Thông tin tài liệu
ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ Xây dựng quy trình phân type rs1801133 (C677T) dựa kỹ thuật real-time PCR kết hợp phân tích HRM Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: Trần Thị Nhựt Linh Thành phố Hồ Chí Minh – 2017 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ Xây dựng quy trình phân type rs1801133 (C677T) dựa kỹ thuật real-time PCR kết hợp phân tích HRM (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày ) Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Chủ nhiệm nhiệm vụ Trần Thị Nhựt Linh Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Đồn Kim Thành Thành phố Hồ Chí Minh- 2017 _ Mẫu Báo cáo thống kê (trang Báo cáo tổng hợp kết nhiệm vụ) _ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ ., ngày tháng năm 200 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Vƣờn ƣơm Sáng tạo Khoa học Công nghệ trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Trần Thị Nhựt Linh Ngày, tháng, năm sinh: 15/05/1995 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: Kỹ sư Công nghệ sinh học Chức danh khoa học: Chức vụ: Nghiên cứu viên Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: Mobile: 01652485546 Fax: E-mail: nhutlinh1505@gmail.com Tên tổ chức công tác: Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sinh học Địa tổ chức: 74 đường số 2, KDC Bình Hưng, huyện Bình Chánh Địa nhà riêng: Ấp Mỹ Lợi, Xã Phước Lập, Huyện Tân Phước, Tỉnh Tiền Giang Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Điện thoại: 08.38.233.363 Fax: E-mail: vuonuomtst@gmail.com Website : www.khoahoctre.com.vn Địa chỉ: 01 Phạm Ngọc Thạch, Quận 1, TP HCM Họ tên thủ trưởng tổ chức: Đoàn Kim Thành Số tài khoản: 3713.0.1083277.00000 Kho bạc: Kho bạc Nhà nước Quận TP HCM Tên quan chủ quản đề tài: Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sinh học II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 01/ năm 2017 đến tháng 12/ năm 2017 - Thực tế thực hiện: từ tháng 01/năm 2017 đến tháng 12/năm 2017 - Được gia hạn (nếu có): khơng - Lần từ tháng… năm… đến tháng… năm… - Lần … Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 70 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 70 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác : tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT … Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 25 15 30 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 25 15 30 Ghi (Số đề nghị tốn) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng NSKH 41,02 Thực tế đạt Tổng NSKH 41,02 Nguồn khác 41,02 41,02 Nguồn khác 28,85 28,85 28,85 28,85 0,13 70 0,13 70 0 0,13 70 0,13 70 0 - Lý thay đổi (nếu có): Đối với dự án: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Thiết bị, máy móc mua Nhà xưởng xây dựng Theo kế hoạch Tổng NSKH Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH Nguồn khác 4 mới, cải tạo Kinh phí hỗ trợ cơng nghệ Chi phí lao động Ngun vật liệu, lượng Thuê thiết bị, nhà xưởng Khác Tổng cộng - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: không (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số TT … Số, thời gian ban hành văn Tên văn Ghi Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: không Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực Nội dung tham gia Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: khơng Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đồn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: không Theo kế hoạch Thực tế đạt Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa (Nội dung, thời gian, kinh TT điểm ) phí, địa điểm ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế đạt hoạch Người, quan thực - Lý thay đổi (nếu có): III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Đơn vị đo Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Bộ primer phân type rs1801133 kỹ thuật real-time PCR HRM Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Bộ primer đặc Bộ primer đặc hiệu cho hiệu cho rs1801133 rs1801133 hoạt động hiệu hoạt động hiệu phản phản ứng real-time ứng real-time Ghi Quy trình phân type rs1801133 PCR HRM Phân type hiệu rs1801133 PCR HRM Phân type hiệu rs1801133 - Lý thay đổi (nếu có): c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Bài báo khoa học Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt Đăng tải nội Đăng tải nội dung khoa hoc dung khoa hoc thực thực đăng ký đăng ký thuyết thuyết minh đề tài minh đề tài Số lượng, nơi công bố (Tạp chí, nhà xuất bản) 01 báo Tạp chí nằm danh mục Hội đồng chức danh Giáo sư Nhà nước Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: khơng Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sỹ Tiến sỹ - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: không Số TT Tên sản phẩm đăng ký Kết Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế: không Số TT Tên kết ứng dụng Thời gian Địa điểm (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ 2 Đánh giá hiệu nhiệm vụ mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: Việc thực thành cơng quy trình phân type rs1801133 dựa kỹ thuật real-time PCR HRM cơng cụ để góp phần làm sáng tỏ mối liên quan chứng tăng homocysteine bệnh người tim mạch, ung thư, vô sinh… đặc biệt bối cảnh chưa có nghiên cứu SNP quần thể người Việt Nam tiến hành Ngoài ra, việc thực đề tài nghiên cứu giúp ích cho việc đào tạo đội ngũ cán khoa học kỹ thuật trẻ lĩnh vực công nghệ sinh học y dược b) Hiệu kinh tế xã hội: Việc xây dựng thành công quy trình phân type rs1801133 tiền đề để phát triển thành kit chẩn đoán phân tử chứng tăng homocysteine Việt Nam sản xuất Bộ kit có chất lượng tương đương với kit chẩn đoán tương tự nước nhiên giá thành cạnh tranh Ngoài ra, kit Việt Nam sản xuất giúp làm giảm phụ thuộc vào kit nước quan trọng kích thích phát triển khoa học cơng nghệ nước lĩnh vực chẩn đoán phân tử bệnh người Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra nhiệm vụ: Số TT I III Nội dung Thời gian thực Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Báo cáo tiến độ Đề tài thực việc thiết kế primer, tối ưu hóa nồng độ MgCl2, đánh giá độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ tái lập Nghiệm thu sở Đề tài thực đầy đủ nội dung khoa học đăng ký thuyết minh Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) Thủ trƣởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký đóng dấu) Mục lục M C L C DANH M C CH VIẾT T T DANH M C B NG DANH M C H NH VẼ ĐỒ THỊ T M T T Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan gen Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) 1.2 Giới thiệu Homocysteine 1.3 Các bệnh liên quan đến chứng tăng homocysteine máu 1.4 Nguyên nhân gây chứng tăng Homocysteine máu 10 1.5 SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) 11 1.5.1 Giới thiệu SNP 11 1.5.2 Các dạng SNP 12 1.5.3 Ứng dụng tầm quan trọng SNP chứng tăng homocysteine người 12 1.5.4 nh hưởng rs1801133 lên chứng tăng homocysteine 13 1.6 Các phương pháp xác định genotype SNP 13 Chƣơng 2: V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 2.1 Vật liệu 16 2.1.1 Vật liệu sinh 16 2.1.2 Các oligonucleotide 16 2.1.3 Hóa chất d ng cho tách chiết DNA 16 2.1.4 Hóa chất sử dụng cho phản ứng Real-time PCR HRM 16 2.1.5 Hóa chất d ng cho phản ứng PCR 16 2.1.6 Hóa chất d ng cho giải trình tự 16 2.1.7 Hóa chất d ng cho chạy điện di 16 2.2 Dụng cụ thiết bị 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp thiết kế oligonucleotide 18 2.3.2 Phương pháp tách chiết thu lấy DNA người 18 2.3.2.1 Nguyên t c 18 2.3.2.2 Cách tiến hành 18 2.3.3 Tối ưu nồng độ MgCl2 19 2.3.4 Khảo sát độ đặc hiệu 19 2.3.5 Khảo sát độ lặp lại 19 2.3.6 Khảo sát độ tái lập 20 2.3.7 Phương pháp giải trình tự 20 2.3.7.1 Thu nhận sản phẩm PCR làm nguyên liệu giải trình tự nucleotide 20 2.3.7.2 Tinh sản phẩm PCR từ cặp primer CN3-CN4 20 2.3.7.3 Phản ứng PCR Sequencing 21 2.3.7.4 Tinh ddNTP thừa – Xternimator3 22 2.3.7.5 Giải trình tự máy giải trình tự ABI 35003 22 2.3.8 Phương pháp điện di 22 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N 24 3.1 Thiết kế primer 24 3.2 Xây dựng tối ưu phản ứng Real-time PCR HRM 26 3.2.1 Xây dựng phản ứng real-time PCR HRM phân type rs1801133 26 3.2.2 So sánh với kết giải trình tự 27 3.2.3 Khảo sát nồng độ MgCl2 29 3.3 Khảo sát đặc tính kỹ thuật quy trình real-time PCR HRM phân type rs1801133 30 3.3.1 Khảo sát độ lặp lại 30 3.3.2 Khảo sát độ tái lập 31 3.3.3 Khảo sát độ đặc hiệu 33 3.4 Đánh giá quy trình 100 mẫu máu thử nghệm 34 3.2 Thảo luận 35 Chƣơng 4: KẾT LU N VÀ KIẾN NGH 38 4.1 Kết luận 38 4.2 Kiến nghị 38 Tài liệu tham khảo 39 Phụ lục 10 Kết Hình 3.12 cho thấy mẫu DNA người cho kết dương tính phản ứng real-time PCR với cặp primer CN5-CN6 thể qua đường hu nh quang vượt ngư ng hu nh quang mẫu DNA từ vi khuẩn cho kết âm tính c ng phản ứng Để kh ng định kết âm tính phản ứng real-time PCR với cặp primer CN5CN6 DNA vi khuẩn âm tính thật, chúng tơi thực phản ứng PCR thông thường với cặp primer 27F - 1495R DNA Đây cặp primer đặc hiệu cho v ng gen 16S rRNA tất vi khuẩn nên nguyên t c, phản ứng PCR với cặp primer cho kết dương tính với DNA vi khuẩn Kết PCR trình bày Hình 3.13 Hình 3.13 Kết sản phẩm PCR DNA vi khuẩn với primer 27F-1495R - ứ Ec1: Escherichia coli; Sa: Staphylococcus aureus; Pa: Pseudomonas aeruginosa; Shi: Shigella dysenteriae; Vi: Vibrio cholerae; Kp: Klebsiella pnueumoniae Kết Hình 3.13 cho thấy phản ứng PCR với cặp primer 27F - 1495R cho kết dương tính DNA vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Klebsiella pnueumoniae Kết kh ng định kết âm tính phản ứng real-time PCR với cặp primer CN5CN6 DNA vi khuẩn âm tính thật Như vậy, cặp primer CN5-CN6 nhân chọn lọc DNA từ người v ng trình tự chứa rs1801133 hay nói cách khác quy trình real-time PCR HRM hồn tồn đặc hiệu cho SNP 3.4 Đánh giá quy trình trên 100 mẫu thử nghiệm
Sau xây dựng khảo sát tiêu kỹ thuật, đánh giá quy trình realtime PCR HRM phân type rs1801133 100 mẫu thử nghiệm Các mẫu thử nghiệm cung cấp Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sinh học Kết đánh giá quy trình 41 mẫu lâm sàng trình bày Hình 3.14 -time PCR HRM 100 DNA Kết Bảng 3.4 cho thấy số mẫu mang genotype T/T 12 mẫu, số mẫu mang genotype C/T 15 mẫu có 73 mẫu mang genotype C/C Như vậy, xây dựng thành cơng quy trình phân type rs1801133 dựa phương pháp real- time PCR HRM THẢO LU N
Hiện ngày có nhiều nghiên cứu liên quan SNP với chứng bệnh người Trong chứng tăng Homocysteine máu người có liên quan đến tiến triển nhiều bệnh nguy hiểm tương tác thuốc điều trị, người ta tìm nhiều nguyên nhân khác dẫn đến tình trạng Đã có cơng trình nghiên cứu xác nhận liên quan rs1801133 chứng tăng homocysteine Cụ thể cơng trình nghiên cứu nhóm tác giả van der Put NMJ (1998) chứng minh rằng: cá thể có rs1801133 mang kiểu gen đồng hợp bình thường CC hoạt tính enzyme MTHFR 100%, giảm 66% kiểu gen dị hợp CT 25% đồng hợp biến đổi TT Sự giảm hoạt tính enzyme MTHFR làm tích tụ homocysteine máu Hàm lượng homocysteine máu cao thường thấy kết hợp với tăng cường nguy bệnh tim mạch (cardiovascular), bệnh hệ thần kinh, nguy sảy thai, ung thư, tình trạng vơ sinh quần thể chủng tộc người khác người da tr ng, người da màu, người châu với mức độ khác Quy trình phân type SNP khơng sử dụng công cụ để nghiên cứu tần suất alen SNP quần thể người mà cịn sử dụng quy trình chẩn đốn phân tử cho việc điều trị bệnh có liên quan đến chứng tăng homocysteine máu 42 Có nhiều phương pháp nhằm phân type SNP Đối với việc xây dựng quy trình phân SNP rs1801133, chúng tơi chọn phương pháp real-time PCR kết hợp HRM thao tác ng n đơn giản (so với PCR kết hợp phân tích c t giới hạn, PCR kết hợp giải trình tự nucleotide), khơng cần thiết bị phân tích phức tạp (so với kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự nucleotide), khơng cần hóa chất đ t tiền (so với kỹ thuật real-time PCR với Taqman probe đặc hiệu, lai phân tử với hair pin probe) nhiên đảm bảo độ xác hiệu phân type SNP Dựa thông tin rs1801133 yêu cầu kỹ thuật real-time PCR kết hợp HRM yêu cầu việc giải trình tự, chúng tơi thiết kế cặp primer tương ứng CN5CN6 (sản phẩm có kích thước 45 bp) CN3-CN4 (sản phẩm có kích thước 221 bp) Các primer đạt yêu cầu để hoạt động Primer dài từ 18-25 nucleotide, b t cặp đặc hiệu vào đoạn gen chứa rs1801133 Hàm lượng GC cho ph p khoảng 20-80% (tốt 50 60%) Khơng có nhiểu ba nucleotide G hay C đầu primer, tránh trường hợp có primer khơng đặc hiệu tạo nhiệt độ nóng chảy khoảng 50-65 C (primer xuôi o primer ngược không chênh C) Năng lượng tự (delta G) cấu trúc thứ cấp lớn -9kcal/mol, cấu trúc khơng đủ độ bền để cản trở hoạt động primer phản ứng PCR Và primer chứng minh đặc hiệu mặt lý thuyết thông qua chương trình Blast NCBI Cịn để phân type rs1801133 việc phân biệt đường cong nóng chảy dựa phân tích HRM sản phẩm PCR mục tiêu phải có kích thước đủ nhỏ để thay đổi nucleotide trình tự nucleotide tương đồng làm thay đổi đường cong nóng chảy trình tự nucleotide Thơng thường, kích thước sản phẩm PCR mục tiêu cho phân tích HRM từ 100-300 bp, nhiên nghiên cứu thiết kế cặp primer nhân sản phẩm PCR mục tiêu có kích thước 45 nucleotide Kích thước sản phẩm PCR mục tiêu nhỏ phân biệt genotype SNP r ràng Ngoài ra, cặp primer thiết kế cho sản phẩm PCR mục tiêu nhỏ giúp tránh SNP khác lân cận với SNP mục tiêu khảo sát SNP làm nhiễu kết phân type SNP mục tiêu Qua khảo sát in silico, kích thước sản phẩm PCR từ cặp primer CN5-CN6 45bp tránh SNP lân cận rs1801133 Tuy nhiên, kích thước sản phẩm PCR mục tiêu 45 bp với cặp primer CN5-CN6 không đủ chiều dài để phân tích phương pháp giải trình tự nucleotide Sanger Đó lý mà chúng tơi thiết kế thêm cặp primer CN3-CN4 có kích thước 221 bp nhằm mục tiêu giải trình tự nucleotide Sanger để kh ng định kết phân type rs1801133 real-time PCR kết hợp HRM xác Chúng tơi so sánh kết phân type rs1801133 real-time PCR kết hợp HRM với 43 kết phân type giải trình tự nucleotide Sanger, tiêu chuẩn vàng phân type SNP Khi xây dựng phản ứng real-time PCR HRM mẫu DNA, chọn mẫu thể dạng đường cong nóng chảy khác nhau, dự đốn tương ứng với dạng genotype T/T, T/C C/C rs1801133 Tiếp đến, chúng tơi thực giải trình tự nucleotide mẫu Kết giải trình tự nucleotide mẫu hoàn toàn ph hợp với kết phân type real-time PCR kết hợp HRM Các peak hu nh quang đại diện cho nucleotide T, C hỗn hợp T/C vị trí rs1801133 s c ký đồ r ràng dễ phân biệt so với tín hiệu hu nh quang Như vậy, quy trình real-time PCR HRM xây dựng nghiên cứu có khả phân type xác rs1801133 MgCl2 thành phần có ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy sản phẩm PCR phân tích HRM nên nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng nồng độ MgCl2 phân biệt dạng đường cong nóng chảy tương ứng với genotype T/T, T/C C/C rs1801133 Nếu nồng độ MgCl2 cao làm cho phản ứng PCR dễ tạo thành sản phẩm không đặc hiệu, làm sai lệch kết phân tích HRM sau này, nồng độ qúa thấp gây khó khăn cho Taq polymerase hoạt động làm cho tách biệt ba kiểu gen khơng ổn định mạch DNA Đó lý mà chúng tơi chọn khảo sát để tìm nồng độ MgCl2 thích hợp để phân biệt genotype T/T, T/C C/C rs1801133 r ràng Do PCR master mix chứa s n MgCl2 nên chọn khảo sát nồng độ MgCl2 bổ sung từ mM đến mM với bước tăng 0,5 mM Kết khảo sát cho thấy nồng độ MgCl2 bổ sung PCR master mix mM tối ưu cho việc phân biệt genotype rs1801133 nên chọn nồng độ mM MgCl2 bổ sung thêm vào phản ứng real-time PCR kết hợp HRM phân type rs1801133 cho thí nghiệm Để đánh giá chất lượng quy trình phân type rs1801133 ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR kết hợp HRM, chọn khảo sát tiêu: độ đặc hiệu, độ lặp lại độ tái lập Độ đặc hiệu quy trình tiêu chất lượng đánh giá tính đặc hiệu quy trình SNP mục tiêu Các kết khảo sát cho thấy cặp primer CN5-CN6 nhân chọn lọc DNA người mà không nhân DNA từ vi khuẩn khác có khả xuất thể người Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Klebsiella pnueumoniae, chứng tỏ quy trình phân type rs1801133 real-time PCR kết hợp HRM hồn tồn đặc hiệu cho SNP Bên cạnh đó, độ lặp lại độ tái lập hai tiêu khảo sát cách tiến hành quy trình mẫu thử nghiệm c ng đợt thí nghiệm hay đợt thí nghiệm khác để đánh giá tính biến thiên việc phân biệt genotype quy trình real-time PCR kết hợp HRM Hệ số CV sử dụng để đánh giá tính biến thiên đơn vị tính phần trăm Một 44 quy trình phân tử có độ xác cao có độ lặp lại độ tái lập tốt thể qua hệ số CV có giá trị nhỏ Trong nghiên cứu này, hệ số CV độ lặp lại độ tái lập 0,082% 0,134% Như vậy, kết quy trình phân type rs1801133 ứng dụng real-time PCR kết hợp HRM có tính ổn định cao Cuối c ng, đánh giá hiệu hoạt động thực tế quy trình real- time PCR kết hợp HRM 100 mẫu thử nghiệm Trong tổng số 100 mẫu tiến hành phân tích, số mẫu mang genotype T/T 12, số mẫu mang genotype C/T 15 có 73 mẫu mang genotype C/C Trong nghiên cứu t lệ người mang genotype T/T T/C chiếm 27%, điều phần cho thấy số lượng lớn cá thể quần thể người Việt Nam có nguy m c bệnh nguy hiểm liên quan đến tăng homocysteine người, xuất phát từ ngun nhân phân tử Thơng tin kiểu gen có ảnh hưởng đến khả m c bệnh cần thiết cho quan y tế tầm soát phịng ngừa bệnh có liên quan đến tăng homocysteine cộng đồng 45 CHƢƠNG 4: KẾT LU N – KIẾN NGH 4.1 Kết luận
-Thiết kế cặp primer CN5-CN6 đặc hiệu cho phản ứng Real-time PCR kết hợp HRM cặp primer CN3-CN4 d ng cho giải trình tự nucleotide đoạn gen chứa rs1801133 -Xây dựng tối ưu hóa nồng độ MgCl2 phản ứng real-time PCR HRM nhằm phân biệt dạng genotype khác T/T, T/C, C/C rs1801133
-Thông qua tiêu độ đặt hiệu, độ lặp lại, độ tái lập đánh giá chất lượng quy trình phân type rs1801133
- p dụng quy trình phân type rs1801133 vừa xây dựng 100 mẫu thử nghiệm có so sánh phần với kỹ thuật giải trình tự nucleotide Sanger 4.2 Kiến nghị
-Khảo sát quy trình với số lượng mẫu lớn để tăng độ tin cậy nghiên cứu
-Khảo sát đặc tính khác độ ổn định, so sánh với kit thương mại để tiến hành phát triển thành kit chẩn đoán 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Goyette P, Sumner JS, Milos R, Duncan AM, Rosenblatt DS, Matthews RG, Rozen R (1994) Human methylenetetrahydrofolate reductase: isolation of cDNA, mapping and mutation identification Nature Genetics (2): 195–200 [2] Trimmer EE (2013) "Methylenetetrahydrofolate reductase: biochemical characterization and medical significance" Current Pharmaceutical Design 19 (14): 2574–93 [3] Frosst P, Blom HJ, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, Boers GJ, den Heijer M, Kluijtmans LA, van den Heuvel LP (1995) A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase Nature Genetics 10 (1): 111–3 [4] Yamada K, Chen Z, Rozen R, Matthews RG (2001) "Effects of common polymorphisms on the properties of recombinant human methylenetetrahydrofolate reductase" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (26): 14853–8 [5] Schwahn B, Rozen R (2001) "Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: clinical consequences" American Journal of Pharmacogenomics (3): 189–201 [6 Nguyễn Đức Hoàng, Hoàng Khánh (2016), Tổng quan homocysteine máu, tăng huyết áp tai biến mạch máu não , Đại Học Y Khoa Huế, Sở Y Tế Thừa Thiên Huế [7] Nguyễn Nghiêm Luật (2015), Homocysteine: dấu ấn sinh học tim bệnh mạch, đột qu , homocysteine niệu bẩm sinh thiếu hụt vitamin B6, B12 folate , Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC [8] Baszczuk A, Kopczyński Z (2014) Hyperhomocysteinemia cardiovascular disease Postepy Hig Med Dosw 68:579-589 in patients with [9] Shenov V, Mehendale V, Prabhu K, Shetty R, Rao P Correlation of serum homocysteine levels with the severity of coronary artery disease (2014) Ind J Clin Biochem 29(3): 339-344 [10] Okura T, Miyoshi K, Irita J, et al (2014) Hyperhomocysteinemia is one of the risk factors associated with cerebrovascular stiffness in hypertensive patients, especially elderly males Nature.com Sci Rep 4: 5663 doi: 10.1038/srep05663 [11] Curro M, Gugliandolo A, Gangemi C, et al (2014) Toxic effects of mildly elevated homocysteine concentrations in neuronal-like cells Neurochem Res 39: 1485-1495 [12] Rai V (2016) Methylenetetrahydrofolate Reductase C677T Polymorphism and Recurrent Pregnancy Loss Risk in Asian Population: A Meta-analysis Indian J Clin Biochem 31(4): 402-413 [13] Ganguly, P., & Alam, S F (2015) Role of homocysteine in the development of cardiovascular disease Nutrition Journal 14 doi: 10.1186/1475-2891-14-6 [14] Single nucleotide polymorphism (SNP) (2015), Scitable by nature education, Definition [15] U.S National Library of Medicine (2017) What are single nucleotide polymorphisms (SNPs) Genetic home reference
[16] Stenson PD, Mort M, Ball EV, Howells K, Phillips AD, Thomas NS, Cooper DN (2009) The Human Gene Mutation Database: 2008 update Genome Med 1(1): 13 doi: 10.1186/gm13 [17] Brustolin S, Giugliani R, Félix TM, (2010) Genetics of homocysteine metabolism and associated disorders Brazilian Journal of Medical and Biological Research 43(1): 1-7 47 [18] Rashed L, Abdel Hay R, AlKaffas M, Ali S, Kadry D, Abdallah S (2017) Studying the association between methylene tetrahdrofolate reductase (MTHFR) 677 gene polymorphismcardiovascular risk and lichen planus J Oral Pathol Med DOI: 10.1111/jop.12588 [19] Roussotte FF, Hua X, Narr KL, Small GW, Thompson PM (2017) The C677T variant in MTHFR modulates associations between brain integrity, mood, and cognitive functioning in old age Biol Psychiatry Cogn Neurosci Neuroimaging (3): 280-288 [20] Safarinejad MR, Shafiei N, Safarinejad S (2011) Relationship between genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase (C677T, A1298C, and G1793A) as risk factors for idiopathic male infertility Reprod Sci 18 (3): 304-15 [21] Zara-Lopes T, Gimenez-Martins AP, Nascimento-Filho CH, Castanhole-Nunes MM, Galbiatti-Dias AL, Padovani-Júnior JA, Maniglia JV, Francisco JL, Pavarino EC, GoloniBertollo EM (2016) Role of MTHFR C677T and MTR A2756G polymorphisms in thyroid and breast cancer development Genet Mol Res.15(2) doi: 10.4238/gmr.15028222 48 49 PHỤ LỤC Kết phân type real-time PCR HRM 100 mẫu thử nghiệm STT Mẫu Genotype 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 1A 2A 3A 4A 5A 6A 7A 8A 9A 10A 11A 12A 13A 14A 15A 16A 17A 18A 19A 20A 21A 22A 23A 24A 25A CC CC CC CC CT CC CC CC CC CC CC CC CC TT TT CC TT CT CC CC CC CT CC CC CC 26 26A CC 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 27A 28A 29A 30A 31A 32A 33A 34A 36A 37A 38A 39A 40A 42A 43A 44A CT CT CC CC CC CT CT CC CC CT CC CC CC CC CC CT i 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 45A 46A 47A 49A 50A 51A 52A 53A 54A 55A 56A 57A 58A 59A 61A 62A 63A 64A 65A 66A 68A 69A 70A 71A 73A 74A 75A 76A 78A 80A 81A 82A 83A 84A 85A 86A 87A 88A 90A 91A 92A 93A 94A 95A 96A 97A CC CT TT CT CT CT CC CC CC CC CC CT CC CC CT CC CT CC CT CT TT CT CC CC CT CC CC CC TT CC CT CT CC CC TT CC CC CT CT CC CC CC CC CC CC CC ii 89 98A CC 90 99A CT 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 100A 101A 102A 103A 104A 105A 113A 114A 115A 116A CT CC CC CC CT CT CC CT CT CC Kết giải trình tự nucleotide 10 mẫu thử nghiệm Mẫu 47A (genotype T/T) Mẫu 78A (genotype T/T) Mẫu 40A (genotype C/C) iii Mẫu 113A (genotype C/C) Mẫu 105A (genotype C/T) Mẫu 114A (genotype C/T) iv Mẫu 116A (genotype C/C) Mẫu 103A (genotype C/C) v Mẫu 1A (genotype C/C) Mẫu 10A (genotype C/C) vi
Ngày đăng: 05/10/2023, 20:31
Xem thêm:
