Thử nghiệm hiệu quả bảo vệ của chủng aeromonas hydrophila knock out gen aroa phòng bệnh xuất huyết trên cá tra ở ao nuôi

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ THỬ NGHIỆM HIỆU QUẢ BẢO VỆ CỦA CHỦNG Aeromonas hydrophila KNOCK-OUT GEN aroA PHÕNG BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA Ở AO NUÔI Mã số: TS02/16-17 Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Phịng CNSH Thủy sản Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Vũ Thị Thanh Hƣơng Cán tham gia: ThS Trƣơng Ngọc Thùy Liên KS Trần Văn Hƣơng ThS Lê Thị Thu Thảo TS Nguyễn Quốc Bình Hình thức thực hiện: • Nghiên cứu bản; Nghiên cứu ứng dụng; • Dự án sản xuất thử nghiệm; • Nghiệp vụ thƣờng xuyên TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2019 MỤC LỤC PHẦN I THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC .4 I ĐẶT VẤN ĐỀ .4 II TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 Các dòng Aeromonas hydrophila gây bệnh ngành nuôi trồng thủy sản giới Việt Nam II.1.1 Aeromonas hydrophila II.1.2 Bệnh xuất huyết .5 II.1.3 Các dòng Aeromonas hydrophila gây bệnh cá .6 II.1.4 Khả xâm nhiễm A hydrophila tiềm vắc-xin A hydrophila sống nhƣợc độc dạng ngâm II.2 Các nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh xuất huyết A hydrophila II.2.1 Các nghiên cứu giới II.2.2 Các nghiên cứu nƣớc 12 III.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .13 III.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .15 III.2.1 Phân tích genome nhóm A hydrophila gây bệnh cá tra Việt Nam 15 III.2.2 Thử nghiệm hiệu bảo vệ vắc-xin từ hai nhóm A hydrophila cá tra giống quy mơ phịng thí nghiệm .16 III.2.3 Thử nghiệm hiệu bảo vệ vắc-xin cá bột, cá hƣơng, cá giống 16 III.2.4 Loại bỏ gen kháng kháng sinh Kanamycin khỏi chủng nhƣợc độc làm vắcxin .18 III.2.5 Đánh giá hiệu bảo vệ A hydrophila đột biến nhƣợc độc (M14) cá tra giống phƣơng pháp cho ăn 22 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 VI.1 Phân tích O-antigen A hydrophila gây bệnh cá tra Việt Nam .23 IV.2 Thử nghiệm hiệu bảo vệ vắc-xin từ nhóm A hydrophila cá tra giống quy mơ phịng thí nghiệm 29 IV.3 Thử nghiệm hiệu bảo vệ vắc-xin cá bột, cá hƣơng, cá giống .32 IV.4 Loại bỏ gen kháng kháng sinh Kanamycin khỏi chủng nhƣợc độc làm vắc-xin 35 IV.5 Đánh giá hiệu bảo vệ A hydrophila đột biến nhƣợc độc (M14) cá tra giống phƣơng pháp cho ăn 37 IV.5.1 Khảo sát liều LD50 chủng A hydrophila hoang dại nhóm II (AGII15-2) cá tra giống 37 IV.5.2 Đánh giá hiệu bảo vệ chủng A hydrophila đột biến nhƣợc độc M14 cá tra giống .38 V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .40 V.1 KẾT LUẬN 40 V.2 ĐỀ NGHỊ .41 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 42 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 49 DANH SÁCH BẢNG Bảng Danh sách dịng A hydrophila đƣợc giải trình tự toàn bộ gen Bảng Các chủng plasmid sử dụng nghiên cứu 13 Bảng Các mồi sử dụng nghiên cứu 14 Bảng Các nghiệm thức xử lý vắc-xin giai đoạn cá giống nghiệm thức công độc 16 Bảng Các nghiệm thức ngâm vắc-xin lần giai đoạn cá bột công độc giai đoạn cá hƣơng 17 Bảng Các nghiệm thức ngâm vắc-xin lần giai đoạn cá giống .17 Bảng Các nghiệm thức công độc giai đoạn cá giống 18 Bảng Các nghiệm thức khảo sát hiệu bảo vệ chủng A hydrophila đột biến M14 cá tra giống 22 Bảng Kết khảo sát liều LD50 cá giống 29 Bảng 10 Hiệu bảo vệ vắc-xin đơn, vắc-xin kép giai đoạn cá giống 31 Bảng 11 Kết khảo sát liều LD50trên cá 45 ngày tuổi 32 Bảng 12 Hiệu bảo vệ vắc-xin đơn, văc-xin kép cá hƣơng .33 Bảng 13 Kết khảo sát liều LD50 cá 2-2,5 tháng tuổi .34 Bảng 14 Hiệu bảo vệ vắc-xin kết hợp (M14 +M25) giai đoạn cá tra 35 Bảng 15 Kiểm tra kết sau tiếp hợp 36 Bảng 16 Kiểm tra kết sau điện biến nạp 37 Bảng 17 Kết khảo sát liều LD50 chủng A hydrophila cá tra giống 38 Bảng 18 Hiệu bảo vệ vắc-xin M14 phƣơng pháp cho ăn .39 DANH SÁCH BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH Biểu đồ Tỉ lệ sống cá tra giống ngâm vắc-xin đơn, vắc-xin kép giai đoạn cá giống công độc với chủng A hydrophila hoang dại .31 Biểu đồ Tỉ lệ cá sống (%) cá hƣơng ngâm vắc-xin đơn, văc-xin kép giai đoạn cá bột 33 Biểu đồ Tỉ lệ sống cá tra giống ngâm vắc-xin kết hợp (M14 +M25) giai đoạn cá tra 34 Hình Cây phân loại dòng A hydrophila dựa so sánh gen (nguồn: NCBI) Hình Vùng gen aroA chủng A hydrophila hoang dại chủng đột biến 19 Hình Hình minh họa trình loại bỏ gen KmR nhờ vào hoạt động enzyme Flippase trình tự FRT 19 Hình Plasmid pCMT flp .20 Hình Cây phát sinh loài dựa khác biệt vùng gen mã hóa cho tyrosin-protein kinase chủng A.hydrophila .24 Hình Cây phát sinh lồi dựa khác biệt vùng gen mã hóa cho O-antigen chain length determinant protein chủng A.hydrophila 25 Hình Sự khác đoạn trình tự vùng O-antigen biosynthesis gene cluster 23 chủng A hydrophila đƣợc giải trình tự gen NCBI 26 Hình Cây phát sinh loài dựa khác biệt vùng gen O-antigen biosynthesis gene cluster chủng A.hydrophila 27 Hình Cây phát sinh loài A hydrophila dựa so sánh gen (nguồn: NCBI) 28 Hình 10 Cá tra bị xuất huyết sau cảm nhiễm với A hydrophila (nguồn: Trung tâm CNSH TP.HCM) .30 Hình 11 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lạc Aeromonas hydrophila M25 (giếng 2-11) với cặp mồi AerF/R, sản phẩm 191bp E coli SM10pir::pCMT(giếng 12) với cặp mồi pCMT F/R, sản phẩm 2158bp .36 Hình 12 Kết điện di gel agarose 1,2% sản phẩm PCR khuẩn lạc phân lập từ cá chết sau cảm nhiễm ngƣợc với cặp mồi AerF/R, sản phẩm 191bp 38 Hình 13 Tỉ lệ cá chết sau 14 ngày công độc với chủng A hydrophila AGII .39 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐBSCL STD RPS M14 M25 CFU A.hydrophila E Coli LD50 LB ĐC NT QCVN BNN NCBI Đồng Bằng Sông Cửu Long Standard Deviation (độ lệch chuẩn) Relative percent survival (phần trăm sống sót) Aeromonas hydrophila đột biến gen aroA nhƣợc độc M25 Aeromonas hydrophila đột biến gen aroA nhƣợc độc M25 Cloning forming unit (khuẩn lạc) Aeromonas hydrophila Escherichia coli Lethal dose 50% (liều gây chết 50%) Luria Bertani Đối chứng Nghiệm thức Quy chuẩn Việt Nam Bộ Nông nghiệp National center for biotechnology information TÓM TẮT Với mục tiêu thử nghiệm hiệu bảo vệ chủng Aeromonas hydrophila knock –out gen aroA phịng bệnh xuất huyết cá tra ao ni, đề tài bƣớc đầu xác định đƣợc hai nhóm A hydrophila hoang dại độc lực cao, gây bệnh cá tra Vắcxin kết hợp chủng M14 chủng M25 đƣợc tạo từ hai nhóm thể đƣợc khả bảo hộ cá bột phƣơng pháp ngâm, với hiệu bảo vệ (RPS) 56% Điều chứng tỏ loại vắc-xin kép có khả bảo vệ cá trƣớc xâm nhiễm A hydrophila sử dụng giai đoạn cá bột Khi cá đƣợc ngâm với vắc-xin kết hợp M14 M25 lần giai đoạn cá bột lần giai đoạn cá giống hiệu bảo vệ thu đƣợc 72%; đó, ngâm lần vắc-xin giai đoạn cá giống RPS đạt đƣợc 60% Ngoài ra, xử lý vắc-xin lần cho cá giống phƣơng pháp cho ăn với vắc-xin M14 hiệu bảo vệ 64% Các kết cho thấy vắc-xin kết hợp M14 M25 có khả phịng bệnh xuất huyết cá tra cá cần đƣợc ngâm vắc-xin lần giai đoạn bột giai đoạn giống Tiềm sử dụng vắc-xin kết hợp M14 M25 phòng bệnh xuất huyết cho cá tra phƣơng pháp ngâm giai đoạn cá bột cho ăn giai đoạn cá giống cao Đây nghiên cứu hồn tồn Việt Nam, có tính ứng dụng thực tiễn cao Tuy nhiên, để sử dụng rộng rãi vắc-xin ao nuôi cá, việc loại gen kháng kanamycin khỏi chủng đột biến nhƣợc độc cần đƣợc nghiên cứu thêm PHẦN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Thử nghiệm hiệu bảo vệ chủng Aeromonas hydrophila knock-out gen aroA phòng bệnh xuất huyết cá tra ao nuôi (Mã số: TS02/16-17) Đơn vị chủ trì: Phịng Cơng nghệ sinh học Thủy sản- Trung tâm Công nghệ sinh học TP HCM Đơn vị phối hợp chính: Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Vũ Thị Thanh Hƣơng Cán tham gia thực hiện: Cán tham gia thực Chức danh ThS Trƣơng Ngọc Thùy Liên Thành viên KS Trần Văn Hƣơng Thành viên ThS Lê Thị Thu Thảo Thành viên TS Nguyễn Quốc Bình Cố vấn khoa học Thời gian thực hiện: 36 tháng (Từ 01/2016 đến 12/2018), bao gồm thời gian gia hạn 12 tháng Kinh phí - Tổng dự tốn: 650.000.000 VNĐ - Kinh phí sử dụng: 626.740.058 VNĐ Mục tiêu nhiệm vụ: Thử nghiệm hiệu bảo vệ chủng Aeromonas hydrophila knock-out gen aroA phòng bệnh xuất huyết cá tra Các nội dung công việc thực đƣợc so với đăng ký Thời gian STT Nội dung đăng ký (bắt đầu – Kết thực Đánh giá kết thúc) Phân tích trình tự vùng O- 1/2016 Kết giải trình tự gen Đạt antigen nhóm A – dịng A hydrophila gây hydrophila gây bệnh cá 5/2016 bệnh (n= chủng) tra Việt Nam cá tra Việt Nam Thử nghiệm hiệu bảo 5/2016 vắc-xin M14+M25có hiệu Đạt vệ vắc-xin từ nhóm A – bảo vệ, RPS đạt 60% hydrophila cá tra giống 8/2016 cơng độc với nhóm A quy mơ phịng thí nghiệm hydrophila hoang dại Thử nghiệm hiệu bảo 8/2016 vắc-xin M14+M25có hiệu Đạt vệ vắc-xin cá bột, – bảo vệ, RPS đạt 72%, cá hƣơng, cá giống 12/2016 ngâm lần giai đoạn cá bột lần giai đoạn cá giống Loại bỏ gen kháng kháng 1/2017 Chƣa thu đƣợc chủng vi Đã thực sinh Kanamycin khỏi chủng khuẩn A hydrophila đột biến nhƣng nhƣợc độc làm vắc-xin 12/2018 không mang gen kháng kháng chƣa thành sinh công Đánh giá hiệu bảo vệ 1/2017 Vắc-xin có hiệu bảo vệ Đạt A hydrophila đột biến với RPS đạt 64% nhƣợc độc (M14) cá tra 12/2018 giống phƣơng pháp cho ăn PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ Cá tra mặt hàng xuất chủ lực ngành thủy sản Việt Nam Theo báo cáo VASEP, kim ngạch xuất cá tra năm 2018 đạt 2,26 tỷ USD, tăng 20% so với kỳ năm 2017 Đây lần vòng 20 năm qua xuất cá tra nƣớc ta đạt đƣợc số kỷ lục nhƣ Các chuyên gia dự báo, mức tăng trƣởng ngành cá tra Việt Nam chƣa dừng lại chất lƣợng giá trị mặt hàng ngày đƣợc nâng cao Với quy mơ trên, ƣớc tính năm nƣớc ta sản xuất tỷ cá tra thƣơng phẩm Đƣợc biết, tình hình dịch bệnh cá tra năm gần xuất ngày dày đặc ngƣời nơng dân phụ thuộc hồn tồn vào kháng sinh để trị bệnh cho cá Các bệnh ln ln xuất q trình ƣơng – ni cá tra, phổ biến gan thận mủ xuất huyết, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngƣời nuôi cá Mặc dù, sản phẩm vắc-xin phòng bệnh xuất huyết cho cá tra có vắc-xin ALPHA JECT ® Panga PHARMAQ đƣợc cấp giấy phép lƣu hành từ Cục Thú Y vào ngày tháng 12 năm 2016, nhiên ALPHA JECT® Panga loại vắc-xin chết, dùng dạng tiêm hiệu vắc-xin chƣa đƣợc trại nuôi cá tra ứng dụng Nhận thấy tầm quan trọng việc cung cấp sản phẩm vắc-xin cho cá tra để phòng bệnh xuất huyết, năm 2012-2014, Trung tâm Công nghệ sinh học TP HCM thực đề tài “Tạo chủng Aeromonas hydrophila đột biến thử nghiệm đánh giá khả đáp ứng miễn dịch cá tra giống” Đề tài tạo đƣợc chủng A hydrophila đột biến phƣơng pháp knockout gen aroA Chủng đột biến gen aroA nhƣợc độc so với chủng hoang dại, không gây chết cá mật độ tiêm 10 CFU/cá, chủng hoang dại gây chết 100% cá tiêm mật độ có LD 50 mật độ 101 CFU/ml Hiệu bảo vệ chủng đột biến đƣợc thử nghiệm cá tra giống quy mơ phịng thí nghiệm với phƣơng pháp tiêm ngâm, với RPS 95% công độc với chủng hoang dại phƣơng pháp Bên cạnh đó, với mục tiêu tạo vắc-xin ngừa bệnh xuất huyết cho cá tra dạng ngâm, đề tài “Nghiên cứu khả đƣờng lây nhiễm A hydrophila gây bệnh xuất huyết cá tra” đƣợc thực từ năm 2014- 2015 Trái với quan điểm trƣớc nhà khoa học cho A hydrophila vi khuẩn gây bệnh hội, kết đề tài cho thấy chủng A hydrophila hoang dại phân lập từ mẫu cá bệnh có khả gây chết cá gây cảm nhiễm phƣơng pháp ngâm với LD50 dao động khoảng 105 CFU/mL Điều cho phép kết luận A hydrophila hoàn tồn có khả xâm nhiễm gây bệnh cho cá nhƣ tác nhân sơ cấp mà không cần tác nhân khác hỗ trợ Từ nhu cầu cấp thiết thị trƣờng nhƣ dựa kết khả quan từ nghiên cứu trƣớc, cần có thêm nghiên cứu để xây dựng quy trình ứng dụng vắc-xin ao nuôi, tạo tiền đề cho nghiên cứu sản xuất vắc-xin tƣơng lai Vì vậy, thực đề tài “Thử nghiệm hiệu bảo vệ chủng Aeromonas hydrophila knock-out gen aroA phòng bệnh xuất huyết cá tra ao nuôi” Đề tài nghiên cứu tiếp nối nghiên cứu thực với mục tiêu tạo đƣợc vắc-xin sống nhƣợc độc phòng bệnh xuất huyết cho cá tra Sự thành công đề tài mang lại sản phẩm vắc-xin nhƣợc độc ngừa bệnh xuất huyết cho cá tra Việt Nam Vắc-xin sống nhƣợc độc vắc-xin phù hợp để ứng dụng cho nuôi trồng thủy sản phù hợp với xu hƣớng giới II TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 Các dịng Aeromonas hydrophila gây bệnh ngành ni trồng thủy sản giới Việt Nam II.1.1 Aeromonas hydrophila Aeromonas hydrophila trực khuẩn có kích thƣớc khoảng 0,8-1,0 1,0-3,5 M, có khả di động nhờ tiên mao mọc cực bơi dung dịch chu mao mọc khắp thể di chuyển bề mặt (Austin and Austin, 2007; Altarriba, Merino and Gav n, 2003) Chủng vi khuẩn đƣợc phân lập môi trƣờng không chọn lọc nhƣ môi trƣờng dinh dƣ ng Nutrient agar (NA) Tryptone soya agar (TSA), hay môi trƣờng chọn lọc nhƣ Rimler-Shott peptone beefextract glycogen (PBG) agar ủ 20-30oC 18-36 Khuẩn lạc A hydrophila thƣờng có hình trịn, màu vàng kem đến vàng sáng, lồi, có kích thƣớc 2-3 mm mơi trƣờng TSA (Hydrophila, 1985) A hydrophila không gây bệnh cá mà cịn gây bệnh ngƣời vật ni nhƣ cừu, chó, m o,đặc biệt vật chủ bị stress (Burke, Cooper and Robinson, 1984; (Huizinga, Esch and Hazen, 1979) (Janda and Duffey, 1988) Vấn đề đƣợc đề cập nghiên cứu Guimarães cộng (2002) xâm nhiễm qua đƣờng ruột ruột A hydrophila bao gồm tƣợng tiêu chảy ngƣời động vật khác (Guimarães, 2002) A hydrophila đƣợc tìm thấy nhiều loại thực phẩm sản sinh nhiều loại chất độc nhƣ haemolysin, enterotoxin cytotoxin (Callister Agger, 1987; Yucel et al , 2005; Daskalov, 2006) II.1.2 Bệnh xuất huyết Bệnh gây A hydrophila đƣợc gọi nhiễm trùng huyết Aeromonas (MAS: motile aeromonad septicaemia) Tác nhân gây bệnh kết hợp với số bệnh khác cá ví dụ nhƣ hội chứng loét EUS (epizootic ulcerative syndrome) động vật nhƣ tác nhân thứ cấp (Inglis, Roberts and Bromage, 1993), (Pathiratne, 1994) Các dấu hiệu lâm sàng cá đa dạng từ sƣng tấy mô, hoại tử, lở loét nhiễm trùng xuất huyết (HAZEN and RAKER, 1978; Angka, 1990) Thông thƣờng A hydrophila trở thành tác nhân gây bệnh quan trọng điều kiện nuôi cá thâm canh gia tăng stress (Sautour et al., 2003) Dƣới điều kiện môi trƣờng thuận lợi, tác nhân gây bệnh nhân lên sản xuất chất độc ECP (extra cellular products) mức cao, gây bùng phát bệnh bất ngờ tử vong cá (Vivas and Carracedo, 2004; Allan and Stevenson, 1981) Bảng Xử lý thống kê số liệu cá hƣơng chết ngâm vắc-xin giai đoạn cá bột Tỉ lệ chết Duncan Nghiệm thức Subset for alpha = 0.05 Số lần lặp lại 3 14.33 19.00 19.00 00 3 3 3 43.00 43.00 3 46.33 48.00 Sig 29.00 40.00 1.000 367 063 170 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 60 3.5 Số liệu cá chết thí nghiệm cơng độc cá giống xử lý vắc-xin M14+M25 giai đoạn cá bột cá giống NT xử lý vắc- NT xử lý vắcxin lần gđ xin lần gđ NT công độc cá bột cá giống STT STT STT 1 M14+M2 2 không ngâm vắc xin M14+M2 không ngâm vắc xin không ngâm vắc xin AGI15-1.1 AGII15-2 AGI15-1.1 AGII15-2 AGI15-1.1 AGII15-2 Không độc Lần lặp + + + công Ngày theo dõi 10 11 12 13 14 tổng cá % ca TB % chết chet cá chết 1 0 0 0 0 0 10% 2 1 0 0 0 0 17% 0 0 0 0 20% 0 0 0 0 0 0 17% 0 0 0 0 0 0 17% 0 0 0 0 10 33% 0 2 0 0 0 0 11 37% 0 0 0 0 19 63% 0 0 0 0 20 67% 0 0 0 0 0 0 0 0% 0 0 0 0 0 0 0 0% 0 0 0 0 0 0 0 0% 61 STD 16% 5% 22% 10% 56% 16% 0% 0% Bảng Xử lý thống kê số liệu cá chết ngâm vắc-xin M14+M25 giai đoạn cá bột cá giống Tỉ lệ chết Duncan Subset for alpha = 0.05 NT N 00 3 15.67 Sig 3 15.67 22.33 084 425 55.67 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 3.6 Số liệu cá chết thí nghiệm cơng độc cá xử lý vắc-xin M14 giai đoạn cá giống phƣơng pháp cho ăn Ngày Stt Nghiệm thức STT 62 10 11 12 13 14 tống cá chết % cá chết % cá chết TB Standard Deviation Cho ăn 1010 CFU/g Cho ăn 109 CFU/g Cho ăn 108CFU/g Cho ăn 107CFU/g 0 0 0 0 0 0 0 0 5% 0 0 0 0 5% 0 0 0 0 0 5% 0 0 0 0 0 0 5% 0 0 0 0 0 10% 0 0 0 0 0 0 5% 0 0 0 0 0 0 0 0% 0 0 0 0 0 0 5% 0 0 0 0 0 0 0 0% 1 0 0 0 0 0 10% 0 1 0 0 0 25% 0 0 0 0 0 0 10% 63 5% 0% 7% 3% 2% 3% 15% 9% Ngâm 10 CFU/mL ĐC (+) ĐC (-) 1 1 0 0 0 0 15% 0 0 0 0 0 0 5% 0 0 0 0 0 10% 1 0 0 0 0 15% 2 0 0 0 0 11 55% 0 0 2 0 11 55% 0 0 0 0 0 0 0 0% 0 0 0 0 0 0 0 0% 0 0 0 0 0 0 0 0% 64 10% 5% 42% 23% 0% 0% Bảng Xử lý thống kê số liệu cá chết ngâm văcxin M14 phƣơng pháp cho ăn Tỉ lệ chết Duncan Số lần Nghiệm thức lặp lại Subset for alpha = 0.05 00 3 1.67 5.00 3 6.67 10.00 3 15.00 41.67 Sig .109 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 65 1.000 4.Kết so sánh trình tự đoạn O-antigen chủng độc lực cao công cụ Blast- NCBI 4.1 Kết so sánh trình tự chủng AG 1.4 với liệu genbank công cụ blast 66 4.2 Kết so sánh trình tự chủng BT 2.1 với liệu genbank công cụ blast 67 4.3 Kết so sánh trình tự chủng TG 2.2.1 với liệu genbank công cụ blast 68 4.4 Kết so sánh trình tự chủng AG 140714 với liệu genbank công cụ blast 69 4.5 Kết so sánh trình tự chủng CT 1.2.1 với liệu genbank công cụ blast 70 4.6 Kết so sánh trình tự chủng DT 1.1 với liệu genbank công cụ blast 71 4.7 Kết so sánh trình tự chủng AG1 với liệu genbank công cụ blast 72 4.8 Kết so sánh trình tự chủng AG 1.4, BT 2.1, TG 2.2.1, AG 140714 cơng cụ blast 73 4.9 Kết so sánh trình tự chủng DT 1.1, CT 1.2.1 công cụ blast 74