Nghiên cứu tạo giống nấm cordyceps militaris bằng phương pháp lai bào tử đơn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG LÊ VĂN KIÊM NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG N�M Cordyceps militaris BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI BÀO TỬ ĐƠN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Đà Nẵng - Năm 2021 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 16990038066221000000 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG LÊ VĂN KIÊM NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG N�M Cordyceps militaris BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI BÀO TỬ ĐƠN Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN MINH LÝ Đà Nẵng - Năm 2021 M�C L�C MỞ ĐẦU 1 T�nh c p thi t c a đ t�i Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 Giới thiệu chung v n m Cordyceps militaris 1.1.1 Phân loại n m Cordyceps militaris 1.1.2 Đặc điểm sinh học c a Cordyceps militaris 1.1.3 Giá trị dược liệu c a Cordyceps militaris 1.2 Đặc điểm sinh sản n m Cordyceps militaris 1.3 Chọn giống n m phương pháp lai b�o tử đơn 12 1.3.1 Quy trình chọn giống n m phương pháp lai b�o tử đơn 12 1.3.2 Các y u tố ảnh hưởng đ n hiệu chọn giống 13 1.4 Tình hình nghiên cứu c a n m Cordyceps militaris 14 1.4.1 Tình hình nghiên cứu th giới 14 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Phạm vi nghiên cứu 18 2.3 Nội dung nghiên cứu 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phương pháp phân lập bào tử đơn bội 19 a Phương pháp phân lập bào tử spore drop/shooting 19 b Phương pháp phân lập bào tử c a Teik-khiang Goh 19 c Phương pháp phân lập bào tử c a Zhang 19 2.4.2 Phương pháp đánh giá kiểu gen MAT c a bào tử 20 a Phương pháp tách DNA 20 b Phương pháp PCR 21 c Phương pháp điện di gel agarose 21 2.4.3 Phương pháp nhân nhanh b�o tử 21 2.4.4 Phương pháp lai b�o tử đơn dịng tạo dịng hữu tính cảm ứng hình thành stroma 22 2.4.5 Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh trưởng hình thái tổ hợp lai 22 2.4.6 Phương pháp xác định h�m lượng Cordycepin 23 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 23 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Cải ti n phương pháp tách b�o tử đơn 24 3.1.1 Đánh giá hiệu c a phương pháp phân lập bào tử đơn 24 3.1.2 Xây dựng phương pháp phân lập bào tử SSE (sing spore extraction) 27 a Đ xu t quy trình phân lập bào tử 27 b Hồn thiện quy trình phân lập bào tử phương pháp SSE 27 c Quy trình tách bào tử đơn theo phương pháp SSE 30 3.2 Xác định MAT gene idiomorph c a BT n m Cordyceps militaris 31 3.3 Đánh giá khả lai c a bào tử đơn 33 3.3.1 Ảnh hưởng c a thành phần môi trư ng nuôi đ n k t lai BT 33 3.3.2 Kiểm tra MAT gene idiomorph c a tổ hợp lai n m C militaris 36 3.4 Đánh giá đặc điểm hình thái, sinh trưởng khả t�ch lũy cordycepin c a tổ hợp lai 37 3.4.1 Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi tổ hợp lai môi trư ng rắn 37 3.4.2 Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi tổ hợp lai môi trư ng lỏng 38 3.4.3 Đánh giá đặc điểm hình thái thể c a tổ hợp lai 39 3.4.4 H�m lượng cordycepin tổ hợp lai 41 3.4.5 Đặc điểm c a tổ hợp lai ti m tuyển chọn 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 K t luận 45 Ki n nghị 45 TÀI LI U THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 53 NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG N�M Cordyceps militaris BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI BÀO TỬ ĐƠN Ngành: Sinh học thực nghiệm Họ tên học viên: LÊ VĂN KIÊM Ngư i hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN MINH LÝ Cơ sở đ�o tạo: Trư ng Đại học Sư phạm – Đại học Đ� Nẵng TÓM TẮT: Trong luận văn ti n hành nghiên cứu v cải ti n phương pháp phân lập bào tử đơn t n m Cordyceps militaris; đánh giá ảnh hưởng c a thành phần môi trư ng nuôi đ n khả lai bào tử đơn; chọn lọc tổ hợp lai vượt trội v đặc điểm h�nh thái, sinh trưởng v� h�m lượng cordycepin v� đ xu t phát triển giống C militaris để đưa v�o thử nghiệm sản xu t K t nghiên cứu đ xu t phương pháp phân lập bào tử (SSE) cho phép thu số lượng bào tử lớn đ n 2,4x103±0,9BT tương đương 79,92 BT/đĩa petri, hạn ch tạp nhiễm sợi n m vi khuẩn xuống 5,4±0,91% BT nảy mầm môi trư ng PDA Phương pháp mới, thực dễ hơn, hiệu cao, không phụ thuộc vào tuổi c a n m, thi t bị thực đơn giản, ứng dụng cho nhi u n m lớn khác Chọn lọc bào tử mang gen idiomorph MAT1-1 MAT1-2 thị phân tử, thu bào tử mang gen MAT1-1 bào tử MAT1-2 t ch ng Ti n hành lai tổ hợp mang gen MAT1-1 MAT1-2 loại môi trư ng nuôi khác nhau, quan sát th y phát sinh stroma c a tổ hợp lai th�nh công v� chứng minh xác định kiểu gen Trong đó, mơi trư ng ni có chứa 20g gạo lứt, 4g nhộng tằm, 64ml dịch (20g sucrose, 20g peptone, 1g MgSO 4·7H2O; 0,5g KH2PO4 v� nước c t 1l) l� môi trư ng tốt nh t để ti n hành lai bào tử đơn C Militaris Khảo sát khả t�ch lũy cordycepin tổ hợp lai giống ban đầu, nhận th y 02 tổ hợp có khả t�ch lũy h�m lượng cordycepin cao v� vượt trội so với tổ hợp lai khác giống bố mẹ Đó tổ hợp (SCm2×SCm1) 2,15mg/g tổ hợp (SCm3×SCm8) 2,46mg/g có h�m lượng cordycepin cao g p đơi ch ng bố mẹ K t đánh giá đặc điểm hình thái sinh trưởng, không bị bi n dị v hình thái màu sắc Cho th y, tổ hợp lai (SCm2×SCm1) thể có m�u cam đậm, chi u dài stroma 48±2, số lượng stroma 85/h , có tốc độ phát triển c a hệ sợi 0,84cm/ngày, k�ch thước khuẩn lạc 1,5mm đặc điểm vượt trội so với tổ hợp lai khác Ngo�i h�m lượng cordycepin thu hũ nuôi l� 8,67mg/hũ cao g p 2,7 lần so với tổ hợp lai (SCm3×SCm8) BREEDING OF CORDYCEPS MILITARIS STRAIN BY-USING SINGLE-SPORE HYBRIDIZATION Major: Experimental biology Full name of Master student: LE VAN KIEM Supervisors: Ph.D NGUYEN MINH LY Training institution: The University of Danang – University of Science and Education Abstract: Thesis conducted the research on improved methods of isolated spores single from the mushroom Cordyceps militaris; assessing the impact of environmental component feed to the possibility of future spores menu; select the filter, the future outstanding on the morphological characteristics, growth and content of cordycepin and development proposals like Cordyceps militaris new to put to the test and production Results of studies have proposed methods to isolate spores new (SSE) allows obtaining the number of spores to 2,4x103±0,9 spores equivalent 79,92 spores/petri dish, limited contamination mycelium and bacteria down to a 5.4±0,91% and spore germination on PDA The new method is more efficient, does not depend on the age of the mushroom, equipment operation is simple, can be applied to many large mushrooms other Selective cell death gene idiomorph MAT1-1 and MAT1-2 by the indicator molecules, obtained spore-bearing genes MAT1-1 and spores MAT1-2 from strains Conduct future the combination carries the genes MAT1-1 and MAT1-2 on types of medium to different rearing was observed in the stroma of combinations of future success and proven by determining the genotype In that environment, feed contains 20g brown rice, 4g silkworm pupae, 64ml translation (20g sucrose, 20g peptone, 1g MgSO4·7H2O; 0.5g KH2PO4 and distilled water 1l) is the best medium to conduct future spores single Cordyceps militaris Survey the ability to accumulate cordycepin in hybrid combinations and like the original, noticed 02 complexes could accumulate high content of cordycepin and superior to the other hybrids and varieties parents It is a combination of (SCm2×SCm1) and 2.15mg/g and combinatorics (SCm3×SCm8) 2.46mg/g with a high content of cordycepin double interracial parents Results morphological characteristics and growth, not variation in morphology and color Suggests, hybrid combinations (SCm2×SCm1) results can the dark orange color, length stroma 48±2, the amount of stroma 85/jar, development speed of fiber 0,84cm/day, the size colonies under 1.5mm is the superior characteristics compared to the other hybrid In addition, the content of cordycepin obtained on each jar pet is 8,67mg/jar twice as high as 2.7 times compared with hybrid combinations (SCm3×SCm8) 10 11 12 13 14