Luận Văn Đánh Giá Lượng Tồn Dư Thuốc Kích Thích Tăng Trọng Trong Thịt Gia Súc, Gia Cầm.pdf

Microsoft Word 6488 doc Bé y tÕ ViÖn Dinh D−ìng B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi ®¸nh gi¸ l−îng tån d− thuèc kÝch thÝch t¨ng träng trong thÞt gia sóc, gia cÇm Chñ nhiÖm ®Ò tµi trÇn quang thñy 6488 27/8/2007 Hµ[.]

Bé y tÕ ViƯn Dinh D−ìng Báo cáo tổng kết đề tài đánh giá lợng tồn d thuốc kích thích tăng trọng thịt gia súc, gia cầm Chủ nhiệm đề tài: trần quang thủy 6488 27/8/2007 Hà Nội - 2007 PHẦN A: TÓM TẮT KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI (a)- Đóng góp đề tài - Xây dựng quy trình phân tích thuốc kích thước tăng trưởng dạng kháng sinh hocmon có độ tin cậy xác cao, áp dụng phịng phân tích thực phẩm Trung ương, Thành phố tuyến Tỉnh - Nêu thực trạng tình sử dụng thuốc; d¹ng loại thc n chn nuụi gia sỳc gia cm có bán thị trường Hà nội; tỉ lệ tồn dư thuốc kháng sinh, hocmon thịt gia súc gia cầm chợ trọng điểm số sở chăn nuôi Hà Nội - Tõ thùc trạng cỏc nh qun lý ngnh Y tế, thú y đưa sách quản lý vĩ mơ, vi mơ việc sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng; nghiên cứu đưa tiêu chuẩn giới hạn tồn dư cho phép loại thuốc kích thích tăng trưởng gia súc gia cầm chưa ban hành ngành Nông nghiệp Y tế; đồng thời thúc đẩy giám sát chặt chẽ sở chăn nuôi nước, sản xuất thịt sản phẩm gia súc gia cầm đạt tiêu chuẩn chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm (CLVSATTP) (b)- Kết cụ thể (các sản phẩm cụ thể) - Quy trình phân tích thuốc kích thích tăng trưởng thịt gia súc, gia cầm - Số lượng chủng loại thuốc kích thích thích tăng trưởng (dạng kháng sinh hocmon) thức ăn gia súc sử dụng chăn nuôi gia súc, gia cầm - Giúp nhà quản lý ngành Nơng nghiệp Y tế thấy tình hình sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng thịt gia súc gia cầm địa bàn Hà Nội để đưa sách quản lý, giám sát, kiểm tra hữu hiệu từ khâu nguyên liệu, chăn nuôi, phân phối thịt gia súc địa bàn Hà nội nói riêng nước nói chung nhanh chóng ban hành tiêu chuẩn lượng cho phép lớn lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng thịt gia súc gia cầm sản phẩm chúng - Đưa tiêu chuẩn hành JECFA, WHO/FAO, JAPAN lượng tồn dư cho phép lớn thuốc kích thích tăng trưởng thịt gia súc gia cầm để ban ngành nước ta tham khảo - Đưa tài liệu thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm vấn đề sử dụng thức ăn chăn ni an tồn cho người tiêu dùng (c)- Hiệu đào tạo - Đào tạo cho phòng thử nghiệm thực phẩm tuyến Tỉnh kỹ thuật phân tích kháng sinh hocmon thực phẩm gia súc gia cầm, phù hợp với điều kiện trang thiết bị phân tích có phịng thử nghiệm - Hướng dẫn cho nhà quản lý, sản xuất đưa thị trường loại thức ăn chăn nuôi công thức phối trộn nguyên liệu thành phần thuốc, quy cách quy định - Hướng dẫn người chăn nuôi sử dụng thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm an toàn, nhằm đưa thị trường sản phẩm thịt sạch, đảm bảo Vệ sinh an toàn thực phẩm - Bổ sung kiến thức cho người tiêu dùng biết tồn dư thuốc kích trưởng sản phẩm thịt gia súc, gia cầm có bán thị trường tác hại thuốc (d)- Hiệu kinh tế - Hướng dẫn nhà sản suất sản xuất loại thức ăn chăn ni có sử dụng loại thuốc kích thích tăng trưởng có hiệu theo giai đoạn chăn nuôi; nhằm tăng sản lượng thịt gia súc gia cầm s¹ch, bước đáp ứng nhu cần tiêu thụ người dân - Chi phí kiểm nghiệm cho tiêu thuốc kích thích tăng trưởng (kháng sinh hocmon) phịng thí nghiệm vệ sinh an tồn thực phẩm tốn kém, đạt độ xác tin cậy cao (e)- Hiệu qủa xã hội - Nâng cao nhận thức nhà quản lý, sản xuất người tiêu dùng vai trị, tác dụng, tác hại thuốc kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi tồn dư thuốc thịt sản phẩm gia súc gia cầm sản xuất đời sống xã hội - Người tiêu dùng thông thái hơn, biết chọn sản phẩm thịt gia súc gia cầm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, ngăn ngừa bệnh có liên quan đến thuốc kích thích tăng trưởng dẫn đến bệnh tiềm ẩn hiểm nghèo gánh nặng cho xã hội béo phì giả tạo, biến đổi giới tính sử dụng thịt gia cầm gia súc có dư lượng kháng sinh hocmon cao vượt mức quy định cho phép (f)- Các hiệu khác áp dụng vào thực tiễn sản xuất đời sống x hội - Ap dụng Quy trình phân tích đề tài xây dựng để phân tích d lợng thuốc kích thích tăng trởng thực phẩm Phòng Thử nghiệm phân tích Trung ơng, Tỉnh, Thành phố - Đề tài nêu loại thuốc kháng sinh, hocmon dạng công thức thức ăn chăn nuôi để nhà quản lý thuốc sản xuất thức ăn chăn nuôi, ngời chăn nuôi gia súc gia cầm tham khảo ¸p dơng thùc tiƠn - Gióp cho ng−êi tiªu dùng thực phẩm có thông tin loại thuốc kÝch thÝch tr−ëng gia sóc gia cÇm, thËn mua thực phẩm đánh giá thực tiễn đề tài đối chiếu với đề cơng nghiên cứu đ đợc phê duyệt (a) Tiến độ - Do ảnh hởng dịch cúm gia cầm, tợng nở mồm long móng gia súc gia cầm nên việc mua mẫu gặp nhiều khó khăn, bị trễ thời gián tiến độ đề tài nghiên cứu (b)- Thực mục tiêu nghiên cứu - Đảm bảo thực đầy đủ mục tiêu nghiên cứu đề đề tài (c) Các sản phẩm tạo so với dự kiến đề cơng - Sản phẩm tạo đề tài đáp ứng đủ dự kiến đề cơng (d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí - Khối lợng đề tài lớn, tập trung vào xây dựng quy trình phân tích, kinh phí cho kiểm nghiệm tiêu kháng sinh hocmon cao; nhng đảm bảo mục tiêu nghiên cứu đề Do đạt hiệu cao việc sử dụng kinh phí đợc cấp Các ý kiến đề xuất - Cần có phối hợp liên ngành quản lý thuốc sở sản xuất thức ăn chăn nuôi có sử dụng thuốc kích thích tăng trởng, thịt sản phẩm gia súc gia cầm bán thị trờng tiêu thụ nh siêu thị bán lẻ - Xây dựng ban hành tiêu chuẩn thuốc kích thích tăng trởng thức ăn chăn nuôi thịt gia súc gia cầm - Xây dựng Phòng thử nghiệm trọng điểm tỉnh thành có lực cao kiểm soát đợc chất lợng VSATTP Từng bớc đa dạng hóa khả phân tích tiêu chất lợng VSATTP PTN thuộc ngành Y tế, tỉnh thành đặc biệt hàng hóa thực phẩm xuất nhập nớc Phần B: Nội dung báo cáo chi tiết kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ Đặt vấn đề 1.1 Tóm lợc nghiên cứu nớc liên quan đến đề tài Tính cấp thiết cần nghiên cứu đề tài Nhờ tiến vợt bậc khoa học kỹ thuật mà ngành công nghiệp sản xuất sản phẩm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi đà ngày phong phú không ngừng phát triển Các chủng loại thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm chế biến sẵn thị trờng đa dạng Ngoài thành phần cung cấp lợng nh protein, lipid, glucid, ngời ta bổ sung chất khoáng, vitamin, kháng sinh chất tăng trọng giúp cho vật vừa lớn nhanh vừa có khả chống đỡ bệnh tật Những lợi ích thức ăn đóng gói sẵn dễ nhận thấy, ngời chăn nuôi vừa không nhiều thời gian tìm nguồn nguyên liệu, chÕ biÕn phï hỵp víi tõng thêi kú sinh tr−ëng vật mà lại cho suất cao nhng buông lỏng quản lý chất lợng loại thức ăn chăn nuôi chạy theo lợi nhuận cã thĨ dÉn tíi nh÷ng sai sãt khã l−êng sản xuất, sử dụng thức ăn chăn nuôi chế biến sẵn, gây hậu nghiêm trọng đến chất lợng vệ sinh an toàn thực phẩm, ảnh hởng lớn tới sức khỏe ngời tiêu dùng Một số nghiên cứu đà đề cập đến tác dụng ý muốn kháng sinh, chất kích thích tăng trởng thức ăn chăn nuôi chế biến sẵn đến chất lợng vệ sinh an toàn thực phẩm Ngời tiêu dùng ngày đà cảnh giác với thực phẩm có liên quan đến công nghệ sinh học, loại phụ gia thực phẩm việc lạm dụng kháng sinh điều trị bệnh tật cho ngời gia cầm, gia súc Việc lạm dụng chất kháng sinh hocmon bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gần đà đợc cảnh báo, nhiên lợng tồn d thịt gia cầm, gia súc cha đợc xác định cụ thể Do vậy, để cung cÊp sè liÖu cã tÝnh khoa häc, Khoa Hãa Thùc phÈm vµ VƯ sinh an toµn thùc phÈm-ViƯn Dinh dỡng đà tiến hành đề tài nghiên cứu Đánh giá lợng tồn d thuốc kích thích tăng trọng thịt gia súc, gia cầm Hy vọng kết đề tài góp phần đề xuất biện pháp tăng cờng công tác quản lý việc sản xuất sử dụng cách có hiệu thức ăn chế biến sẵn nhằm thúc đẩy phát triển ngành chăn nuôi, cung cấp đủ nguồn thực phẩm sạch, vệ sinh an toàn, bảo vệ sức khỏe ngời tiêu dùng 1.2 Giả thiết nghiên cứu đề tài - Tham khảo tài liệu phân tích thuốc kích thích tăng trọng gia súc gia cầm nớc Khảo nghiệm, lựa chọn quy trình phân tích tối u phù hợp với điều kiƯn trang thiÕt hiƯn cã cđa phßng thư nghiƯm; tiến hành thẩm định kỹ thuật đạt; tiêu chuẩn áp dụng thử nghiệm Phòng thử nghiệm - áp dụng quy trình phân tích đà xây dựng xác định lợng tồn d thuốc kích thích tăng trởng thịt phủ tạng gia súc gia cầm chợ trọng điểm sở chăn nuôi Hà Nội - Khảo sát, tìm hiểu, ghi chép loại thuốc kích thích tăng trởng dạng kháng sinh hocmon loại thức ăn gia súc gia cầm có bán thị trờng Hà Nội - Tham khảo nghiên cứu nớc đa tài liệu thức ăn gia súc ; vấn đề an toàn sử dụng - Xử lý thống kê kết phân tích 1.3 Mục tiêu nghiên cứu - Phân tích lợng tồn d thuốc kích thích tăng trởng mẫu thịt lợn thịt gà thị trờng Hà Nội - Thu thập loại thuốc kích thích tăng trọng dùng cho gia súc gia cầm địa bàn Hà Nội, danh mục đợc phép theo khuyên cáo FAO/WHO bị cấm - Khảo sát thị trờng bán thức ¨n gia sóc cã sư dơng thc kÝch thÝch t¨ng trởng Tài liệu thức ăn tăng trọng an toàn sử dụng bảo vệ sức khỏe cộng đồng Địa điểm, thời gian phân tích mẫu - Khoa Hóa-Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm Phòng Hóa Độc Thực phÈm/Trung T©m KiĨm NghiƯm VSATTP, ViƯn Dinh D−ìng - Thêi gian tiÕn hµnh 2004 - 2006 Tỉng quan đề tài: 2.1 Tình hình nghiên cứu nớc liên quan tới đề tài Tình hình nghiên cứu nớc thuốc kích thích tăng trởng dạng kháng sinh hocmon thực phẩm phát triển mạnh mẽ nhiều nớc Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản từ đầu năm 1960 phơng pháp phân tích thiết bị nh Sắc ký lỏng, Sắc ký khí, Elysa đến đầu 1970 kỹ thuật khối phổ đời phân tích tồn d thuốc kích thích tăng trởng dới dạng vết siêu nhỏ Có nhiều khảo sát tại nớc phát triển nh nớc phát triển Châu Phi gần Trung Quốc, cho thấy d lợng thuốc kháng sinh hocmon thực phẩm đặc biệt thịt gia súc gia cầm cao đáng báo động với tỉ lệ cao Do việc nghiên cứu tình hình sử dụng thuốc kích thích tăng trởng sản xuât, chăn nuôi đến sản phẩm thực phẩm, thủy sản xuất nhập đợc đặc biệt giới thời gian qua Các phơng pháp phân tích d lợng kháng sinh hocmon thực phẩm Hiện nay, giới đà có nhiều nghiên cứu phân tích tồn d kháng sinh hocmon thịt nh phủ tạng động vật, phần lớn phơng pháp sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao [7; 8; 9; 10; 11; 12 ; vµ 18; 19; 20; 21; 22; vµ 24; 25; 26; 27; 28; 29] * Phân tích kháng sinh nhóm tetracyclin Các kháng sinh nhóm tetracyclin kháng sinh phổ rộng, có tác dụng vi khuẩn gram âm gram dơng, đặc biệt có tác dụng vi khuÈn nh− Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus, Gonococus, Cholera, Dysentery bacillis, Pertussis, Rickettsia, Chlamydia Mycoplasma Việc sử dụng rộng rÃi kháng sinh nhóm làm tăng nguy đề kháng kháng sinh, cần thiết phải có phơng pháp đánh giá xác mức độ tồn d nhằm bảo vệ sức khỏe ngời tiêu dùng Phơng pháp phân tích vi sinh vật phơng pháp phổ biến để xác định d lợng kháng sinh Tuy nhiên phơng pháp tốn nhiều thời gian, xác định cụ thể loại kháng sinh nhóm độ xác không ổn định Vì phơng pháp sắc ký đợc lựa chọn phơng pháp để phân tích d lợng kháng sinh nhóm tetracyclin Phơng pháp sắc ký cổ điển phơng pháp sắc ký lớp mỏng đợc áp dụng từ năm 1960, sử dụng vật liệu lớp mỏng nh kieselguhr, silica gel celluloza Các mẫu đợc áp dụng chủ yếu dợc phẩm số loại thực phẩm nh sữa, mật ong thịt, cá Phơng pháp điện di mao quản đợc áp dụng có số u điểm so với sắc ký lỏng nh sử dụng dung môi, thời gian phân tích ngắn, hiệu lực tách cao Tuy nhiên phơng pháp đợc áp dụng thực tế để phân tích d lợng kháng sinh lợng mẫu bơm nhỏ độ nhạy thấp Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao phơng pháp đợc áp dụng để xác định d lợng nhỏ kháng sinh thực phẩm Nhiều nghiên cứu đà thực công bố tạp chí phân tích chuyên ngành Các tetracyclin đợc chiết làm chiết pha rắn, sau định lợng sắc ký lỏng sử dụng detector UV PDA Đối với mẫu có d lợng rÊt nhá, ng−êi ta sư dơng s¾c ký láng khèi phổ để định lợng [19] Phân tích olaquindox cacbadox Olaquindox vµ carbadox lµ hai chÊt thuéc nhãm quinoxaline 1,4-dioxide, đợc dùng số nớc để kích thích tăng trởng điều trị ỉa chảy gia súc Do nguy khả gây đột biến gen gây ung th chất sè chÊt chun hãa cđa chóng, EU ®· cÊm sư dụng hai loại hóa chất từ năm 1998 Để giám sát việc sử dụng chất olaquindox carbadox chăn nuôi, phơng pháp phân tích đà đợc phát triển áp dụng để phân tích thức ăn chăn nuôi sản phẩm từ gia súc, gia cầm Các phơng pháp đợc áp dụng để xác định tồn d olaquindox, carbadox chất chuyển hóa sắc ký lỏng hiệu cao với detectơ UV DAD [9, 10] Phân tích hocmon steroid Các hocmon steroid có mặt thịt loại gia súc, gia cầm với hàm lợng thấp vài àg/kg (ppb) Bản thân động vật tự tổng hợp loại hocmon trình chuyển hóa tự nhiên protein chất béo Vì hocmon đợc biết ảnh hởng đến phát triển phân bố mô mỡ Mức độ tỷ lệ loại hocmon, chất tiền thân chất chuyển hóa phụ thuộc vào điều kiện sinh lý, đặc tính di truyền ảnh hởng môi trờng, có điều kiện thức ăn chăn nuôi Vì vậy, việc giám sát hàm lợng hocmon steroid quan trọng để đánh giá chất lợng thịt gia súc, gia cầm Tuy nhiên thực tế khó phân biệt đợc đâu hocmon nội sinh đâu lợng hocmon đợc đa vào qua tình chăn nuôi Vì thông thờng ngời ta phải xác định tỷ lệ loại hocmon, tỷ lệ chất tiền thân chất chuyển hóa Nhiều phơng pháp phân tích đà đợc phát triển để xác định hàm lợng hocmon thịt nh phơng pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu cao, phơng pháp miễn dịch, phơng pháp sắc ký khí khối phổ phơng pháp sắc ký lỏng khối phổ [22, 28] Để đạt độ xác cao hơn, ngời ta kết hợp nhiều phơng pháp với nhau, chẳng hạn kết hợp phơng pháp miễn dịch phơng pháp sắc ký khí khối phổ Phơng pháp phân tích miễn dịch đặc biệt phù hợp để phân tích sàng lọc nhiều mẫu với độ nhạy cao 2.2 Tình hình nghiên cứu nớc liên quan tới đề tài Ơ Việt Nam kháng sinh đợc dùng rộng rÃi để chữa bệnh cho ngời gia súc, ngời ta đà phát đa lợng nhỏ kháng sinh vào thức ăn gia súc gia cầm hạn chế nhiều bệnh truyền nhiễm mà làm vật lớn nhanh, cho nhiều thịt nhiều trứng Sau đó, kháng sinh ngày đợc dùng phổ biến chăn nuôi Ngời ta đà trộn kháng sinh vào thức ăn gia súc với liều lợng thích hợp nhằm kích thích sinh trởng gia súc non mang lại hiệu trờng hợp thức ăn chất lợng, chuồng trại ẩm ớt vệ sinh vùng có dịch bệnh thờng xuyên xẩy vật vào giai đoạn phát triển kháng sinh có hiệu mạnh vật trởng thành Đối với gia súc tiết sữa nh bò sữa, lợn nái tiết sữa, kháng sinh có tác dụng không rõ ràng, kháng sinh tiết qua sữa gây ảnh hởng đến chất lợng sữa, không nên bổ sung kháng sinh vào thức ăn không mục đích chữa bệnh cho vật [1, 2] Bên cạnh lợi ích dễ nhận thấy thức ăn chăn nuôi có bổ sung kháng sinh, tác dụng không mong muốn kháng sinh ngày thể rõ rệt Dùng kháng sinh với liều lợng thấp liên tục đà làm xuất vi khuẩn kháng lại kháng sinh Kháng sinh loại bỏ vi khuẩn có hại mà tiêu diệt vi khuẩn có ích nh vi khuẩn tạo vitamin nhóm B đờng tiêu hoá Do vậy, đà có khuyến cáo hạn chế không dùng kháng sinh thức ăn chăn nuôi, sử dụng tập trung vào giai đoạn gia súc dễ bị khủng hoảng nh cai sữa sớm tránh loại kháng sinh thờng dùng để chữa bệnh cho ngời Một số kháng sinh sử dụng với hàm lợng cao gây tình trạng kháng kháng sinh, gây khó khăn cho công tác phòng chống bệnh tật cho gia cầm, gia súc Lợng tồn d vợt mức cho phép kháng sinh thực phẩm vừa ảnh hởng tới giá trị cảm quan ăn lại vừa có hại tới sức khoẻ ngời tiêu dùng Tại phiên họp Hội đồng chuyên gia JECFA FAO/WHO đợc tổ chức năm 1999 Rome, Italia nhằm đánh gía tồn d− mét sè thc thó y thùc phÈm ®· đa giới hạn lợng ăn vào hàng ngày chấp nhận giới hạn tối đa cho phép số kháng sinh Với Dihydrostreptomycin/streptomicin lợng ăn vào hµng ngµy cã thĨ chÊp nhËn lµ 0-50 ppb theo trọng lợng giới hạn tồn d tối đa cho phép thịt lợn, thịt gà, thịt bò (thịt bắp) kể gan 600 ppb, thận 1000 ppb Lợng ăn vào hàng ngày chấp nhận Neomycin 0-60 ppb theo trọng lợng giới hạn tồn d tối đa cho phép thịt bò, lợn, gà 500 ppb, lợng tồn d cho phép gan, thận cao 3-4 lần so với thịt bắp [3, 14, 16] Gần Việt Nam, số nghiên cứu đà đề cập đến vấn đề d lợng kháng sinh nhóm tetracycline thịt phủ tạng [15] Kết khảo sát cho thấy rằng, sử dụng thức ăn nuôi lợn chứa chlortetracyclin với hàm lợng 110 ppm 330 ppm khoảng thời gian liên tục 31 98 ngày tơng ứng d lợng chlortetracyclin gan thận cao gấp 10 lần d lợng phần thịt mỡ Nghiên cứu tơng tự gà cho thấy cho gà ăn thức ăn chứa 220 ppm chlortetracyclin, lợng tồn d, sau ngừng cho ăn, gan thận 0,66 0,42 (ppm) tơng ứng, tồn d phần da có dính mỡ 0,02 ppm Những nghiên cứu cho thấy sau ngày ngừng cho ăn thức ăn có chứa chlortetracyclin, không phát thấy tồn d kháng sinh thịt Do vậy, thức ăn chăn nuôi có chứa chlortetracyclin việc cách ly gia cầm với thức ăn 1-2 ngày cần thiết Carbadox olaquindox loại kháng sinh nhanh chóng phân hủy thể động vật để tạo thành desoxycarbadox gan thận nhng bền trứng phần thịt [2, 5] Quinoxaline-2-carboxylic acid (QCA) chất chuyển hóa carbadox Đối với olaquindox, chất chuyển hóa tìm thấy khác mô khác khác loại vật nuôi Chất đợc hấp thu nhanh chóng đờng ruột thải trừ qua đờng nớc tiểu lợn, bổ sung olaquindox vào thức ăn với hàm lợng 60 ppm, sau 28 ngày tồn d olaquindox dới 0,005 ppm phần thịt dới 0,01 ppm thận Trong nhiều năm qua, số loại hocmon dẫn suất đà đợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trởng cho gia cầm, gia súc [8,9,10] Khi trộn thyroxin vào thức ăn với lợng nhỏ 40-60 (ppm) có tác dụng tăng trởng rõ rệt gia cầm, gia súc tình trạng thiếu hụt iod phần ăn hàng ngày không cân đối chất dinh dỡng Nếu kéo dài thời gian sử dụng thức ăn chăn nuôi có bổ sung thyroxin không đủ thời gian cách ly trớc giết mổ 10 ngày lợng tồn d thyroxin vợt mức cho phép, vi phạm quy định chất lợng vệ sinh an toàn thực phẩm [23] Một sè lo¹i néi tiÕt tè sinh dơc progesteron, testosteron, 17β-estradiol đà đợc dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với mục đích tăng trọng nâng cao hiệu thức ăn Tuy nhiên, năm 50-60 cđa thËp kû tr−íc thiÕu thËn träng đa hocmon vào thức ăn chăn nuôi nên hàng chục năm sau số nớc phát triển nh Thuỵ ®iĨn, Anh, Ph¸p, Scotland ng−êi ta ®· nhËn thÊy hËu rõ rệt đến tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm có liên quan đến sức khoẻ cộng đồng Hiện tợng đồng tính luyến tăng, giảm mật độ tinh trùng, tinh hoàn lệch, ẩn trẻ em trai tuổi dậy trẻ em gái sớm Đến năm 1989, nớc cho phép sử dụng testosteron, estradiol điều trị bệnh Đến năm 1999, ngời ta đà thông báo nguy gây ung th 17- estradiol nên không dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với mục đích tăng trọng [1,2] Phơng pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao đà đợc áp dụng số phòng phân tích thực phẩm, để xác định nhiều loại chất kích thích tăng trởng, có hocmon steroid [22, 28] Để phân tích sắc ký, mẫu sau chiết xuất, đợc làm làm giàu trớc tạo dẫn xuất dễ bay hơi, thông thờng silyl hóa Quá trình làm thờng phức tạp, tốn thời gian dung môi, nhiều tác giả đà nghiên cứu để cải tiến quy trình làm nh áp dụng vật liệu chiết pha rắn để giảm thời gian phân tích lợng hóa chất sử dụng Việc phân tích hocmon thịt động vật phức tạp nhiều, thờng phải kết hợp phơng pháp chiết xuất lỏng lỏng chiết xuất pha rắn, số tác giả kết hợp chiết pha rắn với làm qua sắc ký lỏng trớc dẫn xuất phân tích Qua khảo sát loại thức ăn thị trờng điều kiện chăm sóc, đề phòng dịch bệnh cho gia cầm, gia súc nớc ta [1,2,5], đề tài đà tập trung phân tích tồn d kháng sinh nhóm tetracyclin, olaquindox, carbadox; hocmon steroid tổng hợp bao gåm testosteron, progesteron, oestradiol, trenbolon, dexamethason Phô lục Phụ lục Thẩm định phơng pháp phân tích kháng sinh tetracyclin, chlortetracyclin, oxytetracyclin Thẩm định phơng pháp nhằm đánh giá phép thử áp dụng phòng thử nghiệm có đạt độ xác phơng pháp đo kết đo, đạt phơng pháp đợc áp dụng nội bộ, thông qua phê duyệt để ban hành tiêu chuẩn ngành Việt nam bao gồm thông số thẩm định theo [6]: -Xác định giới hạn phát (Limit of Detection/LOD), giới hạn định lợng (Limit of Quantitation/LOQ); -Kho¶ng tun tÝnh, hƯ sè håi quy tuyến tính -Hệ số thu hồi (Độ xác) -Đối tợng mẫu làm thẩm định: Gan lợn 1.1 Giới hạn phát giới hạn định lợng phơng pháp Chuẩn bị mẫu nạp chuẩn mức nồng độ gần với giới hạn phát dự đoán 0,025 ppm OTC TC; 0,05ppm với CTC Nạp 500àl hỗn hợp OTC, TC có nồng độ 0,5 ppm, CTC có nồng độ ppm vào g mẫu trắng (mẫu trắng mẫu thịt không phát có tồn d thuốc kháng sinh OTC TC) Phân tích mẫu nạp chuẩn xác định độ lệch chuẩn mẫu Giới hạn phát đợc tính toán theo công thức: LOD = x SD, giới hạn định lợng đợc xác định công thức LOQ = 10 x SD Kết chi tiết đợc thể bảng sau: Bảng 1.1: Xác định giới hạn phát hiƯn cđa OTC TT Sè mẫu thí nghiệm Hàm lợng OTC nạp vào mẫu (ppm) X1 0,05 X2 0,05 X3 0,05 X4 0,05 X5 0,05 Trung bình Độ lệch chuẩn Hàm lợng OTC xác định đợc mẫu (ppm) Giới hạn phát (ppm) (LOD) =3 x Sd Giới hạn định lợng (ppm) (LOQ)=10xS d 0,041 0,057 0,052 0,055 0,066 0,055 0,009 0,027 0,09 Tõ kết bảng xác định đợc giới hạn phát oxytetracyclin thịt 0,027 ppm giới hạn định lợng 0,09 ppm mẫu 79 Bảng 1.2: Xác định giới hạn phát TC TT Hàm lợng OTC nạp vào mẫu (ppm) 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Trung b×nh Sè mÉu thí nghiệm X1 X2 X3 X4 X5 Hàm lợng OTC xác định đợc mẫu (ppm) 0,043 0,064 0,034 0,04 0,051 0,043 Độ lệch chuẩn Giới hạn phát (ppm) (LOD) =3 x Sd Giới hạn định lợng (ppm) (LOQ)=10xS d 0,012 0,036 0,12 Từ kết bảng xác định đợc giới hạn phát tetracyclin thịt 0,036 ppm giới hạn định lợng 0,12 ppm mẫu Bảng 3: Xác định giới hạn phát hiƯn cđa CTC TT Hµm lợng OTC nạp vào mẫu (ppm) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Trung b×nh Sè mÉu thÝ nghiƯm X1 X2 X3 X4 X5 Hàm lợng OTC xác định đợc mẫu (ppm) 0,011 0,068 0,074 0,063 0,079 0,075 §é lƯch chn Giới hạn phát (ppm) LOD = x Sd Giới hạn định lợng (ppm) LOQ = 10 xSd 0,018 0,055 0.18 Từ kết bảng xác định đợc giới hạn phát chlortetracycline thịt 0,055 ppm giới hạn định lợng 0,18 ppm 1.2 Xác định khoảng tuyến tính DÃy chuẩn kháng sinh đợc khảo sát có nồng độ nh sau 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1; 5; 10 (ppm) Phân tích chuẩn nói xác định phơng trình hồi quy tuyến tính dựa vào diện tích pic 80 Bảng 1.4: Diện tích píc kháng sinh tơng ứng nồng độ chuẩn Các đờng chuẩn hồi quy đợc xác định nh hình sau: Diện tích Nồng độ (ppm) OTC 4530 8624 20342 42385 83788 460227 938081 0,05 0,1 0,25 0,5 10 TC 4720 8956 21534 43755 84184 472389 962512 CTC 1509 2978 7643 16730 31163 175360 366585 §−êng chn oxytetracycline DiƯn tÝch 1000000 y = 93912x - 4162.5 R2 = 0.9999 800000 600000 400000 200000 ppm 0 10 12 §−êng chn oxytetracyclin §−êng chn chlortetracycline §−êng chn tetracycline DiƯn tÝch DiÖn tÝch 1200000 y = 96365x - 4360.2 R2 = 0.9998 1000000 800000 600000 400000 200000 ppm 0 10 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 y = 36611x - 2395 R2 = 0.9995 ppm 12 §−êng chuÈn tetracyclin 10 12 Đờng chuẩn chlortetracyclin Khoảng tuyến tính xác định đợc loại kháng sinh nhóm tetracycline từ 0,05 đến 10 (ppm) 81 1.3 Khảo sát hệ số thu hồi Tiến hành thí nghiệm nạp 100 àl hỗn hợp chuẩn OTC, TC, CTC có nồng độ 25 ppm lần lợt vào 10 mẫu trắng (mẫu trắng mẫu thịt không phát có tồn d thuốc kháng sinh OTC, CTC TC) Bảng 1.5: Kết xác định hệ số thu hồi oxytetracyclin TT Số mẫu thí nghiệm Hàm lợng OTC nạp vào mẫu 0,5 (ppm) Hàm lợng OTC xác định đợc (ppm) Độ thu håi TB cña 10 mÉu (%) 10 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,392 0,460 0,480 0,434 0,386 0,372 0,320 0,418 0,520 0,438 0,422 84,4 Xtrung bình Bảng 1.6: Kết xác định hệ số thu hồi tetracyclin TT Số mẫu thí nghiệm Hàm lợng TC nạp vào mẫu 0,5 (ppm) Hàm lợng TC xác định đợc (ppm) 10 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,428 0,520 0,448 0,424 0,418 0,502 0,320 0,374 0,472 0,44 0,435 Xtrung bình Độ thu hồi TB cđa 10 mÉu (%) 87,0 B¶ng 1.7: KÕt qu¶ xác định hệ số thu hồi chlortetracyclin TT Số mẫu thí nghiệm Hàm lợng CTC nạp vào mẫu 0,5 (ppm) Hàm lợng CTC xác định đợc (ppm) X1 X2 0,5 0,5 0,398 0,564 X3 0,5 0,492 X4 X5 0,5 0,5 0,476 0,446 82 §é thu håi TB cña 10 mÉu (%) 92,0 X6 0,5 0,542 X7 0,5 0,338 X8 0,5 0,438 10 X9 X10 0,5 0,5 0,394 0,458 Xtrung bình 0,440 Độ thu hồi tetracyclin, oxytetrracyclin chlortetracyclin tơng ứng 87,0%; 84,0% 92,0% 83 Phụ lục Thẩm định phơng pháp phân tích Carbadox olaquindox 2.1 Giới hạn phát giới hạn định lợng phơng pháp Chuẩn bị mẫu nạp chuẩn mức nồng độ gần với giới hạn phát dự đoán 0,05ppm olaquindox 0,01ppm với carbadox Nạp 1ml dung dịch chuẩn olaquindox có nồng độ (ppm) vào 10g mẫu trắng (mẫu trắng mẫu thịt không ph¸t hiƯn cã tån d− thc kh¸ng sinh olaquindox), 1ml dung dịch chuẩn carbadox có nồng độ 0,02 (ppm) vào g mẫu trắng Phân tích mẫu nạp chuẩn xác định độ lệch chuẩn mẫu Giới hạn phát đợc tính toán theo công thức: LOD = x SD, giới hạn định lợng đợc xác định công thức LOQ = 10 x SD Kết chi tiết đợc thể bảng sau: Bảng 2.1: Xác định giới hạn phát định lợng olaquindox TT Số Hàm lợng mẫu olaquindox thí nạp vào nghiệ mẫu (ppm) m X1 0,1 X2 0,1 X3 0,1 X4 0,1 X5 0,1 Trung bình Hàm lợng olaquindox xác định đợc mÉu (ppm) 0,091 0,079 0,118 0,086 0,070 0,086 §é lệch chuẩn Giới hạn phát (ppm) LOD = x Sd Giới hạn định lợng (ppm) LOQ = 10 xSd 0,018 0,054 0,18 Từ kết bảng xác định đợc giới hạn phát olaquindox thịt 0,054 ppm giới hạn định lợng 0,18 (ppm) Bảng 2.2: Xác định giới hạn phát định lợng carbadox TT Số Hàm lợng mẫu carbadox thí nạp vào nghiệ mẫu (ppm) m X1 0,02 X2 0,02 X3 0,02 X4 0,02 X5 0,02 Trung bình Hàm lợng carbadox xác định đợc mÉu (ppm) 0,027 0,014 0,017 0,024 0,018 0,018 84 Độ lệch chuẩn Giới hạn phát (ppm) LOD = x Sd Giới hạn định lợng (ppm) LOQ = 10 x Sd 0,005 0,015 0,051 Tõ kÕt qu¶ b¶ng xác định đợc giới hạn phát carbadox thịt 0,015 (ppm) giới hạn định lợng 0,051 (ppm) 2.2 Xác định khoảng tuyến tính DÃy chuẩn carbadox đợc khảo sát có nồng độ nh sau 0,057; 0,114; 0,228; 0,456; 0,912; 5,7 (ppm) D·y chuÈn olaquindox có nồng độ 0,061; 0,122; 0,244; 0,488; 0,976 4,88 (ppm) Phân tích chuẩn nói xác định phơng trình hồi quy tuyến tính dựa vào diện tích pic Các đờng chuẩn hồi quy đợc xác định nh hình sau: Đờng chuẩn carbadox: Đờng chuẩn carbadox DiÖn tÝch 600000 y = 92984x + 2570.7 R2 = 0.9991 500000 400000 300000 200000 100000 ppm 0 Khoảng tuyến tính carbadox 0,057 đến 5,7 (ppm) Đờng chuẩn olaquindox: §−êng chuÈn olaquindox DiÖn tÝch 500000 y = 96136x - 1281.7 R2 = 0.9996 400000 300000 200000 100000 ppm 0 Kho¶ng tuyÕn tÝnh ®èi víi olaquindox lµ tõ 0,061 ®Õn 4,88 (ppm) 2.3 Khảo sát hệ số thu hồi Tiến hành thí nghiệm nạp 200 àl dung dịch chuẩn olaquindox có nồng độ (ppm) lần lợt vào 10 mẫu trắng (mẫu trắng mẫu thịt không phát có tồn d thuốc kháng sinh olaquindox) Nạp 1ml dung dịch chuẩn carbadox có nồng độ (ppm) vào 10 mẫu trắng (mẫu trắng mẫu thịt không phát có tồn d thuốc kháng sinh carbadox) Phân tích mẫu nạp chuẩn để tính toán hệ số thu hồi 85 Bảng 2.3: Kết xác định hệ số thu hồi olaquindox TT Số mẫu thí nghiệm Hàm lợng olaquindox nạp vào mẫu (ppm) Hàm lợng olaquindox xác định đợc (ppm) Độ thu håi TB cña 10 mÉu (%) 10 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,18 0,13 0,15 0,12 0,17 0,14 0,09 0,17 0,16 0,17 0,19 74,0 % Xtrung bình Độ thu hồi olaquindox 74,0% nạp chuẩn có nồng độ 0,2 (ppm) Bảng 2.4: Kết xác định hệ số thu hồi carbadox TT 10 Sè mÉu thÝ nghiÖm X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 Xtrung bình Hàm lợng carbadox nạp vào mẫu (ppm) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Hàm lợng carbadox xác định ®−ỵc (ppm) 0,08 0,06 0,083 0,069 0.077 0,049 0,071 0,057 0,081 0,058 0.068 §é thu håi TB cđa 10 mÉu (%) 68,0 % Độ thu hồi carbadox 68,0% nạp chuẩn có nồng độ 0,1 (ppm) 86 phụ lục Thẩm định phơng pháp phân tích Hocmon 3.1 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lợng (LOQ) - Xác định LOD Từ dung dịch chuẩn trenbolon 1ppm, ta tiến hành pha nồng độ 0,5; 0,2; 0,02; 0,002 0,00063 (ppm) Sau lần lợt bơm dung dịch vào hệ thống sắc ký, nhận thấy nồng độ 0,00066 ppm tức 0,66 ppb ®¸p øng tÝn hiƯu chiỊu cao pÝc xt hiƯn cao gÊp lÇn nhiƠu nỊn (signal/noise = 3) , cã thể chấp nhận nồng độ giới hạn phát phát khối phổ, tức LOD = 0,66 ppb - Xác định LOQ LOQ = x 0,66 ppb = 2,0 ppb; víi (S/N = 10) Tơng tự xác định đợc LOD LOQ với dexamethason, testosteron, progesteron, 17estradiol: Bảng 3.1: Giới hạn phát định lợng loại hocmon Tên chuẩn LOD (ppb) LOQ (ppb) Dexamethason Trenbolon Testosteron Progesteron 17β-estradiol 0,15 0,66 1,5 1,5 1,5 0,5 2,0 5,0 5,0 5,0 3.2 Xác định độ tuyến tính Tiến hành bơm mẫu chuẩn có nồng độ nằm khoảng nồng độ làm việc Mỗi mẫu chuẩn chuẩn bơm lần Từ diện tích pic qua lần bơm tính nồng độ trung bình mẫu chuẩn Từ vẽ đồ thị biểu diễn tơng quan nồng độ mẫu chuẩn với diện tích Đợc biểu thị phơng trình hồi quy tun tÝnh vµ hƯ sè håi quy tun tÝnh r2 87 Duong chuan_Trenbolon 200000 y = 71688x - 803.42 R2 = 0.9998 Dien tich pic dien tich pic 150000 2.5 100000 0.05 0.0050.5 0.0015 50000 0 -50000 Duong chuan_Dexamethason 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 y = 32036x + 114.42 R2 = 0.9998 0.05 0.5 0.005 0.0025 ug/ml Duong chuan_Progesteron 120000 120000 2.5 80000 60000 20000 0.5 0.05 60000 40000 0.05 0.005 0.5 1.5 ug/ml 80000 20000 0.005 y = 40515x + 62.657 2.5 R = 0.9998 100000 Dien tich pic Dien tich pic R = 0.9996 40000 ug/ml Duong chuan_Testosteron y = 41969x + 705.83 100000 2.5 2.5 0.5 0.5 1.5 ug/ml 2.5 Duong chuan_17beta-Oestradiol 160000 y = 56172x - 143.52 2.5 R2 = 0.9998 Dien tich pic 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0.05 0.5 0.005 0.5 1.5 ug/ml 2.5 3.3 §é phơng pháp * Thêm lợng mẫu chuẩn testosterone, progesteron 17-estradiol có nồng độ xác định vào mẫu trắng (mẫu trắng mẫu thịt không phát có tồn d hocmon trên) Thực với mẫu chuẩn có nồng độ 0,05 ppm; 0,5ppm; 2,5 ppm mẫu tiến hành xác định 10 lần Từ tính đợc hệ số thu hồi phơng pháp theo công thøc sau ∑ (x n SD = i −x ) RSD(C.V ) = n −1 88 s × 100 x Bảng 3.2 Kết xác định hệ sè thu håi ë 0,05 (ppm) TT 10 Sè mÉu thÝ nghiÖm X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 Xtbình Hàm lợng chuẩn nạp vào mẫu 0,05 (ppm) 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Hàm lợng chuẩn xác định đợc (ppm) 0,029 0,036 0,040 0,035 0,038 0,052 0,040 0,039 0,043 0,041 0,039 SD/RSD Recovery (%) 0,006/15,1 78,6 Bảng 3.3 Kết xác định hÖ sè thu håi ë 0,5 (ppm) STT 10 Sè mÉu thÝ nghiÖm X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 Xtbình Hàm lợng chuẩn nạp vào mẫu 0,5(ppm) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Hàm lợng chuẩn xác định đợc (ppm) 0,42 0,38 0,53 0,39 0,42 0,35 0,48 0,38 0,52 0,46 0,433 SD/RSD Recovery (%) 0,062/14,3 86,6 Bảng 3.4 Kết xác định hệ sè thu håi ë 2,5 (ppm) TT Số mẫu thí nghiệm Hàm lợng chuẩn nạp vµo mÉu 2,5 (ppm) X1 X2 X3 X4 X5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Hàm lợng chuẩn xác định đợc (ppm) 2,32 2,20 2,38 2,63 1,92 89 SD/RSD Recovery (%) 10 X6 X7 X8 X9 X10 Xtb×nh 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,58 2,25 1,87 2,84 2,45 2,344 0,303/12,9 93,8 Thêm lợng mẫu chuẩn Trenbolon, Dexamethason vào mẫu trắng (mẫu trắng mẫu thịt không phát có tồn d hocmon trên) Thực víi mÉu chn cã nång ®é 0,005; 0,05; 1,0 (ppm) mẫu tiến hành xác định 10 lần Từ tính đợc hệ số thu hồi phơng pháp theo công thức Bảng 3.5 Kết xác định hệ sè thu håi ë 0,005 (ppm) STT 10 Sè mÉu thÝ nghiÖm X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 Xtbình Hàm lợng chuẩn nạp vào mẫu 0,005(ppm) 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 Hµm lợng chuẩn xác định đợc (ppm) 0,035 0,037 0,028 0,032 0,043 0,035 0,045 0,032 0,036 0,050 0,037 SD/RSD Recovery (%) 0,0067/18,1 74,6 Bảng 3.6 Kết xác định hệ số thu håi ë 0,05 (ppm) TT 10 Sè mÉu thÝ nghiÖm X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 Xtbình Hàm lợng chuẩn nạp vào mẫu 0,05(ppm) 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Hàm lợng chuẩn xác định đợc (ppm) 0,038 0,046 0,050 0,045 0,040 0,034 0,050 0,052 0,047 0,040 0,044 90 SD/RSD Recovery (%) 0,0059/13,4 88,4 Bảng 3.7 Kết xác định hệ số thu håi ë 1,0 (ppm) STT 10 Sè mÉu thÝ nghiÖm X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 Xtbình Hàm lợng chuẩn nạp vào mẫu 1,0 (ppm) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Hµm lợng chuẩn xác định đợc (ppm) 0,92 0,95 1,12 0,90 0,84 0,95 0,94 0,86 1,10 0,93 0,945 91 SD/RSD Recovery (%) 0,092/9,6 95,1 Phơ lơc Mét sè ¶nh kh¶o sát tình hình sử dụng thuốc thú y chăn nuôi số sở chăn nuôi Sóc Sơn Từ liêm - Hà nội 92 93