Bước đầu nghiên cứu khả năng lây truyền hiv từ mẹ sang con

Trang 1

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y Há NỘI SSO BẢO CạO TỔNG KẾT ĐỀ TáI NGHIấN CỨU KHOA HỌC Cấp quản lý để tỏi: BỘ Y TẾ Ten dờ tai: BUOC Dad NGHIEN Cdu KHA NANG LAY TROYEN HIV Tử MẸ SANG CON

Trang 2

Cấp quản lý đểtỏi: — BỘY TẾ

Cơ quan chủ trớ đề tỏi: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HA NỘI

Tởn đẻ tỏi:

BƯỚC ĐẦU NGHIấN CỨU KHẢ NĂNG LằY TRUYỀN HIV

TỪ MẸ SANG CON

Chủ nhiệm để PGS.TS Phan Thị Thu Ảnh Phụ chủ nhiệm để tỏi: ` PGS.TSKH Nguyễn Chợ Phi Thư ký để tỏi: 'TS Nguyễn Thị Vinh Hỏ Những người thực hiện: 1, PGS.TS Phan Thị Thu Anh PGS.TSKH Nguyễn Chợ Phi BS Hoỏng Thị Quý BSCK Nguyễn Thị Ngọc Phượng BSCK Vũ Thị Nhung PGS.TS Nguyễn Đức Vy TS Nguyễn Thị Bợch Yến TS Nguyễn Thị Vinh Hỏ BS Đỗ õnh Nguyệt 10 BS Vũ Trợ Tiến 11 BS Đỏm Tỷ Anh 6 ta uw ema D Trường Đại học Y Hỏ Nội Bệnh viện Bạch Mai Trung tóm Lao Phạm Ngọc Thạch Bệnh viện Từ Dũ Bệnh viện Phụ sản Hỳng Vương

Viện bảo vệ sức khoẻ bỏ mẹ - Trẻ sơ sinh

"Trung tóm lao Phạm Ngọc Thạch Trường Đại học Y Hỏ Nội

Bệnh viện Bạch Mai

Trường Đại học Y Hỏ Nội

Trang 3

MUC LUC

PHAN A: TOM TAT CAC KET QUA CHINH CUA DE TAL

1 Kết quả chủ yếu đạt được của để tỏi

2 Ap dung thực tiởn

3 Đõnh giõ thực hiện để tỏi

4, Đõnh giõ việc sử dụng kinh phợ

Š Cõc ỵ kiến để xuất

PHằN B: CạC KẾT QUạ NGHIấN CỨU CỦA ĐỂ TáI ĐẶT VAN DE

CHƯƠNG 1: TONG QUAN TAI LIEU 1.1 Lich sit phat triờn HIV/AIDS

1.1.1, HVIAIDS trởn thế giới 1.12 HIVIAIDS ở Việt Nam 1.2 Một số khõi niệm về HIY/AIDS

121.HW

1.2.2 Genotyp cia HIV-1 1.3 Sinh tý bệnh học nhiễm HIV

1.3.1 Cơ chế tấn cừng của HIV vỏo tế bỏo

1.3.2, Quõ trớnh nhón lởn về lan truyền HèU san khi vỏo tế bỏo 7.3.3 Cõc rối loạn dõp ứng miễn dich

1.3.4 Cõc nhiễm trỏng cơ lội, ứng tuc

1.4 Cõc phương thức lóy truyền HỊV

1.4.1 Lõy truyền qua quan hệ tink duc 1.4.2 Lóy truyền qua đường mắ

Trang 4

1.5 Một số kỹ thuật xõc định HIV va genotyp HIV 1.5.1 Phương cõch xờt nghiệm

1.5.2 Kỹ thuật ELISA

1.5.3 Cõc kỹ thuật phản tợch DNA-HIV

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VA PHƯƠNG PHạP NGHIấN CỨU

2.1 Đối tượng nghiởn cứu 2.2 Phương phõp nghiởn cứu

3.2.1, X lý mẫu vỏ chiết tõch DNA va RNA cia HIV-1 3.2.2, Khuếch đại sản phẩm 3.3.3 Phõt hiện sẵn phẩm của phản ứng PCR bằng điện di 2.3 Xử lý số liệu CHƯƠNG 3: KẾT QUạ NGHIấN CỨU 3.1 Một số thừng tin về sản phụ

3.2 Kết quả PCR với cõc mẫu mõu mẹ

3.3 Kết quả PCR với cõc mẫu mõu cuống rốn

3.4 Phõt hiện DNA HIV-1 bang PCR sử đụng cõc loại mồi khõc nhau

3.5 Kết quả PCR khi sử dụng đồng thời cõc loại mỗi

Trang 5

aa AIDS ARV CCRS CXCR4 cD DNA RNA HIV PCR RT WHO CạC CHỮ VIẾT TạT Acid amin Acquired Immuno Deficiency Syndrom Anti Retrovirus Base pair Chemokin Co-Receptor -5 Chemokin X Co-Receptor-4 Cluster Differentiation Deoxyribonucleic Acid Ribonucleic Acid

Human Immunodeficiency Virus

Polymerase Chain Reaction Reverse Transcription

Trang 6

Paghiờen thee DE tad

PHAN A:

TểM TAT CAC KET QUA CHINH CUA DE TAL

1 Kết quả chủ yếu đạt được của để tỏi:

Cỳng với sự lan rộng của đại dịch HIV/AIDS số phụ nit nhiờm HIV

đang nhanh chụng gia tăng trởn toỏn thế giới Theo WHO (1993) cụ hơn 5

triệu phụ nữ, chủ yếu ở cõc nước đang phõt triển vỏ hơn 500.000 trẻ đưới 13

tuổi nhiễm HIV Đến năm 2005 ước tợnh số trẻ cm nhiễm HIV sẽ tăng lởn 5

- 10 wigu trởn thờ giới Phương thức lõy truyền HỊV ở trẻ em thường gặp

nhất hiện nay lỏ lấy truy: lệ từ L5 - 20% ở cõc nước ằu Mỹ, ở chóu Phi tỷ lệ nỏy cụ thể lởn đến 39% thậm chợ cụ nơi tới 50%

từ mẹ sang cừn Với

Ở nước ta số lượng người nhiễm HIV ngỏy cỏng gia tăng, Theo bõo cõo của Uỷ ban phúng chống AIDS tinh dờn ngay 31/12/2004 [1] đọ cụ 90.830 người HIV(+), nhưng tỷ lệ lóy truyền HIV từ mẹ sang con cũng như phương thức lóy truyền HIVvẫn chưa cụ tỏi liệu nỏo đẻ cập đến Hơn nữa để chón đoõn xắc định trẻ sơ sinh cụ mẹ HIV(+) khừng thể sử dụng cõc phản ứng huyết thanh học như đọ đỳng hiện nay ở Việt Nam,

Vớ vậy mục tiởu của để tỏi lỏ:

- Ứng dụng kỹ thuật sinh học phóu từ để xõc dink nhiờm HIV 6 trẻ

so sink cờ me HIV(+)

- Bước đầu nghiởn cứu khả năng lóy truyền HIV từ mẹ sang con 1.1 Đõng gụp mới của để tỏi:

Việc chắn đoõn trẻ sơ sinh nhiễm HIV rất khụ khăn vớ khõng thể IzG của mẹ (trong đụ cụ IgG khõng HIV) truyền sang con qua thụ thể tế bỏo nhau thai lỏm cho phản ứng buyết thanh phõt hiện khõng thể khõng HIV ở

trẻ luừn dương tợnh đỳ đứa trẻ đụ cụ thực sự nhiễm HTV hay khừng Ở đẻ tỏi nay cõc Iõc giõ lần đầu tiởn đọ sử dụng kỹ thuật PCK với 3 loại mồi khuếch

đại cõc đoạn gen vỳng pl7, C;V; (gp120) vỏ gp41 của HIV-1 để xõc định tớnh trạng nhiễm HIV của 52 cập trẻ sơ sinh vỏ mẹ cụ HIV(+) Ngoỏi ra 15/52 cặp trẻ sơ sinh vỏ mẹ được xõc định tiởm HIV-I trong huyết thanh

Trang 7

(0 gldÐm tục Dờ tai

1.2 Kết quả cụ thể:

- Cõc tõc giả đọ xõc định được tý lệ (+) của phản ứng PCR với 2 cặp

mồi gp41 vỏ pL7 cao hơn hẳn so với cặp mỗi C.V, Nởn sử dụng kỹ thuật

PCR ợt nhất với 2 loại mối pL7 vỏ gp4I để xõc định nhiễm HIV ở trẻ xơ sinh

cụ mẹ HIV(+)

- Do mẹ được can thiệp bởi thuốc khõng virus trước sinh (chương trớnh của Bộ Y tẻ) Vớ vậy tỷ lệ lóy truyền HIV từ mẹ HIV(+) sang con giai

đoạn trong tử cung được xõc định lỏ 5,7%

- Bằng kỹ thuật RT-PCR cho kết quả HIV(+) cao hon PCR; RT-PCR phõt hiện được 46,7% mẫu mõu cuống rốn trẻ sơ sinh HIV(+), trong khi đụ

bằng kỹ thuật PCR chỉ phõt hiện được 6,7% mẫu mõu cuống rốn HIV(+)

RT-PCR cụ thể phõt hiện HIV(+) ở mầu cuống rốn do mẹ truyền sang cao

hon PCR cụ thể dơ thời gian lay truyền trong tử cung vỏo những tuần cuối HIV chưa đủ thời gian để HIV xóm nhập vỏo trong tế bỏo Iympho hoặc

lượng bản sao của HIV/Iml mõu quõ thấp bị tổ chức liởn vửng bất giữ vỏ

thực bỏo khừng vỏo được tế bỏo Sau 1 tuần tuổi cần được kiểm tra lÒ

PCR

Những kết quả thu được bằng cõc kỹ thuật PCR vỏ RT-PCR cụ giõ trị

giỷp ợch cho việc chẩn đoõn chợnh xõc tớnh trạng phơi nhiễm vỏ nhiễm HIV,

theo dửi đõp ứng điởu trị với thuốc khõng virus, chóm sục vỏ dự phúng lóy

truyền HIV cho những đứa trễ sinh ra từ người mẹ HTV(+) Như vậy khừng

phải đợi trẻ 18 thõng tuổi mới cụ kết quả xõc chẩn, khừng cún phải cụ tớnh

trạng đứa trẻ khừng nhiễm HIV ở cỳng những đứa trẻ bị nhiễm HIV

1.3 Hiệu quả về đỏo tao:

- Kết quả đủ để đỏo tạo ệ1 luận văn Cao học

- Cung cấp DNA của 52 cập mẹ con (104 mẫu mõu) cho việc xõc định cõc đồng thụ thể CCRS vỏ CXCR4 cho học viởn Cao học

1.4, Hiệu quả kinh tế:

Trang 8

Maghigon thes Dờ tat

theo dửi bằng PCR lóu nhất sau 1 thõng cố thể xõc chẩn được nhiễm hay

khừng nhiễm HIV

Xõc định được tỷ lệ nhiễm HIV trong tử cung sẽ giỷp cho bỏ mẹ nhiễm HIV hiểu được nếu được điều trị trước sinh bằng thuốc khõng virus

thớ tỷ lệ nỏy chỉ đưới 10%, vớ vậy số người mẹ bỏ con sẽ rất it, bớt gõnh

nặng chơ Xọ hội

1.5, Hiểu quả về xọ hội:

Việc xõc định trẻ sơ sinh lóy truyền HIV từ mẹ cụ thể gụp phần qu' định õp dụng chiến lược tiởm chủng mở rộng ở trẻ em HIV(+) một cõch thợch hợp, quyết định sử dụng cõc biện phõp khõng virus cho phụ nữ cụ

thai, trẻ sơ sinh vỏ dự phúng cho nhiễm trỳng cơ hội ngay từ những ngỏy

đóu của trẻ, cũng như cụ kế hoạch theo dửi sức khoẻ của trề sau nỏy

1.6 Hiệu quả khõc:

- Số DNA của 52 cập mẹ con (104 mẫu mõu) cụ thể sử dụng để nghiởn cứu khõc

- Cung cấp cho 01 học viởn cao học xõc định đột biến cõc đồng thụ thờ CCR, va CXCR, & 104 mau mau

~02 bỏi bõo đăng ở tạp chợ Nghiởn cứu Y học vỏ Thừng tin Y Dược

2 ạp dụng thực tiễn:

- Cụ thể sử dụng kỹ thuật RT-PCR trong chấn đoõn sớm phơi nhiễm HIV va theo dai trẻ sơ sinh nhiễm HIV khi kết quả PCR(-)

- Cụ thể sử dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoõn xõc định trẻ sơ sinh

nhiềm HIV Những trường hợp RT:PCR(+) nhưng PCR(-) thi sau 01 tuần nởn lỏm lại PCR

Š kết quả PCR cụ hiệu quả cao trong chấn đoõn xõc định trẻ sơ sinh nhiễm HIV nởn sử đụng 2 loại mồi p1? vỏ gp41 của HIV-I

3 Đõnh giõ thực hiện để tỏi đối chiếu để cương nghiởn cứu đỏ được phở duyet

3,1 Tiến độc

Trang 9

Qghetime that Di teat

- Triển khai nghi

cứu tại Hỏ Nội

~ Triển khai nghiởn cứu tại thỏnh phố Hồ Chợ Minh - Hoỏn thỏnh số liệu, thõng 12/2004

- Thõng 01 - 06/2005 sử lý số liệu vỏ viết bõo cõo nghiệm thu 3.2 Thực hiện mục tiởu nghiởn cứu:

Thực hiện đầy đủ mục tiởu nghiởn cứu để ra trong để cương

3.3 Sẵn phẩm tạo ra so với dự kiến để cương

Dự kiến xõc định HIV bằng kỹ thuật PCR ở 50 cập mẹ con (100 mẫu mõu: 50 mẫu mõu mẹ + 50 mẫu mắu cuống rốn của con)

Đọ thực hiện được 52 cặp mẹ con (104 mẫu mõu: 52 mẫu mõu mẹ vỏ 52 mẫu mõu cuống rốn)

Ngoỏi ra 15/52 cặp mẹ con được xõc định thởm HIV trong huyết

thanh bằng kỹ thuật RT-PCR Điều nỏy đọ cụ giõ trị giỷp theo đối nh trường hợp mặc dỳ PCR(-) nhưng nếu RT-PCR(+) cụ nghĩa những trườn: hợp đụ cụ phơi nhiễm nhưng chưa nhiễm HIV sau 0L tuón sinh phải lầm lại PCR, lỷc đụ mới khẳng định trẻ nhiễm HIV hay khừng

4 Đõnh giõ việc sử dụng kinh phợ:

~ Tổng kinh phợ được duyệt cấp 150.000.000 đ

+ Hoõ chất: 94.000.000 d

+ Cừng thuở khoõn chuyởn mừn: 30.000/000đ + Chỉ phợ khõc: 26.000.000 đ

~ Kinh phợ sự nghiệp khoa học cấp: 100%

~ Toỏn bộ kinh phợ đọ được thanh toõn vỏ quyết toõn vỏo thõng 08/2004 5 Cõc ý kiến đề xuất:

- Kinh phợ ban đầu nởn cấp 2/3 tổng kinh phợ vớ phải sử dụng mua

hoõ chất, đặc biệt với để tỏi õp dụng kỹ thuật sinh học phón tử Năm đầu tiởn chỉ được cấp IO triệu, sau đụ được bổ sung thởm 5 triệu nờn việc triển

khai vừ cỳng khụ khăn

~ Với kinh phợ được cấp thớ chỉ thực hiện được đề tỏi ở cơ sở đọ cụ

Trang 10

f0NgRigee thứ (Để tỏi PHẦN B: CạC KẾT QUạ NGHIấN CỨU CỦA ĐỀ TẢI ĐẶT YẤN ĐỀ

Đại dịch HTV/AIDS đọ vỏ đang trở thỏnh vấn để y tế vỏ xọ hội

nghiởm trọng trởn toỏn cầu Hiện nay khừng một chóu lục, một quốc gia, một cộng đồng hay một cõ nhón lại khong bj HIV de doa Tinh dờn cudi

năm 2002, trởn toỏn thế giới cụ khoảng 42 triệu người nhiễm HIV/AIDS

trong đụ người lớn 38,6 triệu (phụ nữ 19,2 triệu), trẻ em dưới 15 tuổi 3.2

triệu [4] AIDS y ra những tồn thương vừ cỳng khủng khiếp cho con

người, khừng chỉ đối với người đọ chết mỏ cồn cho gia đớnh vỏ cộng đồng

của họ Vớ chưa cụ phương cõch chữa khỏi bệnh nởn tổn thất của dịch bệnh nỏy cún gia tầng Số phụ nữ vỏ trẻ em, hai trong những dối tượng nhiễm HIV đang nhanh chồng tăng lởn trởn toỏn thế giới Ước tợnh đến năm 2005

số trẻ em nhiễm HIY sẽ tăng lởn từ 5 - 10 triệu trởn toỏn cầu

Phương thức lóy truyền HIV ở trẻ em thường gặp nhất hiện nay lỏ lóy

từ mẹ sang con, với tỷ lệ 15 - 20 % ở cõc nước phõt triển ằu - Mỹ, tỷ lệ nỏy

cụ thể tăng đến 25 - 35% ở cõc nước đang phõt triển [21] ở cõc nước chậm

phõt triển (chóu Phi) thậm chợ tý lệ nỏy tăng đến 50% [37]

Ở Việt nam số lượng người nhiễm HIV ngỏy cỏng gia tăng, tợnh đến

ngỏy 31/12/2004 cả nước đọ cụ 90.380 người nhiễm HIV, số trường hợp chuyển sang AIDS lỏ 14.428 vỏ số người đọ chết do AIDS lỏ 8.398 [1]

nhưng tỷ lệ lóy trụ từ mẹ sang con cũng như phương thức lóy truyền

chưa cụ tỏi liệu vỏ cừng trớnh nỏo đẻ cập tới Việc xõc định trẻ sơ sinh nhiễm HIV từ mẹ lỏ rất quan trọng, vớ nụ liởn quan đến chiến lược tiởm

chủng vỏ điều trị dự phúng cho trẻ ngay từ những ngỏy đầu của cuộc đời,

cũng như việc theo đối tiến triển bệnh sau nỏy Ngoỏi ra chấn đoõn sớm

nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh cún rất nhiều khụ khăn nếu dựa vỏo cõc thử

Trang 11

mõu con đọ lỏm cho trẻ sơ sinh luừn cụ phản ứng huyết thanh HIV(+)

Trong khi đụ hiếm khi xõc định được khõng thể khõng HIV loại IgM vi thoi gian xuất hiện ngắn vỏ khừng thể õp dụng chẩn đoõn Vớ vậy ở giai đoạn

mới sinh chỉ cụ thể phõt hiện HIV bằng kỹ thuật phõt hiện khõ:

virus hoặc phõt hiện sự cụ mặt của HIV hay một đoạn gen đặc hiờu HIV

nguyởn

trong mấu trẻ Một trong những kỹ thuật cụ thể phõt hiởn sớm HIV với độ

nhạy vỏ độ đặc hiệu cao lỏ kỹ thuật PCR, RT-PCR Cõc kỹ thuật nỏy cho

phờp phõt hiện một đoạn gen đặc hiệu của HẻV trong DNA của tế bỏo Iympho hoặc RNA trong huyết thanh mõu ngoại vi của trẻ nhiễm, chỷng đọ vỏ đang được õp dụng rộng rọi ở cõc nước phõt triển trong chẩn đoõn sớm

HIV, nhất lỏ ở trẻ sơ sinh

Nhiều nước trởn thế giới đọ nghiởn cứu vỏ thừng bõo cõc phương thức

lóy truyền, cũng như tỷ lệ lóy truyền từ mẹ sang con Ở Việt Nam chưa cụ

cừng trớnh nỏo nghiởn cứu vỏ cừng bố Vớ vậy mục tiởu nghiởn cứu của đẻ

Tỏi lỏ:

1 Ứng dụng kỹ thuật sinh hạc phón Hè để xõc định nhiễm HIV ở

trể sơ sinh cụ mẹ HIV(+)

Trang 12

Oghitoe thee Be tii

CHUONG 1:

TONG QUAN

1.1 LỊCH SC PHAT TRIEN HIV/AIDS TREN THE GIGI VA 6 VIET NAM

LLL HIV/AIDS tren thờ gidi

C6 thể chia lịch sử phõt triển HIV/AIDS trởn thế giới lỏm 3 thời kỳ: 1.1.L1 Thời kỳ yởn lặng: 1970 -1981

Nhiễm HIV bất đầu yởn lặng từ những năm 1970 trước khi phõt hiện HIV (Human Immunodeficiency Virus) va AIDS (Acquired Immuno- deficiency Syndrom)

Năm 1970 tớm thấy khõng thể khõng HIV ở những mẫu mõu bảo quản từ nam 1959 ở Zaire vỏ đến giữa những năm 1979-1981 người ta thị

ở một số thanh niởn đồng tợnh luyến õi vỏ tiởm chợch ma tuý xuất hiện một

số bệnh nhiễm trỳng cơ hội ợt gặp như Herpes nặng, viởm phổi do

Pneumocystis Carinii, Kaposi sareoma, cõc bệnh đụ thường rất nặng vỏ khừng đõp ứng điều trị [5]

1.1.L2 Thời kỳ phõt hiờn virus: 1981-1985

Thõng 6/1981, trung tóm kiểm soõt bệnh rật (CDC) ở Atlanta (Mỹ) phõt hiện bệnh nhón mắc hội chứng suy giảm miễn dịch đầu tiởn trởn thế giới ở 5 thanh niởn đồng tợnh luyến bị viởm phối nặng đo Pneumocysts Carinii ở Los Angelcs Sau đụ nhiều nơi đọ lần lượt cừng bố những trường hợp mắc bệnh AIDS ở những bệnh nhón ưa chảy mõu vỏ những người

nghiện chợch ma tuý, những người mẹ vỏ con của họ

Đầu nấm 1983 viện Pasteuy Paris đọ cừng bố phõt hiện được virus cụ

liởn quan đến hạch đặt tởn lỏ LAV (Lymphomadenopatlhy Associated

Virus)

Trang 13

Gghitom tha Dờ tt

Năm 1984 Levy phón lập được virus cụ liởn quan đến hội chứng suy giảm miễn dịch vỏ đặt tởn lỏ ARV (AIDS Related Virus),

Năm 1985 hội nghị định danh phõp quốc tế đọ thống nhất tởn gọi virus nỏy lỏ HIV-1 vỏ cũng năm nỏy đọ cụ bộ sinh vật phẩm phõt hiện HIV lỏ ELISA [14], phón lập được HIV-2 vỏ AZT lần đầu tiởn được sử dụng để điều tị AIDS

1.1.L3 Thời kỳ 1985 đến nay

Thời kỳ trởn toỏn thế giới chống AIDS Chương trinh AIDS toan cau

GPA (Global Programme on AIDS) di duge thiờt lap vao ngay 01/12/1987

Thế giới đọ lấy ngỏy 1 thõng 12 lỏ ngỏy “Thế giới phúng chống AIDS”

Như vậy tuy phõt hiện HIV năm 1983 nhưng thực tế HIV đọ cụ từ những thập kỷ 60-70 vỏ đến thập kỷ 80 mới bỳng nổ thỏnh dịch

1.1.2 HIV/AIDS ở Việt nam: HIV-I lỏ virus góy AIDS ở Việt nam,

Trường hợp HIV đóu tiởn ở Việt nam được phõt hiện tại thỏnh phố Hồ Chợ Minh vỏo thõng 12 năm 1990 Số HIV tăng mạnh vỏo những năm

1993-1994, liởn tục gia tăng hỏng năm vỏ đọ trở thỏnh vấn để bức xỷc ở

Việt nam Đến 31/12/2004 số Inỹ tợch nhiễm HIV trởn toỏn quốc lỏ 90.380 trường hợp, số bệnh nhón AIDS 1 14.428 va chờt vớ AIDS lỏ 8398 [1] Dich

diễn biến phức tạp vỏ Khừng ngừng phõt triển ở 64/64 tỉnh thỏnh, trong mọi

nhụm đối tượng trong đụ cụ phụ nữ vỏ trẻ em [7]

1.2 MOT SO KHAI NIEM VE HIV/AIDS

1.2.1 Virus góy suy giảm miễn dịch ở người (HẻV: Human Immuno-

deficiency virus) 1.2.1.1 Cấu trỷc:

HIV cụ đặc điểm chung của họ retroviridae Hạt virus hoỏn chỉnh cụ hớnh cầu, đường kợnh 80-120 nm, gồm 3 lớp:

Trang 14

Vighiten thes Bi tat

kilodalton (gp169) Phón tử nỏy gồm 2 phón 1a glycoprotein mang ngoai cụ

trọng lượng phón tử 120 kiiodalton (gp120), một khõng nguyởn dễ biến đổi,

phần nữa lỏ géycoprotcin xuyởn mỏng cụ trọng lượng phản tử 41 kilodalton {ap41) RNA robe be "Bay: sỏo chờp move RN) pad Hớnh 1.1: Cấu trỷc HIV

~ Lớp vỗ trong gồm 2 lớp protein: Lớp ngoỏi hớnh cầu được cấu tạo bởi protcin cụ trọng lượng phón tử 17 kilodalton (p17) Lớp trong cụ hớnh trụ được cấu tạo bởi protein đờ trọng lượng phón tử 24 kilodalton (p24)

~ Lớp lối ở trong lớp vừ trong gồm 2 phón tử ARN đơn cụ 3 gen cấu trỷc: Gen Gag lỏ gen mọ hoõ cho khõng nguyởn đặc hiệu nhụm của lớp vỏ

trong virus, gen Pol mọ hoõ cho cnzym sao chờp ngược (RT=Rcverse transcripasc), protease vỏ cndonuclcasce, gen Env mọ hoõ cho cõc

#lycoprotein lớp vỏ ngoỏi

1.2.1.2 Cờc protein cấu trỷc của HIV vỏ gen mọ hoõ: - Cõc protein khõng nguyởn đặc hiệu nhụm (Gag):

Trang 15

È Cõc protein cụ bản chat enzym (Pol): Tw protein tiờn than được tõch

ra cdc enzym sao chờp ngugc, protease va cdc protein cần cho quõ trớnh tợch hop ADN cửa virus vỏo chromosome tế bỏo

Gen nhiờm trừng

GAGPOL, vỏ sao chờp,

LTR Gốilởnnhau Gensaochờp LIR

Hớnh 1.2: Cõc protein cấu trỷc của HIV vỏ gen mọ hoõ

- Cõc protein đặc hiệu vờ (Env) gp120 va gp41 gờm 856 acid amin (aa), Từ aa thứ 1 đến thứ 30 lỏ đoạn peptiđ tợn hiệu Tiếp theo từ aa 31 đến aa 511 lỏ gp120, từ ựa 512 đến 856 lỏ gp 41 Vị trợ aa từ 204 - 367 lỏ phón

đoạn C;V; của gp120

~ ựpl20 gồm cõc đoạn aa tương đối hằng định (vỳng C = constant

region) vỏ cõc đoạn aa rất thay đổi (vỳng V = Variable region) Cụ tất cả 4

vỳng C (Cụ, Cạ, Cạ, Cạ) vỏ 5 vỳng V (Vị, Vạ, Vạ, Vạ VÒ) nằm xen kế nhau

Sự thay đổi cõc aa cụ ý nghĩa nhất lỏ ở vỳng V„, đóy lỏ vỳng kợch thợch sản

Trang 16

Nght ten Bi tỏi

xuất khõng thể trung hoỏ ở cơ thể nhiễm, trớnh tự nucleotid rất thay đổi giữa

cõc chủng HIV-1 Đoạn aa từ 204 - 367 (C;V,) quyết định sự hướng dong

cita HIV-1 dờn dai thuc bao va monocyte Doan aa 414 - 456 lỏ vỳng gắn

CD4 [26]

- gp41 từ aa 518 - 856 gồm nhiều vỳng chức năng Một trong nhữn

vị trợ quan trọng lỏ vỳng tạo miễn dịch chợnh nằm ở đọ tận aa, gồm 2

cụ chức năng kợch thợch tạo khõng thể rất đặc hiệu cho chủng HIV-1 [20] vỏ cụ vai tr quan trong trong cơ chế hoỏ mỏng với tế bỏo nhiễm

1.2.1.3 Cõc protein điều hoỏ vỏ gen mọ hoõ:

Tat: Mọ hod cho protein Tat, 12 m6t protein chủ yếu tham gia sắp xếp

cõc bản sao virus

Rev: Tao ra protein Rev lam nhiệm vụ điều hoỏ sự mớnh diện mARN

của virus, thỷc đẩy mARN từ nhón ra bỏo tương để tăng sản xuất cõc

protein virus, tăng tạo nởn cac virus con

Nef: tao ra protein Nef cụ tõc dụng điểu hoỏ óm tợnh lỏm giảm sự trớnh điện của Tat vỏ Rev, lỏm giảm sự sao chờp virus

Cõc gen mọ hoõ cho cõc protein khõc nhau của HIV như protein Viê, Vpr, Vpt đ6 vai trú hỗ trợ cho cõc hoạt động tập hợp vỏ nảy chổi cõc virion con vỏ giải phụng chỷng ra khỏi tế bỏo chủ

1.1.4 Vai trồ của cõc enzym:

- RT: enzym sao chếp ngược lỏ enzym DNA polymerase phụ thuộc ARN, dang hoạt động của nụ lỏ pụ6/51 & HIV-1 va p68 & HIV-2 cụ tõc dụng sao chờp bộ gen virus thỏnh DNA tiển virus

- Protease (p12) cụ tõc dụng tõch cõc protein được mọ hoõ bởi gen Gag vỏ gen Pol thỏnh cõc phón tử hoạt động

- Endonuclease (p3I ở HIV-I vỏ p34 ở HIV-2) đảm nhiệm tợch hợp DNA của virus vỏo nhiễm sắc thể tế bỏo chủ

Trang 17

Mghitme th Dờ tei

1.2.1.5 Phần loại HIV:

- Phón loại theo typ huyết (hanh:

Hai loại virus góy nởn AIDS ia HIV-1 va HIV-2 Bệnh cảnh lóm sỏng của AIDS vỏ đường lóy giống nhau Chỷng

chỉ khõc nhau về khõng nguyởn, trọng lượng phón tử của cõc thỏnh phần cấu trỷc, thời gian mang bộnh, tỷ lệ

góy nhiễm vỏ tiến triển của bệnh

~ Phón loại theo õi tợnh với cõc loại tế bỏo:

HIV cụ õi tợnh với cõc loại tế bỏo khõc nhau: Chủng HIV õi tợnh với

đại thực bỏo vỏ bạch cầu đơn nhón (M-trofc) ợt nhón lởn, ợt huỷ hoại tế bỏo

gọi lỏ NSI (Non Syncytium âinducting: khừng góy hợp bỏo) thường gặp ở người giai đoạn khừng triệu chứng Chủng HIV õi tợnh với T dymphocyte

T) gọi lỏ SI (Syncytium inducting: Góy hợp bỏo) nhón lởn nhanh trong tế

bỏo lympho T hoat hoõ lỏm huỷ hoại tế bỏo vỏ thường thấy ở bệnh nhón ở

giai đoạn cụ triệu chứng [34]

1.2.2 Genotype của HIV-1 [34]

Bằng cõch phản tợch trớnh tự chuỗi env của HIV-1 ở cõc chảu khõc nhau, Mayer vỏ Cs năm 1992 đọ tớm ra 6 subtype của HIY-I khõc nhau vỏ đặt tởn chỷng lỏ Subtype A, B, C, D, E, F trong đụ chủng gốc phón lập được

õc Mỹ vỏ Tay ằu được đặt tởn lỏ subtype B

Louwagie vỏ CS 1993 [ượch từ 12} phón tợch gen Gag của 70 mẫu bệnh phẩm chứa HIV-1 lấy từ nhiều vỳng trởn thế giới đọ phón biệt được 5 trong 6 subtype trởn lỏ A,B,C,D,F cún subtype E chỉ phón loại được qua

phón tợch chudi gen env

Janssen va CS (1994-1995} bờ sung them 4 subtype 1a GH subtype F cờ 3 subsubtype (F1,F2,F3); F3 chinh IA subtype mời duge dat

tởn lỏ subtype K [trợch từ 12]

Cõc subtype góy đại dịch HIV-] ở nhiều vỳng trởn thế giới vỏ được gọi lỏ nhụm M (Main) Con subtype phan lập từ Cameroon duge dat tờn lỏ

Trang 18

Bhs than DE tek

nhụm Ơ (Outline).Nhụm HẻV-1 khõc nhụm M vỏ nhụm Ẫ thớ được gọi lỏ

nhờm N (Non M-Non O)

Một trong những chủng tõi tổ hợp được phảõt:hiện đầu tiởn lỏ cõc chủng được gọi lỏ

Nam ạ Khi cõc tõc giả phón tợch gp120 vỏ gp41 thấy subtype E như lỏ một

subtype riởng biệt Song người ta thấy ở vỳng Gag vỏ Pol tất cả cõc chủng

subtype E” thường gặp ở Thõi Lan vỏ cõc nước Đừng

virus “subtype E” đều rất giống subtype A subtype E lỏ một tõi tổ hợp phức tạp hơn của cõc subtype A/E/G [23] Dạng tõi tổ hợp lưu hỏnh (CRF) dờng

vai trú quan trọng vỏo sự lan truyền của đại dịch HIV-] trởn toỏn cầu Ching CRF-15 moi duge phat hiện ở Thõi Lan lỏ một tõi tổ hợp giữa

subtype B vỏ CRE 01-AE [36]

Một vỏi cừng trớnh nghiởn cứu ở Việt Nam [1831] đọ cho thấy

subtype E (CRF01-AE) lỏ chủng HIV nổi trội ở tất cả cõc quần thể người

nhiễm HỊV Subtype B vỏ cõc tõi tổ hop CRF A/B vỏ A/G bất đầu xuất hiện

nhưng với lệ thấp [18]

Hiện nay cõc chủng tõi tổ hợp đang tăng, ứnh chất phức tạp vẻ khõng

nguyởn vỏ di truyền HIV-I trong địch tễ lan truyền của đại dịch trởn toỏn

cầu Khả năng xuất hiện khõng thuốc Anti-virus khõc nhau ở cõc subtype

HIV-1 khõc nhau Như vậy việc điều trị HIV-I bằng cõc thuốc khõng virus

sẽ khõc nhau ở cõc khu vực địa lý khõc nhau

1.3 SINH LÝ BENH HOC NHIEM HIV 1.3.1 Cơ chế tấn cừng của HỊY vỏo tế bỏo 1.3.1.1, Cõc tế bỏo HIV tdin cong:

- Cõc tế bỏo mõu: Tế bỏo Lympho TCD4, Monocyte, đại thực bỏo tế bao Lympho B, Tờ bio Dendritic, tiờn tuy bao

È Cõc tế bỏo nọo: Tế bỏo sao, tế bỏo thần kợnh đởm - Cõc tế bỏo dạ đỏy, ruột

Trang 19

ghijen the Dờ tit

- Cõc tế bỏo da: Langerhans, xơ non

~ Cõc tế bỏo khõc: xương, cơ biểu mừ mao mạch, tế bỏo mỡ

13.1.2 Co chờ xóm nhập vỏo tế bỏo của HIV

HIV xóm nhập vỏ nhón lởn ở nhiều loại tế bỏo Cõc tế bỏo nỏy đều cụ phón tử tiếp nhận HIV như CD4 vỏ đồng thụ thể õi tợnh đại thực bỏo lỏ CCRọ vỏ õi ứnh tế bao lympho Ia CXCR4

~ Phón tử CD4 lỏ thụ thể đối với gp120 của HIV:

Do cụ sự tương tõc giữa gpl20, gp41 của HIV với phón tử CD4 ở

mỏng tế bỏo Gp120 gắn vỏo mỏng của tế bỏo đợch, cún gp41 cụ vai trú hoỏ

mỏng để giải phống nhón của virus vỏo trong bỏo tương tế bỏo đợch Phức

hợn gp120-CD4 được tạo thỏnh lỏm cho gp120 bị thay đổi hớnh dạng, bộc lộ gp4l, virus vỏ tế bỏo hợp nhất bằng cõch phần kị nước của mỏng virus

chộn vỏo giữa lớp lipid kờp của mằng tế bỏo đợch, hiện tượng hoỏ mỏng xảy

A cha HIV được đẩy vỏo bỏo tương của tế bỏo đợch

ra, lỗi

- Cõc đồng thụ thể khõc giỷp HIV xam nhập tế bỏo đợch: CXCR-4, CCR-5, CCR-3, CCR-2b, HFPG (Heparan sunphate proteoglycans), 1CAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule), Co chế xóm nhập HIV vỏo tế bỏo ngoại vi nhờ phón từ CD4 thừng qua cõc đồng thụ thể, CCR-5 lỏ đồng

thụ thể đối với chủng HIV õi tợnh M vỏ lỏ chủng hoạt động ở giai đoạn sớm

cha AIDS, trong khi đụ CXCR4 chủ yếu cho chủng HIV õi tợnh T vỏ thường

xóm nhập vỏo TCD4 ở giai đoạn muộn của bệnh Vớ vậy khi cụ đột biến ở

cõc gen mọ cho đồng thụ thể thớ virus khụ xam nhập vỏo tế bỏo tương ứng,

bệnh sẽ phõt triển chậm HTV cún xóm nhập vỏo cả cõc tế bỏo đợch cụ CD4

trởn bể mặt khừng phải tế bỏo Iympho như tế bỏo cơ, tế bỏo trophoblast,

nguyởn bỏo sợi ở đa, ở cơ, tế bỏo glial ở nọo cũng nhờ cụ quõ trớnh gắn gp120 của HIV với cõc đồng thụ thể mỏ kởnh Ca"? được hoạt hoõ vỏ hướng động cõc tế bỏo cụ phón tử CD4" khõc, quõ trớnh chết theo chương trớnh được khởi động

Trang 20

Righiien thee DE tai

1.3.2 Quõ trớnh nhón lởn vỏ lan truyờn HEV sau khi vỏo tế bỏo

- Sau khi HIV phụng thợch genome vỏo bỏo tương tế bỏo đợch Dưới tõc dụng của enzym sao chờp ngược (RT = Reverse Transcriptase) cla

virus, RNA của HTV được chuyển thỏnh DNA vỏ xóm nhập vỏo nhón tế bỏo

[22]

- Trong nhón của tế bỏo đợch DNA của HIV tợch hợp vỏo DNA của tế

bỏo được gọi lỏ “tiởn virus” DNA của HIV sẽ tổng hợp RNA vỏ cõc

mRNA tuong ứng, vỏ tạo nởn cõc virion HIV để rồi tiếp cận mỏng tế bỏo cụ

sẵn gp120/gp4l, mỏng tế bỏo sẽ bọc cõc virion lại rồi được cất khỏi mỏng

thỏnh virus con hoỏn chỉnh, tiếp tục lóy nhiễm vỏ lan truyền sang cõc tế bỏo

đợch khõc [17]{22]- Nay chời, on

Gdn kờt Sao chờp ngược Sao mọ vỏ nhón lởn ` trưởng thỏnh

Bỏo tương Nhón tế bỏo Bỏo tương , Hớnh L.3: Chu trớnh phõi triển của HIV

1.3.3 Cõc rối loạn đõp ứng miễn dịch

1.3.3.1 Cơ chế góy rối loạn miễn địch

Hệ thống miễn dịch dim bảo sự toỏn vẹn của cơ (thể, trong điều kiện cụ rất nhiều tõc nhón xóm nhập Hầu hết cõc tõc nhón đụ vỏo cơ thể đều bị loại trừ Song đối với HIV thớ khõc, do HIV tấn cừng trực tiếp cõc tế bỏo

miễn dịch Giai đoạn đầu của nhiễm, đõp ứng miễn dịch cụ tõc dụng nhưng

Trang 21

ighitme thee Di tỏi

khừng cụ khả năng tiởu điệt hoỏn toỏn HIV, Đụ lỏ xuất hiện cõc khõng thể đạc hiệu HIV Biểu hiện khõng nguyởn p24 giảm vỏ chưa cụ triệu chứng Quõ trớnh nỏy diễn ra dỏi hay ngắn tuỳ thuộc vỏo đõp ứng miễn dịch của cơ thể nhiễm HIV góy tổn thương về số lượng vỏ chức năng của nhiều loại tế bỏo đặc biệt tế bỏo miễn dịch Lympho TCD4 vỏ đại thực bỏo

Giảm số lượng Lympho TCD4 kờo theo cõc tế bỏo phụ thuộc TCD+

cụ 2 quần thể: Th1 cụ chức nọng hỗ trợ giỷp cho đõp ứng miễn dịch tế bỏo;

“Th2 hỏ trợ cho tế bỏo Lympho B trong đõp ứng miễn dịch thể dịch TCD4

bị tiởu diệt trực tiếp vỏ giõn tiếp:

+ Trực tiếp: Sự nhón lởn vỏ phõt triển HIV trong tế bỏo lỏm thay đổi tợnh thấm mỏng tế bỏo góy vỡ, chết theo chương trớnh nhanh hơn bớnh thường, góy độc tế bỏo do một lượng lớn DNA của virus vỏ cõc mảnh bản sao mARN của virus hớnh thỏnh, phón tử CD4 mới hớnh thỏnh trong tế bỏo bị liởn kết với gp20 của HIV

+ Giõn tiếp: HIV phong bế sự trưởng thỏnh cả tế bỏo Lympho TCD4, do hợp bỏo (TCD4 mang gp120 + TCD4 chưa nhiễm) lỏm chỷng cụ đời

ngần hơn bớnh thường, do cơ chế tự miễn vớ khõng thể chống gp120 vỏ cả tế

bỏo lỏnh cụ gắn gp120, hoặc do khừng cụ tế bỏo nguồn vỏ tế bỏo non [2] 1.3.3.2 Hậu quả của cõc cơ chế góy giảm tế bỏo Lympho TCD4:

- Giảm số lượng vỏ chức năng tiết khõng thể của Lympho B: Khõng thờ khõng HIV trước tiởn lỏ lớp IgM, sau đụ giảm dẫn vỏ thay vỏo đụ lỏ

khõng thể lớp IạG khõng khõng nguyởn p24 vỏ giảm đón cỳng với sự xuất hiện lại của khõng nguyởn Khõng thể khõng khõng nguyởn vừ của HIV

({gp120) thớ tồn tại trong suốt thời gian nhiễm

- Tang số lượng TCDư trong suốt quõ trớnh của bệnh nhưng ở giai đoạn cuối thớ TCD8 giảm

- Otokin:

+ Ở giải đoạn chưa bị suy giảm miễn địch thớ dưới tõc dụng của IL~1

đo đại thực bỏo hoạt hoõ tiết ra, tế bỏo Lympho TCD4 được hoạt hoõ vỏ tiết

Trang 22

Highton thu Dờ tik

ra IL-2 vỏ cõc cytokin khõc nởn đọ giỷp cho đõp ứng miễn dịch tế bỏo (TCDS, NK, DTB) va thờ dich tang

+ Ở giai đoạn sau (giai đoạn cụ triệu chứng): cõc cytokin khừng những giảm về số lượng mỏ cún giảm về chức năng Cơ thể lóm vỏo tớnh trạng suy giảm miễn địch, cụ tăng phức hợp miễn dịch, tăng tự khõng thể vỏ một số protein huyết thanh khõc [37] bị nhiễm trỳng cơ hội hoặc ung thư

1.3.4 Cõc nhiễm trỳng cơ hội, ung thư

~ Tiởu chảy kờo dai

- Viởm phời do Pneumocystis, toxoplasma ~ Cõc bệnh do nấm Candida - Nhiễm trỳng đường hừ hấp do Cytomegalo virus - Zona - RGi loan hờ thong than kinh - Sarcoma Kaposi

1.4 CạC PHƯƠNG THỨC LằY TRUYEN HIV

Người ta cụ thể phón lập được HIV từ mõu, tỉnh địch, địch tiết óm đạo, nước bọt, nước mất, sữa mẹ, nước tiểu, Tuy vậy chỉ cụ mõu, tỉnh

dich, dich tiết óm đạo đụng vai trú quan trọng lỏm lóy auyền HIV, Cụ 3 phương thức lóy truyền chủ yếu:

144.1 Lóy truyền qua quan hệ tớnh dục

- Những vết xước như ở niởm mạc óm đạo, hậu mừn, miệng hay

dương vật cụ thể xảy ra trong quan hệ tớnh dục lỏ đường vỏo của virus vỏ từ đụ vỏo mõu HIV cụ thể gắn vỏ xóm nhập vỏo tỉnh trỳng, bạch cầu của tỉnh dịch, tế bỏo Langerhan ở địch nhóy am đạo hoặc hậu mừn

- Nguy cơ lóy nhiễm HIV qua một lần quan hệ tớnh dục với người

nhiờm HIV tir 1%-10% Nguy cơ nỏy tăng lởn khi quan hệ tớnh dục với

Trang 23

3gb tha 9€ tỏi

nhiều người, đặc biệt với người cụ bệnh lóy truyền qua đường tớnh dục thớ

nguy cơ cụ thể tăng lởn tới 20 lần

1.4.2 Lóy truyền qua đường mõu

- Mõu toỏn phần bao gồm cõc thỏnh phẩn hữu hớnh vỏ cõc yếu tố dong mau cụ thể cụ chứa HIV Nguy cơ lóy truyền qua đường mõu cụ tỷ lệ

rất cao (>90%) Từ năm 1985 cụ cõc bộ xờt nghiệm để sỏng lọc huyết thanh

phõt hiện khõng thể chống HIV, nguy cơ lóy truyền qua đường nỏy đọ giảm

rử rệt, Tuy nhiởn đối với cõc người cho mõu mới nhiễm HIV (giai đoạn của 36) thớ bằng cõc xờt nghiệm huyết thanh khừng thể phõt hiện được mỏ phải

cụ cõc xết nghiệm phõt hiện khõng nguyởn virus (p24) hoặc phõt hiện

DNA-HIV (bằng PCR) hoặc RNA-HIV (bảng RT-PCR) hoặc phản lập

virus Điều nỏy thực sự hạn chế ở cõc nước đang phõt triển vỏ cõc nước kờm

phõt triển

~ HIV cụ thể lóy truyền qua đường bơm kim tiởm, dung cụ phẫu

khừng được tiệt trỳng cẩn thận HIV cũng cụ thể lóy truyền qua cấy truyền hoặc ghờp cơ quan, tổ chức vỏ tỉnh dịch

1.4.3, Lay truyền từ mẹ sang con ở thời kỳ chủ sinh

- Người ta cụ thể phón lập HIV hoặc DNA của virus trong tế bỏo bõnh rau, mõu của thai nhỉ từ 8 tuần tuổi vỏ ở nhiều tuần sau đụ

- Cơ chế lóy truyền HIV từ mẹ sang con vẫn chưa hoỏn roỏn sõng tỏ “rẻ sơ sinh cụ thể nhiễm HIV từ mẹ xảy ra ở 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn khi thai nằm trong tử cỳng:

Người mẹ cụ HIV(+) cụ thể truyền cho con qua bõnh rau Người ta

đọ phat hiện virus hoặc DNA của virus trong tổ chức nỏy từ 10 - 15 tuần tuổi thai Lóy truyền trong thời kỳ mang thai nỏy chi gap khoảng 5 - 10%

số trường hợp trẻ sơ sinh của bỏ mẹ cụ HIV(+) Tỷ lệ lóy truyền trong thời kỳ mang thai chủ yếu xảy ra vỏo những thõng cuối của thai kỳ, đặc biệt khi

thai được khoảng 34 tuần [29][30]

Trang 24

Tighten thes DE tect

Cơ chế lay truyền theo đường nỏy rất phức tạp vỏ chưa hoỏn toỏn biết

tử do cấn trỷc vỏ chức nọng của bõnh rau thay đổi theo sự phõt triển của thai Vỏo thời gian cuối của thai nghờn cõc tế bỏo của mẹ cụ thể vỏo tuần hoỏn của thai nhợ Do vậy đường nỏy virus cụ thể chuyển vỏo thai nhỉ qua

bõnh rau Người ta thấy tỷ è

cung người mẹ HIV(3) tăng lởn khi tuổi của mẹ y truyền qua bõnh rau khi thai nằm trong tử o, khi nồng do HIV trong mõu mẹ cao, khợ khõng nguyởn p24 (+) vỏ khi ở giai đoạn muộn đọ cụ cõc triệu chứng lóm sỏng của AIDS hoặc tế bỏo Tạo, < 200 tế bỏo/mrmẺ,

+ Giai đoạn thai qua đường sinh dục người mẹ khi chuyển da:

Khi chuyển dạ đứa trẻ cụ thể bị lóy nhiễm do tiếp xỷc trực tiếp với

mõu vỏ cõc chất dịch ở óm đạo người mẹ cụ HIV(+) Nguy cơ lóy truyền

qua đường nỏy tăng khi ði đọ vỡ, khi đẻ khụ, chuyển dạ kờo đỏi, phan mờm của mẹ bị sang chấn, thai bị xóy xước vỏ đặc biệt cơn co tử cung mạnh cũng

cụ thể đẩy mõu mẹ cụ HIV vỏo tuần hoỏn con Nếu khừng được can thiệp

khoảng L5 - 25% mẹ nhiễm HIV sẽ truyền cho con [38]

+ Giai đoạn cho con bỷ:

Phương thức lóy truyền HIV qua sữa mẹ được phõt hiện lần đóu tiởn vỏo năm I989, bõo cõo đọ chứng mớnh một trẻ sơ sinh từ mẹ HIVC) bị nhiễm HIV do bỷ sữa của người nuừi dưỡng bị nhiễm HIV, Tỷ lệ lóy truyền qua đường nỏy thấp khoảng 10-15% Tỷ lệ nỏy cao hơn khi bệnh của mẹ ở giai đoạn muộn, khi nụng độ HIV trong mõu cao, HIV cao trong sữa ở giai đoạn đầu (6 tuón) sau để vỏ giảm dẫn trong suốt thời gian cho con bứ

1.5 MỘT SỐ KỸ THUẬT XạC ĐỊNH HIY Vá GENOTYPE HIV:

Người ta cụ thể phõt hiện nhiễm HIV giõn tiếp qua khõng thể hoặc trực tiếp sự cụ mặt của HIV Do điều kiện kinh tế của cõc nước đang phõt

triển vỏ chưa phõt triển, việc sử dụng một số kỹ thuật để chẩn đoõn xõc định

HIV nhu Western Blot hode phan ứng khuếch đại chuỗi (PCR) ợt cụ thể

hoặc khừng thể thực hiện được Vớ vậy gần đóy Tổ chức Y tế thể giới đọ

cừng bố nhiều chiến lược thững kỹ thuật khõc nhau trong xờt nghiệm mỏ khừng cón phải sử dụng đến những kỹ thuật trởn miễn lỏ cõc xờt nghiệm đụ

Trang 25

‘Rghiton thax Di tỏ

cụ độ nhạy vỏ độ đặc hiệu cao như ELISA hoặc những thử nghiệm gọi lỏ “đơn giản” hay “nhanh” Tuỳ theo mục đợch của thử nghiệm mỏ Tổ chức Y tế thế giới đọ khuyến cõo 3 chiến lược xờt nghiệm mỏ Việt Nam gọi lỏ 3

phương cõch xờt nghiệm

1.5.1 Phương cõch xờt nghiệm

- Phương cõch 1: Trong phương cõch nỏy, người ta thực hiện I xờt nghiệm duy nhất, hoặc thử nghiệm nhanh/đơn giản hoặc thir nel

8erodia hoặc thử nghiệm miễn dịch hấp thu enzym (ELISA) Phuong cach

nỏy dỳng để sỏng lọc trong an toỏn truyền mầu

~ Phương cõch 2: Trong phương cõch nỏy, người ta thực hiện 2 xờt

nghiệm; hoặc thử nghiệm nhanh/đơn giản với ELISA hoặc Serodia: hoặc 2

ELISA với nguyởn lý hoặc khõng nguyởn khõc nhau Phương cõch 2 õp

dụng cho giõm sắt trọng điểm

~ Phương cõch 3: Trong phương cõch nỏy, người ta thực hiện 3 xờt

nghiệm; hoặc ELISA với 2 loại thử nghiệm khõc nhau hoặc 3 thử nghiệ khõc nhau; hoặc 3 thử nghiệm đều lỏ ELISA nhưng với nguyởn lý hoặc

khõng nguyởn khõc nhau Chẩn đoõn nhiễm HIV bắt buộc phải sử dụng

phương cõch 3 nỏy vớ nếu khừng sẽ chấn đoõn nhầm để lại hậu quả vừ cỳng to lớn khừng những đối với người bị chẩn đoõn mỏ đối với cả gia đớnh c họ vỏ xọ hội 1 tế tè

thuật ELISA [16]{35] lỏ 1 trong những kỹ thuật được Tổ chức Y

giới khuyến cõo nởn sử dụng ở cõc nước phõt triển vỏ chưa phõt triển

khừng những dỳng cho sỏng lọc cụ giõ trị “gợi ý” vớ kỹ thuật nỏy cụ độ nhạy cao cho kết quả dương tợnh với một mẫu bệnh phẩm thực sự đương

tợnh, mỏ cún lỏ thử nghiệm bổ sung do cụ độ đặc hiệu cao cho kết quả óm

tợnh đối với

lu bệnh phẩm thực sự lỏ ảm tợnh được ding để xờt nghiệm

thởm những huyết thanh đọ được xõc định sỏng lọc Thử nghiệm ELISA nỏy được lựa chọn lỏ 1 trong những thử nghiệm bổ sung để khẳng định thử

nghiệm sỏng lọc lỏ “đỷng” Kỹ thuật ELISA dỳng cõc pcptid đặc hiệu cho

cõc gen pl7,C,V; (gp120), gp41 (thường sử dụng cõc peptid tổng hợp hoặc

phón lập vỳng quyết định của gp120) lỏm khõng nguyởn gắn vỏo cõc giếng

của phiến nhựa Huyết thanh của bệnh nhón cố khõng thể đặc hiệu với

pepld (khõng nguyởn) đụ được cho vỏo giếng Sau khi rửa khõng thể thừa,

Trang 26

ghetto thas BE tt

cho thởm vỏo giếng huyết thanh chống IgG người cụ fin peroxidase Cho

cơ chất vỏo giếng phản ứng, nếu cụ phức hợp peptid (khõng nguyởn của HIV) - IgG antipeptid - anti IgG thớ cơ chất sẽ phõn ứng vỏ cho sản phẩm cụ

mau Do OD bing my do quang ở bước sụng 450 nm Từ OD của cõc giếng chứng, chỷng ta cụ thể xõc định được nồng đỏ khõng thể chống

pepud đụ Từ đụ ta cụ thế biết được cõc đoạn gen của HIV Ngoỏi ra kỹ

thuật ELISA nỏy cún được thực hiện theo nguyởn lý cạnh tranh hay kẹp chả

1 „3 Cõc kỹ thuật phõn tợch DNA-HIV:

Người ta lấy cõc tế bỏo đơn nhón mõu ngoại vi của bệnh nhón nuừi

cấy hỗn hợp với tế bỏo chưa nhiễm HIV Sau khoảng 3 - 14 ngỏy nuừi cấy,

ta cụ thể tõch DNA từ cõc tế bỏo nhiễm HIV nỏy vỏ trớnh tự nucleotid được

phón tợch bằng sequenase vỏ đATP Đối chiếu trớnh tự chuỗi với

dữ liệu gen HIV, từ đụ xõc định được DNA-HIV gón hỏng

Trang 27

Mghifre tha Dh tỏi

~ DNA-PCR (PCR) (Hinh 1.4): Kỹ thuật được thực hiện bằng cõch khuếch đại những đoạn DNA đợch đặc hiệu Ta lặp lại nhiều chu kỳ tổng

hop DNA bing polymerase bờn với nhiệt Ở nhiệt độ 50 - 60°C cõc đoạn mỗi (primer) oligonuclcotide đặc hiệu sẽ bắt cặp theo nguyởn tắc bổ sung

vỏo hai đầu đoạn acid nueleic đợch Sau đụ tăng nhiệt độ của phản ứng lởn 72C, nhiệt độ thợch hợp cho polymerase hoạt động Sự cụ mặt của dideoxy- ribonucleoside triphosphate (dNTP), phản ứng tổng hợp bản sao của DNA, đợch theo nguyởn tắc bổ sung được thực hiện Sau đụ nóng nhiệt độ lởn 94%C lỏm chơ DNA vừa được tổng hợp lại tõch ra thỏnh hai chuỗi đơn, trởn đụ cõc đoạn mi cụ thể gắn vỏo 1 lần nữa khi nhiệt độ hạ xuống 54°C Chu kỳ

tiếp tục lặp lại 30 - 35 chu kỳ cho việc xõc dinh DNA dich

Trang 28

Gighitme tes Di tak

~ RNA-PCR (RT-PCR) (Hinh 1.5):

&ỹ thuật RN.X-PCR lỏ mội kỹ thuật ứng dụng PCR xõc dịnh mRNA

của virus cụ trong huyết thanh của người nhiễm HIV với nguyởn lý mRNA

sẽ tạo ra một sợi cDNA nhờ RT (enzym sao chờp ngược) Tử đụ cDNA sẽ được bổ cứu sợi kếp DNA vỏ tiếp thục thực hiện cõc bước của phản

ting PCR dờ tao ra DNA dac hiờu

- Cõc yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật PCR:

+ DNA đừng để khuếch đại phải thật tỉnh sạch Lượng DNA cụ khuynh hướng giảm dẩn khi sử dụng với polymerase cụ hiệu quả cao Ưu điểm của kỹ thuật PCR lỏ cho phờp khuếch đại những mẫu cụ trong bệnh phẩm bảo quản khừng tốt đọ bị phón huỷ như vết mõu lóu ngỏy, của người chết, tợnh dịch đọ khừ

+ DNA polymerase lỏ enzym chịu nhiệt, được chiết tõch từ vi khuẩn

sống ở suối nước nụng, enzym chịu nhiệt nỏy chợnh lỏ Taq polymerase cụ vai trú xỷc tõc từ đầu đến cuối quy tớnh phản Ứng Ngỏy nay cõc polymerase chịu nhiệt cụ khả năng hoạt động như một enzym phiởn mọ

ngược cụ RNA lỏ khuừn vỏ ion Mg”, enzym nỏy cụ thể khuếch đại mẫu lỏ

RNA thừng qua cDNA

+ Mồi: Mỗi lỏ yếu tố quan trọng nhất để khuếch đại đặc hiệu vỏ hiệu

quả Chọn mỗi cẩn phải lưu ý trớnh tự của mồi sao cho khừng cụ sự bắt cặp

bổ sung giữa mỗi "xuừi” vỏ mỗi “ngược” hoặc “kẹp tốc” đo bắt cặp giữa

cõc phón khõc nhau bởn trong một mỗi Cõc mỏi chọn đặc trưng cho trớnh tự DNA cần khuếch đại, trớnh tự mỗi nằm giữa bản mỗi “xuừi” vỏ mỗi

“ngược” khừng quõ lớn (nhỗ hơn Ikb)

+ Số lượng chủ kỳ của phản ứng PCR: khừng vượt quõ 40 chủ kỳ, bởi vớ PCR diễn biến qua 2 giai đoạn: Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhón, giai đoạn sau khuếch đại giảm dón (vớ sự giảm cõc thỏnh phần của phản ứng, xuất hiện cõc sẵn phẩm ức chế phản ứng, cõc bản sao vừa được tổng hợp khừng kết hợp với mỗi vỏ chỷng bắt cặp với nhau)

+ Ngoỏi cõc yếu tố trởn cún cụ nẻng độ 4 loại nucleotid, nồng độ Mg”, sit dụng cho phản ứng

Trang 29

1.5.3.2 Xờe dinh genotype HIV bing ki thudt xdc dink trinh up nucteotic

(Sequencing):

Kỹ thuật xõc định trớnh tự nuclcotid lỏ kỹ thuật được õp dụng rộng rọi

trong nghiởn cứu genotype HIV Đoạn DNA của HIV được khuếch đại

bằng phản ứng PCR lồng Sản phẩm PCR được đưa vỏo xõc định trớnh tự

nueleotid cụ sử dụng dideoxynucicotidc đặc biệt với mầu sắc riởng, Trớnh tự

nucleotide ca DNA được phón tợch trởn mõy phón tợch trớnh tự (sequencer)

vỏ được sử lý trởn mõy tợnh với cõc phần mềm phỳ hợp, sơ sõnh với trớnh uy chuỗi nueleotide tương ứng của cõc subtype chuẩn Từ đụ cụ thể xõc định được subtype của chủng HIV cần tớm,

Tụm lại:

Đại dịch HIV/AIDS đọ vỏ đang trở thỏnh vấn để y tế vỏ xọ hội trong

toỏn cầu Ở Việt Nam số người nhiễm HéV trong đụ cụ phụ nữ vỏ trẻ em

ngỏy cỏng gia tăng, tuy cơ chế lóy truyền từ mẹ sang con ngoỏi cõc đường đọ biết, nhưng cõc yếu tố tõc động đến cõc đường đụ cũng như ty Iờ |:

truyền từ mẹ sang con thớ chưa cụ cừng trớnh nỏo cừng bố Vớ

y bước đầu

nghiởn cứu khả năng lóy truyền HIV từ mẹ sang con lỏ cần thiết

Những hiểu biết về cấu trỷc, chu trớnh xóm nhập cửa HIV vỏo tế bỏo

đợch, những biến đối về miễn dịch, diễn biến lóm sỏng cũng như những biến đổi huyết thanh của người nhiễm HIV Đếi với người lớn hoặc trẻ em

trởn 18 thõng thớ cụ thể lựa chọn kỹ thuật phõt hiện giõn tiếp sự cụ mật của

HIV qua cõc khõng thể hoặc trực tiếp sự cụ mặt của HIV Song 6 trờ so sinh cụ mẹ nhiễm HIV thớ chỉ bằng kỹ thuật sinh học phón tử (phản ứng khuếch

đại chuỗi) mõu cuống rốn mới cụ thể giỷp người re biết được sớm con của

sản phụ nhiếm HIV(+) cụ bị nhiễm từ mẹ sang trong giai đoạn ở tử cung khừng, hoặc bị nhiễm trong thời kỳ chuyển dạ thớ sau tối đa 10 - 15 ngỏ

thể phõt hiện được khừng phải chờ đợi chẩn đoõn bằng cõc phản ứng huyết thanh sau 18 thõng tuổi, thời gian khừng cún khõng thể chống HIV của mẹ

cụ

Trang 30

Haghiime tha Dờ tic

CHUONG 2:

ĐỐI TƯỢNG Vá PHƯƠNG PHạP NGHIấN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIấN CỨU:

- 104 mẫu mõu của 52 cặp mẹ - con, mẹ cụ huyết thanh chẩn đoõn HIV(+) ~ Mõu mẹ: 5 ml mõu tĩnh mạch đựng trong ống nghiệm cờ EDTA

~ Mầu con: 5 ml mầu cuống rốn đựng trong ống nghiệm cụ chứa EDTA (lấy ngay sau sinh)

3.2 PHƯƠNG PHẬP NGHIấN CỨU:

È Khõm lóm sỏng, tư vấn sản phụ tự nguyện tham gia nghiởn cứu

- Xõc định nhiễm HIV ở 52 cập mẫu mõu mẹ - con bằng kỹ thuật PCR sử dung 3 loại mổi khuếch đại vỳng CV, (zp120), p17 vỏ gp41 của HIV-1 qua cõc bước sau;

2.2.1 Bước 1: Xử lý mẫu vỏ chi ich DNA vỏ RNA của HIY-1

* Chiết tõch DNA tiởn HIV-1 từ tế bỏo bạch cầu đơn nhón mõu ngoại vi: - Lỏm giỏu lymphocyte (tạo Buffy coat) ở cõc mẫu mõu để tõch chiết DNA-HIV Ống mõu cụ EDTA được để lắng tự nhiởn ở 4°C qua đởm Hỷt lấy 1/3 lớp huyết thanh ở phợa đưới vỏ toỏn bộ vúng bạch cầu sõt lớp hỏng cau Tron đều, ta được mẫu mõu giầu lymphocyte

- Đếm cừng thức bạch cấu ở cõc mẫu (buffy coat) nỏy bằng mõy huyết học Hemacell Plus, Luong lymphocyte ding dờ tach chiết DNA-HTV được điều chỉnh vỏo khoảng 5x10” - 7x10” tế bỏo/nmẺ, Lượng DNA sử dụng cho phón ứng PCR được tõch chiết từ một lượng tế bỏo cụ khoảng 5x10" lumphoeyte

- DNA tiờn HIV-I (provirus) được chiết tõch từ tế bỏo đơn nhón mõu ngoại vi bằng cõch sử dụng bd test kit Capture Column Kit (Gentra Systems, Minneapolis, MN, USA)

* Chiết tõch RNA từ huyết thanh: Tõch RNA-HIV từ huyết thanh, tạo

cDNA vỏ DNA bằng cõch sử dụng bộ test kợt RNA-PCR/HIV (QlAamp

Trang 31

2.2.2 Bước 2: Khuếch đại sản phẩm

* Phản ứng nested PCR (PCR lồng): Thỏnh phần PCR mix (Roche USA)

sau khi cụ DNA dich

Trang 32

Fighetine there Dờ thi

- Mời F/R (50 pmoltl): 10 yl - H,O vd: 100 tử

Trớnh tự nucleotid của cõc loại cặp mừi cho kỹ thuật PCR

- Khuếch đại vỳng C;V;: Sản phẩm cuối cỳng cụ kợch thước khoảng 342 bp:

| Yúng PCR Cap sỂ mỗi mai Vim i tri † (6! >3) Trớnh tự ị |

Trang 33

(Wiybetion thee DE tied

|

Vong Cap | & Y Trớnh tự

Vong phan ứng thứ nhất: Hỗn hợp trong eppendorf phản ứng gồm:

Eppendorf thi: PCR mix (c6 cip mời FI/R1) + DNA đợch (DNA tiền

virus tõch chiết từ tế bỏo đơn nhón mõu ngoại vớ bệnh nhón)

Eppendorf chứng (-): PCR mix + H,O

Sản phẩm của vúng phần ứng nỏy được lỏm DNA nguyởn liệu (templatc) cho vúng phản ứng thứ hai

úng phản ting PCR lan thit hai: Eppendorf phan ing gờm:

PCR mix (cờ cặp mồi F2/R2) + template

Sản phẩm vúng PCR thờ hai nay được chạy điện di trờn gel agarose

để phõt hiện DNA cha HIV Điều kiện phản ứng: ~ 94PC: 2 phỷt + 94C: 30 gióy Dị + 50°C (cho C;V, & gp41) hoặc 55C (cho p17): 30 gióy pe chủ kỳ +72: ~ 72C: 5 phỷt 60 gióy

- 4C: giữ cho đến khi chạy điện di

Trang 34

Dahiine thas Bi tai + MgsO,: +Mổi FMII1: + Mời FM112: + AMV reverse transcriptase: + DNA polymerase: + RNA dich: +H,0 Phản ứng cụ thể tợch cuối cỳng lỏ: ~ Điều kiện phản ứng: + 48PC: 45 phỷt + 949C: 2 phỷt + 94°C: 30 giay + 6ŒC: 1 phỷt + 68%C: 2 phỷt + 689C: 7 phỷt > 4C: œ, - Trớnh tự nucleotid cõc cập mồi: 4ml Sul Sul ipl 1H 20 pl vừa đủ 50 pl 40 chu ky Vong| 2 PCR! mỗi Vi tri Trinh ty @ >3) Thứ |EM-111| 7301-7319 |GGC AAA GáG AAG AGT GGT G nhất

Thứ |FM-I 13| 7371-7397 |GGA GCA GCA GGA AGC ACT ATG GGC GCG FM-112 | 7933-7806 |CCC TGC CTA ACT CTA TTC ACT ATA GA AAA! ——4 | hai ẻEM-115 76ư5-7637|AạA AGA TCA ATT ACT CCA AGTG

- Sin phẩm của vúng phản ứng thứ nhất được lỏm DNA nguyởn liệu cho

Trang 35

Aghiie thee BE tit +dATP: lại +4dCTP: Tul + dGTP: 1pl + dTTP: lại + Mời FM113: Spl +Mừi FMII5: 5m + Taq polymerase: 0,5 jul + DNA đợch: Spl +H,0 vite di Phản ứng cụ thể tợch cuối cỳng lỏ: _ 50 pl - Điều kiện phần ứng: + 94'C: 2 phỷt + 949C: 1 phỷt + 55C: I phỷt | 30 chu kỳ + 72C: 1 phỷt j + 72°C: 7 phat

+4°C: gitt cho dờn khi chay điện đi

2.2.3, Bước 3: Phõt hiện són phẩm của phón ứng PCR bằng điện di tren

gel agarose

- Agarose: 1,2% trong dờm TBE pH 8,3 (Sigma, USA)

- DNA (ain pham eta phan tng PCR): Spl

- Thang chuẩn DNA (Roche) (cõc băng cụ kợch thước từ 50 đến 100 bp, khoảng cõch giữa cõc bang lỏ 100 bp); 5 pử

- Dúng điện: 100V, thời gian điện đi 45 phỷt

- Sau điởn đi, băng DNA trởn go agarose được phõt hiện bằng nhuộm ethidium bromide (10 mg/ml)

Trang 36

Gghitm the Be tet

- 8o sõnh kợch thước của cõc băng DNA của mẫu với thang DNA chuẩn đẻ xõc định kết quả PCR

~ Chụp ảnh băng điện di bằng mõy ảnh polaroid vỏ nhận định kết quõ

3.3, XỬ LÝ SỐ LIỆU: Theo chương trớnh Epi-Info 6.0

Trang 37

(NfgRidm the Dờ tat CHƯƠNG 3: KẾT QUạ NGHIấN CĩU 3.1 Một số thừng tin về sản phụ: Bảng 3.1: Một số thừng tợn về 52 sản phụ HIV(+) Thong tin về sản phụ n Tỷ lệ (%) Tuổi 19-35 52 10000 | Ngiễ TP Hồ Chợ Minh 26 30,00 Cõc tỉnh phợa Nam khõc il 21,00 Ha Nội 08 15,30 Hai Phong 02 3,80 Quang Ninh 02 3,80 | Cõc tỉnh phợa Bắc khõc 03 Nghẻ nghiệp Buừn ban 12 â Cừng nhón 10 j i Khừng nghề 30 | ƒ Tũnh độ vỏnhoõ | Mỳ chữ OL | Phố thừng cơ sở 38 Phổ thừng trung học 10 Đại học 02 Sau đại học 01 Tiởn sử sản khoa | Con so 40 Con da | T2 HIV) âHIV 2002 â 08 â HIV 2003 Ta â Dấu hiệu lóm sỏng Khừng trớ “50 | ARC ” ~ Or ị STD ~ Được diểu trị thuốc khõng virus trước sinh | 32 :

Nhận xờt: Lứa tuổi của sản phụ cún rất trẻ, đa số khừng nghề nghiệp, cụ

trớnh độ văn hoõ ở mức phổ thừng cơ sở, để con so vỏ ở giai đoạn khừng

triệu chứng

Trang 38

10 | Chồng quan hệ gõi mại đóm 01 T 19 |

| _— | Tước hừn nhón ị

Nhận xờt: Nguy cơ phơi nhiễm chủ yếu do khừng dỳng bao cao su, khừng

phõt hiện được trường hợp nỏo sản phụ cụ khả năng lóy nhiễm HIV qua

đường mõu

3.2 Kết quả PCR với cõc móu mõu mẹ:

Bảng 3.3: Kết quả xõc định nhiễm HIV của 52 mẫu mõu mẹ | Kếtquả | ELISA ủ PCR i | Nhiễm â | pl7 CV, eed | Hiva | a 52 43 3 4 | 52 âDương tợnh | 32 (100%) l (82,7%) | 33 (63,5%) | 4L (78,8%) | 52 (100%) | t T—- lAmtinn | =0 â0907380 19 (36.5%)| 11 (21,2%)| 0 se ee !

Nhận xờt: Tất cả mẫu mõu mẹ đều cho kết quả ELISA(+) Tỷ lệ PCR(+)

Trang 39

100 Tu „100 Dương tợnh Am tinh

ELISA pi? C2V3 gp4d Nhỉ?m HIV

Hớnh 3.3: Kết quả xõc định nhiễm HIV của 52 mẫu mẫu mẹ 3.3 Kết quả PCR của cõc mẫu mõu cuống rốn:

Bảng 3.4: Kết guả xõc định nhiễm HIV của 52 mẫu mắu cuống rốn

PCR

Kết quả | ELISA Nhiem

pi7 CY; gpd HIV-1 i Duong tinh | 52 (100%) | 03 (5,7%) | 2(3,8%) | 3(5,2%) | 3(5,7%) pon | 52 1 3 | 2 | 3 |] 3 | | \ | | Am tinh 8 49 (94,39) | 50 (96,2%) | 49 (94,2%) | 49 (94,3%)

Trang 40

ZXgạiệm thự Di tat

3.4 Phõt hiện DNA HIV-1 6 cờc san phụ nhiễm HIY vỏ ở con bằng PCR sử dụng cõc loại mừi khõc nhau

Nh@n xờt; Sit dung mdi pi7 va gp41 trong phan ung PCR phat hiđn HIV

mẫu mõu mẹ cho kết quả tốt hơn mồi C;V; Với cõc mẫu mõu cuống rốn sử

Định dạng
Số trang	73
Dung lượng	10,54 MB