Ðánh giá lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trọng trong thịt gia súc gia cầm

Trang 1

BOYTE

VIÊN DINH DUONG

BAO CAO TONG KET DE TAI

ĐÁNH GIÁ LƯỢNG TỔN DƯ THUỐC KÍCH THÍCH

TANG TRONG TRONG THIT GIA SUC, GIA CAM

Chủ nhiệm dẻ tài: TRAN QUANG THUY

6488

27/8/2007

Trang 2

PHAN A: TOM TAT KET QUA NOI BAT CUA DE TAI

1 KET QUA NOI BAT CUA DE TAL

(@)- Déng gdp mei cita dé tai

- Xây dựng quy trình phân tích thuốc kích thước tăng trưởng dang kháng sinh vàhocmon có

độ tin cây và chính xác cao, áp đụng được tại các phòng phân tích thực phẩm tại Trung ương,

Thanh phố và tuyến Tỉnh

- Nêu được thực trạng tình sử dụng thuốc; các dạng và loại thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm có bán trên thị trường Hà nội, và tỉ lệ tồn dư thuốc kháng sinh, hocmon trong thịt gia súc gia

cầm tại các chợ trọng điểm và một số cơ sở chăn nuôi của Hà Nồi

- Từ thực mạng trên đó các nhà quản lý trong ngành Ÿ tế, thú y đưa ra các chính sách quản lý vĩ mô, vi mô trong việc sử dụng thuốc kích thích ting trưởng, nghiÊn cứu đưa ra các liêu

chuẩn giới hạn tồn dư cho phép các loại thuốc kích thích tăng trưởng gia súc gia cầm chưa được ban hành trong ngành Nông nghiệp và Y tế, đồng thời thúc đẩy giám sát chặt chẽ hơn

nữa các cơ sở chăn nuôi trong nước, sản xuất thịt và sản phẩm gia súc gia cầm đạt tiêu chuẩn

chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm (CLVSATTP)

()- Kết quả cụ thể (các sẵn phẩm cụ thổ)

- Quy trình phân tích thuốc kích thích tăng trưởng trong thịt gia súc, gia cầm

- Số lượng và chủng loại thuốc kích thích thích tăng trưởng (dang kháng sinh và hocmon) và thức ăn gia súc sử dụng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm

- Giúp các nhà quản lý trong ngành Nông nghiệp và Y tế thấy được tình hình sử dụng thuốc

kích thích tăng trưởng trong thịt gia súc gia cầm tại địa bàn Hà Nội để đưa ra chính sách quản lý, giám sát, kiểm tra hữu hiệu từ khâu nguyên liệu, chăn nuôi, phân phối thịt gia súc trên địa bàn Hà nội nói riêng và trong cả nước nói chung và nhanh chóng ban hành tiêu

chuẩn lượng cho phép lớn nhất đối với lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng trong thịt

gia súc gia cầm và các sản phẩm của chúng

- Đưa ra các tiêu chuẩn hiện hành của JECFA, WHO/FAO, JAPAN vé lugng tin du cho

phép lớn nhất thuốc kích thích tăng trưởng trong thịt gia súc gia cầm để các ban ngành nước

ta tham khảo

- Đưa ra tài liệu về thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm và vấn đề sử dụng thức ăn chăn ni an

tồn cho người tiêu dùng

(£)- Hiệu quả về đào tạo

- Đào tạo cho các phòng thử nghiệm thực phẩm tuyến Tỉnh kỹ thuật phân tích kháng sinh và

hocmon trong thực phẩm gia súc gia cầm, phù hợp với các điều kiện trang thiết bị phân tích

Trang 3

- Huéng dan cho các nhà quản lý, sản xuất đưa ra thị trường các loại thức ăn chăn nuôi đúng công thức phối trộn nguyên liệu và thành phần thuốc, đúng quy cách và quy định

- Hướng dẫn người chăn nuôi sử dụng thức ăn chấn nuôi gia súc gia cầm an toàn, nhằm đưa

ra thị trường sẵn phẩm thịt sạch, đảm bảo Vệ sinh an toàn thực phẩm

- BS sung kiến thức cho người tiéu ding biết được về tồn dư thuốc kích trưởng trong sẵn phẩm thịt gia súc, gia cầm có bán trên thị trường và tác hại của thuốc

(4)- Điệu quả về lánh lễ

~ Hướng dẫn nhà sản suất sản xuất các loại thức ăn chăn nuôi có sử đụng các loại thuốc kích

thích tăng trưởng có hiệu quả theo từng giai đoạn chăn nuôi, nhằm tăng sẵn lượng thịt gia súc

gia cầm sạch, từng bước đắp ứng được nhu cần tiêu thụ của người dân

- Chỉ phí kiểm nghiêm cho chỉ tiêu thuốc kích thích tăng trưởng (kháng sinh và hocmon) tại

các phỏng thí nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm ít tốn kém, vẫn đạt độ chính xác và tin cậy

cao,

(@)- Hiệu qùa về xã hội

- Nang cao nhận thức của các nhà quản lý, sản xuất và người tiêu dùng vỀ vai trỏ, tac dung, tác hại của thuốc kích thích tăng trưởng trong trong chăn nuôi và tồn dư thuốc trong thịt và

sẵn phẩm của gia súc gia cầm trong sẵn xuất và đời sống xã hội

- Người tiêu dùng thông thái hơn, biết chọn sẵn phẩm thịt gia súc gia cầm đấm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, ngăn ngừa được các bệnh có liên quan đến thuốc kích thích tăng trưởng có

thể dẫn đến các bệnh tiềm ẩn và hiểm nghèo gánh nặng cho xã hôi như béo phì giả tạo, biến

đổi giới tinh do sử dụng thịt gia cầm gia súc có dư lượng kháng sinh và hocmon cao vượt

quá mức quy định cho phép (0- Các hiệu quả khác

2 AP DUNG VAO THUC TIEN SAN XUAT VA DOI SONG XA HOI

- Áp dụng Quy mình phân tích đẻ tài xây dựng để phân tích dư lượng thuốc kích thích tăng trưởng trong thực phẩm tại các Phòng Thử nghiệm phân tích Trung ương, Tình, Thành pho - Đề tài nêu ra các loại thuốc kháng sinh, hocmon và các dạng công thức thức ăn chăn nuôi để các nhà quản lý thuốc và sản xuất thức ăn chăn nuôi, người chăn nuôi gia súc gia cảm tham khảo áp dụng trong thực riễn

Trang 4

3 ĐÁNH GIÁ THỰC TIEN ĐỀ TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỀ CƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT

(a) Tiến đó

- Do ảnh hưởng của dịch cứm gia cầm, hiện tượng nở mẻm long móng ở gia súc gia cầm nên việc mua mẫu gặp nhiều khó khăn, bị trễ vẻ thời gián tiến độ đẻ tài nghiên cứu

(b)- Thực hiện mặc tiêu nghiên cứu

- Đảm bảo thực hiện đầy đủ các mục tiều nghiên cứu đẻ ra của đề tài (e) Các sẵn phẩm tạo ra so với dự kiến của bản để cương

- Sản phẩm tạo ra của đẻ tài đáp ứng đủ các dự kiến của đẻ cương (d) Đánh giá việc sử dụng kính phí

- Khối lượng để tài lớn, tập trung vào xây dựng quy trình phân tích, và kinh phí cho kiểm nghiệm chỉ tiêu kháng sinh và bocmon khá cao; nhưng vẫn đảm bảo cắc mục tiêu nghiên cứu để ra, Do vậy đạt higu qua cao trong việc sử dụng kinh phí được cấp

4 CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT

- Cân có sự phối hợp liên ngành trong quản lý thuốc và các cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi có sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng, thịt và sẵn phẩm gia súc gia cảm bán trên thị trường tiêu thụ như siêu thị và bán lễ

- Xây dựng và ban bành tiêu chuẩn các về thuốc kích thích tăng trưởng trong thức ăn chăn nuôi và thịt gia súc gia cảm

Trang 5

PHAN B: NOI DUNG BAO CAO CHI TIET KET QUA NGHIEN CUU DE TAI CAP BO

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 TÓM LƯỢC NHỮNG NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

LIEN QUAN DEN DE TAL TINH CAP THIET CẦN NGHIÊN CỨU CỦA

ĐỀ TÀI

hờ những tiến bộ vượt bậc của khoa học kỹ thuật mà ngành công nghiệp sản xuất

các sản phẩm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi đã ngày một phong phú và không ngừng phát

triển Các chủng loại thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cảm chế biến sẵn trên thị trường hiện nay: rất đa dạng Ngoài các thành phần cơ bản cung cấp năng lượng như protein, lipid, glucid, người ta còn bổ sung chất khoáng, vitamin, kháng sinh và chất tăng trọng giúp cho con vật vừa lớn nhanh vừa có khả năng chống đỡ bệnh tật Những lợi ích của thức ăn đóng gới sẵn rất dễ nhận thấy, người chăn nuôi vừa không mất nhiều thời gian tìm nguồn nguyên liệu, chế biến phù hợp với từng thời kỳ sinh mưởng của con vật mà lại cho năng suất rất cao nhưng nếu buông lỗng quản lý chất lượng các loại thúc ăn chăn nuôi và chạy theo lợi nhuận sẽ có thể dẫn tới những sai sót khó lường rong sản xuất, sử dụng thúc ăn chăn nuôi chế biến sẵn, gây hậu quả nghiêm tong đến chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, ảnh hưởng lớn tới sức khổe người riêu dùng,

Một số nghiên cứu đã đẻ cập đến những tác dụng ngoài ý muốn của kháng sinh, chất kích thích tăng tưởng trong thức ăn chăn nuôi chế biến sẩn đến chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Người tiêu dùng ngày nay đã cảnh giác với những thực phẩm có liên quan đến công nghệ sinh học, các loại phụ gia thực phẩm và việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị bệnh tật cho người và gia cảm, gia súc Việc lạm dụng các chất kháng sinh và hocmon bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gần đây đã được cảnh báo, tuy nhiên lượng tỏn dư trong thịt gia cảm, gia súc vẫn chưa được xác định cụ thể Do vậy, để cung cấp số liệu có tính khoa học,

Khoa Hóa Thực phẩm và Vệ sinh an toàn thực phdm-Vién Dinh dưỡng đã tiến hành đẻ tài

nghiên cứu “Đánh giá lượng tỏn dư thuốc kích thích tăng rong trong thịt gia súc, gia cảm” Ty vọng kết quả của đẻ tài sẽ góp phần đẻ xuất biện pháp tăng cường công tác quản lý việc

sản xuất và sử dụng một cách có hiệu quả thức ăn chế biến sẵn nhằm thúc đẩy sự phát riển ngành chăn nuôi, cung cấp đủ nguồn thực phẩm sạch, vệ sinh an toàn, bảo vệ sức khỏe người

tiêu dùng,

1.2 GIẢ THIẾT NGHIÊN CỨU CỦA ĐỂ TÀI

Trang 6

có của phòng thử nghiệm; tiến bành thẩm định kỹ thuật đạt, tiêu chuẩn áp dụng thử nghiệm tại Phòng thử nghiệm

- Ấp dụng quy tình phân tích đã xây dựng xác định lượng tổn dư thuốc kích thích tăng trưởng trong thị và phủ tạng gia súc gia cảm tại các chợ trọng điềm và 2 cơ sở chăn nuôi của ER Noi

- Khảo sắt, im higu, ghi chép céc loai thuốc kích thích tăng trưởng dạng khắng sinh và bocmon và các loại thúc ăn gia súc gia cầm có bần trên thị trường Hà Nội

- Tham khảo và nghiên cứu trong và ngoài nước đưa ra tài liệu về thức ăn gia súc của ; vấn để an toần trong sử dụng

- Xủ lý thống kê kết quả phân tích

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Phân tích lượng tỏn dư thuốc kích thích tăng trưởng rong mẫu thịt lợn và thịt gà trên thị nường Hà Nội,

~ Thu thập các loại thuốc kích thích tăng trọng dùng cho gia súc gia cảm trên địa bàn TR Nội, danh mục được phép theo khuyên cáo của FAO/WHO và bị cấm

- Khảo sắt thị trường bán thức ăn gia súc có sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng, Tài liệu về thức ăn tăng trọng và an toàn trong sử dụng bảo vệ sức khỏe cộng đồng,

Địa diễn, thời gian phân tích mẫu

~ Khoa Hóa-Vệ Sinh An Toàn Thục Phẩm và Phòng Hóa Độc Thực phẩm/Trung Tâm Kiểm Nghiệm VSATTP, Viện Dinh Dưỡng,

Trang 7

2 TONG QUAN CUA DE TAL:

2.1 TINH HINH NGHIEN CUU NGOAINUGC LIEN QUAN TỚI ĐỀ

TAI

Tình hình nghiên cứu ngoài nước đối với thuốc kích thích tăng trưởng dạng kháng sinh và hocmon đối với thực phẩm phát triển mạnh mẽ tại nhiều nước Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản từ đầu những năm 1960 về phương pháp phân tích trên các thiết bị như Sắc ký lỏng, Sắc ký khí,

Blysa và đến đầu 1970 các kỹ thuật khối phổ ra đời có thể phản tích tỏn dư thuốc kích thích

tăng rưởng dưới dạng vết siêu nhỗ Có nhiều khảo sắt tại tại các nước phát triển cũng như các nước kém phát triển tại Châu Fhi và gần đây tại Trung Quốc, cho thấy dư lượng thuốc kháng sinh va hocmon rong thực phẩm và đặc biệt trong thịt gia súc gia cằm khá cao đáng báo động với lệ cao Do vậy việc nghiên cứu tình hình sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng trong sản

xuât, chăn nuôi và đến sản phẩm thực phẩm, thủy sản xuất nhập khẩu được đặc biệt chú trên

thế giới trong thời gian qua

Các phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh và hocmon trong thực phẩm

Hign nay, rên thế giới đã có nhiều nghiên cứu phân tích tổn dư kháng sinh và hoemon trong thị cũng như phủ tạng động vật, phần lớn các phương pháp đều sử dụng thiết bị sắc ký lông hiệu năng cao [7; 8; 9; 10; 11; 12 ; và 1ê; 19, 20; 21, 22; và 24; 25, 26; 27, 28; 29]

3 Phân tích kháng sinh nhóm tetracyclin

Các kháng sinh nhóm tetracyclin là những kháng sinh phổ rộng, có tắc dụng trên cả các vi khuẩn gram âm và gram dương, đặc biệt có tác dụng trên các vi khuẩn như Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococeus, Gonococus, Cholera, Dysentery bacillis, Pertussis, Rickettsia, Chlamydia va Mycoplasma Vige sử dụng rộng rãi các kháng sinh nhóm này có thể làm tăng nguy cơ để kháng kháng sinh, vì vậy cẩn thiết phải có những phương tháp đánh giá chính xác về mức độ tổn dư nhằm bảo vệ súc khỏe người tiêu dùng, Phương Tháp phân tích bằng vi sinh vật là một phương pháp phổ biến để xác định dư lượng kháng sinh, Tuy nhiên phương thấp này tốn nhiều thời gian, không thể xác định cụ thể từng loại kháng sinh trong nhóm và độ chính xác là không ổn định Vì vậy biện nay các phương pháp sắc ký được lựa chọn À phương pháp chính để phân tích dư lượng các kháng sinh nhóm tetacyclin Phương pháp sắc ký cổ điển là phương pháp sắc ký lớp mỏng được ấp dụng từ những năm 1960, sử dụng các vật liệu lớp mỗng như kieselzubr, silica gel và celluloza Các mu được áp dụng chủ yếu là dược phẩm và một số loại thực phẩm như sữa, mật ong và thịt, cá Phương pháp điện di mao quản cũng được áp dụng và có một số ưu điểm so với sắc ký lông như sử dụng rất ít dung môi, thời gian phân tích ngẩn, hiệu lực tích cao Tuy nhiên Thương pháp này ít được áp dụng rong thực tế để phân tích dư lượng kháng sinh vì lượng mẫu bơm nhỏ và do đó độ nhạy thấp, Phương pháp sắc ký lồng higu năng cao là thương pháp chính được áp dụng biện nay để xác định dư lượng rất nhỗ các kháng sinh trong thục phẩm

Trang 8

tetracyclin được chiết và làm sạch bằng chiết pha rén, sau đó định lượng trên sắc ký lồng sử dụng các deector UV hoặc PDA Đối với các mẫu có dư lượng rất nhổ, người ta sử dụng sắc ký lông khối phổ để định lượng [19]

Phân tích olaauindox và cacbadox

Olaquindox va carbadox là bai chất thuộc nhóm quinoxaHne 1,4-dioxide, được dùng ở một số nước để kích thích tăng trưởng và điều tị ïa chảy trên gia súc Do những nguy cơ vẻ khả năng gây đột biến gen và gây ung thư của các chất này và một số chất chuyển hóa của chúng, EU đã cấm sử dụng bai loại hóa chất này từ răm 1998 Để giấm sắt việc sử dụng các chất olaquindox và carbadoz trong chăn nuôi, các phương pháp phân tích cũng đã được phát triển và áp dụng để phân tích trong thức ăn chăn nuôi và sản phẩm từ gia súc, gia cảm Các Thương pháp được áp dụng để xác định tồn dư olaquindox, carbadox và các chất chuyển hóa chính là sắc ký lòng hiệu năng cao với detectơ UV hoặc DAD [9, 10]

Phan tích cde hocmon steroid

Các hocmon steroid có thể có mặt trong thịt các loại gia súc, gia cảm với hầm lượng, sất thấp vai g/kg (ppb) Ban than dong vat cũng tự

trình chuyển hóa tự nhiên các protein và chất béo Vì vậy các hocmon nay được biết là có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và phân bố của các mô mỡ và cơ, Mức độ và tỷ lệ các loại bocmon, các chất tiền thân và các chất chuyển hóa phụ thuộc vào các điều kiện sinh lý, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của môi trường, mong đó có điều kiện và thức ăn chăn nuôi Vì vậy, việc giấm sắt bầm lượng các bocmon steroid là rất quan trọng để đánh giá chất lượng thị gia súc, gia cảm, Tuy nhiên thực tế rất khó có thể phân biệt được đâu là hoemon nội sinh và đâu là lượng hoemon được đưa vào qua quá tình cbăn nuôi Vì vậy thông thường người te thải xác định tỷ lệ giữa các loại hocmon, tỷ lệ các chất tiễn thân và các chất chuyển hóa Nhiều phương pháp phân tích đã được phát miền để xác định hàm lượng hocmon trong thị như thương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, phương pháp miễn dịch, thương pháp sắc ký khí khối phổ và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ [22, 28] Để đạt độ chính xác cao hơn, người ta có thể kết hợp nhiều phương rháp với nhau, chẳng hạn kết hợp, Thương pháp miễn dịch và phương rháp sắc ký khí khối phổ Phương pháp phân tích miễn dịch đặc biệt phù hợp để phân tích sàng lọc nhiều mẫu với độ nhạy rất cao

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC LIÊN QUAN TỚI ĐỀ

TAL

hợp các loại hocmon này trong qué

Ở Việt Nam kháng sinh được dùng rộng rãi để chữa bệnh cho người và gia súc, người ta da phét bign ra rằng nếu đưa một lượng nhỏ kháng sinh vào thức ăn gia súc gia cẳm thì không những bạn chế nhiều bệnh truyền nhiễm mà còn làm con vật lớn ranh, cho nhiều thị: và nhiều trứng Sau đó, kháng sinh ngày càng được dùng phổ biến rong chăn nuôi Người đã trộn kháng sinh vào thúc ăn gia súc với liều lượng thích bợp nhằm kích thích sinh trưởng đối với gia súc còn non và mang lại hiệu quả trong trường hợp thúc ăn kém chất lượng, chuồng trại Ẩm uớt mất vệ sinh và những vùng có dịch bệnh thường xuyên xây ra ở những

Trang 9

con vật mới vào giai đoạn phất triển thì kháng sinh có hiệu quả mạnh hơn cơn vật trưởng thành Đối với gia súc tiết sữa như bò sữa, lợn nái đang tiết sữa, kháng sinh có tác dụng

không rõ rằng, có thể kháng sinh tiết qua sữa gây ảnh hưởng đến chất lượng sữa, không nên

bổ sung kháng sinh vào thúc ăn nếu không vì mục đích chữa bệnh chơ con vat [1, 2]

Bén cạnh những lợi ích dễ nhận thấy của thức ăn chăn nuôi có bổ sung kháng sinh, những tác dụng không mong muốn của kháng sinh ngày càng thể hiện rõ rệt Dùng kháng sinh với liễu lượng thấp và liên tục đã làm xuất hiện vi khuẩn kháng lại kháng sinh Kháng sinh không những loại bỏ những vi khuẩn có hại mà còn tiêu diệt các vi khuẩn có ích như: vỉ khuẩn tạo vitamin nhóm B trong đường tiêu hoá Do vậy, đã có những khuyến cáo hạn chế hoặc không dùng kháng sinh trong thúc ăn chăn nuôi, chỉ sử dụng tập trung vào những giai đoạn gia súc dễ bị khủng hoảng như cai sữa sớm và tránh các loại kháng sinh thường dùng để chữa bệnh cho cơn người

Một số kháng sinh khi sử dụng với hàm lượng cao gây ra tình trạng kháng kháng sinh, gay khó khăn cho công tắc phòng chống bệnh tật cho gia cảm, gìa súc Lượng tồn dư vượt mite cho phếp kháng sinh trong thực Thẩm vừa ảnh hưởng tới giá trị cầm quan của món ăn lại vừa có bại tới sức khoẻ người tiêu dùng Tại phiên họp của Hội đồng chuyên gia JECFA cha FAO/WHO duge 16 chức năm 1999 tại Rome, lalia nhằm đánh gía tổn dư một số thuốc thú ý trong thực phẩm đã đưa ra giới bạn lượng ăn vào hàng ngày có thể chấp nhận và giới bạn tối đa cho phép của một số kháng sinh, Với DihydroseptomycinJszeptomicin lượng ăn vào bằng ngày có thể chấp nhận là 0-50 ppb theo trọng lượng và giới bạn tồn dư tối da cho phép trong thịt lợn, thị gà, thit bò (hịt bắp) kể cả gan là 600 ppb, còn trong thận là 1000 ppb Tượng ăn vào bằng ngày có thể chấp nhận đối với Neomycin JA 0-60 ppb theo rọng lượng và giới bạn tổn dư tối đa cho phép trong thịt bồ, lợn, gà là 500 ppb, lượng tổn dư cho phếp trong gan, thận cao hon 3-4 lan so với thị bắp[3, 14, lồ]

Gan day ở Việt Nam, một số nghiên cứu đã đẻ cập đến vấn để dư lượng kháng sinh nhóm tetracycline tong thị và phủ tạng [15] Kết quả khảo sắt cho thấy rằng, khi sử dụng thức ăn nuôi lợn chứa chloretacyclin với bầm lượng 110 ppm hoặc 330 ppm trong khoảng thời gian liên tục 31 và 98 ngày tương ứng thì dư lượng chlortewacyclin trong gan và thận cao gấp 10 lần dư lượng trong phần thịt mỡ, Nghiên cứu tương tự ở gà cũng cho thấy khi cho gà ăn thức ăn chứa 220 ppm chlortetacyclin, lượng tồn dư, sau khi ngừng cho ăn, Ở gan va than À 0/66 và 0,42 (pm) tương ứng, rong khi tổn dư ở phần da có dính mỡ chỉ là 0,02 ppm Những nghiên cứu này cũng cho thấy sau một ngày ngừng cho ăn thúc ăn có chứa chlortetacyclin, không còn phát hiện thấy tổn dư kháng sinh này wong thịt Do vậy, nếu trong thức ăn chăn nuôi có chứa chlortewacyclin thì việc cách ly gia cầm với thức ăn đó 1-2 ngày là cần thiết,

Trang 10

nhau ở các loại vật nuôi Chất này được hấp thu nhanh chóng ở đường ruột và thải trừ qua đường nước tiểu ở lợn, khi bổ sung olaquindox vào thúc ăn với hàm lượng 60 ppm, sau 28 ngày tổn dư olaquindox còn dưới 0,005 ppm ở phân thịt và dưới 0,01 ppm trong thận

Trong nhiều năm qua, một số loại hocmen và các dẫn suất của nó đã được bổ sung, vào thức ăn cbăn nuôi nhằm kích thích tăng trưởng cho gia cằm, gia súc [89,10] Khi rộn thyroxin vào thức ăn với lượng nhỏ 40-60 (ppm) có tác dụng tăng trưởng rõ rệt đối với gia cảm, gia súc đang Ở trong tình trạng thiếu hụt iod hoặc khẩu phần ăn bàng ngày không cân đối các chất dinh dưỡng Nếu kéo dài thời gian sử dụng thức ăn chăn nuôi có bổ sung thyroxin và không đủ thời gian cách ly trước khi giết mổ 10 ngày thì lượng tỏn dư thyroxin có

thể vượt mức cho phếp, vỉ phạm các quy định về chất lượng vệ sinh an toần thực phẩm [23]

Một số loại nội tiết tố sinh dục progesteron, testosteron, 17-estradiol cũng đã được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với mục đích tăng trọng và nâng cao hiệu quả của thúc ăn Tuy nhiên, rong những nim 50-60 của thập kỷ trước do thiếu thận trọng khi đưa

hocmon vào thức ăn chăn nuôi nên hàng chục năm sau tại một số nước phát triển như Thuy

điển, Anh, Pháp, Scotland người ta đã nhận thấy hậu quả rõ rệt của nó đến tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm có liên quan đến sức khoẻ cộng đỏng Hiện tượng đỏng tính luyến ái tăng, giảm mật độ tỉnh trùng, tỉnh hoàn lệch, ẩn ở trẻ em tai và tuổi dậy thì ở rẻ em gái sớm hơn Đến năm 1989, các nước này chỉ cho phép sit dung testosteron, esradiol trong điều trị bệnh Đến năm 1999, người ta đã thong béo nguy co gay ung thir cia 176 estradiol nên cũng không dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với mye dich tăng trọng [1,2]

Thương pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao hiện nay đã được áp dụng tại một số thòng phân tích thực phẩm, để xác định nhiều loại chất kích thích tăng trưởng, trong đó có các hocmon steroid [22, 28] Dé phân tích bằng sắc ký, mẫu sau khi chiết xuất, được làm sạch và làm giầu rước khi tạo dẫn xuất dễ bay bơi, thông thường JA silyl hóa, Quá trình làm sạch thường rất phúc tạp, tốn thời gian và dung môi, và vậy nhiều tắc giả đã nghiên cứu để cải tiển quy mình làm sạch như áp dụng các vật liệu chiết pha rấn để giảm thời gian phân tích và lượng hóa chất sử dụng, Việc phân tích các hocmon trong thị: động vật còn phúc tap hon nhiều, vì vậy thường phải kết hợp phương pháp chiết xuất lỏng lỗng và chiết xuất pha tấn, một số tắc giả còn kết hợp chiết pha rắn với làm sạch qua sắc ký lỗng rước khi dẫn xuất và Thân tích

Trang 11

3 DOITUGNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

3.1 THIET KE NGHIEN COU

- Tham khảo các tài liệu phân tích Quốc tế vẻ thuốc thích thích tăng rưởng (kháng sinh và hocmon) trong thực phẩm; áp dụng xây dựng Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm tối ưu phù hợp dựa vào điều kiện, trang thiết bị hiện có của Phòng Thủ nghiệm Viện Dinh dưỡng; và sau khi tiến hành thẩm định phương pháp nếu đạt độ tin cậy và chính xác; áp dụng phân tích 150 mẫu

thịt gia súc gia cảm tại các chợ trong điểm và cơ sở chăn nuôi tại Hà Nội,

- Khảo sát các loại thuốc kích thích tăng tưởng và thức ăn gia súc gia cảm có bán trên thị trường Hà nội thuộc thuộc Nhà nước, doanh nghiệp, thị trường tự do và tham khảo tham chiếu tiêu chuẩn vẻ hàm lượng cho phép lơn nhất tồn dư thuốc trong thịt và sản phẩm thịt của gia

súc gia cảm theo tiêu chuẩn Quốc tế, tiến tới từng bước xây dựng tiêu chuẩn của Việt nam

~ Dựa vào các tài liệu trước đây và hiện có trong và ngoài nước, đưa ra tài liệu về thức ăn chăn

nuôi và an toàn cho người sử dụng thịt gia súc gia cầm vẻ Vệ sinh an toàn thực phẩm

~_ Tư vấn về quản lý, kiểm soát chất lượng và VSATP đới với thức ăn chăn nuôi và thịt gia súc

gia cam

3.2 CHON MẪU, CỔ MẪU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

*®Đối tượng nghiên cứu

Mua mẫu thị và phủ tạng gia súc gia cảm tưới sống ngay sau giết mổ tại các chợ trọng điểm phân phối thục phẩm lớn (Chợ Hằng Bè, chợ Hôm, chợ Mơ, chợ Trương Định, chợ Thanh Xuân) và tại các cơ sở chăn nuôi (Sóc Sơn, Từ Liêm),

*Cữ mẫu

- 20 mẫu gia súc, gia cảm x 05 chợ = 100 mẫu

~ 25 mẫu gia súc, gia cảm x 02 cơ sở chăn nuôi = 50 mẫu

Cỡ mẫu được tính theo công thức sau:

Ztxpx(-

Trong đó

tổng số mẫu cần thu thập, Z: 1,96 với khoảng tin cậy 95% e: sai số cho phếp, thường là 5%

?: t lệ mẫu nhiễm, uớc tính theo các kết quả nghiền cứu trên thé giới là 10%

Trang 12

Thay các số đã biết vào công thúc trên ta tính được cỡ mẫu là

1/96? x0,1x (1- 0,1)

=138

(0,05)

Dé thòng sơ suất lầm hing miu 8-10% Ja 12 mẫu, vậy cỡ mẫu phải thu thập i: n= 138 mẫu + 12 mẫu = 150 mẫu

* Chọn mẫu và kỹ thuật lấy mẫu theo (TCVN 4833-1:2002)

Mẫu thịt, gan của gà và lợn được thu thập đại diện ở các chợ nội thành gian từ 8-10 gid sắng và 2 cơ sở chăn nuôi tại Sóc sơn và Tù liêm, Hà Nội trong ngày Mỗi mẫu thịt gà (thit d0i và thị lườn), mẫu thị lợn Œhỳ vai và thị lạc) được lấy tối thiểu là 500g, mau gan ti thiểu là 300, đựng vào túi polyetylen sạch, bảo quản lạnh ong hộp xốp, đưa ngay về phòng thí nghiệm rong thời gian không quá 3 giờ Tại phòng thí nghiệm, mẫu được tiến hành xử lý sơ bộ và cân lấy lượng mẫu phân tích ngay trong ngày, mẫu còn lại được lưu giữ trong hộp nhựa kín có lắp và được bảo quản ở nhiệt độ -20°C tủ lạnh đông [3]

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 CHỈ TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xây dựng quy trình phân tích chỉ tiêu hầm lượng thuốc kháng sinh, hocmon - Đánh giá thực trạng tồn dư thuốc trong thịt gia súc gia cảm trên địa bàn Hà Nội, - Xác định danh mục thuốc kích thích tăng trưởng và các loại thức ăn gia súc gia cảm

(bguyên liệu, thuốc phối trộn, phụ gia)

- Quần lý sử dụng thuốc rong chăn ni và an tồn cho người tiêu dùng

3.3.2 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU NGHIÊN CỨU

Tham chiếu các tài liệu phân tích trong và ngoài nước, để xây dựng quy trình phân tích thuốc kích thích tăng tưởng với điều kiện hiện tại của Phòng kiểm nghiệm thực phẩm- ‘Vien Dinh dưỡng có đánh giá các thông số thẩm định của phương pháp Sau đó áp dụng Quy

trình phân tích lượng tổn dư thuốc kháng sinh và hocmon trong thịt gia súc, gia cảm

3.3.2.1 Phương pháp phân tích tetracyclin, oxytetracyclin và chlortetracyclin

a) Nguyên lý

Mẫu được chiết với đệm McTivaine và TCA và làm sạch bằng chiết pha rắn RP-C18-

Supelco Xác định tetracyclin trong gia súc gia cảm bằng Hệ thống sắc ký lỗng với detectơ FDA ở bước sóng 365nm Pha động 0,01M azít oxalic-axetoniri-metanol (80:13:7,v:v:v), cột sắc ký lỏng pha ngược RP-C18 (250 x 4,6mm x 5lum)

Trang 13

5) Phạm vì áp dung Quy tinh này áp dụng cho các loại thực phẩm tươi có nguồn gốc động vật oT

lệu tham chiếu

A.L, Cinquina, F Longo, G Anastasi, L Giannetti, R Cozzani (2003), Validation ofa high- yerformance liquid chromatography method for the determination of oxytetacycline, tetracycline, chlortetacycline and doxycycline in bovine milk and meat Journal of Chromatography A, 987: 227-233[11]

4) Dung cu, thiét bj

Hg thống sắc ký lỏng Breeze/Wiater với các detecto UV 2487 va bom 1525

Hg thing sắc ký lông Rmyower bơm mẫu tự động, với detecto EDA 2996 và detecto huỳnh quang 2487

Cot Symmetry C18 (Waters -Mg), Sim x 46mm x 150mm, kèm bảo vệ cột Šymmety Guard C18

À) Háa chất, dung môi, dung dich dém

Các hóa chất và đụng môi thuộc loại tình khiếi phân tích: Branol (Prolabo - Pháp)

Metanol, axetoniril (.T Baker - My) nebexan va axit clohydric (Merck - Dic)

Chất chudn temacyclin C,,H,.N,0,/444,43, oxytetacyclin — C,,H,.N,0,/460,44, va chlortemacyclin C,H, ,CIN,0,/470,84 (Sigma-Mỹ)

Dung dich dém

Dém Mcllvaine pH 440.05: Can 28,4 g Na IPO, cho vio binh định mức 1] và boà tan bằng nước cất sỏi định mức tới vạch, lắc đều hồn hop Can 210 g axit ximic monohydrat vào: bình định mức 11 khác, hoà tan bằng nước cất và định mức tới vạch, lắc kỹ Lấy 11axít xitric ở tên trộn với 625 ml Na HPO, trong bình 21 Điều chỉnh pH tới 440,05 bằng cách thêm từng giọt HƠI 0,1M (8,3ml HCI đặc/) hoặc NaCH 0,1M (4g/1) Dung dịch này sử dụng được trong

1 tuần

Dòng dịch đệm Mcllvaine EDTA: thêm 6,05 g Na;RDTA.2H,O vào 1,625 L đệm Mellvaine và trộn bón hợp tới khi tan hết, Dung dịch này sử dụng được trong Ì tuần

Axdt oxalie rong metanol: boà tan 1,26 g axit oxalic ( loại sắc ký) trong bình định mức 11, pba loãng dung dịch tdi vach mie bing metanol va trộn đều bón hợp Dung dịch được sử dụng trong 1 ngày,

e) Pha dung dich chuẩn

- Dựng dịch chuẩn kháng sinh nhóm teiracyclin: pha dung dịch chuẩn ở điều kiện

Trang 14

tránh ánh sắng trực tiếp và bảo quan tong bình mẫu nâu

Dựng dịch chuẩn gốc 1000 pm: cân 100 + 0,lmg các chất chuẩn tetracyclin, ozytetracyclin và chlartetacyclin vào từng cốc S0ml, hoa tan và chuyển vào bình định mức 100m], định mức bằng MeOH ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ Các dung dịch chuẩn gốc bảo quần ở 4°C 06 thé sử dụng được rong 3 thắng

Tiến hợp đụng dịch chuẩn gốc 100 ppm: lấy 10ml mỗi dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm ở trên cho vào 1 bình định mức 100ml, pha loãng tới vạch mức bằng metanol ở nhiệt độ Thòng và lắc kỹ bón hợp Bảo quản ở 4°C

Dung dịch chuẩn làm việc các khẳng sinh nhóm tetracyclin 25 ppm: lấy 2,5ml dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc hàm lượng 100 ppm vào trong bình định mức 1Ôml, định mức tới vạch bằng MeCH ở nhiệt độ phòng, lắc đều bón hợp Bảo quản ở 4°C, pha mới dung dịch này bằng tuần

Dung dich chuẩn các kháng sinh nhôm teracyclir chạy sắc ký 005; 0,1; 0,25, 0,5 va 1,0 (ppm): Ky 20; 40, 100; 200 va 400 (il) chuẩn hón hợp teracycline lầm việc cho vào các bình định mức 10ml, Thêm 6m] axít oxalic trong metanol vào mới bình Định mức tới vạch bằng nước cất ở nhiệt độ phòng và lắc kỹ hồn hợp Bảo quản ở 4°C, pha mới bàng ngày,

J) Xáy dựng đường chuẩn

Trang 15

hiới và làm sách mẫu:

Cân 5/00 + 0,058 mẫu vào bình nón có nút mài 50ml, thêm 20ml dung dịch đệm Mellvaine BDTAvà siêu âm lạnh rong 30 phút (hoặc lắc mạnh bằng máy lắc ngang trong 30 hin), Gan Ky dịch rong vào bình nón khác, bã được chiết 2 lần như trên mới lần bằng 5ml dung dịch đệm Mcllvaine-EDTA, g6p dịch ong vào bình nón, thêm 3ml axit tricloaxetic 0,5gán] vừa cho vừa lắc nhẹ trong khoảng 1 phút Để bình nón vào nước đá 15 phút, lọc thu ấy dịch rong vào bình nón 30m1 Dịch lọc sau đó được cho qua cột SFB-C18 (hoạt hoá bằng 6m] MeCH, 6m] nước cất: 2 lần), Rửa cột SFE bằng 10m] nước cất, bút cbân không đến khô Ri giải bằng 2ml MeOH Dịch rửa giải được bơm vào cột tách sắc ký lỏng để xác định tetacyclin, oxyteracyclin và chlortetracyclin, Quy tình phân tích được tóm tắt ri sau;

Cho 5 ø mẫu vào bình nón

} 4 20mldém Mellvaine

Siêu am tong 30 phút (hoặc lắc mạnh bằng máy lắc ngang)

4— Rữa bã 5ml đệm Mcllxaine x2 lần và Tập lại chiết như trên,

Góp dịch lọc qua phẫu lọc vào bình nón hoặc ly tâm lạnh 4000/p, 4°C rong 15p

3mlaxit tricloaxetic 0,5g#m] và lắc nhẹ trong 1 phút; để lạnh 15 phút và lọc Lee dịch mẫu qua phẫu lọc vào bình nón 30m] boặc ly tâm lanh 4000v/p, 4°C mong lấp

hoạt hod ii {SE 3ml dịch lọc mẫu

6ml MeOH

Tầm sạch qua cột SEE-C18

¢ Rữstap 3mlE,O cat x 3 lần, sau đó hút Ỷ chân không đến khô

Rita giải bang 2 ml axit oxalic tong etanol, cho vao lp/vial 2 mÌ

Ỳ

Bom 50H dịch cuối vào HELC 6ml nước cất

Trang 16

Diu Hiện sắc ký - Dung môi pha động: 0,01M axít oxalic/ACN/ MeOH ( 80/13/1, v#/#) - Nhiệt độ cột 30%C ~ Detecto UV 350nm ~ Thể tích bơm 500 - Tốc độ dòng Iml/phút h) Tính kết quả

Dự lượng các kháng sinh ong mẫu thực được tính toán dựa vào đường hỏi quy tuyến tính được xác định ở trên hoặc theo công thức sau đây:

q=ŒxẾ* A,

Thong đó: C„: Hàm lượng mẫu phân tich (ppm) Cá: nông độ mẫu chuẩn (ppm)

Ag} Dign tich pic miu A„: Diện tích pc chuẩn Va Thể tích dich cuối (ml)

¬m¡ khối lượng mẫu phân tích (kg)

* Quy trình phán tích nhắm teracyclin có độ đúng và độ chính xác: - Hệ số hỏi quy tuyến tính: 0,9997

- Hệ số thu bồi: đối với oxytemacyclin ở nông độ 25 ((ppm)) Àà 84%; emacycln 87%; chlortemacyclin 92%

- Giới ban phat hign (LOD): d6i voi oxytemacyclin 0,027 ppm, vdi_ tetracyelin 0,036 ppm, chlortetracyclin 0,05Sppm

- Giới bạn định lượng (LOQ): đối với oxytemacyclin 0,09 ppm, tetracyelin 0,12 ppm; y6i trenbolone, chlortetracyclin 0,18 ppm

được mảnh hoạ ở phần thẩm định (phụ yc 1)

Trang 17

3.3.2.2 Phương pháp phân tích cacbadox 4) Nguyên lý

Cacbadox được chiết từ mẫu thịt bằng etanol, sau đó loại tạp bằng cách chiết lỏng - lông với dung dịch đệm và n-hezan, làm sạch qua cột oxýt nhôm và phân tích bằng sắc ký lông hiệu năng cao với detectơ LJV ở bước sóng 350nm

5) Phạm vì áp dung

Quy mình này áp dụng cho các loại thục phẩm có nguồn gốc động vật ©)Tài liệu tham chiếu

MacIntosh AI, Neville GA (1984) Liquid chromatographic determination of carbadox, de soxycarbadox, and nitrofurazones in pork tissues, J Assoc Off Anal Chem Sep-

Cet, 67(5):958-62 [23] 4) Dung cu, thiét bj

EBS thong sic ký lỗng Breeze với các detects UV 2487 và bơm 1525

HB thing sc ky long Empower bom mẫu tự động, với detectơ PDA 2996 và detecto huỳnh quang 2487

Cot Symmeny/Water - C18, (150mm x 4,6mm x Sum), o6t bảo vé Symmetry Guard +) Háa chất, dung môi

Các hóa cbất và dung môi thuộc loại tỉnh khiết phân tích: Btanol, etylaxetat (Frolabo-Fhép)

Metanol, axetonitri (Merck)

nebexan va axit clohydric, bot oxftnhém-Al,0,, celit (Merck-Ditc) Chuẩn carbadox C,;HypN,0,/263,25 (Sigma-My)

Axit metaphotphoric 3.6%, amoni axetat (Prolabo-Ph4p) Dam kali dihydrogen photphat KH,PO,) 0.2 M, pH= 3.5

J9 Pha dung dich chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc cacbadox: 100 ppm pha trong metanol Bio quan tanh 4nh sing và ở 4C,

Dung dich chudn lam vige: Pha loãng tù chuẩn gốc thành các dung dịch chuẩn có nông 46 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; va 1,0 (ppm) bing metanol Bio quan 64°C, Pha méi hing ngày

8) Xáy dựng đường chuẩn

Trang 19

Cân 10 g mẫu đã đồng nhất

bột nhão: 1g bột nhôm 1 00 aiietonol

Chiết bằng máy xay tong 10 phút

|

Lọc qua một lớp Celit 545, thu lấy dịch lọc

"Thêm vào dịch lọc 25 m1axít metaphotphoric 3,6%

'

TẮc đều, cô quay chân không đến khoảng 25m] Thêm 5m] hexan, lắc đều, ly tâm

Thêm 10 m1KH,FO, 0,2 M

Tron déu, thêm nước ¬ chuyển sang bình gạn Chiết 3 lần, mới lân bằng 50 mÌ ety] axetat

Gặp dịch chiết bữu &, loại nước bằng Na,SO,

Ỷ

Cô quay chân không đến khô ở 502C

4 — 20mletylsxetat

Ha tan bằng 3 tnl ety laxetat

] —> | 4— nửa giải: 20m]1ELOH:MeCH:BLAC (10:10:80) Tầm sạch Qua cột ALO,

4

Cô quay dịch lọc đến khô ở 45C và hòa tan cặn bằng 500 il pha dong Diéu kiện chay sắc ký

- Pha dong: axetonitril : amoni axerat 0,01M : eranol (25:70:5), pH 6,8 - Tốc độ dòng: Iml/phút

~ Nhiệt độ cot: 30°C

Trang 20

- Detects UV: bude séng 350 nm 1) Tính kết quả cae x fale A om Trong 46: C,:Ham lugng mu phan tich (ppm) C.: ndng 4 mau chudn (ppm) A,} Dign tich pic miu A ¿ Diện tích pc chuẩn Va: Thé tích dịch cuối (ml) xa; khối lượng mẫu phân tích (kg) * Quy trình phán tích cacbadox có độ đúng và độ chính xác : - Hệ số hỏi quy tuyến tính: 0,9987

- Hệ số thu hỏi: với mẫu nạp chuẩn nảng độ 0,1 (pm) là 68% - Hệ số biến thiên (C V): 0,005

- Giới bạn thất hiện (LOD): 0,015 (ppm) - Giới han định lượng (LOQ): 0,051 (ppm) được mảnh hoạ ở phần thẩm định (phụ lục 2)

Trang 21

3.3.2.3 Phương pháp phân tích olaquindox

4) Nguyên lý

Mẫu đã đỏng nhất kỹ được chiết bằng nước cất, sau đó được làm sạch qua cột SEE- phenyl, Dịch cuối được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ UJV ở bước sóng 260 nm

Quy mình này áp dụng cho các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật ©)Tài liệu tham chiếu

Spierenburg, TJ., H Van Iemhe, Q DeGmff, and LP Jagen (1988) Liquid chromatographic determination of olaquindox in medicated feeds and in contents of porcine gastrointestinal tact J Assoc Off Anal Chem Nov-Dec; 71(6):1106-9 [29]

4) Dung cu, thiét bj

T‡ thống sắc ky ling Breeze với các detecto UV 2487 va bơm 1525

HBS thing sic kj long Empower bom mẫu tự động, với detecto FDA 2996 va detecto huỳnh quang 2487

Cot Symmeny C18 (Waters-Mg), 150mm x Spm x 4,6; c6t bao vé Symmetry Guard Cot chigt pha rấn loại phenyl (100mg, 1.5m), Altech, Mỹ

+) Háa chất, dụng môi

Các hóa chất và dung môi thuộc loại tinh khiết phân tích: Branol (Frolabo - Pháp)

Metanol, axetoniril (.T, Baker - Mỹ) trhexan, amoni azetat (Merek - Đức) Chuẩn olaquindox C,J1,„W0, (TAFAN)

Sf) Pha dung dich chuẩn

Dung dich chuẩn gốc olaquindox: 100 ppm pha tong metanol, Bio quan tránh ánh sing và ở 4'C,

Dung dich chuẩn làm việc: Pha loãng từ chuẩn gốc thành các dung dịch chuẩn có néng 46 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 và 1,0 (ppm) bang metanol

Đường chuẩn olaquindox được xây dựng bằng cách phân tích dãy chuẩn có nỏng độ từ 0,05 đến 1 (pm) Đường chuẩn và phương tình hỏi quy tuyến tính đối olaquiadox được thể biện ở bình dưới đây

Trang 22

Đương duầnglaguhđnc Đi th |opoo ý 2 BEBMệx + 23888 e000 F? = 0.9975, 0000 4p0tp 29000 5 h) Các buốc tiến hành quy trình phân tich olaquindox: 3 g mẫu đỏng nhất "Thêm 20 mm] nước cất Tắc ngang 2 giờ Ty tâm 15 phút, tốc độ 4500 vòng/ phút Thu iy dịch chiết hoại hoá, 6mlmetanol, — >}

3 ml nude cat ‘Lam sach qua SPB, loại phenyl (5m1)

Rin cot: 2 Minx 2ml nue cat Tầm khô trong 4 phốt

+— Rita git

5 ml ACN: H,0 (7,5: 92,5) Tiến hành sắc ký

Điều kiện chạy sốc ký

Trang 23

h) Tính kết quả

A, Vv,

C,=C,x—x+ A c m

Thong đó: C,; Hàm lượng mẫu phân tich (ppm) Cá: nông độ mẫu chuẩn (ppm)

Agi Dign tich pic miu A„: Diện tích pc chuẩn Va Thể tích dịch cuối (ml) mm: khối lượng mẫu phân tich(kg) * Quy trình phán ích olaguindox có độ đúng và độ chính xác: - Hệ số hỏi quy tuyếp tính: 0,9975 - Hệ số thu hỏi: 744 - Hệ số biến thiên (C V): 0,018

- Giới bạn phát hign (LOD): 0,054 ppm - Giới han định lugng (LOQ): 0,18 ppm được mình hoạ ở phần thẩm định (phụ lục 2)

Trang 24

3.3.2.4 Phương pháp phân tích testosteron, progesteron, 17B-estradiol, trenbolon, dexamethason

a) Nguyên lý

Mẫu thị, gan được chiết bing dém axetate (0,2M; pH 5,2) và dung méi MeOH Dịch lọc sau ly tâm được làm sach chat béo qua cot SEE-C18, rửa giải bing MeCH dem co quay, hoà tan cặn bằng hồn hợp dung môi n-hexan(diclometan (60/40; v4) Dịch mẫu tiếp tục được làm sạch qua cột SEE.S¡ và rửa giải bằng hồn hợp dung môi n-hexanfetyl axetat (25/15, v), cô quay chân khơng hồ cặn bằng axetonimil và tiến hành chạy sắc ký bằng Sắc ký lông với detectơ FDA ở bước sóng 242 và 260nm

Quy mình này áp dụng cho các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật ©) Tài liệu tham chiếu

1 lungju Seo, Hye-Young Kim, Bong Chul Chung, Jongki Hong (2005) Simultaneous detemmination of anabolic stercids and synthetic hocmones in meat by freezing: lipid filtration, solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectomeny

Journal of Chromatography A, 1067: 303-309 [22]

2 Tomoyuki Miyazaki, Takeo Sasamoto, Tsuneo Hashomoto and Yataro Kokubo Detemmination of Anabolic Agents in beef and milk by HPLC with Photodiode Amay Detector Vol.36, No 6 (1995) [28]

4) Dung cu, thiet bf

- Hệ théng HPLC Shimadzu; ot Lichrospher pha ngược RP- 18 (250mm x 4,6num x

Sym)

- Máy đồng nhất Ula Tuax T25 - Máy ly tâm Milro 22R-Hetich

~ Máy siêu âm đuổi khí Uluasonie LC30

- Cột lầm sạch chiết pha rấn SFE- Sỉ và cột SPE-C18 loại 3m]Supelco +) Hoá chất, dung méi, tinh khiết phán tích sắc ký

- Hoá chất, dung môi (Merck)

Axetonitril, diclometan, metanol, n-hexan,

- Đậm axetat (0,2M, pH 5,2): hoa tan 27,126g nami axetat trihydrat trong bình định mức 11, pba loãng dung dịch tới vạch múc bằng nước cất 2 lần và trộn đều bón hợp,

Dung dich được sử dụng trong 1 ngày

- Thuốc thử độ tỉnh khiết 98 - 99%,

Trang 25

17 Bestradiol{® ,H,,0,/272,4-kh6i lượng phân tử Œanver) TtogesteronjC,,H,,O,/314,5 (SIGMA)

Testosreron/Ð„E1„,O,/288,4 (Acros organics)

Dexametha son/C,,H,.FO,/392,5 SIGMA) ‘Trenbolon/C ,H,,0,/270,4 (SIGMA)

9 Pha dung dich chudn hén hop

Pha dung dich chudn 6 điều kiện tránh ánh sắng trục tiếp và bảo quản trong bình

mau nau:

Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm: cân 10030,lmg các chất chuẩn testosteron, gtogesteron, 17-estradiol, renbolon, dexamethason vào từng cốc 50ml, hoà tan và chuyển vào bình định mức 100 ml, định mức bằng axetcnirill ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ Các dung dich chuẩn gốc bảo quản ở 4°C có thể sử dụng được trong 3 thắng,

Tiến hợp dung dịch chuẩn gốc 100 ppm: lấy 10ml mới dung dịch chuẩn gốc 1000, Hgin] ở trên cho vào 1 bình định mức 100m], pha loãng tới vạch mức bing axetonitrill, lắc kỹ bốn hợp Bão quản 4*Œ

Dùng dịch chuẩn làm việc các hœcmon 25 ppm: lấy 2,5ml dung dịch chuẩn bốn hợp gốc hàm lượng 100ugán] vào trong bình định mức 0m], định mức tới vạch bằng azetonimil ở nhiệt độ phòng, lắc đều hón hợp, Bảo quản ở 4°C Fba mới dung dịch này hàng tuần

Dùng dịch chuẩn các hocmon chạy sắc ký 0,0025; 0,005, 0,05; 0,5; 1,0; 2,5 (ppm) hút 1,0; 2,0; 20,0; 200; 400; 1000 (1) chuẩn hồn hep hocmon 25ppm lam việc cho vào các

bình định mức 10ml, Định mức tới vạch bằng azetoniwil ở nhiệt độ phòng và lắc kỹ hồn hợp Bio quản ở 4'C, sử dụng được trong 1 tuần

Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn có nông độ khác nhau bằng HETC thu được các te có diện tích khác nhau Dựa trên nảng độ các dung dịch chuẩn và diện tích các pi thu được xác định đường chuẩn cho tùng loại hoemon

Trang 26

Duong chuan_Trenbolon 2aunn 180008 Ÿ tnnnnn sunnn " sooo 4 3 =118181~1294:3

Duong chuan_Dexametnason resto Duong oan Teststn

+0000 y= saise + 14a uate (at 7 N77 „_ EHHB snnnn 4nnnn 2nnnn R= 0.999 = š HM6 ‘000 Ì an 2000 te hy EF dã h) Các bước tiến hành Chiết mãi

Thịt và gan gà, lợn được xay nhuyễn, cân lấy 10g cho vio Sng ly tam, thém 10ml đệm azetat 0,2M (pEE5,2) và 50ml MeCH, nghiên kỹ bằng máy có đầu nghiên dạng thanh,

siêu âm 1Ô phút ở nhiệt độ 60, ly tâm trong 15 phút với tốc độ 8000 vòng/ghút ở nhiệt độ 4% Sau đó giữ ở nhiệt độ 4°C trong 1h để gan chất béo và lọc Khi cần thiết lầm sạch chất béo thêm, bút Sml dịch chiết thêm cho qua cột SEE-C18 (đã hoạt hóa bằng 6 m1 MeOH và 6 =mÌ nước cất), rửa tạp bằng 6ml nước cất và óm] bón hợp dung môi MeOHJnước (40/60; v/v), xửa giải bằng 6ml MeCH Dịch chiết đem cô quay bốc hơi dung môi đến khô ở nhiệt độ 454C, Cặn còn lại được hoà tan bằng 3ml hón hợp dung môi nbexanjiiclometan (60/40; vi), Dịch tiếp tục được chơ qua cột làm sạch SEB-5i (đã hoạt hoá cột bing 6ml n-bexan), ria tp bang 6ml bin hgp dung méi n-hexan/etyl axetat (75/25; v/v) rồi rửa giải bằng 6ml hin hgp dung méi n-hexanjetyl axetat (25/75; v/v) Dịch chiết đem cô quay chân không đến

khó, cặn được hoà tan bằng 2m] ACN,

#Điều kiên chạy HPLC:

Nhém hocmon testosteron, dexamethason, progesteron vé trenbolon - Cột LiChrospher /Supeleo RP18 (250mm x 4,6mm x Sum)

Trang 27

~ Pha dong: ACN/ MeCH/ HO (45/10/45, v/v/v), t6c độ dòng 1ml/phút,

- Nhiệt dé cot 30°C

- Lượng bơm mẫu 50L

- Xác định bằng PDA, dãi sóng 200 - 400nm, độ phân giải là 8nm, thời gian tích phân là 1/6 se, bước sống định lượng là 242nm đối với testosteron, dexametbason, Trogesteron và trenbolon Hocmon 17 Bestradiol ~ Cét LiChrospher/Supelco-RP18 (250mm x 4,6mm x Sum ) - Pha động: ACN/MeCH (60/40, vA¥), tốc độ dòng Iml/phuit ~ Nhiệt độ buồng cột 30°C ~ Thể tích bơm mẫu 504.1

Xác định bing PDA, dai sóng 200 - 400 nm, độ phân giồi là 8am, thời gian tích phân 1,6 giây, bước sóng định lượng là 210 nm, kiểm tra lại ở bước sóng 230nm và 260nm

Trang 28

Quy trink chiét hocmon: 10g mẫu

4— 10ml đệm axetat (0,2M; pH 5,2)

ống ly tâm (100m), nghiên bằng máy đến đồng nhất kỹ (3 phút) -4— 50ml MeOH (quấy boặc lắc kỹ) Ỷ

Siêu âm (10 phút, ở 60'C), ly tam lanh 8000v/phit, 4°C; 15 phút

Giữ ở nhiệt độ 4°C trong 1h

Hoạt hoá \

6ml MeOH "| Loại ipid (cột SEE-C18) - 5ml dịch mẫu

6m] nước cất 4C [rap 6mlnuốc cất

[ 6m] MeOHƒ nước (40/60; v/v) Ý 4—— rửa gi: 6ml MeOH

Cô quay chân không ở nhiệt do 40°C v

Toà cặn bing 3m] hén hop n-hexan/Hiclometan (60/40; v/¥)

Hoat hod Y

6ml mhexan _y Lim sach (c6t SFB-Si)

4— nia tap: 6ml nhexanjetylaxetat 75/25) {tiie gid: 6m mhexan/ ethyl exert 25/15) C6 quay chin khéng 6 nbiét do 40°C v

Toà cặn bằng 2m] ACN, bơm 50H] vào hệ thống sắc ký ) Tính kết quả

Vy,

Cec, x faye A, m

Trong 46: - C,; Ham lugng miu phin tich (ppm) ~ Cạ nông độ mẫu chuẩn (pm)

~ Aq: Diện tích pic mau

Trang 29

~ Ag: Diga tích pic chuẩn ~ Va: Thể tích dịch cu6i (ml) ~ m: khéi lượng mẫu cân (kg)

* Quy trình phán ích hocmon có độ đâng và độ chính xác: - Hệ số hỏi quy tuyến tính; 0,9996,

- Hệ số thu hỏi: đối v6i testosteron, progesteron, oestradiol ở 0,05 (ppm) là T8,6%; ở 0,5 (ppm) - 86,6%; và 2,5 (ppm) - 93.8% Vet trenbolon, dexamethason J 0,005 (ppm) là 74,6%; ở 0,05 (ppm) - 88,4%; va 1,0 (ppm) - 95,1%

Trang 30

3.3.3 CÁC CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU CU THE ~ Trang thiết bị hiện có của Phòng Thử nghiêm:

+ Sắc ký lỏng và khí thường, khối phổ cùng các thiết bị thông thường khác của phòng

Thân tích thực phẩm

+ Dụng cụ, hóa chất, chuẩn, thuốc thử tỉnh khiết Sắc ký

3.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Phần mềm xử lý số liệu kết quả phân của các thiết bị phân tích hiện đại

- Lý thuyết Toán thống kẻ để thẩm định độ đúng và độ chính xác của Quy trình phân tích (hệ số biến động, độ lặp lại, sai số thô phép đo

Trang 31

4 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU

4.1 Kết quả phản tích kháng sinh tetracyclin, oxytetracyclin và chlortetracyclin Béng 4.1: Két quả phán ích tevacyclin trên 150 mẫu thị và phi lạng

gil Sahemgmdu | Sd mducd phat hign ee,

TẾ Logi mau phan Anh Tớ tin - 11% 1| Thụ ba 35 4 114 2.| Thị gà 50, 3 60 3.[ Gan im 35 5 143 4.| Gan gà 30 6 20 Tổng số 180 18 12

ết quả phân tích tetacyclin trong 150 mẫu thù và gan của gia cảm, gia súc thụ thập, tại Hà Nội cho thấy đã có 18 mẫu nhiễm, chiếm tỷ lệ 12% Gan gà có tỷ lệ mẫu phát biện

tetracycline khá cao 20%, trong khi tỷ lệ này Ở các mẫu thịt gà là 6%

Đối với oxyteuacyclin chỉ có 2/35 mẫu thị lợn bị nhiễm, không có mẫu thị gà và mẫu gan rào thất hiện loại kháng sinh này,

Đối với các mẫu phát biện có kháng sinh, lượng tỏn dư đã được xác định trên thiết bị sắc ký lỏng biệu năng cao, kết quả thể hiện tại Bảng 4.2 và Bằng 4.3

Bảng 42: Tôn dư kháng sinh trong thịt và gan lon (ppb)

TT | Tén mau Nai lấy mẫu Tetracyclin Onytetracyelin

Thit lon 100 (MRL/JECEA) [100 (MRLIJEC)

1 [Thulgn | Chg Hing BS Sĩ

2 |THtlpa [Chg Hom 84

3 |Thhulgn | Chg Thanh Xoin 98

4 [Thitln | ChợThanh Xuân S1

5 |Thulệm | Chợ trương Định 203

6 |Thtlea | ChợTrươngĐịnhG) 95

Gan lon 300 (MRUJECFA)

7 [Ganlgn | ChợTrương Định 140

8 | Ganlgn | Chg Thanh Xuan 160

9 [Ganlon [Chg Hing B& (b) 210

10 |Ganlon | Chg Thanh Xuan 120

Trang 32

Béng 43: Tên dư kháng sinh trong thịt và gan ga (ppb) TT] Tên mẫu Nơi lấy mẫu Tetracyclin Onyietracyelin Thịt gà 100 (MRLIJECFA) 12 [ This Chợ Thái Hà 98 13 |Thrai Chợ Trương Định 161 14 [Thi sa Chợ Mơ 196 Gan gà 300 (MRLIJECFA) 15 [Gangà Chợ Thái bà 160 16 | Gangà Chợ Mơ (d) 240 11 |JGangà Chợ ö chợ dừa 130 18 | Gangà Chợ Trương Định S0 19 | Gangà Chợ Thái HÀ Ver 20. [Gan sa Chợ Trương Định 170

Trang 33

TRnh 4.2: Mẫu thử lợn (thời gian bane cla Hình 4.2: Mẫu thit gà (thôi gian ba của pic oxytetracyelin t,= 4.687) pic tetracyclin 1, = 6.192)

4.2 Két qua phan tich Carbadox va olaquindox

Hình 45: Chuẩn carbadox Hình 46: Chuẩn olaquindox

Thân tích các mẫu thit, gan của gà và lợn thu thập tại Eồ Nội trên thiết bị sắc ký ong biệu năng cao, ở giới bạn phát biện olaquindox 14 0,054 ppm va carbadox JA 0,015 ppm thì không có mẫu rào phát hiện thấy tản dư bai loại kháng sinh này

4.3 Kết quả phân tích hocmon

Đông thời với 150 mẫu thị, gan sà và lợn cũng đã được xác định bam lugng hocmon trên thiết bị sắc ký lỏng, kết quả thể hiện ở Bảng 4.4; 4.5; 4/6,

Trang 34

Bảng 4.4: Kết quả phán tích học mon trên 150 mẫu thịt và phú tạng

mm Số lượng mẫu Số mẫu cá phát hiện aie

at Tio wit phán tích hocmon TH % 3, [Tak ba 35 9 25,7 6, | Tass 50 3 s T |Sanln 3 21 S0 8 | Gangà 30 10 333 Tổng số T80 2 28,67

Béng 45:Tén du hocmon trong thịt và gan lon (ppb)

` tư n mốu - EwMes|Prmmas| Ossra | Trnbe- | Dexame-

Trang 35

14 [Ganka | ChợThanh Xuân S06

15 [Ganka | ChợThanh Xuân 12/16

Béng 46:Tén du hocmon trong thịt và gam gà (ppb)

Tr Tp | weitimin [Rese] Prare| Geary Tomko | đươn

Trang 36

* Theo bằng (4.5 và 4.6) số lần phát hiện tồn dư từng loại hocmon gém: Testosteron, +rogesteron, oestadiol, trenbolon, dexamethason tương ứng với lợn (3, 2, 13, 12, 8/38) và gà

(1,4, 5, 52/17); có tổng 55 lần phát hiện (tần suất phát hiện của 17B- estradiol(18)>menblon(17)>dexamethason(10)>progesteron(6)>testosteron(4)- Hinh 4,7 14 1349 & E Oo a BLon asa ® %3 y Hình 4.7: Só làn phát hiện tòn dự từng loại hoemon 2

* Có 43 mẫu phát biện tôn dư bocmon chiếm 28,67% trên tổng số 150 mẫu phân tích (Bằng 4.4); rong số 43 mẫu nhiễm có 27 mẫu mua tại các chợ (18%) và 16 mẫu lấy tại cơ sở (10,67%)

- Trong đó 30 mẫu lợn/ 70 mẫu phân tích, 13 mẫu gà / 80 mẫu phân tích, phát biện tén dư hocmon tương ứng 20,0% và 8,67% - Hình 4.8

Trang 37

71,33% mẫu không nhiễm

2008 ton 867% gu

THầnh 4.8: Tỉ lệ mẫu phát biện tổn dư hocmon trên tổng số 150 mẫu phân tích

* Tí lệ % số mẫu gà và lợn phát biện tồn dư trên 43 mẫu:

30 mẫu lợn (9 thị, 21 gan) - 69,77% và 13 mẫu gà (3 thịt, 10 gan) - 30,23% Hình 4.9 99,772 [Ti lệ mẫu lạc Tie mau gà 30,239

Tình 4.9; Tï lệ mẫu gà và lợn phát hiện tỏn dư trên 43 mẫu

* 11 mẫu trên tổng số 150 mẫu phân tích phát biện thấy tản dư bai loại hoemon trên cùng, mgt miu (Bing 4.5 và 4/6)

- Trong đó Lợn : 7 mẫu/30 mẫu phát hign; va gi: 4 mA u/13 mau phét hiện

* Số mẫu phát hiện bocmon tổng hợp vượt quá giới ban téndu cho phép 8% (12 mẫu/150 xmẫu phân tích), Nếu tính 12 mẫu/43 mẫu phát hiện là 27,9% trong đó lợn 21% và gà 7,0 % - TRnh 4.10,

Trang 38

Tỷ lệ% [1D@xamethason| E Trenbolon Lợn Gà

Hình 4.10: Tỷ lệ mẫu vượt quá tổn dư

cho phép tính trên 43 mẫu

Trang 39

* Tiêu chuẩn đánh giá hàm lượng thuốc kích thích tăng trưởng trong gia súc gia cdm da trên Giới hạn tồn dự cho pháp lớn nhất (MRE)

- Nhém 176- estradiol, progesteron, testosteron

Trong thịt và gan: không xác dinh (not specified) có nghĩa rằng số liệu có giá trị về nhận biết và bàm lượng tổn dư của thuốc thú y trong gia súc, gia cằm biểu thị một khoảng rộng an toàn cho tiều thụ trong thục thẩm khi thuốc được sử dụng theo cách an toàn Vì lý do đó, và các nghiên cứu trong đánh giá riêng, Hội đồng chuyên gia vé phy gia thực phdm JECFA cia FAO/WHO da ket luận sự có mặt của dư lượng thuốc rong sản phẩm gia súc gia cảm đã không lơ ngại cho súc khoẻ và không cần đưa ra mức giới bạn tôn dư cho phép lớn nhất bằng

số chơ ba loại hocmon trên,

- Nhám boemon tổng hợp theo tiêu chuẩn JECFA va FAO +Trenbolone; thị: 2 ppb;gan 1Ô ppb

+ Dexamethasone: thit 0,5 ppb; gan 2,5 ppb

- Theo TCVN 7046:2002 dhịt sươi - quy định kỹ thuật (2) dựa trên luật định giữa Việt Nam và Liên bang Nga về việc xuất khẩu thịt của VN sang Nga; đã được Tổng Cục TCĐLCL ban banh dua ra gidi han tn du 3 loai hocmon sau trong thị; ngoài ra các loại bocmon khác chim cé tong TCVN

+ Ostogen: 0,5ppb + Testosteron: 15pp>

+ Diethylsthylbestrol (hocmon téng hyp da bicdm) khéng được có tỏn dư

~ Theo Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lượng thục thực phim 867/1998/QD-BYT, gidi bạn dư lượng thuốc thú y tối đa cho phép rong sản phẩm thị quy định cho 05 nhóm thuốc (09 loại thuốc ) mong đó nhóm kháng sinh có 04 thuốc là clorampbenicol, flumequin, olaquindox đều không xác định dư lượng; còn spectinomycin và sunfadimidin dua ra các giới bạn dư lượng cho thếp trong thịt, gan, thận, mỡ, sữa [4]

- Nhám kháng sinh tetracyclin (OTC, TC, CTC) theo tiêu chuẩn IBCEA + Thịt gà, lợn: 100 ppb

+ Gan gà, lợn; 300 ppb

Trang 40

4.4 Danh sách các loại thuốc kích thích tăng rong dùng cho gia súc gia cảm trên địa bàn Hà Nội, danh mục được phép theo khuyên cáo của FAO/WHO

Chúng tôi thu thập các loại thuốc kích thích tăng trưởng và thức ăn gia súc bán trên thị

trường Hà nội Đỏng thời tìm hiểu các tài liệu Quốc tế về thuốc kích thích tăng trưởng trong

gia súc gia cảm,

4.4.1 Danh sách các loai thuốc kích thích tảng trong dùng cho gia súc gia cảm trên địa bàn Hà Nội (kháng sinh và bocmon kích thích lăng truéng)

Bảng 48: Danh mục thuốc kháng sinh đùng cho gia súc gia cẩm

TT | Tên thuốc | Nha Thank phan Tae dung Quy cách

sản xuất đồng gái &

hàm lượng _ 1 [Ampi-Col [Công | ong 100g, Đặc m†tiêu chay do |20g/ gói

cổ bẩn | Ampicillin thương hin, ecoli thuốc thú | ribydrate- 8000 | gay phd thing sau

yNam | mg cai sữa, những bệnh

Hai Colistin sunpbate- | ở gia súc sơ sinh, tụ 17500000 UL huyết trùng