Nghiên cứu tạo protein koja tái tổ hợp trên escherichia coli

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TẠO PROTEIN KOJA TÁI TỔ HỢP TRÊN ESCHERICHIA COLI Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược Chủ trì nhiệm vụ: Nguyễn Quốc Thái Thành phố Hồ Chí Minh - 2023 CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TP Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 05 năm 2023 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: Thuộc lĩnh vực: Hoá sinh Dược; Công nghệ sinh học Dược Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Nguyễn Quốc Thái Ngày, tháng, năm sinh: 29/11/1984 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Tiến sĩ Chức danh khoa học: Tiến sĩ Chức vụ: Giảng viên Điện thoại: Tổ chức: 028 38295641–222 Mobile: 0966371157 Fax: E-mail: nqthai@ump.edu.vn Tên tổ chức công tác: Khoa Dược Địa tổ chức: 41 Đinh Tiên Hoàng, P Bến Nghé, Quận 1, TP HCM Địa nhà riêng: B.5-07 KCH EHomeS Nam SG, xã Bình Hưng, huyện Bình Chánh, TP HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ(1): Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược Điện thoại: 028 38295641 Fax: 028 38225435 E-mail: khoaduoc@ump.edu.vn Website: http://www.uphcm.edu.vn Địa chỉ: 41 Đinh Tiên Hoàng, P Bến Nghé, Quận 1, Tp HCM Tên quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 10 năm 2020 đến tháng 10 năm 2021 - Thực tế thực hiện: từ tháng 12 năm 2020 đến tháng 10 năm 2022 - Được gia hạn: từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 04 năm 2022 Kinh phí sử dụng kinh phí: Tên Khoa Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài a) Tổng số kinh phí thực hiện: 30 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học nhà trường: 30 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 10/2020– 25 10/2021 12/2020– 10/2021 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 10/2020– 10/2022 12/2020– 04/2022 gói khơng khốn chi Ghi (Số đề nghị tốn) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đơn vị tính: Triệu đồng Theo kế hoạch Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Tổng NSKH 25 Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH 25 25 25 5 5 30 30 30 30 Nguồn khác - Lý thay đổi (nếu có): Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Nguyễn Quốc Tên cá nhân tham gia thực Nguyễn Quốc Nội dung tham gia Sản phẩm chủ yếu đạt - Định hướng đề - E coli Ghi chú* Thái Thái tài - Tra cứu tài liệu - Triển khai phần thực nghiệm đề tài - Tổng hợp, báo cáo Phạm Thanh Trang Phạm Thanh Trang - Tra cứu tài liệu - Triển khai phần thực nghiệm đề tài Nguyễn Thị Linh Giang Nguyễn Thị Linh Giang - Tra cứu tài liệu - Triển khai phần thực nghiệm đề tài BL21(DE3) mang plasmid pETSUMO-kojA - Các điều kiện biểu gen kojA để thu protein tái tổ hợp - 02 báo đăng tạp chí quốc gia uy tín - E coli BL21(DE3) mang plasmid pETSUMO-kojA - Các điều kiện biểu gen kojA để thu protein tái tổ hợp - E coli BL21(DE3) mang plasmid pETSUMO-kojA - Các điều kiện biểu gen kojA để thu protein tái tổ hợp - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đồn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Thực tế đạt Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, (Nội dung, thời gian, TT địa điểm ) kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế đạt hoạch 10/2020– 12/2020– 11/2020 01/2021 Tối ưu hoá codon cho biểu gen kojA E coli Thiết kế vector biểu gen 11/2020– kojA tối ưu hố có gắn 12/2020 His-SUMO tag 01/2021– 02/2021 Tạo dòng E coli sản xuất protein KojA tái tổ hợp 12/2020– 02/2021 02/2021– 09/2021 Khảo sát điều kiện biểu gen kojA để thu protein tái tổ hợp 02/2021– 07/2021 09/2021– 04/2022 Viết báo cáo nghiệm thu đăng tạp chí 08/2021– 10/2021 04/2022– 05/2022 Người, quan thực Nguyễn Quốc Thái, Phạm Thanh Trang, Nguyễn Thị Linh Giang Nguyễn Quốc Thái, Phạm Thanh Trang, Nguyễn Thị Linh Giang Nguyễn Quốc Thái, Phạm Thanh Trang, Nguyễn Thị Linh Giang Nguyễn Quốc Thái, Phạm Thanh Trang, Nguyễn Thị Linh Giang Nguyễn Quốc Thái - Lý thay đổi (nếu có): Nghiên cứu bổ sung nội dung dự đốn độ tan protein KojA từ làm sở cho việc tối ưu hoá codon cho biểu E coli thiết kế plasmid biểu gen kojA có gắn His-SUMO tag III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu E coli BL21(DE3) mang plasmid pETSUMO-kojA Đơn vị đo Số lượng - Lý thay đổi (nếu có): Theo kế hoạch Thực tế đạt Dòng tế bào biểu protein KojA tái tổ hợp điều kiện thích hợp Dòng tế bào biểu protein KojA tái tổ hợp điều kiện thích hợp b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Các điều kiện biểu gen kojA để thu protein tái tổ hợp Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Protein KojA Protein KojA tái tổ hợp tinh tái tổ hợp tinh khiết kiểm khiết kiểm tra điện di tra điện di SDS-PAGE SDS-PAGE Ghi - Lý thay đổi (nếu có): c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Bài báo Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt MedPharm 02 báo Res (1) đăng tạp tạp chí quốc chí quốc gia uy gia có uy tín tín (2) Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) 02 báo tạp chí Y học Việt Nam (Tổng hội Y học Việt Nam) Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sỹ Tiến sỹ - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: Số TT Tên sản phẩm đăng ký Kết Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế Số TT Tên kết ứng dụng Thời gian Địa điểm (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ MỤC LỤC MỤC LỤC I DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC HÌNH IV DANH MỤC BẢNG V CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ACID KOJIC 1.1.1 Công thức phân tử acid kojic 1.1.2 Ứng dụng acid kojic 1.1.3 Sinh tổng hợp acid kojic 1.2 SẢN XUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP BẰNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI 1.2.1 Các chủng E coli sử dụng sản xuất protein tái tổ hợp 1.2.2 Sản phẩm protein tái tổ hợp chủng E coli 1.3 VECTOR BIỂU HIỆN 1.4 DỰ ĐOÁN KHẢ NĂNG TAN IN SILICO CỦA PROTEIN KHI BIỂU HIỆN TRÊN E COLI 1.4.1 Các đặc điểm cấu trúc có ảnh hưởng đến độ tan protein 1.4.2 Dự đoán khả tan in silico protein biểu E coli 1.5 TÁI GẤP CUỘN PROTEIN THỂ VÙI 1.6 TINH CHẾ PROTEIN BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC VỚI CỘT NI-SEPHAROSE 10 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 12 2.1.1 Vector chủng vi sinh vật 12 2.1.2 Thang chuẩn protein 12 2.1.3 Môi trường thử nghiệm 12 2.1.4 Dung mơi, hóa chất thuốc thử 13 2.1.5 Dụng cụ trang thiết bị 13 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.2.1 Xây dựng mô hình tương đồng mơ cấu trúc KojA 13 2.2.2 Dự đoán khả tan KojA công cụ Protein-Sol 13 2.2.3 Dự đoán khả tan KojA công cụ SOLart 14 2.2.4 Dự đốn khả tan KojA cơng cụ SoDoPE 14 2.2.5 Thiết kế plasmid tái tổ hợp pET-SUMO-kojA mang gen mã hoá cho protein KojA 14 2.2.6 Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli BL21(DE3) 15 2.2.7 Thu nhận plasmid pET-SUMO-kojA 15 2.2.8 Thu nhận protein tái tổ hợp 16 2.2.9 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thu protein pha tan 16 2.2.10 Hòa tan protein thể vùi 17 i 2.2.11 Khảo sát điều kiện hòa tan protein thể vùi 17 2.2.12 Định lượng protein phương pháp Bradford 17 2.2.13 Tinh chế protein sắc ký lực với cột Ni-Sepharose 17 2.2.14 Chạy điện di SDS-PAGE 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 MƠ HÌNH TƯƠNG ĐỒNG CỦA KOJA 20 3.1.1 Kết gióng hàng lựa chọn protein mẫu dùng để xây dựng mô hình tương đồng 20 3.1.2 Kết xây dựng mơ hình tương đồng mơ cấu trúc 3D KojA 20 3.2 DỰ ĐOÁN KHẢ NĂNG TAN IN SILICO CỦA KOJA 21 3.2.1 Dự đoán khả tan protein KojA Protein-sol 21 3.2.2 Dự đoán khả tan protein KojA SOLart 22 3.2.3 Dự đoán khả tan protein KojA SoDoPE 23 3.3 THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP MANG GEN KOJA 24 3.3.1 Điều chỉnh sai lệch sử dụng codon (Codon usage bias adjustment) 24 3.3.2 Điều chỉnh hàm lượng GC 25 3.3.3 Enzym cắt giới hạn yếu tố CIS tối ưu hóa 25 3.3.4 Trình tự gen sau tối ưu hoá 26 3.4 BIỂU HIỆN PROTEIN KOJA 27 3.5 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NI CẤY THÍCH HỢP THU PROTEIN PHA TAN 28 3.5.1 Nhiệt độ nuôi cấy sau cảm ứng với IPTG 28 3.5.2 Nồng độ chất cảm ứng 29 3.5.3 Môi trường nuôi cấy 30 3.6 KHẢ NĂNG HÒA TAN PROTEIN THỂ VÙI BẰNG DUNG DỊCH URÊ 32 3.7 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN HÒA TAN PROTEIN THỂ VÙI 33 3.7.1 Nhiệt độ thời gian hòa tan protein thể vùi 33 3.7.2 Nồng độ urê pH dung dịch hòa tan protein thể vùi 33 3.7.3 Nồng độ β-mercaptoethanol 34 3.8 KẾT QUẢ TINH CHẾ PROTEIN THỂ VÙI 35 3.8.1 Tẩy rửa thể vùi với dung dịch đệm chứa Triton X-100, urê M 35 3.8.2 Tinh chế protein KojA 35 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 4.1 KẾT LUẬN 37 4.2 ĐỀ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 42 ii Báo cáo tổng hợp kết đề tài NCKH Kết bàn luận OD600 16-20 Tổng sinh khối (g) thu từ 50 mL dịch nuôi cấy A M B 63 kDa KojA 48 kDa 61 kDa 48 kDa 63 kDa 13-14 1,2 M 9-10 KojA 61 kDa Hình 3.11 Khảo sát nhiệt độ cảm ứng biểu M: Thang chuẩn protein A 1: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA (-)IPTG pha tổng; 2,3: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA/TB 30 °C pha tan, tủa B 1: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA (-)IPTG pha tổng; 2,3: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA/TB 25 °C pha tủa, tan Nhận xét: Nhiệt độ thích hợp cho ni cấy E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pETSUMO-kojA sau cảm ứng 25 °C Theo dõi trình ni cấy cho thấy tốc độ tăng trưởng nuôi nhiệt độ 25 °C chậm so với 30 °C dựa vào mật độ tế bào đo dựa vào OD600 Sau 16-20 nhiệt độ 25 °C mật độ tế bào ổn định, không thay đổi, nhiệt độ 30 °C mật độ tế có dấu hiệu giảm xuống, OD600 đo thấp so với nhiệt độ 25 °C, lượng protein thu tính lượng tế bào tương tự (hình 3.11) Do đó, nhiệt độ 25 °C chọn để nuôi cấy E coli biểu protein thử nghiệm sau 3.5.2 Nồng độ chất cảm ứng Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid chất cảm ứng có tính ổn định hiệu cao hệ thống T7 promoter, sử dụng rộng rãi phịng thí nghiệm Tuy nhiên, IPTG chất cảm ứng có độc tính tiềm tàng chi phí cao Bên cạnh đó, lactose chất cảm ứng tự nhiên operon lac, không tốn không độc hại tế bào E coli [49] Cần khảo sát điều kiện cảm ứng tối ưu, tiết kiệm hiệu trình biểu protein tái tổ hợp Chủng E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET-SUMO-kojA cảm ứng biểu nhiệt độ 25 °C, mơi trường TB có bổ sung IPTG với nồng độ 0,1 0,5 mM 29 Báo cáo tổng hợp kết đề tài NCKH Kết bàn luận Đồng thời khảo sát nuôi cấy môi trường ZYP-5052, tự động cảm ứng Sau nuôi cấy, tiến hành chạy điện di SDS-PAGE theo dõi kết (hình 3.12) Nhận xét: Qua kết điện di SDS-PAGE cho thấy ba điều kiện khảo sát cảm ứng biểu protein KojA Do IPTG có giá thành cao độc tế bào nên cần sử dụng IPTG với nồng độ 0,1 mM môi trường cần chất cảm ứng Ở mơi trường ZYP-5052 có chứa lactose, vi khuẩn E coli BL21(DE3) sử dụng hết glucose chuyển qua sử dụng lactose, đồng thời cảm ứng trình phiên mã xảy ra, lúc vi khuẩn bắt đầu biểu protein tái tổ hợp Dựa vào hình 3.16 thấy mơi trường ZYP-5052 tự động cảm ứng biểu protein KojA thành công M 63 kDa KojA 48 kDa 61 kDa Hình 3.12 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng M: Thang chuẩn protein; 1: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA (-)IPTG pha tổng; 2,3: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA/TB (+)0,5 mM IPTG pha tủa, pha tan; 5,6: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA/TB (+)0,1 mM IPTG pha tủa, pha tan; 6,7: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA/ZYP-5052 pha tủa, pha tan 3.5.3 Môi trường nuôi cấy Luria-Bertani Broth môi trường sử dụng phổ biến để ni cấy E coli Mơi trường LB Broth có hàm lượng dinh dưỡng phong phú tính thẩm thấu phù hợp cho pha tăng trưởng tế bào Tuy nhiên, thực tế khơng phải lựa chọn tốt để đạt nuôi cấy mật độ tế bào cao Việc tăng lượng pepton chiết xuất nấm men dẫn đến mật độ tế bào cao hơn, ngồi bổ sung cation hóa trị hai MgSO4 lượng nhỏ tăng trưởng tế bào cao Q trình chuyển hóa glucose tạo acid có khả tạo thành hệ đệm ổn định, bổ sung glucose kiểm sốt pH bình ni cấy, bổ sung vào mơi trường hệ đệm phosphat để ổn định điều Những môi trường TB (Terrific Broth) chứng minh tạo mật độ tế bào cao LB Broth Một môi trường tối ưu biết đến môi trường tự cảm ứng ZYP-5052 Môi trường sử dụng glucose, lactose 30 Báo cáo tổng hợp kết đề tài NCKH Kết bàn luận glycerol để tối ưa hóa điều kiện cảm ứng Glucose nguồn carbon tối ưu cho pha tăng trưởng tế bào, nguồn glucose cạn kiệt, tế bào sử dụng nguồn carbon từ glycerol lactose, chất cảm ứng với operon lac Khi sử dụng môi trường này, thao tác nuôi cấy dễ dàng quan sát [25] Chủng E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET-SUMO-kojA cảm ứng biểu nhiệt độ 25 °C, 50 mL mơi trường TB có bổ sung 0,1 mM IPTG, LB Broth có bổ sung 0,1 mM IPTG, môi trường ZYP-5052 Sau nuôi cấy, thu sinh khối tế bào chạy điện di SDS-PAGE theo dõi kết (bảng 3.5, hình 3.13) A B M M 63 kDa KojA 48 kDa 61 kDa C 63 kDa kojA 48 kDa 61 kDa M 63 kDa kojA 48 kDa 61 kDa Hình 3.13 Khảo sát mơi trường ni cấy A M: Thang chuẩn protein 1: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA/TB (-) IPTG; 2,3: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA/TB (+)0,1 mM IPTG pha tủa, pha tan B M: Thang chuẩn protein 1,2: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA/ LB Broth (+)0,1 mM IPTG pha tủa, pha tan; 31 Báo cáo tổng hợp kết đề tài NCKH Kết bàn luận C M: Thang chuẩn protein; 1: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA/ZYP-5052 OD600=0,8-1 pha tủa; 2,3: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA/ZYP-5052 pha tủa, pha tan Bảng 3.5 Khảo sát môi trường nuôi cấy E coli BL21(DE3) Môi trường TB LB Broth ZYP-5052 Tổng sinh khối thu 1,15 g 0,6 g 0,73 g Nhận xét: Ở ba môi trường protein SUMO-KojA xuất pha pha protein tủa pha protein tan, đa phần protein nằm pha protein tủa dịch chiết tế bào E coli Sau 1620 nuôi cấy, sinh khối nuôi 50 mL môi trường TB 1,15 g cao nhiều so với LB Broth, ZYP-5052, lựa chọn mơi trường TB cho nghiên cứu sau Kết khảo sát cho thấy nuôi cấy môi trường TB, thêm 0,1 mM IPTG 25 °C cho lượng protein lớn protein KojA biểu chủ yếu dạng thể vùi Từ 50 mL dịch nuôi cấy thu 1,15 g tổng sinh khối 0,85 g pha tủa (thể vùi) 3.6 KHẢ NĂNG HÒA TAN PROTEIN THỂ VÙI BẰNG DUNG DỊCH URÊ Thể vùi hình thành kết cụm lại từ khối hạt protein, lý biết đến liên kết liên phân tử, chủ yếu liên kết disulfid bề mặt kị nước phân tử protein Vì vậy, protein thể vùi tạo trình thu nhận khơng có hoạt tính sinh học Để thu nhận protein gấp cuộn có hoạt tính từ thể vùi, cần trải qua q trình hịa tan với dung dịch biến tính nhằm phá vỡ liên kết sai, tách riêng phân tử protein Hòa tan thể vùi dung dịch urê M pH 7,8 (tỉ lệ thể vùi 40 mg/mL dung dịch hòa tan) nhiệt độ °C, theo phương pháp mô tả mục 2.2.10 Tiến hành điện di SDS-PAGE để phát hiện, phân tích xuất protein KojA (hình 3.14) M 63 kDa KojA 48 kDa 61 kDa Hình 3.14 Khả hịa tan thể vùi chứa protein KojA dung dịch urê M: Thang chuẩn protein; 1: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA/TB (-) IPTG; 2: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA pha tủa; 3: KojA/urê 8M/1 32 Báo cáo tổng hợp kết đề tài NCKH Kết bàn luận Nhận xét: Qua kết điện di SDS-PAGE, thấy vạch protein to đậm có kích thước khoảng 61 kDa-tương ứng với kích thước protein SUMO-kojA dịch urê M, pH 7,8 Với kết cho thấy dung dịch urê M, pH 7,8 có khả hòa tan thể vùi protein KojA 3.7 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN HÒA TAN PROTEIN THỂ VÙI 3.7.1 Nhiệt độ thời gian hòa tan protein thể vùi Hòa tan thể vùi dung dịch urê M pH 7,8 (tỉ lệ thể vùi 40 mg/mL dung dịch hòa tan) nhiệt độ °C, 25 °C 37 °C với khoảng thời gian 1-3 qua đêm (14-16 giờ) Hiệu hòa tan đánh giá qua phương pháp định lượng protein Bradford (bảng 3.6) Bảng 3.6 Nồng độ protein KojA (mg/mL) thu sau hòa tan thể vùi thời gian nhiệt độ khác Nhiệt độ °C 25 °C 37 °C Thời gian giờ 16 2,5 3,12 3,33 3,12 2,83 3,22 3,47 3,25 2,87 3,25 3,31 2,98 Nhận xét: Tăng nhiệt độ giảm thời gian hòa tan protein, nhiệt độ lớn 37 °C hịa tan khơng ổn định, dễ ảnh hưởng đến protein hòa tan Ở 25 °C sau thu hàm lượng protein hòa tan lớn 3,47 mg/mL, lựa chọn hòa tan thể vùi 25 °C cho nghiên cứu sau 3.7.2 Nồng độ urê pH dung dịch hòa tan protein thể vùi Theo Singh Panda (2005), sử dụng urê nồng độ thấp, pH kiềm mạnh giúp tránh tương tác không mong muốn phân tử protein Tiến hành hòa tan thể vùi dung dịch urê M pH 7,8 dung dịch urê có nồng độ 2, 4, M pH 10 12 Dịch protein hòa tan thu tiến hành đo hàm lượng protein phương pháp Bradford chạy điện di SDS-PAGE Kết trình bày bảng 3.7 hình 3.15 Bảng 3.7 Nồng độ protein KojA (mg/mL) thu sau hoà tan thể vùi nồng độ urê pH khác (“-”: không khảo sát) Urê M Urê M Urê M Urê M pH 7,8 3,47 pH 10 1, 57 3,4 3,48 pH 12 1,8 3,17 3,53 - 33 Báo cáo tổng hợp kết đề tài NCKH M Kết bàn luận 63 kDa KojA 48 kDa 61 kDa Hình 3.15 Khảo sát khả hòa tan thể vùi chứa protein KojA M: Thang chuẩn protein; 1,2,3: KojA/urê 2, 4, M pH 10; 4,5,6: KojA/urê 2, 4, M pH 12; 7: KojA/urê M pH 7,8 Nhận xét: Kết điện di SDS-PAGE (hình 3.15) cho thấy nồng độ urê thấp hịa tan thể vùi tốt, lượng protein hòa tan thu từ thể vùi dung dịch urê M, pH 10 thấp (1,57 mg/mL), lượng protein hòa tan thu từ thể vùi dung dịch urê M, pH 12 nhiều (3,53 mg/mL) Do đó, chúng tơi lựa chọn dung dịch urê M, pH 12 điều kiện hòa tan tốt 3.7.3 Nồng độ β-mercaptoethanol Các chất khử β-mercaptoethanol làm tăng khả hòa tan protein Khảo sát khả hòa tan thể vùi dung dịch urê M pH 12 với β-mercaptoethanol nồng độ 0, 1, 5, 10 mM Hiệu hòa tan protein thể vùi đánh giá qua phương pháp Bradford (Hình 3.16) protein (mg/mL) 1.8 1.5 0.95 0.94 0.47 0.5 0 mM mM mM 10 mM Hình 3.16 Khảo sát khả hòa tan thể vùi chứa protein KojA sử dụng β-mercaptoethanol Nhận xét: Kết thu cho thấy khơng sử dụng β-mercaptoethanol cho lượng protein hịa tan lớn (1,8 mg/mL) gấp lần so với việc sử dụng β-mercaptoethanol nồng độ 34 Báo cáo tổng hợp kết đề tài NCKH Kết bàn luận mM; nồng độ 10 mM β-mercaptoethanol cho lượng protein hòa tan thu thấp (0,47 mg/mL) Do khơng bổ sung β-mercaptoethanol cho thử nghiệm hòa tan protein thể vùi sau 3.8 KẾT QUẢ TINH CHẾ PROTEIN THỂ VÙI 3.8.1 Tẩy rửa thể vùi với dung dịch đệm chứa Triton X-100, urê M Triton X-100 dẫn xuất polyethylen glycol nhóm hydroxy cuối chuyển đổi thành phenyl ether p-(2,4,4-trimethylpentan-3-yl) Nó có vai trị chất hoạt động bề mặt không ion Nhận thấy protein KojA hòa tan từ thể vùi nhiều protein không mong muốn, sử dụng dung dịch đệm rửa chứa Triton X-100 1%, urê M pH 7,8 để loại bớt thành phần lipid, protein màng Sau rửa protein thể vùi với dung dịch đệm rửa chứa Triton X-100 1%, urê M pH 7,8, tiến hành hòa tan phần tủa dung dịch urê M, pH 12 vòng 25 °C Chạy điện di SDS-PAGE để kiểm tra hiệu M 63 kDa KojA 48 kDa 61 kDa Hình 3.17 Khảo sát khả tẩy rửa thể vùi Triton X-100 1%, urê M M: Thang chuẩn protein; 1,2,3: Protein/1% Triton X-100, urê M; 4: KojA/urê M Nhận xét: Dung dịch đệm rửa chứa Triton X-100 1%, urê M pH 7,8 có khả hòa tan số protein loại bớt protein trước hòa tan protein thể vùi với dung dịch urê M Tuy nhiên dung dịch đệm rửa hòa tan lượng nhỏ protein thể vùi lượng protein tạp băng protein hòa tan dung dịch urê M nhiều 3.8.2 Tinh chế protein KojA Sự tái gấp cuộn protein tiến hành theo nguyên tắc tách rời phân tử protein, giảm dần nồng độ chất biến tính Trong đề tài này, thực tái gấp cuộn protein KojA phương pháp pha loãng giảm dần nồng độ urê kết hợp sắc ký lực với cột Ni-Sepharose mL Tiến hành hòa tan 0,2 g thể vùi ml dung dịch đệm urê M, pH 12 25 °C vịng Dịch đặc sau trình tinh chế qua cột sắc ký lực ion kim loại thu mL phân đoạn rửa dung dịch đệm có nồng độ urê giảm dần Dung dịch đệm tải sử dụng chạy cột Ni-Sepharose bao gồm: 1) Dung dịch đệm A1: mL dung dịch đệm A chứa urê M, 10 mM imidazol 35 Báo cáo tổng hợp kết đề tài NCKH Kết bàn luận 2) Dung dịch đệm A2: mL dung dịch đệm A chứa urê M, 20 mM imidazol 3) Dung dịch đệm A3: mL dung dịch đệm A chứa urê M, 50 mM imidazol 4) Dung dịch đệm A4: mL dung dịch đệm A chứa urê M, 100 mM imidazol 5) Dung dịch đệm A5: mL dung dịch đệm A chứa urê M, 100 mM imidazol 6) Dung dịch đệm A6: mL dung dịch đệm A chứa urê M, 250 mM imidazol 7) Dung dịch đệm A7: mL dung dịch đệm B chứa urê M Mẫu sau xử lý với hệ thống sắc ký lực cột Ni-Sepharose, chạy điện di SDSPAGE (Hình 3.18) M 10 11 63 kDa KojA 48 kDa 61 kDa Hình 3.18 Kết tinh chế tái gấp cuộn KojA M: Thang chuẩn protein; 1: E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-kojA (-) IPTG; 2: Protein/1% Triton X-100, urê 1M; 3: KojA/urê M pH 12; 4: Protein không bám cột; 5,6,7,8,9,10,11: Phân đoạn rửa dung dịch A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 Nhận xét: Kết cho thấy dịch protein sau qua cột, KojA giữ lại phần, phần lớn protein không bám cột Sau phân đoạn rửa loại tạp, dịch protein có xuất băng protein tương ứng với kích thước KojA (61 kDa) có độ tinh cao phân đoạn A5, A6, A7 Hàm lượng protein phân đoạn A6 xác định phương pháp Bradford 0,22 mg/mL, tương ứng khả thu từ thể vùi ban đầu 2,2 × 10-3 mg/mg, từ dịch nuôi cấy 37 mg/L 36 Báo cáo tổng hợp kết đề tài NCKH Kết luận đề nghị CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Trong thời gian thực đề tài thu kết sau: - Đã dự đoán khả tan KojA qua công cụ in silico việc cần thiết phải thiết kế biểu gen dạng dung hợp với thẻ để tăng độ tan (Nội dung bổ sung thêm so với đề cương đăng ký) - Đã thiết kế vector biểu gen kojA có gắn His-SUMO tag sử dụng tối ưu hóa codon cho biểu E coli - Đã tạo dịng, biểu thành cơng chủng Escherichia coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-SUMO-kojA có khả tạo KojA dạng thể vùi - Khảo sát điều kiện ni cấy quy mơ phịng thí nghiệm cho kết nuôi cấy môi trường TB, thêm 0,1 mM IPTG 25 °C cho lượng protein lớn protein KojA biểu chủ yếu dạng thể vùi - Thể vùi hòa tan tốt dung dịch urê M, pH 12 25 °C vịng khơng thêm β-mercaptoethanol - Đã tinh chế protein thể vùi thành công cột sắc ký lực cột Ni-Sepharose, protein tinh khiết thu phân đoạn rửa dung dịch urê M, nồng độ iminazol 100, 250, 500 mM Khả tinh chế protein KojA IMAC có hiệu suất 37 mg/L dịch ni cấy 4.2 ĐỀ NGHỊ Kể từ nghiên cứu Terabayashi năm 2010, có nhiều nghiên cứu tác nhân ảnh hưởng đến sản xuất acid kojic thông qua tác động lên gen kojA, kojT, kojR, tác động gen leaA A flavus [50] Gen kojR mã hóa cho yếu tố phiên mã đặc hiệu Zn(II)2Cys6, hoạt hóa cho gen kojT kojA [21] Hiện chưa có nghiên cứu cụ thể gen kojA đề xuất, đề tài thách thức bước khởi đầu cho việc sản xuất, khám phá chức kojA Gen kojA tìm thấy chủng nấm Aspergillus A oryzae, A flavus [21], gen ngoại lai với E coli Do đó, chúng tơi lựa chọn thiết kế vector có khả cải thiện độ hịa tan protein nuôi cấy gắn thẻ His-SUMO tag với codon tối ưu hóa Nghiên cứu tạo dịng, biểu thành công chủng Escherichia coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-SUMO-kojA Tuy nhiên KojA thu chủ yếu dạng thể vùi Giới hạn thời gian đề tài chưa cho phép khảo sát vector vật chủ biểu khác E coli BL21(DE3) nên chúng tơi tiến hành khảo sát yếu tố có khả cải thiện độ tan KojA như: nhiệt độ sau cảm ứng biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng, môi trường nuôi cấy Kết sau tối ưu hoá yếu tố cho thấy lượng protein hịa tan thấp Do chúng tơi định thu KojA dạng thể vùi sau tiến hành hoà tan tái gấp cuộn Sau chọn lựa điều kiện hịa tan protein thể vùi tốt nhất, tiến hành tinh chế tái gấp cuộn protein thể vùi cột sắc ký lực Ni-Sepharose Kết cho thấy thu KojA tinh khiết hiệu suất thấp, lượng lớn KojA không bám cột Ni-Sepharose Để thu protein KojA với hiệu suất cao tinh khiết sử dụng cho nghiên cứu xác định cấu trúc tinh thể vai trò KojA đường tổng hợp acid kojic, 37 Báo cáo tổng hợp kết đề tài NCKH Kết luận đề nghị khả ứng dụng KojA làm xúc tác sinh học, đề nghị tiếp tục khảo sát nội dung sau: - Khảo sát tác nhân tăng cường biểu protein KojA dạng hòa tan như: Chọn chủng E coli đột biến cho trxB, chủng E coli đột biến C41(DE3) C43(DE3), lựa chọn plasmid đồng biểu chaperon - Sử dụng chế tinh chế khác sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel - Khảo sát lực KojA với cofactor nhân flavin FAD, FMN - Thử nghiệm hoạt tính sinh học KojA thu được, ví dụ hoạt tính oxidase với chất glucose 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Mohamad R., Mohamed M S., Suhaili N et al (2010), "Kojic acid: Applications and development of fermentation process for production", Biotechnology and Molecular Biology Reviews (2), pp 24-37 [2] Yoo D S., Lee J., Choi S S et al (2010), "A modulatory effect of novel kojic acid derivatives on cancer cell proliferation and macrophage activation", Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences 65 (4), pp 261-266 [3] Shaikh Sumaiya A R T (2015), "A Review on Glucose Oxidase", International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences 4, pp 636-642 [4] Wong C M., Wong K H , Chen X D (2008), "Glucose oxidase: natural occurrence, function, properties and industrial applications", Appl Microbiol Biotechnol 78 (6), pp 927938 [5] Yazgan I., Aydin T., Odaci D et al (2008), "Use of pyranose oxidase enzyme in inhibitor biosensing", Analytical Letters 41 (11), pp 2088-2096 [6] Machida M., Yamada O , Gomi K (2008), "Genomics of Aspergillus oryzae: learning from the history of Koji mold and exploration of its future", DNA Res 15 (4), pp 173-183 [7] Machida M., Asai K., Sano M et al (2005), "Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae", Nature 438 (7071), pp 1157-1161 [8] Kotani T., Ichimoto I., Tatsumi C et al (1976), "Bacteriostatic activities and metal chelation of kojic acid analogs", Agricultural and Biological Chemistry 40 (4), pp 765-770 [9] Lee H F., Boltjes B , Eisenman W (1950), "Kojic acid as an inhibitor of tubercle bacilli", American review of tuberculosis 61 (5), pp 738-741 [10] Aytemir M D , ệzỗelik B (2010), "A study of cytotoxicity of novel chlorokojic acid derivatives with their antimicrobial and antiviral activities", European journal of medicinal chemistry 45 (9), pp 4089-4095 [11] Nawarak J., Huang-Liu R., Kao S.-H et al (2008), "Proteomics analysis of kojic acid treated A375 human malignant melanoma cells", Journal of proteome research (9), pp 37373746 [12] Rodrigues A P D., Farias L H S., Carvalho A S C et al (2014), "A novel function for kojic acid, a secondary metabolite from Aspergillus fungi, as antileishmanial agent", PloS one (3), pp e91259 [13] Kim J., Chang P.-K., Chan K et al (2012), "Enhancement of commercial antifungal agents by kojic acid", International journal of molecular sciences 13 (11), pp 13867-13880 [14] Burdock G A., Soni M G , Carabin I G (2001), "Evaluation of health aspects of kojic acid in food", Regulatory toxicology and pharmacology 33 (1), pp 80-101 [15] Chen J S., Wei C.-i., Rolle R S et al (1991), "Inhibitory effect of kojic acid on some plant and crustacean polyphenol oxidases", Journal of Agricultural and food Chemistry 39 (8), pp 1396-1401 [16] Saghaie L., Pourfarzam M., Fassihi A et al (2013), "Synthesis and tyrosinase inhibitory properties of some novel derivatives of kojic acid", Research in pharmaceutical sciences (4), pp 233 [17] Katagiri H , Kitahara K (1929), "The Formation of Kojic Acid by Aspergillus Oryzae", Bulletin of the Agricultural Chemical Society of Japan (6-9), pp 38-47 39 [18] Futamura T., Okabe M., Tamura T et al (2001), "Improvement of production of Kojic acid by a mutant strain Aspergillus oryzae, MK107-39", J Biosci Bioeng 91 (3), pp 272-276 [19] Wan H M., Chen C C., Chang T S et al (2004), "Combining induced mutation and protoplasting for strain improvement of Aspergillus oryzae for kojic acid production", Biotechnol Lett 26 (14), pp 1163-1166 [20] Shakibaie M., Ameri A., Ghazanfarian R et al (2018), "Statistical optimization of kojic acid production by a UV-induced mutant strain of Aspergillus terreus", Braz J Microbiol 49 (4), pp 865-871 [21] Ammar H A M., Ezzat S M , Houseny A M (2017), "Improved production of kojic acid by mutagenesis of Aspergillus flavus HAk1 and Aspergillus oryzae HAk2 and their potential antioxidant activity", Biotech (5), pp 276 [22] Nurashikin S., Rusley E , Husaini A (2013), "Solid-state bio conversion of pineapple residues into kojic acid by Aspergillus flavus: a prospective study", World Acad Sci Eng Technol (8), pp 825-827 [23] El-Kady I A., Zohri A N A , Hamed S R (2014), "Kojic acid production from agroindustrial by-products using fungi", Biotechnology research international 2014 [24] Liu J M., Yu T C., Lin S P et al (2016), "Evaluation of kojic acid production in a repeated-batch PCS biofilm reactor", J Biotechnol 218, pp 41-48 [25] Bentley R (2006), "From miso, sake and shoyu to cosmetics: a century of science for kojic acid", Nat Prod Rep 23 (6), pp 1046-1062 [26] Bajpai P., Agrawala P K , Vishwanathan L (1982), "Production of kojic acid by resuspended mycelia of Aspergillus flavus", Can J Microbiol 28 (12), pp 1340-1346 [27] Galagan J E., Calvo S E., Cuomo C et al (2005), "Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with A fumigatus and A oryzae", Nature 438 (7071), pp 1105-1115 [28] Nierman W C., Pain A., Anderson M J et al (2005), "Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus", Nature 438 (7071), pp 1151-1156 [29] Andersen M R , Nielsen J (2009), "Current status of systems biology in Aspergilli", Fungal Genet Biol 46 Suppl 1, pp S180-190 [30] Terabayashi Y., Sano M., Yamane N et al (2010), "Identification and characterization of genes responsible for biosynthesis of kojic acid, an industrially important compound from Aspergillus oryzae", Fungal Genet Biol 47 (12), pp 953-961 [31] Marui J., Yamane N., Ohashi-Kunihiro S et al (2011), "Kojic acid biosynthesis in Aspergillus oryzae is regulated by a Zn(II)(2)Cys(6) transcriptional activator and induced by kojic acid at the transcriptional level", J Biosci Bioeng 112 (1), pp 40-43 [32] Kleiner‐Grote G R., Risse J M , Friehs K (2018), "Secretion of recombinant proteins from E coli", Engineering in Life Sciences 18 (8), pp 532-550 [33] Rosano G L , Ceccarelli E A (2014), "Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges", Frontiers in microbiology 5, pp 172 [34] Jia B , Jeon C O (2016), "High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives", Open biology (8), pp 160196 [35] Gräslund S., Nordlund P., Weigelt J et al (2008), "Protein production and purification", Nature methods (2), pp 135 40 [36] Sørensen H P , Mortensen K K (2005), "Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli", Microbial cell factories (1), pp [37] Arechaga I., Miroux B., Karrasch S et al (2000), "Characterisation of new intracellular membranes in Escherichia coli accompanying large scale over‐production of the b subunit of F1Fo ATP synthase", FEBS letters 482 (3), pp 215-219 [38] Bessette P H., Åslund F., Beckwith J et al (1999), "Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm", Proceedings of the National Academy of Sciences 96 (24), pp 13703-13708 [39] Hartl F U , Hayer-Hartl M (2002), "Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein", Science 295 (5561), pp 1852-1858 [40] Lu X., He S., Zong H et al (2016), "Improved 1, 2, 4-butanetriol production from an engineered Escherichia coli by co-expression of different chaperone proteins", World Journal of Microbiology and Biotechnology 32 (9), pp 149 [41] Shuo-shuo C., Xue-zheng L , Ji-hong S (2011), "Effects of co-expression of molecular chaperones on heterologous soluble expression of the cold-active lipase Lip-948", Protein Expr Purif 77 (2), pp 166-172 [42] Gustafsson C., Govindarajan S , Minshull J (2004), "Codon bias and heterologous protein expression", Trends Biotechnol 22 (7), pp 346-353 [43] Novagen (2013), "pET system manual", novagen [44] Bird L E (2011), "High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli", Methods 55 (1), pp 29-37 [45] Costa S J., Almeida A., Castro A et al (2013), "The novel Fh8 and H fusion partners for soluble protein expression in Escherichia coli: a comparison with the traditional gene fusion technology", Appl Microbiol Biotechnol 97 (15), pp 6779-6791 [46] Singh S M , Panda A K (2005), "Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins", J Biosci Bioeng 99 (4), pp 303-310 [47] Scopes R K (2001), "Strategies for protein purification", Curr Protoc Protein Sci Chapter 1, pp Unit 1.2 [48] Bornhorst J A , Falke J J (2000), "[16] Purification of proteins using polyhistidine affinity tags", Methods in enzymology, Elsevier, pp 245-254 [49] Sambrook J , Russell D W (2006), "Preparation and transformation of competent E coli using calcium chloride", Cold Spring Harbor Protocols 2006 (1), pp pdb prot3932 [50] Hameed U , Khan M A (2014), "Lactose Induced Expression of Thermotoga petrophila α-amylase Gene Regulated by T7 Promoter in E coli Codon Plus (DE3)", International Journal of Agriculture & Biology 16 (4) [51] Kale S P., Milde L., Trapp M K et al (2008), "Requirement of LaeA for secondary metabolism and sclerotial production in Aspergillus flavus", Fungal Genetics and Biology 45 (10), pp 1422-1429 41 PHỤ LỤC Phụ lục Trình tự nucleotid gen mã hoá cho KojA từ A oryzae RIB40 (GeneID: 5995965, UniProtKB/Swiss-Prot: Q2U5I0.1 ATGCGTGTCGCGACACAGCTAAGGGTCGGCATCGTCGGTGGCGGATGGAACGGC TGCCATCTTGCTTTAGAGCTCAAGAAACAGGGCCACCGAGTTTCTTTGTTCGAGC AGAAGCCTGATATCTTTCAAGGCGTCTCAGGAAACTTTGGTATCCGCTTGCACAA GGGGCCACACTACCCTCGGTCTAAAGCAACTCGAGACAGCTGCCGTGAAGCCTTG GTCAAGTTCTGTGAGACGTATCCCGAACTAGTCGTCCACCATGAATCCGCGATAT ATGCACACGGCGAAGCGGACGCTCTGGGGAACCCATCGAAGGTCTCGGATGAGG CATTCAGGGATGTATGCTACGAATCTCCTGAGTGTACTGCGGTTGATCCGAAGGC GAATGGTTTCCAGGGCCTCATCAGCGCATACAATCTGGATGAACCCAGCGTCGCT ATTGGCGACCGACTCCGGAATACATTCAAAGAGAAACTTGGTCGTGCAGGCATCT ACGTGCACCTCAATGCAACAGTCGACCGTATCATCCACACCGAGGACACCAACG CATTCAAACCGGGGACGGGCAGTACGTCTTTGACGTAGTGATCAACGCCACCGGT TATACCAGCCTTCTGCCACAAAATATTGCAGATGCTCTTCCGGTTGACATTGGCAT CACCTATCAGACCTGTATTGCTCTCGTTTACGAAGACCAGCAGCCACAGGAAAAG CCTCTTTCCTTCATTGTCATGGATGGCTGGTTTCCCTGCGTGATGCCGGCGATCGA CACAAACGAGCCCCTTCAGAAGAAGTATATCTTGACACACGGCAGTTACACCATC CTCGGATCATTCGACCGTCACGAGGAGGGTCAAGAGCTTCTGGATAGTCTGGACG AGGAAGCTATCGCTGCTCGGATCAAGCCCCACTGTGAGCGGGAGATTACCCGGTT CTGGCCCGGATTTCTCGATCGGTTCCAGTACCGCGGCTGGAAGGGCAGTGTCCTG GCCAAGTTAAAGACCACATCCGAATTCCGAAGCAGTTTGACGTTTGAAAAAGAC GGCGTGATCCACATCTTCCCCGGCAAGGTGAGCAACGTTGTAACGGCTGCCGAGG AAGTGGTTCCTCTGATCAATGACATTGCGCGCCGACGGCACGGTGTGGTTCGGGA GTGGAATGGCGTACGCTTCACTGTGAGCAGCGCCTTCCACACCCACAGCAAGGG ATTGGCGATAAGCCAGGGCTGGGCGAGCACCACACTAGCAACTTGCAGACCTAT GTTTCACTAGTGACTGCAAACTAA Phụ lục Trình tự acid amin SUMO: MSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLR RLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG] 42 Phụ lục Đường chuẩn Bradford 0.8 0.7 OD595 nm 0.6 0.5 0.4 y = 0.6653x + 0.0123 R² = 0.9984 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 C (mg/ml) 43 1.2