnh đặc trưng cho dao động của CTAB là 1470 cm -1 , 1402 cm -1 , 1626 cm -1 , 2850 cm -1 , 2918 cm -1 (Hình 3.4)
Hình 3.4 Phổ FTIR của các mẫu micro PMO
MPT: Mẫu microPMO trung tính; MPA3: Mẫu microPMO amin, thời gian thủy phân APTES là 3 giờ; MPC: Mẫu microPMO cacboxyl
Các đỉnh hấp thụ tại 1412 cm -1 và 1270 cm -1 liên quan đến dao động của liên kết Si-CH2, trong khi đỉnh 910 cm -1 thể hiện dao động của liên kết Si-O-H Các đỉnh 444 cm -1, 1033-1044 cm -1 và 1095 cm -1 tương ứng với dao động Si-O-Si, còn đỉnh 1167 cm -1 phản ánh dao động Si-O-C, sẽ biến mất khi thủy phân hoàn toàn Đỉnh 1512 cm -1 đặc trưng cho liên kết NH2 của microPMO amin MPA3, không có mặt trong phổ của microPMO trung tính MPT Đỉnh 1555 cm -1 trong phổ của MPC tương ứng với dao động CO-NH, cho thấy rằng acid succinic anhydride đã phản ứng với nhóm amin trong MPA3 để tạo ra liên kết amide và nhóm chức carboxyl.
3.1.3 Hình thái học của vật liệu
3.1.3.1 Hình thái học của nanoPMO
Hình thái học của các nanoPMO: NPT, NPA, NPC10 được phân tích bằng kính hiển vi điện tử phát xạ trường (FESEM) (Hình 3.5)
Hình 3.5 Hình ảnh FESEM của nano PMO
NPT: Mẫu nanoPMO trung tính; NPA: Mẫu nanoPMO amin; NPC10: Mẫu nanoPMO cacboxyl, nồng độ SAA là 10mg/ml
Mẫu nanoPMO trung tính (NPT) có hình lục giác với kích thước trung bình từ 500 nm đến 2μm Trong khi đó, mẫu nanoPMO amin (NPA) có hình cầu với kích thước đồng đều từ 1 đến 2 μm Mẫu nanoPMO carboxylic (NPC10) cũng có hình cầu, nhưng bề mặt của NPC10 sần sùi và không mịn màng như NPT và NPA.
3.1.3.2 Hình thái học vật liệu microPMO
Hình thái học của các microPMO được phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEM) (Hình 3.6)
Hình 3.6 Hình ảnh FESEM mẫu microPMO
MPT: Mẫu microPMO trung tính; MPA3: Mẫu microPMO amin, thời gian thủy phân APTES là 3 giờ; MPC: Mẫu microPMO cacboxyl
Hình ảnh FESEM cho thấy MPT có cấu trúc hình cầu với kích thước không đồng đều, trải dài từ 2 – 10 μm Mẫu microPMO amin MPA và microPMO cacboxylic MPC cũng có dạng hình cầu, nhưng số lượng còn ít do đang trong quá trình khởi tạo Quy trình tổng hợp chưa được tối ưu hoàn toàn, dẫn đến kích thước không đồng đều từ 1 đến 5 μm.
Các thông số đặc trưng của vật liệu PMO bao gồm diện tích bề mặt riêng, thể tích lỗ và kích thước lỗ Đối với chất rắn xốp, diện tích bề mặt riêng là tổng diện tích bề mặt ngoài và bề mặt bên trong của các lỗ rỗng Thể tích lỗ được xác định bằng tổng thể tích nitơ hấp thụ.
Bảng 3.2 Các đặc trưng của vật liệu PMO
Mẫu Diện tích bề mặt riêng
(m 2 /g) Thể tích lỗ (m 3 /g) Kích thước lỗ (nm)
NPT: Mẫu nanoPMO trung tính; NPA: Mẫu nanoPMO amin; NPC10: Mẫu nanoPMO cacboxyl, nồng độ SAA là 10mg/ml
MPT: Mẫu microPMO trung tính; MPA3: Mẫu microPMO amin, thời gian thủy phân APTES là 3 giờ; MPC: Mẫu microPMO cacboxyl
Thể tích lỗ xốp và đường kính lỗ xốp của các mẫu PMO cho thấy rằng cả sáu vật liệu đều có tính chất siêu xốp Vật liệu nanoPMO có diện tích bề mặt riêng từ 200-1500 m²/g, kích thước lỗ khoảng 2-3 nm và thể tích lỗ từ 0,2-1 m³/g Trong khi đó, microPMO có diện tích bề mặt riêng nhỏ hơn, khoảng 600-900 m²/g, kích thước lỗ lớn hơn (3-5 nm) và thể tích lỗ từ 0,5-1 m³/g Đặc biệt, trong các loại nanoPMO amin, NPT có diện tích bề mặt riêng và thể tích lỗ lớn hơn so với NPA và NPC10, trong khi kích thước lỗ của ba loại vật liệu này tương đương nhau.
3 loại microPMO trung tính, MPT có diện tích bề mặt riêng, kích thước lỗ và thể tích lỗ lớn nhất
3.2 Khảo sát khả năng hấp phụ làm giàu, phân tách angiotensin II của vật liệu
3.2.1 Đường chuẩn Angiotensin II và BSA Để ứng dụng vật liệu silic hữu cơ siêu xốp nhằm phân tách các phần tử sinh học kích thước nhỏ khỏi các protein kích thước lớn, thực hiện khảo sát hấp phụ không đặc hiệu của vật liệu với protein có kích thước lớn Trong công trình này sử dụng protein huyết thanh bò BSA có khối lượng phân tử 66 kDa (kích thước ~10 nm)[49] và protein Angiotensin II khối lượng phân tử 1,046 kDa[50] làm mô hình Đo nồng độ Angiotensin II bằng máy đo quang phổ huỳnh quang Nanodrop với 5 điểm nồng độ lần lượt là 500 àg/ml, 250 àg/ml, 125 àg/ml, 62,5 àg/ml, 31,25 àg/ml Kết quả thu được để xây dựng đường chuẩn Angiotensin theo nồng độ hình 3.7
Hình 3.7 Đường chuẩn nồng độ Angiotensin phụ thuộc vào độ hấp phụ y = 0.0011x - 0.0016 R² = 0.9992
0 200 400 600 Đ ộ hấ p ph ụ củ a a n g io te n si n
Nồng độ angiotensin ban đầu àg/ml
30 Đo nồng độ BSA với 5 điểm nồng độ lần lượt là 10; 5; 2,5; 1; 0,5 mg/mL Kết quả thu được để xây dựng đường chuẩn BSA theo nồng độ hình hình 3.8
Hình 3.8 Đường chuẩn nồng độ BSA phụ thuộc vào độ hấp phụ
Phương trình đường chuẩn đã xây dựng được liệt kê trong Bảng 3.2
Bảng 3.3 Phương trình đường chuẩn của các protein
STT Tên protein Đường chuẩn R 2
3.2.2 Khả năng hấp phụ và làm giàu, phân tách angiotensin II của vật liệu
3.2.2.1 Xác định thời gian cần để hấp phụ tối đa Angiotensin II
Khối lượng Angiotensin II hấp phụ trên 1 gram vật liệu tại thời điểm t được tính toán dựa vào phương trình đường chuẩn và công thức (1), với độ hấp phụ được xác định bằng máy quang phổ huỳnh quang Nanodrop Nghiên cứu sử dụng 10mg vật liệu MPT để hấp phụ 50μl dung dịch protein Angiotensin có nồng độ 0,5mg/mL trong các khoảng thời gian khác nhau Kết quả cho thấy lượng Angiotensin II hấp phụ tăng dần theo thời gian; sau 2 phút, khoảng 50% lượng protein đã được hấp phụ, và đến 5 phút, Angiotensin II đạt mức bão hòa Thời gian tối ưu để hấp phụ tối đa Angiotensin II là 5 phút, với phương trình y = 0.6296x - 0.0232 và R² = 0.9999.
Nồng độ BSA ban đầu (mg/mL)
Hình 3.9 Khối lượng Angiotensin II hấp phụ lên 1g MPT theo thời gian
MPT: Micro PMO trung tính
3.2.2.2 Xác định thời gian cần để thôi tối đa Angiotensin II ra khỏi vật liệu Để xác định thời gian cần để thôi tối đa Angiotensin II ra khỏi vật liệu Nghiên cứu sử dụng 10mg MPT hấp phụ 200μl dung dịch Angiotensin II 0,2 mg/ml trong vòng 5 phút (thời gian hấp phụ Angiotensin II tối đa) Sau khi thêm dung dịch thôi (elutent), đo nồng độ của Angiotensin II trong dung dịch thôi sau mỗi thời điểm Kết quả cho thấy lượng Angiotensin II thôi ra khỏi vật liệu sau khi hấp phụ tăng lên theo thời gian Có thể thấy rằng thời điểm sau 30 phút lượng Angiotensin II đã được thôi ra hết từ MPT và đạt mức bão hòa Như vậy, thời gian cần để thôi tối đa Angiotensin
II ra khỏi vật liệu là 30 phút (Hình 3.10)
0 2 4 6 8 10 12 lư ợ ng AG II hấ p thụ (m g/g )
K h ối lư ợ n g A n gi ot en si n th ôi r a (m g/ g)
Hình 3.10 Xu hướng thôi Angiotensin II từ vật liệu MPT theo thời gian
MPT: Micro PMO trung tính
3.2.2.3 Khảo sát sự làm giàu Angiotensin II của các vật liệu PMO
Sau khi xác định thời gian hấp phụ tối đa của Angiotensin II, chúng tôi tiến hành khảo sát sự làm giàu của Angiotensin II trên cả 6 vật liệu PMO.
BÀN LUẬN
4.1.1 Tối ưu quy trình tổng hợp vật liệu PMO
Phương pháp sol-gel để tổng hợp hạt nano có nhiều ưu điểm nổi bật như tổng hợp ở nhiệt độ thấp, khả năng chế tạo vật liệu lai hoá vô cơ - hữu cơ, dễ pha tạp và tạo ra các hình dạng khác nhau như bột, khối, màng, sợi Phương pháp này cho phép điều khiển độ xốp và độ bền cơ học thông qua xử lý nhiệt, với hóa chất thường không độc Quá trình gel hóa trong phương pháp sol-gel ảnh hưởng đến đường kính lỗ và độ xốp của vật liệu Nguyên lý tổng hợp PMO dựa trên thủy phân và ngưng tụ để tạo thành hệ sol ổn định, sau đó trùng hợp các hạt sol thành cấu trúc gel ba chiều Nguyên liệu chính bao gồm tiền chất silic hữu cơ như 1,2-Bis(triethoxysilyl)ethane (BTEE) và 1,2-Bis(trimethoxysilyl)ethane (BTME) cho nano và micro PMO Chất hoạt động bề mặt CTAB đóng vai trò định hướng cấu trúc trong quá trình tổng hợp, trong khi các PMO được chức năng hóa bề mặt với nhóm amin nhờ APTES và nhóm cacboxyl nhờ SAA.
Sản phẩm cuối cùng đã được đo phổ FTIR, cho thấy tất cả các PMO không còn đỉnh đặc trưng của CTAB Quy trình tổng hợp vật liệu dựa trên phổ FTIR để tối ưu nồng độ chất tạo nhóm chức cacboxyl và thời gian APTES thủy phân Để xác định nồng độ SAA tối ưu cho nhóm chức carboxyl, vật liệu PMO cacboxyl được tổng hợp với 3 nồng độ SAA: 1mg/ml, 10mg/ml, và 50mg/ml, trong thời gian phản ứng 8 giờ Phổ FTIR cho thấy ở nồng độ 10mg/ml có số lượng nhóm cacboxyl nhiều nhất, và thời gian phản ứng SAA rút ngắn còn 2 giờ thay vì 24 giờ như tác giả Yue Đối với microPMO amin, thời gian APTES tối ưu là 3 giờ, khi đó dao động NH2 được ghi nhận Kết quả FESEM cho thấy hình thái học của microPMO amin và PMO carboxyl chưa đồng đều, cho thấy vẫn đang trong quá trình khởi tạo.
35 trình này chưa phải là quy trình tối ưu tuy nhiên trong phổ FTIR cũng đã có sự xuất hiện của nhóm amin -NH2 trong cấu trúc hóa học
4.1.2 Đặc trưng của vật liệu PMO
Các mẫu PMO cho thấy cả sáu vật liệu đều có tính chất siêu xốp với thể tích lỗ và đường kính lỗ xốp khác nhau Vật liệu nanoPMO có diện tích bề mặt riêng từ 200-1500 m²/g, kích thước lỗ khoảng 2-3 nm và thể tích lỗ từ 0,2-1 m³/g Trong khi đó, microPMO có diện tích bề mặt riêng nhỏ hơn, khoảng 600-900 m²/g, kích thước lỗ lớn hơn từ 3-5 nm và thể tích lỗ từ 0,5-1 m³/g Hình thái hạt ảnh hưởng đáng kể đến diện tích bề mặt riêng; kích thước hạt nhỏ hơn sẽ dẫn đến diện tích bề mặt riêng lớn hơn Các hạt có hình dạng bất thường và bề mặt thô ráp thường có diện tích bề mặt riêng cao hơn so với các hạt có bề mặt nhẵn Dựa trên những so sánh này, nanoPMO và microPMO có thể được thử nghiệm cho các ứng dụng phân tách và làm giàu các phân tử sinh học với kích thước và điện tích phù hợp.
Các vật liệu PMO trong luận văn được tổng hợp dựa trên quy trình của Qian và Yue Qian đã thành công trong việc tổng hợp hai loại vật liệu PMO: microPMO trung tính (PMOM) và nanoPMO trung tính (PMON) Zhu cũng đã tổng hợp thành công PMO trung tính (PMOT) và PMO amin (PMO-NH2) Yue đã tổng hợp PMO cacboxyl (ss-MONs), với các kết quả được tóm tắt ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1 So sánh các đặc trưng của vật liệu trong nghiên cứu nàyvới những nghiên cứu khác
Diện tích bề mặt riêng (m 2 /g)
Qian[5] microPMO trung tính 976 0.74 2.8 Cầu 200-750 nanoPMO trung tính 612 0.56 3.1 Cầu 2000-5000
Zhu[40] PMO trung tính 710 0.75 5.7 Que 1500×100-200
NPT: Mẫu nanoPMO trung tính; NPA: Mẫu nanoPMO amin; NPC10: Mẫu nanoPMO cacboxyl, nồng độ SAA là 10mg/ml
MPT: Mẫu microPMO trung tính; MPA3: Mẫu microPMO amin, thời gian thủy phân APTES là 3 giờ; MPC: Mẫu microPMO cacboxyl
Nghiên cứu này chỉ ra rằng vật liệu NPT và MPT có diện tích bề mặt riêng, thể tích lỗ và kích thước lỗ lớn hơn so với vật liệu PMO theo nghiên cứu của tác giả Qian Về kích thước hạt, kết quả từ hai nghiên cứu cho thấy kích thước hạt nanoPMO trung tính khoảng 200-750nm và kích thước hạt microPMO trung tính trong khoảng 2000-5000nm.
Trong nghiên cứu của tác giả Zhu, các vật liệu PMO trung tính và amin được tổng hợp có dạng hình que với kích thước lỗ khoảng 5,5-5,7nm, tương đương với kích thước lỗ của microPMO amin trong nghiên cứu của chúng tôi Tuy nhiên, PMO trong nghiên cứu của Zhu khác với nghiên cứu của chúng tôi do việc sử dụng chất hoạt động bề mặt khác nhau: Zhu sử dụng P123, một co-polymer không ion hóa có tính chất biến đổi thể chất theo nhiệt độ Khi nhiệt độ vượt quá 20°C và nồng độ tăng, P123 chuyển từ dạng lỏng sang gel do hình thành micelle Ngược lại, nghiên cứu của chúng tôi sử dụng chất hoạt động bề mặt cation CTAB làm khuôn.
Nghiên cứu của Yue cho thấy rằng các vật liệu PMO cacboxyl có diện tích bề mặt riêng, thể tích lỗ và kích thước lỗ lớn hơn, nhưng kích thước hạt lại nhỏ hơn Sự khác biệt này xuất phát từ việc sử dụng tiền chất khác nhau; Yue sử dụng Bis[3-(triethoxysily)propyl]tetrasulfide (BTES), trong khi chúng tôi sử dụng BTME và BTEE, những tiền chất có cấu trúc khác nhau, dẫn đến kích thước vật liệu khác nhau.
4.2 Về kết quả khảo sát sự hấp phụ, làm giàu, phân tách protein của vật liệu PMO
Y học hiện đại đang chú trọng vào việc phát hiện các marker sinh hóa quan trọng để sàng lọc và chẩn đoán sớm bệnh lý Ở giai đoạn đầu của bệnh, nồng độ các dấu chỉ sinh học trong dịch sinh học thường rất thấp, gây khó khăn trong việc phân tích và định lượng Do đó, việc tăng nồng độ các dấu chỉ sinh học trước khi phân tích là cần thiết để nâng cao độ nhạy và độ chính xác của các kỹ thuật phát hiện Để thực hiện điều này, vật liệu PMO với kích thước lỗ phù hợp đã được tổng hợp, vì kích thước lỗ ảnh hưởng lớn đến khả năng hấp phụ chọn lọc của các phân tử sinh học.
Khả năng hấp phụ protein của các vật liệu micro/nanoPMO được thực hiện thông qua phương pháp hấp phụ vật lý, một cách tiếp cận đơn giản và hiệu quả.
Nguyên lý cơ bản trong quá trình hấp phụ protein là tạo sự tiếp xúc giữa vật liệu và protein trong một khoảng thời gian nhất định Sau khi ủ, các peptid kích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào lỗ xốp, trong khi các protein lớn không thể khuếch tán và sẽ bị rửa trôi hoặc hấp phụ lên bề mặt vật liệu Vật liệu nano thường không hiệu quả trong việc bắt protein do kích thước lớn (> 3,2 nm) của hầu hết các protein Tuy nhiên, vật liệu PMO với kích thước lỗ nhỏ có khả năng hấp phụ protein không đặc hiệu, dẫn đến giảm lượng protein trong dung dịch Để đo độ hấp phụ, sử dụng máy quang phổ huỳnh quang Nanodrop với mẫu 3µL, sau đó tính toán lượng protein hấp phụ trên 1 gam vật liệu theo công thức (1).
Nghiên cứu sự hấp phụ protein của vật liệu PMO được thực hiện với Angiotensin II, một phân tử nhỏ có trọng lượng 1046 Dalton Quá trình ủ giữa vật liệu micro PMO trung tính MPT và Angiotensin II được khảo sát tại các thời điểm 2, 5, 10, và 30 phút, nhằm xác định thời gian bão hòa hấp phụ protein Kết quả cho thấy, lượng Angiotensin II hấp phụ lên vật liệu MPT tăng nhanh trong 2 phút đầu và đạt trạng thái bão hòa tại thời điểm 5 phút, do đó đây là mốc thời gian tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo Khi tiến hành thí nghiệm với dung dịch elutent, số liệu cho thấy sau 30 phút, Angiotensin II gần như được giải phóng hoàn toàn khỏi vật liệu, xác định thời điểm 30 phút là thời gian tối đa cho quá trình thôi Angiotensin II trong các thí nghiệm sau.
Sau khi xác định thời gian tối ưu cho vật liệu hấp phụ Angiotensin II, tiến hành khảo sát khả năng làm giàu Angiotensin của 6 vật liệu PMO Các vật liệu này được thử nghiệm với nồng độ Angiotensin II rất thấp, không thể định lượng bằng phương pháp đo phổ hấp phụ tử ngoại ở bước sóng 280 nm trong 5 phút Kết quả cho thấy khả năng hấp phụ của các vật liệu này đối với Angiotensin II.
II ra khỏi vật liệu trong vòng 30 phút với thể tích dung dịch thôi nhỏ hơn rất nhiều
38 lần thể tích hấp phụ Mục đích làm tăng nồng độ protein trong dung dịch thôi và đo được phổ hấp phụ tử ngoại ở bước sóng 280 nm
Khảo sát khả năng làm giàu và phân tách Angiotensin II trong sự hiện diện của protein lớn và nồng độ cao BSA cho thấy albumin huyết thanh bò (BSA) có cấu trúc hình cầu mỏng với kích thước 4 nm × 4 nm × 14 nm và khối lượng phân tử 66400 Da BSA, một protein lưỡng tính nhờ vào nhóm -NH2 và -COOH, có điểm đẳng điện pI = 4,7, dẫn đến điện tích dương khi pH < 4,7 và điện tích âm khi pH > 4,7 Thí nghiệm được thực hiện bằng cách hấp phụ vật liệu với dung dịch BSA/Agiotensin II trong 5 phút và sau đó thôi trong 30 phút, so với mẫu vật liệu chỉ hấp phụ BSA Kết quả được đo bằng phổ hấp phụ tử ngoại ở bước sóng 280 nm, từ đó gián tiếp tính được nồng độ Angiotensin II.
II qua nồng độ chênh lệch
Theo Đồ thị 3.3, vật liệu PMO đã làm tăng nồng độ Angiotensin II từ 7-12 lần so với nồng độ ban đầu Sự hiện diện của protein lớn như BSA cũng cho thấy nồng độ Angiotensin II tăng lên từ 5-41 lần (Bảng 3.4) Mặc dù chưa thể khẳng định rằng sự chênh lệch này hoàn toàn do Angiotensin II mà không có BSA, nhưng điều này chứng minh rằng PMO có khả năng phân tách và làm giàu các peptide nhỏ như Angiotensin II trong hỗn hợp protein lớn.
pH của dung dịch đệm ảnh hưởng đáng kể đến sự hấp phụ protein lên vật liệu, với điểm đẳng điện (pI) và tính kỵ nước của PMO cùng acid amin là những yếu tố quyết định Lực Van der Waals, liên kết hydro, tương tác kỵ nước và lực tĩnh điện đều đóng vai trò quan trọng, trong đó lực tĩnh điện là mạnh nhất Khi pH gần với pI, lực đẩy giữa các phân tử sinh học giảm, cho phép sự đóng gói dày đặc hơn Tuy nhiên, các nhóm tích điện trên protein vẫn có thể tương tác với nhau và với bề mặt, dẫn đến quá trình hấp phụ chủ yếu bị chi phối bởi liên kết hydro, tương tác kỵ nước và lực Van der Waals Angiotensin II, với pI là 6,7, trong dung dịch đệm PBS (pH 6,8) sẽ không mang điện.