Sử dụng tinh đã phân tách sorted semen để tạo phôi bò in vitro xác định trước giới tính

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP MIỀN NAM BÁO CÁO NGHIỆM THU SỬ DỤNG TINH ĐÃ PHÂN TÁCH (SORTED SEMEN) ĐỂ TẠO PHƠI BÕ IN VITRO XÁC ĐỊNH TRƢỚC GIỚI TÍNH CHUNG ANH DŨNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 11/ 2015 (Theo mẫu Sở Khoa học Công nghệ TPHCM) (Trang 2: mẫu áp dụng sau chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) SỬ DỤNG TINH ĐÃ PHÂN TÁCH (SORTED SEMEN) ĐỂ TẠO PHÔI BÕ IN VITRO XÁC ĐỊNH TRƢỚC GIỚI TÍNH CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2015 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Đề tài nghiên cứu nhằm thử nghiệm số phương pháp kỹ thuật hút trứng buồng trứng bò sống (OPU), phân tách tinh trùng để tạo phơi bị invitro xác định trước giới tính thử nghiệm tạo phơi bị, bê giống hướng sữa có tiềm sản xuất cao để cung cấp thêm kỹ thuật sản xuất giống bị, góp phần xây dựng đàn bò giống trung tâm sản xuất giống bò sữa TPHCM Đề tài thực năm đạt số kết sau: (1) Đã thử nghiệm hồn thành quy trình kỹ thuật hút trứng buồng trứng bò sống (OPU) cung cấp nguồn trứng cho thụ tinh in vitro Trong điều kiện tay nghề chưa cao đối tượng bò chưa phù hợp, nên thực OPU với tần suất lần/2 tuần, kết hợp với sử dụng kích dục tố HTNC hay FSH để nâng cao hiệu thực OPU Nhìn chung hiệu suất thực OPU đạt khoảng 50% với số trứng hút trung bình buồng trứng 1,63 (2) Đã thử nghiệm thiết lập thông số quy trình phân tách tinh trùng X từ tinh trùng bị đơng lạnh Chế độ phân tách với thông số: điện 14.53 V, tần số hạt 31,20 kHz, áp suất dòng chảy 15,0 psi phương pháp phân tách: sử dụng phương pháp tách giọt đơn với tín hiệu dương tính nhằm làm giàu số tế bào (1.0 Drop Enrich) phương pháp tách tế bào dương tính (1.0 Drop Yield) cho hiệu tốt với hiệu phân tách 72,34-77,16% độ khiết từ 77,74-81,44% Tuy nhiên, chất lượng tinh trùng thấp tiêu phần trăm tế bào sống (35,65-44,96%), tỷ lệ di động (18,98-28,26%) tỷ lệ kỳ hình tinh trùng lại cao (77,8378,16%) (3) Đã tạo phôi in vitro từ nguồn trứng OPU tinh phân tách ngoại nhập Mặc dù, số lượng trứng thu buồng trứng kỹ thuật OPU thấp so với buồng trứng lấy từ lò mổ (1,63 so với 9,76), chất lượng tốt nên tỷ lệ thụ tinh tạo phôi dâu, phôi nang cao (56,19% 33,90% so với 25,22% 8,29%) Do chất lượng tinh phân tách đề tài thấp nên chưa tạo phôi in vitro (4) Đã thử nghiệm 27 lượt cấy truyền phôi in vitro (trứng OPU tinh phân tách ngoại nhập) bò rạ, kết có bê cái, tỷ lệ thụ thai cịn thấp, đạt 7,5% (5) Đã xây dựng quy trình OPU phân tách tinh bị đơng lạnh FACS SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Currently, the main constraint of dairy cattle in surrounding areas of Ho Chi Minh City is low reproduction Therefore, application of assisted reproductive technologies (ART) is necessary to improve reproduction of dairy cattle and rapidly increase lactating herd The study has been conducted in order to try some new ART techniques such as ovum pick-up by ultrasound system, separating Xsperm by Fluorescent-Activated Cell Sorting, in vitro bovine embryo production from different sources of gamete and female dairy calf production from these embryos through embryo transfer The results showed that OPU could be conducted once two weeks by using hormone therapies with FSH or PMSG However, the efficiency was still low, only 1.63 oocytes/ovary/OPU Spermsexing by FACS was rather high efficiency (72.34-77.16%) and purity (77.7481.44%), but still low sperm vitality (35.65%-44.96%) and high percentage of abnormality (77.83-78.16%) Although quantity of oocytes were retrieved from an ovary by OPU lower than slaughter-house (1.63 vs 9.76), but efficiency of OPU oocyte was higher than slaughter-house oocyte when using in in vitro embryo production (56.19%-33.90% vs 25.22%-8.29%, IVF ratio and blastocyst ratio respectively) Unfortunately, in vitro embryo production from OPU oocyte and sorted-semen (results of this study) was unsuccessful becaused of low quality of sorted-semen There were two female calves from 27 embryo transfers, it showed that successful ratio still be low, only 7.5% OPU process and sperm-sexing by FACS process have been established and should be studied more OPU and spermsexing technique should be transferred to technicians and inseminator in big dairy farms and they should be practiced frequently for high achievement MỤC LỤC Trang Tóm tắt đề tài/dự án (gồm tiếng Việt tiếng Anh) Mục lục I II Danh sách chữ viết tắt III Danh sách bảng IV Danh sách hình V PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài/dự án: Chủ nhiệm đề tài/dự án: Cơ quan chủ trì: Thời gian thực hiện: Kinh phí duyệt: Kinh phí cấp: theo TB số: TB-SKHCN ngày / Mục tiêu Nội dung ……………………………………………… Sản phẩm đề tài/dự án …………………………………… CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kỹ thuật cấy truyền phơi tạo phơi bị in vitro 1.2 Tinh phân tách hay tinh giới tính (Sorted semen hay Sexed semen) 1.2.1 Nhu cầu sử dụng tinh phân tách để sản xuất bê hướng sữa 1.2.2 Các phương pháp phân tách tinh trùng mang nhiễm sắc thể X Y 1.2.3 Các nghiên cứu sử dụng tinh bò phân tách để tạo phôi in vitro 1.3 Kỹ thuật chọc hút trứng buồng trứng (OPU) bò sống 10 12 1.3.1 Mục đích nghiên cứu, sử dụng kỹ thuật OPU 12 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật OPU 12 1.3.3 Ứng dụng kỹ thuật OPU vào sản xuất phơi in vitro cấy truyền phơi bị 14 1.3.4 Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật OPU 15 2.1 CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NC 19 Nội dung Thử nghiệm số kỹ thuật để tạo trứng tinh phân tách phục vụ cho việc tạo phơi bị in vitro xác định trước giới tính 19 2.1.1 Thử nghiệm kỹ thuật OPU (Ovum pick-up): để sản xuất trứng bị có chất lượng cao, từ bò cao sản nước, tạo nguồn nguyên liệu ổn định chất lượng cho kỹ thuật sản xuất phơi bị in vitro 19 2.1.2 Thử nghiệm kỹ thuật phân tách tế bào: phƣơng pháp FACS (Fluorescent-Activated Cell Sorting) sản xuất tinh dịch chứa tinh trùng mang NST X 25 2.2 Nội dung Thử nghiệm tạo phơi bị invitro xác định trƣớc giới tính từ nguồn nguyên liệu khác 34 2.2.1 Thí nghiệm 2.1: Thử nghiệm tạo phơi bị in vitro xác định trước giới tính từ trứng bị cao sản nước lấy từ kỹ thuật OPU tinh bị đơng lạnh phân tách (chỉ chứa tinh trùng mang NST X) bò đực giống cao sản ngoại nhập 34 2.2.2 Thí nghiệm 2.2: Thử nghiệm tạo phơi bị in vitro xác định trước giới tính từ trứng bị cao sản nước lấy từ kỹ thuật OPU tinh bò (bình thường) ngoại nhập phân tách (chỉ có tinh trùng mang NST X) nước 37 Nội dung Thử nghiệm tạo bê có chất lƣợng cao từ việc sử dụng phơi bị invitro xác định trước giới tính nêu trên, thơng qua kỹ thuật cấy truyền phôi 37 CHƢƠNG III KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 39 Nội dung Thử nghiệm số kỹ thuật để tạo trứng tinh phân tách phục vụ cho việc tạo phơi bị in vitro xác định trước giới tính 39 3.1.1 Thử nghiệm kỹ thuật OPU (Ovum pick-up): để sản xuất trứng bị có chất lượng cao, từ bò cao sản nước, tạo nguồn nguyên liệu ổn định chất lượng cho kỹ thuật sản xuất phơi bị in vitro a) Kết thử nghiệm OPU với tần suất thực 39 b) Kết thử nghiệm OPU kết hợp với xử lý trước 41 2.3 3.1 39 hormone 3.1.2 Thử nghiệm kỹ thuật phân tách tế bào phƣơng pháp FACS (Fluorescent-Activated Cell Sorting) sản xuất tinh dịch chứa tinh trùng mang NST X 43 a) Phân tích khác biệt lượng DNA tinh trùng X Y phát 43 FACS trình gating để phân tách b) So sánh hiệu tách chế độ tách khác hạt chuẩn 45 phương pháp 1.0 Drop Pure c) So sánh hiệu tách phương pháp tách tinh trùng khác 46 chế độ Parameter d) So sánh chất lượng tinh trùng sau phân tách so với trước 48 phân tách e) Đánh giá tính khiết tinh dịch sau phân tách 3.1.3 Đánh giá chất lượng tinh trùng bình thường tinh trùng phân 49 51 tách tinh bị đơng lạnh lưu hành thị trường a) Nồng độ tinh trùng hai loại tinh bình thường tinh phân 51 tách b) Tỷ lệ tinh trùng sống hai loại tinh bình thường tinh 52 phân tách c) Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình hai loại tinh bình thường tinh 53 phân tách d) Tỷ lệ tinh trùng di động hai loại tinh bình thường tinh 54 phân tách e) Khả thụ tinh in vitro hai loại tinh bình thường tinh 54 phân tách 3.2 Nội dung Thử nghiệm tạo phơi bị invitro xác định trƣớc giới 55 tính từ nguồn nguyên liệu khác 3.2.1 Thí nghiệm Thử nghiệm tạo phơi bị in vitro xác định trước giới tính từ trứng bị cao sản nước lấy từ kỹ thuật OPU tinh bị đơng lạnh phân tách (chỉ chứa tinh trùng mang NST X) bò đực giống cao sản ngoại nhập 55 3.2.2 Thí nghiệm Thử nghiệm tạo phơi bị in vitro xác định trước giới tính từ trứng bò cao sản nước lấy từ kỹ thuật OPU tinh bị (bình thường) ngoại nhập phân tách (chỉ có tinh trùng mang NST X) nước 59 3.3 Nội dung 3: Thử nghiệm tạo bê có chất lƣợng cao từ việc sử dụng phơi bị invitro xác định trước giới tính nêu trên, thông qua kỹ thuật cấy truyền phôi 62 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63 Kết luận 63 Đề nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65-71 Các phụ lục Hợp đồng nghiên cứu Khoa học Phát triển công nghệ số 76/2012/HĐSKHCN, ngày 27 tháng 04 năm 2012 Phụ lục Hợp đồng nghiên cứu Khoa học Phát triển công nghệ số 76/2012/HĐ-SKHCN (ngày 27 tháng 04 năm 2012), ký ngày 04/06/2014 Thẩm tra toán năm 2012, ngày 06 tháng 03 năm 2014 Thẩm tra toán năm 2014, ngày 11 tháng 02 năm 2015 Danh sách hộ tham gia đề tài, nội dung cấy truyền phôi Xác nhận hộ tham gia cấy truyền phôi sinh bê Xác nhận chỉnh sửa báo cáo nghiệm thu thức theo góp ý HĐ Các sản phẩm đề tài Quy trình OPU Quy trình phân tách tinh bị đơng lạnh FACS Báo cáo phân tích “Đánh giá khả ứng dụng kỹ thuật OPU, FACS, MOET để sản xuất bò hướng sữa có tiềm sản xuất cao TPHCM” Bài báo “Sử dụng tinh phân tách (Sorted semen) để tạo phơi bị sữa in vitro xác định trước giới tính” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam số (55), trang: 127-132 2015 Đào tạo 05 sinh viên tốt nghiệp: 03 sinh viên khoa Công nghệ sinh học - ĐH Nông Lâm Thủ Đức 02 sinh viên khoa Công nghệ sinh học - ĐH Công nghiệp thực phẩm 01 học viên Cao học chuẩn bị báo cáo DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt BT Ovary Buồng trứng ĐC Đối chứng DNA Deoxyribo Nucleic Acid ET Embryo Transfer Cấy chuyển (truyền) phôi FACS Fluorescent-Activated Cell Sorting Phân tách tế bào kích hoạt huỳnh quang Shealth (FACS) Áp suất dòng chảy Efficiency (FACS) Hiệu phân tách Purity (FACS) Độ tinh Drop Frequency (FACS) Tần số hạt Piezo Amplitude (FACS) Điện FSH Follicle Stimulating Hormone Hormone kích thích nang nỗn GTNT Artificial Insemination Gieo tinh nhân tạo HTNC Pregnant Mare Serum Gonadotropin-PMSG Huyết ngựa chữa IVC In vitro Culture Nuôi phôi in vitro IVEP In vitro Embryo Production Sản xuất phôi in vitro IVF In vitro Fertility Thụ tinh in vitro IVM In vitro Maturition Ni chín trứng in vitro MO Multi Ovulation Đa xuất noãn NST Chromosome Nhiễm sắc thể OPU Ovum Pick-Up Hút trứng buồng trứng (thú sống) PVP Poly Vinyl Pyrrolidone TN Thí nghiệm DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG Bảng Kết thử nghiệm OPU với tần suất thực 39 Bảng Kết thử nghiệm OPU kết hợp với xử lý trước hormone 42 Bảng Kết phân tách hạt chuẩn với chế độ tách khác 46 Bảng Kết phân tách tinh trùng phương pháp khác 47 Bảng Kết phân tích so sánh chất lượng tinh trùng trước sau phân tách FACS 49 Bảng Kết đánh giá tinh trùng tinh bị đơng lạnh bình thường phân tách 51 Bảng Kết tạo phôi in vitro từ tinh phân tách ngoại nhập với nguồn trứng khác 56 Bảng Kết tạo phôi in vitro từ tinh phân tách trứng OPU kết hợp với xử lý trước loại hormone bò cao sản 57 Bảng Kết tạo phôi in vitro từ nguồn trứng OPU với tinh phân tách ngoại nhập tinh phân tách đề tài 59 Bảng 10 Kết đánh giá chất lượng hai loại tinh sau phân tách (tinh X tinh Y) 60 xác định loại tinh trùng mang nhiễm sắc thể giới tính X, Y để xác định giới tính phơi Các phương pháp bao gồm: Phương pháp PCR với dấu hiệu phân tử đặc trưng thể nhiễm sắc thể Y, phương pháp lai chỗ với phát tán tín hiệu huỳnh quang, phương pháp phân tích kiểu nhân (karyotyping) Quá trình phân tách tinh trùng bao gồm nhiều giai đoạn khác có ảnh hưởng tiêu cực đến khả sống sót, khả thụ tinh kiểu gen tinh trùng Các trình bao gồm việc nhuộm nhân, ủ, tiếp xúc với tia UV, pha lỗng q trình nhuộm phân tách, ngồi tinh trùng bị ảnh hưởng lực học suốt trình di chuyển qua máy phân tách tinh trùng lúc phóng thích tinh trùng vào ống đựng mẫu Sau q trình phân tách tinh trùng cịn phải trải qua giai đoạn ly tâm để loại bỏ dịch bao quanh đồng thời để làm gia tăng nồng độ tinh trùng Ngồi tinh trùng phải tiếp tục xử lí tùy theo mục đích sử dụng như: sử dụng lập tức, đông lạnh bảo quản 4.2 Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ, hóa chất Hệ thống phân tách tế bào FACSJazz Cell Sorter Chuẩn bị vật liệu - Tinh dịch - 70% EtOH 83 - EtOH abs - Dung dịch ly giải: 1M Tris-HCl pH 8.0; 3M NaCl; 0.5M EDTA; 20% SDS - Triton X-100 - Dithiothreitol (DTT) - Proteinase K - Glycogen - 3M Sodium Acetate (NaAc) - Dung dịch TE - Máy ủ nhiệt 500C 4.3 Quy trình phân tách (1) Chuẩn bị tinh trùng Tinh trùng cọng rạ giải đông nhanh cách đặt vào bể ổn nhiệt 37oC phút Sau đó, toàn tinh dịch cho vào ống li tâm 15 mL Tinh dịch đặt thành lớp bên môi trường Sperm Rinse ủ khoảng 60 phút nhiệt độ 38,5oC Tinh trùng di động bơi khỏi lớp tinh dịch để lên lớp môi trường phía Tinh trùng chết khơng di động nằm lại bên Sau đó, thu 1/2 thể tích mơi trường bên cho vào ống li tâm 15 mL li tâm 2500 rpm phút để thu cặn tinh trùng (2) Nhuộm tinh trùng cho phân tách - Bổ sung thuốc nhuộm LDS751 vào mẫu tinh trựng theo t l (2ì106 tinh trựng:0.04àg LDS751) - Ủ tinh trùng thuốc nhuộm 20 phút 15-20oC - Rửa thuốc nhuộm cách li tâm, lần với SpermWash (3) Phân tách tinh trùng 84 Phân tích flow cytometry với bước sóng kích thích 488-543nm bước sáng phát 712 nm Chế độ tách hệ thống FACSJazz thử nghiệm để đạt hiệu phân tách tốt với thông số cụ thể là: - Điện (Piezo Amplitude) 14.53 V - Tần số hạt (Drop Frequency) 31,20 kHz - Áp suất dòng chảy (Shealth) 15,0 psi - Phương pháp phân tách: sử dụng phương pháp tách giọt đơn với tín hiệu dương tính nhằm làm giàu số tế bào (1.0 Drop Enrich) phương pháp tách tế bào dương tính (1.0 Drop Yield) (4) Kiểm tra tính khiết tinh trùng sau phân tách Kiểm tra tính khiết tinh trùng sau phân tách phản ứng PCR định tính biểu gen chuyên biệt giới tính đực Phản ứng PCR sử dụng trình tự S4 trình tự lặp lại cao đơn vị lặp lại 1,5 kb chứa trình tự lặp lại khác bên Phân tích FISH cho thấy S4 nằm tồn cánh dài vùng lân cận cánh ngắn nhiễm sắc thể Y Hỗn hợp phản ứng 25 μl bao gồm: μl DNA, 15 pmol mồi, 1,25 U Taq polymerase, 0,2 mM dNTP, 1X EX Taq buffer (theo kit Takara, Nhật) Chu kì phản ứng PCR: Phản ứng PCR thực 30 chu kỳ Mỗi chu kì: 95oC-30 giây; 52 oC – 45 giây; 72 oC – 45 giây Mồi cho xác định giới tính bị cặp mồi S4B có trình tự sau: S4BF: CAAGTGCTGCAGAGGATGTGGAG S4BR: GAGTGAGATTTCTGGATCATATGGCTACT Cặp mồi S4 sản phẩm 178 bp đặc hiệu đực, thêm vào sản phẩm 145 bp cho đực lẫn Sau khuếch đại DNA cặp mồi kết thu hai vạch gel điện di trường hợp tinh dịch có chứa nhiều tinh trùng Y có vạch tinh dịch có chứa nhiều tinh trùng X Kết thử nghiệm Sau thử nghiệm chế độ phân tách với thông số kỹ thuật khác 85 nhau, kết cho thấy với chế độ phân tách với thông số: điện 14.53 V, tần số hạt 31,20 kHz, áp suất dòng chảy 15,0 psi phương pháp phân tách: sử dụng phương pháp tách giọt đơn với tín hiệu dương tính nhằm làm giàu số tế bào (1.0 Drop Enrich) phương pháp tách tế bào dương tính (1.0 Drop Yield) cho hiệu tốt với hiệu phân tách 72,34-77,16% độ khiết từ 77,74-81,44% Tuy nhiên, chất lượng tinh trùng thấp tiêu phần trăm tế bào sống (35,65-44,96%), tỷ lệ di động (18,98-28,26%) tỷ lệ kỳ hình tinh trùng lại cao (77,83-78,16%) Chất lượng tinh trùng bị ảnh hưởng q trình xử lí tinh trùng q trình phân tách động xung điện Một số yếu tố đáng kể trình nhuộm tinh trùng với thuốc nhuộm LDS751; trình lọc rửa tinh trùng nhiều lần; tinh trùng bị đẩy áp lực mạnh vào nozzle hệ thống tách, tích điện giọt dung dịch chứa tinh trùng tách Kết luận đề nghị Đã bước đầu nghiên cứu thiết lập thông số quy trình phân tách tinh trùng X từ tinh trùng bị đơng lạnh kĩ thuật FACS Mặc dù hiệu phân tách cao chất lượng tinh trùng sau phân tách hạn chế Đề nghị tiếp tục cấp kinh phí để nghiên cứu hồn thiện quy trình phân tách này, nhằm nâng cao chất lượng tinh trùng sau phân tách, đạt mức ngang với chất lượng tinh phân tách có thị trường 86 Báo cáo phân tích Đánh giá khả ứng dụng kỹ thuật nhƣ OPU, FACS, MOET để sản xuất bị hƣớng sữa có tiềm sản xuất cao TPHCM TS Chung Anh Dũng I TÌNH HÌNH ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT OPU, FACS VÀ MOET TRÊN THẾ GIỚI Tình hình ứng dụng kỹ thuật OPU giới Kỹ thuật OPU kỹ thuật thu trứng buồng trứng thú sống (Ovum Pick-Up – OPU hay Transvaginal Ultrasound Guided Oocyte-Aspiration TUGA), kỹ thuật giúp cung cấp nguồn trứng ổn định chất lượng tốt Năm 1988, lần kỹ thuật thiết lập bị, nhóm chun gia Hà Lan Họ chứng minh việc sử dụng kỹ thuật OPU không ảnh hưởng đến sức khỏe khả sinh sản bò cho trứng Trung bình có khoảng 100.000 nỗn buồng trứng bị lúc sinh Trong đó, với sinh sản tự nhiên có khoảng 4-6 bê sinh đời bò Điều cho thấy lãng phí lớn nguồn di truyền, đặc biệt bò cao sản, trường hợp sinh sản tự nhiên Vì vậy, kỹ thuật OPU giúp khai thác hiệu nguồn di truyền từ bò cao sản Bảng So sánh sử dụng nguồn trứng từ OPU lị mổ để sản xuất phơi cấy truyền phôi tươi, phôi đông lạnh khu vực khác giới (IETS, 2013) 87 Theo số liệu Hiệp hội cấy truyền phôi quốc tế (International Embryo Transfer Society, 2014) nước châu Á cịn sử dụng kỹ thuật OPU, nước chăn ni bị khu vực Nam Mỹ gần sử dụng kỹ thuật OPU để tạo nguồn trứng cho sản xuất phơi bị in vitro Nhìn chung, tổng số phơi bị in vitro sản xuất tồn giới năm 2013, số phơi sản xuất từ nguồn trứng thu từ lò mổ 5,6% so với phôi từ nguồn trứng OPU (29.041 so với 517.587) Điều chứng tỏ kỹ thuật OPU ngày sử dụng nhiều sản xuất phơi bị in vitro giới Kết sử dụng kỹ thuật OPU giới đạt tiến nhanh, tính 85.838 bị thực kỹ thuật OPU, sản xuất 1.531.609 trứng 517.587 phơi in vitro đạt mức trung bình 17,85 trứng/bị 6,03 phơi/bị (IETS, 12/2014) Trong suốt giai đoạn 1997-2012, việc sử dụng kỹ thuật OPU để cung cấp nguồn trứng tạo phôi in vitro gia tăng liên tục nhanh chóng Nếu năm 1997, có 30.569 phôi in vitro từ OPU sử dụng cấy truyền phơi tồn giới, đến năm 2012 có 384.999 phơi in vitro từ OPU sử dụng cấy truyền phôi, tức tăng gấp 12,6 lần Điều cho thấy ứng dụng kỹ thuật OPU cấy truyền phơi bị ngày mạnh Trong đó, quốc gia khu vực Nam Mỹ áp dụng kỹ thuật mạnh (hình 1) Biểu đồ Ứng dụng OPU cấy truyền phôi giới 1997-2012 88 Nếu tính riêng việc ứng dụng OPU để sản xuất cấy truyền phơi tƣơi tồn giới giai đoạn 1997-2012, kết cho thấy phát triển tương tự So với năm 1997, việc ứng dụng OPU vào cấy truyền phôi tươi năm 2012 tăng 28,9 lần (12.018 phôi so với 348.238 phôi) Như rõ ràng, việc ứng dụng OPU vào cấy truyền phôi tươi áp dụng nhiều so với tình hình chung Trong Nam Mỹ khu vực ứng dụng OPU mạnh cấy truyền phơi tươi (hình 2) Biểu đồ Ứng dụng OPU cấy truyền phôi tƣơi giới 1997-2012 Biểu đồ Ứng dụng OPU cấy truyền phôi đông lạnh giới 19972012 89 Đối với việc ứng dụng OPU vào cấy truyền phôi đông lạnh, xu hướng chung giảm dần kể từ năm 2004 trở lại Năm 2004, số phôi OPU đông lạnh sử dụng cấy truyền cao (110.862 phôi), cao gấp 5,9 lần so với năm 1997 (18.551 phôi) cao gấp 3,0 lần so với năm 2012 (36.761 phôi) Sự sụt giảm áp dụng OPU cấy truyền phôi đông lạnh đến từ khu vực châu Á, năm 2004 khu vực cấy truyền 107.570 phôi OPU đông lạnh, chiếm 97% số lượng phôi OPU đông lạnh toàn giới, đến năm 2012 khu vực châu Á cịn sử dụng 200 phơi OPU đông lạnh cấy truyền phôi Ngược lại, Nam Mỹ tiếp tục khu vực ứng dụng mạnh OPU cấy truyền phơi đơng lạnh (hình 3) Tình hình ứng dụng kỹ thuật MOET giới Thuật ngữ MOET (Multi Ovulation & Embryo Transfer) ngày phổ biến dùng để kỹ thuật gây đa xuất nỗn cấy truyền phơi Cấy truyền phơi (hay chuyển trứng thụ tinh) kỹ thuật thu nhận phôi (hay trứng thụ tinh) từ đường sinh sản động vật (cá thể cho) chuyển sang đường sinh sản khác (cá thể nhận) để hồn tất q trình thai nghén (mang thai, sinh đẻ) Trong mục tiêu gieo tinh nhân tạo nhằm khai thác tối đa tiềm di truyền bò đực giống, mục tiêu gây đa xuất nỗn giúp bị rụng nhiều trứng lúc nhằm khai thác tối đa tiềm di truyền bị có khả sản xuất, sinh sản tốt Kỹ thuật cấy truyền phôi kết hợp đa xuất noãn gieo tinh nhân tạo, giúp sản xuất nhiều bị có khả sản xuất (thịt, sữa…) thơng qua đàn bị bình thường mang thai giùm Như MOET, hay cấy truyền phôi in vivo, giúp khai thác nhanh tối đa bò giống có tiềm sản xuất cao Bảng Ứng dụng MOET đàn bị tồn giới 1997-2012 90 Biểu đồ Ứng dụng cấy truyền phôi in vivo (MOET) giới 1997-2012 Theo IETS (2013), việc ứng dụng phôi in vivo giới năm 2012 tăng 40,26% so với năm 1997 (505.876 phôi so với 360.656 phôi), gia tăng không liên tục suốt giai đoạn Như so với cấy truyền phôi in vitro (từ trứng OPU), ứng dụng cấy truyền phôi in vivo không tăng trưởng đặn mạnh Trong số khu vực áp dụng cấy truyền phôi in vivo giới, khu vực Bắc Mỹ áp dụng mạnh nhất, khu vực Nam Mỹ lại chuộng cấy truyền phơi in vitro in vivo Trong số quốc gia châu Á có áp dụng kỹ thuật cấy truyền phơi, Nhật quốc gia ứng dụng kỹ thuật mạnh nhất, hai loại phôi in vivo in vitro 91 Biểu đồ Ứng dụng cấy truyền phôi in vivo đông lạnh giới 1997-2012 Biểu đồ Ứng dụng cấy truyền phôi in vivo đông lạnh giới 1997-2012 Kết ứng dụng cấy truyền phôi in vivo đông lạnh tươi thể biểu đồ cho thấy sử dụng phôi in vivo đông lạnh tăng trưởng tốt so với phơi in vivo tươi Điều hiểu việc cấy phơi in vivo tươi địi hỏi phải chuẩn bị số lượng bò đồng pha đủ để tiếp nhận số lượng phơi từ bị cho, giới hạn ứng dụng phôi in vivo tươi Trong hai loại phôi in vivo này, khu vực Bắc Mỹ khu vực ứng dụng mạnh nhất, châu Âu Nam Mỹ 92 Tình hình ứng dụng kỹ thuật phân tách tinh trùng phƣơng pháp FACS giới Tinh dịch gia súc phân tách tinh trùng X Y (gọi tắt tinh dịch phân tách) với độ xác 90% phương pháp CCS (Cytometric Cell Sorter) hay FACS (Fluorescent-Activated Cell Sorter) Các phương pháp thành công vào năm 1990 (Johnson, 1991-1992-1994-1995; Cran cs, 1993-19951997; Abeydeera cs, 1998) Tuy nhiên, có chênh lệch nhỏ độ xác phân loại tinh trùng X (87,8%) tinh trùng Y (92,1%) Hiệu kinh tế (Seidel 2003), khả ứng dụng (Hoheboken, 1999 Weigel, 2004) thương mại hóa (Amann, 1999) loại tinh dịch phân tách tinh trùng X hay Y báo cáo nhiều giới Các báo cáo gần trình bày nhiều kết sử dụng loại tinh dịch phân tách tinh trùng X Y ngành chăn ni bị (Seidel, 2002-2003; Weigel, 2004; Foote, 1996; Johnson, 1999-2000; Garner, 2001; Hasler cs, 1995; Hunter, 2003), đánh giá việc sử dụng loại tinh gieo tinh nhân tạo (Cran, 1997; Morrel, 1991; Seidel, 1999; Bodmer cs, 2005; Schenk, 2005) sản xuất phơi bị in vitro (Cran, 19931995; Lu cs, 1999; Zhang cs, 2003; Lu Seidel, 2004; Fischer cs, 2005; Wilson cs, 2005) Sử dụng tinh dịch phân tách tinh trùng có nhược điểm tỷ lệ thụ thai thấp (Seidel, 1999) Tuy nhiên, nâng số lượng tinh trùng (đã phân tách X Y) liều tinh dịch ngang với loại tinh khơng phân tách tỷ lệ thụ thai cải thiện đáng kể (khoảng 60-80% so với sử dụng tinh dịch không phân tách) (Seidel, 1999; Doyle cs, 1999) Nhược điểm khả sống tinh trùng phân tách bị giảm thấp sau bảo quản lạnh (Schenk, 1999) Phương pháp cơng nghệ hóa máy phân tách tinh trùng giới tính dịng tế bào (Flow Cytometric Sexing Sorter) Tinh trùng bị tách giới tính cơng nghệ Flow cytometry thương mại hóa nước Mỹ, Canada có xu hướng tăng lên thời gian gần đây, đặc biệt châu Á Nhật Bản, Hàn Quốc Ứng dụng tinh trùng bị phân tách giới tính sản xuất bê ngành chăn ni bị sữa Cơng nghệ có nhược 93 điểm chi phí cao, kỹ thuật phức tạp tỷ lệ thụ thai thấp so với tinh trùng chưa phân tách Để sử dụng thành cơng tinh trùng tách giới tính địi hỏi phải có kinh nghiệm ni gia súc, thao tác tinh trùng phải cẩn thận kỹ thuật thụ tinh lành nghề Công nghệ Flow cytometryđang ngày hoàn thiện để tách tinh trùng với hiệu cao ảnh hưởng tới chất lượng tinh trùng, với chi phí giảm ứng dụng nhiều ngành chăn nuôi (Seidel, 2003) Mặc dù giá tinh phân tách cao tinh bình thường nhiều, tỷ lệ thụ tinh sử dụng tinh phân tách thấp tinh bình thường, phân tích kỹ hiệu kinh tế việc sử dụng tinh phân tách bò sữa (cả bò rạ lẫn bò tơ), Albert De Vries (2015) chứng minh có hiệu kinh tế bị tơ, bò rạ nên sử dụng tinh phân tách lần gieo tinh nên thực bị cao sản có gia phả rõ ràng II ĐIỀU KIỆN ĐỂ ỨNG DỤNG THÀNH CÔNG CÁC KỸ THUẬT MỚI 2.1 Kỹ thuật MOET - Có chương trình chọn giống tốt để phát chọn cá thể bị có suất cao làm bị cho phơi - Có đội ngũ cán kỹ thuật thao tác giỏi bò sống, kỹ thuật khám qua trực tràng, sử dụng hormone gây đa xuất nỗn, gieo tinh nhân tạo, thu phơi, cấy phơi - Có đội ngũ cán giỏi kỹ phịng thí nghiệm để thực thao tác phơi tìm phơi, đánh giá chất lượng phơi, đơng lạnh phơi… - Có phịng thí nghiệm với đầy đủ thiết bị, dụng cụ, hóa chất - Có quy trình kỹ thuật (quy trình chọn bị cho phơi, quy trình gây đa xuất nỗn, quy trình gieo tinh nhân tạo, quy trình thu phơi, quy trình cấy phơi…) phù hợp với điều kiện sẵn có (nhân lực, phịng thí nghiệm…) 2.2 Kỹ thuật OPU Có chương trình chọn giống tốt để phát chọn cá thể bị có suất cao làm bị cho trứng 94 - Có đội ngũ cán kỹ thuật thao tác giỏi bò sống, kỹ thuật khám qua trực tràng, sử dụng hormone kích thích nhiều nang noãn phát triển, sử dụng hệ thống siêu âm để chọc hút trứng - Có đội ngũ cán giỏi kỹ phịng thí nghiệm để thực thao tác tìm trứng, ni chín trứng, thụ tinh vi giọt, nuôi phôi, đánh giá chất lượng phơi, đơng lạnh phơi… - Có phịng thí nghiệm với đầy đủ thiết bị, dụng cụ, hóa chất Đặc biệt phải có hệ thống siêu âm hình ảnh với đầu dò chuyên dụng cho hút trứng buồng trứng bị sống - Có quy trình kỹ thuật (quy trình chọn bị cho trứng, quy trình sử dụng hormone kích thích nhiều nang nỗn phát triển, quy trình hút trứng siêu âm, quy trình IVM-IVF-IVC, quy trình cấy phơi…) phù hợp với điều kiện sẵn có (nhân lực, phịng thí nghiệm…) 2.3 Kỹ thuật FACS - Có chương trình chọn giống tốt để phát chọn cá thể bị đực giống có suất cao làm bị cho tinh, đồng thời phải có chương trình kiểm tra bị đực giống qua đời sau - Có đội ngũ cán kỹ thuật thao tác giỏi bò sống, kỹ thuật lấy tinh bò đực, kỹ thuật huấn luyện bò đực nhảy giá - Có đội ngũ cán giỏi kỹ phịng thí nghiệm để thực thao tác lọc rữa tinh, đánh giá chất lượng tinh, pha lỗng tinh, phân tách tinh flow cytometry, đơng lạnh tinh… - Có phịng thí nghiệm với đầy đủ thiết bị, dụng cụ, hóa chất Đặc biệt phải có hệ thống máy phân tách (VD BD FACSJazz cell sorter), hệ thống vi tính đánh giá nhanh chất lượng tinh, hệ thống đơng lạnh tinh - Có quy trình kỹ thuật (quy trình chọn bị đực giống kiếm tra qua đời sau, quy trình khai thác thu tinh, quy trình đánh giá chất lượng tinh, quy trình sử dụng hệ thống FACS để phân tách tinh, quy trình đơng lạnh tinh…) phù hợp với điều kiện sẵn có (nhân lực, phịng thí nghiệm…) 95 III KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT MỚI TRÊN ĐÀN BÕ SỮA TẠI TPHCM Căn tình hình ứng dụng kỹ thuật OPU, MOET FACS đàn bò sữa giới, cho thấy kỹ thuật ngày nước chăn ni bị sữa tiên tiến ứng dụng mạnh Điều giúp tăng tiến di truyền đời sau lên nhanh Vì vậy, rõ ràng xu hướng phát triển khoa học công nghệ cần phải ứng dụng đàn bị sữa ni TPHCM Đặc biệt giai đoạn nay, thành phố định hướng phát triển đàn bò sữa giữ nguyên tổng đàn khoảng 80.000 con, phải tăng suất sữa bình quân lên 6.500-7.000kg/con/chu kỳ Dựa điều kiện cần thiết để ứng dụng thàn công kỹ thuật OPU, MOET FACS nêu trên, thấy TPHCM có gần đủ điều kiện này, cụ thể: - Đã có trại bị giống lớn, áp dụng chương trình chọn lọc bị giống tốt cho trứng, phơi hay tinh Cụ thể trại bò An Phú, trại bị hợp tác với Israel - Đã có thiết bị, dụng cụ cần thiết hệ thống siêu âm OPU, hệ thống phân tách tinh trùng FACS, toàn trang thiết bị để thực thu, cấy phôi… thiết bị, dụng cụ nằm rải rác Viện, trường đại học - Đã có hệ thống phịng thí nghiệm tế bào động vật đủ mạnh để sản xuất phơi bị in vitro - Đã có đội ngũ cán kỹ thuật nắm nguyên tắc quy trình kỹ thuật nêu - Có đội ngũ kỹ thuật viên tay nghề cao để thực kỹ thuật khó bò sống khám qua trực tràng, gieo tinh sâu vào sừng tử cung, cấy phôi… 96 Tuy nhiên, để ứng dụng thành công kỹ thuật này, số hạn chế cần phải khắc phục, bao gồm: - Xây dựng trung tâm quản lý, chọn lọc giống bị tồn địa bàn thành phố, đảm bảo phát bò cao sản trứng, phôi - Xây dựng Hiệp hội phát triển bị sữa đủ mạnh để kết nối tất nguồn lực nằm rải rác viện, trường, trại bị… có tập hợp đủ điều kiện cần thiết thực kỹ thuật - Xây dựng chương trình Phát triển cải thiện đàn bị sữa toàn thành phố, tương tự DHIA Mỹ Có ứng dụng kỹ thuật cách lâu dài bền vững IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Từ phân tích trên, thấy việc ứng dụng kỹ thuật OPU, MOET hay FACS đàn bò sữa nuôi khu vực TPHCM cần thiết Hiện tại, TPHCM có gần đủ điều kiện cần thiết để ứng dụng thành công kỹ thuật Vấn đề quan trọng việc xây dựng tổ chức, chương trình phối hợi để tập hợp nguồn lực lại, nhằm đảm bảo thành công ứng dụng kỹ thuật 97