Báo cáo phân tích sinh hóa chuyên sâu, Đánh giá lượng tồn dư salbutamol bằng các phương pháp sắc kí khác nhau, so sánh, tổng hợp giữa các phương pháp LCMSMS, GCMS, HPLC, tài liệu tổng hợp từ nhiều nguồn, báo cáo tiểu luận
MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG iii DANH SÁCH HÌNH iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Giới thiệu Salbutamol 1.2.1 Tính chất Salbutamol 1.2.2 Salbutamol y học 1.2.3 Tác dụng phụ Salbutamol 1.2.4 Tác dụng Salbutamol lên động vật nuôi người CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương pháp (LC-MS/MS) 2.1.1 Phương pháp thực 2.1.2 Chuẩn bị mẫu 2.1.3 Chương trình phân tích 2.2 Phương pháp QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) kết hợp UPLC-MS/MS 10 2.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn mẫu 10 2.2.2 Chương trình phân tích 10 2.2.3 Khảo sát chương trình nhiệt độ 11 2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích 11 2.3 Phương pháp (GC/MS) 12 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn mẫu 12 2.3.2 Khảo sát thông số hệ thống GC/MS 12 2.3.3 Xây dựng đường chuẩn khảo sát LOD, LOQ dựa vào đường chuẩn 13 2.4 Phương pháp (HPLC) 13 2.4.1 Chuẩn bị mẫu từ mô thịt 13 i 2.4.2 Phạm vi tuyến tính giới hạn phát 14 2.4.3 Độ xác 14 2.5 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học Salbutamol 14 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SALBUTAMOL 17 3.1 Phương pháp (LC-MS/MS) 18 3.2 Phương pháp QuEChERS kết hợp UPLC-MS/MS 20 3.4 Phương pháp (HPLC) 22 3.6 Đánh giá kết phương pháp phân tích salbutamol 23 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 ii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Kết phân tích thành phần dinh dưỡng thức ăn Bảng 2.2: Các nghiệm thức thực nghiệm gà Bảng 2.3: Tổng hợp số mẫu điều tra Salbutamol Bảng 2.4: Bảng tóm tắt pha dung dịch chuẩn Bảng 2.5: Chương trình Gradient pha động Bảng 2.6: Khảo sát ảnh hưởng thông số thiết bị khối phổ lên cường độ peak 11 Bảng 2.7: Chương trình gradient 11 Bảng 3.1: Các trị số m/z Salbutamol Salbutamol-d9 19 Bảng 3.2: Kết tối ưu hóa lượng (E) phân mảnh 20 Bảng 3.3: Thời gian lưu diện tích peak (n = 6) 21 Bảng 3.4: Kết thử nghiệm mẫu thử 21 Bảng 3.5: Kết phương pháp phân tích Salbutamol 23 Bảng 3.6: Ion sơ cấp ion β2-agonist nội chuẩn 24 iii DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo Salbutamol Hình 2.1: Cơng thức phân tử IS Salbutamol-d9 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu Hình 2.3: Cột sắc ký pha đảo C18 Hình 2.4: Cấu trúc chung β-AA dạng thay thường gặp vòng thơm 16 Hình 2.5: Cấu trúc phân tử số phenetanolamin Ái lực β-Adrenergic Receptors ghi ngoặc đơn (Anderson, Moody, & Hancock, 2009).17 Hình 3.1: Sắc kí đồ Salbutamol 18 Hình 3.2: Cơ chế phân mảnh Salbutamol 19 Hình 3.3: Cơ chế phân mảnh Salbutamol-d9 19 Hình 3.4: Sắc kí đồ Salbutamol (148; 166) 21 Hình 3.5: Khối phổ đồ chuẩn salbutamol salbutamol-d3 25 Hình 3.6: Khối phổ đồ chuẩn salbutamol salbutamol-d3 tra từ thư viện NIST 25 Hình 3.7: 1H-NMR spectrum of rac-salbutamol 26 Hình 3.8: 13C-NMR spectrum of rac-salbutamol 26 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt LOD LOQ MS HPLC GC LC UPLC Diễn giải từ viết tắt Giới hạn phát (Limit of Detection) Giới hạn định lượng (Limit of Quantificaion) Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (Highperformance liquid chromatography) Phương pháp sắc ký khí (Gas chromatography) Phương pháp sắc ký lỏng (Liquid chromatography) Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu (Ultra Performance Liquid Chromatoghraphy) v CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Chất tăng trọng hay chất tạo nạc hợp chất hóa học thuộc họ β – agonist xếp vào loại chất cấm sử dụng chăn nuôi tồn giới Họ β – agonist, điển hình salbutamol, hợp chất tổng hợp phenethanolamine Trong y học, salbutamol sử dụng tác nhân dùng điều trị bệnh hô hấp, dùng cho người với tên biệt dược albuterol, salbutamol Trong chăn nuôi, dược liệu đưa vào thức ăn gia súc nhằm giảm lớp mỡ da, tăng cơ, tăng trọng vật nuôi Theo nhiều nghiên cứu, salbutamol gây hại cho gia súc người ăn phải thịt vật ni có sử dụng loại thức ăn có trộn salbutamol, chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức gan Ở Châu Âu Châu Mỹ loại hóa chất bị cấm sử dụng Ở Việt Nam, loại dược liệu thuộc nhóm - Agonists gồm 18 hóa chất bị cấm (Quyết định số 54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 Bộ NN & PTNT) Tuy nhiên, salbutamol số 18 hóa chất thuộc nhóm - Agonists cịn sử dụng chăn ni Mặc dù có nghiên cứu dư lượng salbutamol thịt heo thịt gà công tác kiểm tra dư lượng salbutamol thực tế khiêm tốn Xuất phát từ tình hình thực tế, sở khoa học cơng trình nghiên cứu salbutamol cơng bố ngồi nước, đồng thời nhờ hỗ trợ thiết bị Trung tâm Kiểm nghiệm Cần Thơ, đề tài “Đánh giá lượng tồn dư Salbutamol có thịt gà phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS)” thực với mong muốn tìm điều kiện tối ưu q trình phân tích dư lượng salbutamol thịt gà phương pháp LC/MS-MS Đồng thời theo dõi thời gian đào thải salbutamol để giúp người chăn nuôi ý thức hoạt động chăn nuôi sử dụng salbutamol, giúp người tiêu dùng chọn lọc loại thực phẩm có nguồn gốc an tồn đời sống Nghiên cứu góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng giúp người chăn nuôi việc phát triển kinh tế (Trịnh Thanh Ngoan, 2020) 1.2 Giới thiệu Salbutamol 1.2.1 Tính chất Salbutamol • Cơng thức phân tử: C13H21O3N • Khối lượng phân tử: 239,31 đvC • Cơng thức cấu tạo: OH NH HO HO Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo Salbutamol • Trạng thái: dạng bột, màu trắng • Tonc: 157 – 158oC • Tính tan: tan nhiều H2O; CH3OH; C2H5OH, tan CHCl3; ether, không tan C6H6 Tên gọi: 4–(2–(tert–butylamino)–1–hydroxyethyl)–2-(hydroxymethyl)phenol Các tên gọi tương tự: Albuterol; AlbuterolSulfate; Almotex; Anebron; Cobutolin; Tobybron; Vencronyl; Venetlin; Ventilan; Ventodisks; Ventolin; Ventoline; 1.2.2 Salbutamol y học Salbutamol ứng dụng y học để điều trị bệnh hen suyễn hiệu nghiệm Thuốc điều trị bệnh hen suyễn có chứa Salbutamol có nhiều thị trường nước giới, chúng chia thành nhiều dạng khác nhau: + Chai xịt: loại phổ biến để bơm Salbutamol với lượng nhỏ thuốc bơm trực tiếp phổi + Bình khí dung: cách bơm trực tiếp thuốc vào phổi thời gian lâu Hình thức ống xịt Salbutamol tác động nhanh hơn, có nhiều ảnh hưởng tích cực dạng dung dịch dạng viên + Dung dịch (tiêm syrơ): Salbutamol tiêm qua tĩnh mạch, da để điều trị bệnh hen suyễn hút dung dịch vào Ventolin syrô chứa mg Salbutamol tương đương 2,4 mg Salbutamol sulfate 5ml + Dạng viên: viên Ventolin chứa mg mg Salbutamol tương đương 2,4 4,8 mg Salbutamol sulfate riêng biệt Thành phần phụ thêm vào bao gồm: Butylparaben, Ca3(PO4)2, CaSO4, Lactose, Magnesium stearate, Oleic acid, TiO2 Viên Salbutamol có tác dụng chậm khoảng 12 sau liều Nó sử dụng với thuốc chống viêm cho thời gian dài để kiểm soát triệu chứng, đặc biệt bệnh ho đêm phòng ngừa bệnh hen suyễn 1.2.3 Tác dụng phụ Salbutamol Ảnh hưởng Salbutamol sử dụng thuốc chủ yếu tác động lên bệnh chuột rút, bệnh run tay chân Ảnh hưởng khác thuốc tác kích lên 1-adrenoceptor tim (ít 500 lần so với tác kích lên -2-adrenoceptor) nhìn chung gây bệnh giãn mạch máu kết làm ảnh hưởng đến huyết áp tim Những ảnh hưởng phổ biến bao gồm: ảnh hưởng đến tâm lý, dễ xúc động, ho, tiêu chảy, chóng mặt, dễ bị kích động, thể cảm thấy khó chịu, đau đầu, chứng ợ nóng, tăng áp suất máu, khó tiêu, dễ cáu, thở không đều, suy nghĩ, rút cơ, buồn nôn, nóng nảy, gặp ác mộng, chảy máu cam, hoạt động sức, tim đập nhanh, phát ban, run tai, run tay chân, khó ngủ, đau bao tử, ngẹt mũi, dễ đau họng, làm đổi màu răng, hay rùng mình, thở khò khè, co thắt phế quản nghiêm trọng 1.2.4 Tác dụng Salbutamol lên động vật nuôi người Salbutamol hormone tăng trưởng tổng hợp hóa học có tác dụng kích thích gia súc, gia cầm tăng trọng nhanh Nó có tác dụng làm giãn phế quản, giãn trơn cuống phổi, điều khiển chất dinh dưỡng hướng tới mơ cơ, tăng q trình tổng hợp protein để tích lũy nạc giảm tích lũy mỡ thể Chính tăng trọng nhanh mà thời gian chăn nuôi rút ngắn, giảm chi phí thức ăn, thuốc men Chất kích thích tăng trưởng tích lũy thực phẩm thịt làm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, gây bệnh lý có biểu rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,… CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương pháp (LC-MS/MS) Dựa theo nghiên cứu Trịnh Thanh Ngoan (2020) “Đánh giá lượng tồn dư Salbutamol có thịt gà phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS)” 2.1.1 Phương pháp thực 2.1.1.1 Đối với gà thả vườn - Động vật thí nghiệm Thí nghiệm tiến hành 18 gà ta có trọng lượng 0,6 ± 0,1kg tiêm ngừa H5N1, xổ tẩy ký sinh trùng trước tiến hành thí nghiệm - Thức ăn phần thí nghiệm Thức ăn mua địa điểm bán thức ăn vào đầu thí nghiệm, gồm có tấm, cám, bắp, bột cá phối hợp thành phần sở (KPCS) Bảng 2.1: Kết phân tích thành phần dinh dưỡng thức ăn Thành phần % Moisture 8,21 Ash 5,85 CP 15,0 EE 23,5 CF 8,51 NFE 62,93 ME (kcal/kg) 5117 Các giá trị phân tích lần lặp lại để đánh giá hàm lượng thích hợp dành cho gà thử nghiệm Cơng thức thức ăn thí nghiệm bố trí sau: Bảng 2.2: Các nghiệm thức thực nghiệm gà Nghiệm thức Mô tả NT1 Cho thức ăn (KPCS) không chứa Salbutamol Sau cho ăn thức ăn (KPTN) 28 ngày NT2 Tiến hành thu mẫu phân tích NT3 Ngưng thuốc - Gà cho ăn KPCS ngày NT4 Ngưng thuốc - Gà cho ăn KPCS ngày NT5 Ngưng thuốc - Gà cho ăn KPCS ngày NT6 Ngưng thuốc - Gà cho ăn KPCS 10 ngày Ghi chú: + KPCS: Thức ăn không chứa Salbutamol + KPTN: Thức ăn chứa Salbutamol 1000μg/kg Khẩu phần thức ăn phối trộn Salbutamol cách cân 20mg Salbutamol hịa tan hồn tồn nước, sau phun lên 20kg thức ăn dạng viên mua ngồi cửa hàng sau trộn lên bảo quản thoáng mát Tiến hành phân tích để xác định xác hàm lượng salbutamol mẫu thức ăn KPCS KPTN Đến cuối nghiệm thức gà tiến hành mổ khảo sát để lấy mẫu phân tích Gà làm lơng, cắt tiết bỏ lòng, thu mẫu thận, gan thịt ức, đem xay nhuyễn máy xay thịt Mẫu ký hiệu theo nghiệm thức trữ đông -18oC, trước tiến hành phân tích mẫu rã đơng trộn Tổng số mẫu thực nghiệm: 18 mẫu thịt gà, 18 mẫu gan gà 18 mẫu thận phosphate tận ATP đến số protein mục tiêu tế bào, dẫn đến thư giãn • S-Salbutamol: S-salbutamol cho nguyên nhân gây tăng đáp ứng phế quản điều trị hen suyễn Salbutamol S-salbutamol hoạt động thụ thể thụ thể muscarinic Đây protein liên kết G có bảy vùng màng chuyển hóa Là protein liên kết G, thay đổi cấu trúc phân ly đơn vị alpha giống thụ thể beta hai Tuy nhiên, đơn vị phụ alpha kích hoạt enzym khác đường Trong đường này, đơn vị phụ alpha kích hoạt phospholipase C Enzyme xúc tác trình phosphoryl hóa phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) thành inositol 1,4,5triphosphate (IP3) bên màng (Sankar M et al., 1998) • Beta-agonist Salbutamol chất có nguồn gốc từ họ Beta-agonist Beta-agonists hợp chất hữu tự nhiên hay tổng hợp có cấu trúc hố học giống với phenetanolamines Một vài -agonists sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho người gia súc để có tác động đặc biệt trơn, trái lại, - agonists nghiên cứu tác nhân chống béo (antiobesity) Nghiên cứu cho thấy số -agonists hoạt động giống metabolic modifiers với khả đặc biệt tái sếp chất dinh dưỡng ăn vào nhằm tăng phát triển xương đồng thời giảm tích lũy mơ mỡ trâu bị, heo, gà giị, gà tây phát triển (Beermann 1993; Moondy, Hancock Anderson 2002; NRC 1994) Beta-agonists tác động qua đường tiêu hóa có hiệu liều dùng 5-30 ppm cho ăn thời gian ngắn (28-42 ngày) cuối giai đoạn gần xuất chuồng Tác động bị loại thải theo thời gian, sử dụng chất cần phải tính tốn cẩn thận để xác định thời gian cho ăn hợp lý Beta-agonists không làm tăng sản lượng sữa không cho phép sử dụng đàn thú giống (Moody, Hancock Anderson 2002) • Cơ chế hoạt động -agonist Beta-agonist tác động trực tiếp thông qua thụ thể -adrenergic xương màng tế bào mỡ tín hiệu generate, tín hiệu kiểm sốt hoạt động chuyển hóa tế bào Khi ractopamine -agonists khác gắn vào thụ thể adrenergic tế bào mỡ, tín hiệu sinh hóa khởi đầu, hoạt hóa số enzyme đường dẫn, dẫn đến giảm tỷ lệ tổng hợp dự trữ mỡ (lipogenesis) tăng huy động lipid tế bào (lipolisis) 15 ... choáng váng,… CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương pháp (LC-MS/MS) Dựa theo nghiên cứu Trịnh Thanh Ngoan (2020) ? ?Đánh giá lượng tồn dư Salbutamol có thịt gà phương pháp sắc ký lỏng ghép... 14 2.5 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học Salbutamol 14 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SALBUTAMOL 17 3.1 Phương pháp (LC-MS/MS) 18 3.2 Phương pháp QuEChERS... cơng trình nghiên cứu salbutamol cơng bố ngồi nước, đồng thời nhờ hỗ trợ thiết bị Trung tâm Kiểm nghiệm Cần Thơ, đề tài ? ?Đánh giá lượng tồn dư Salbutamol có thịt gà phương pháp sắc ký lỏng ghép