Nghiên cứu phát triển dạng bào chế cho thuốc điều trị vết thương mạn tính dựa trên protein pdgf bb tái tổ hợp

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Tên nhiệm vụ: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN DẠNG BÀO CHẾ CHO THUỐC ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG MẠN TÍNH DỰA TRÊN PROTEIN PDGF-BB TÁI TỔ HỢP Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Chủ nhiệm nhiệm vụ: Nguyễn Trí Nhân Tp Hồ Chí Minh, năm 2020 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Tên nhiệm vụ: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN DẠNG BÀO CHẾ CHO THUỐC ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG MẠN TÍNH DỰA TRÊN PROTEIN PDGF-BB TÁI TỔ HỢP (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 30/10/2020) Chủ nhiệm nhiệm vụ Nguyễn Trí Nhân Cơ quan chủ trì nhiệm vụ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Tp Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 10 năm 2020 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG 1 Tên nhiệm vụ: Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Lĩnh vực Y dược Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Nguyễn Trí Nhân Ngày, tháng, năm sinh: 29/8/1982 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Tiến sỹ Chức danh khoa học: Giảng viên Chức vụ: Trưởng khoa Điện thoại: Tổ chức: 08-38355273 Nhà riêng: Mobile: 0913-119183 Fax: E-mail: ntrnhan@hcmus.edu.vn Tên tổ chức công tác: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Địa tổ chức: 227 Nguyễn Văn Cừ, phường 4, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh Địa nhà riêng: TWB-15-10A Chung cư Lê Thành, 198A Mã Lò, P Bình Trị Đơng A, Q Bình Tân, TP.HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Điện thoại: 028 38353193 Fax: 08 38350096 Website: www.hcmus.edu.vn Địa chỉ: 227 Nguyễn Văn Cừ, phường 4, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh Họ tên thủ trưởng tổ chức: Trần Linh Thước Số tài khoản: 3713.0.1056908.0000 Kho bạc: Nhà Nước, Quận 5, TP.HCM Tên quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học – Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 11/ năm 2017 đến tháng 4/ năm 2020 i - Thực tế thực hiện: từ tháng 12/ năm 2017 đến tháng 10/năm 2020 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng năm 2020 đến tháng 10 năm 2020 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 2506 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 1506 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: 1000 tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT … Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 753 602,4 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 20/3/2019 753 21/4/2020 602,4 Ghi (Số đề nghị tốn) 753 602,4 c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Thực tế đạt Tổng NSKH 574 324 Nguồ n khác 250 Tổng NSKH 1817 1067 750 1.065,269 0 0 0 0 115 2506 115 1506 1000 75,231 1.355,4 Nguồn khác 214,9 - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số Số, thời gian ban Tên văn Ghi TT hành văn 1076/QĐ-SKHCN Quyết định việc phê duyệt nhiệm vụ khoa ngày 09/11/2017 học công nghệ ii Số 199/2017/HĐSKHCN ngày 09/11/2017 Số 485/QĐ-SKHCN ngày 30/5/2018 Hợp đồng thực nhiệm vụ nghiên cứu khoa học công nghệ Quyết định việc phê duyệt kế hoạch lựa chọn nhà thầu gói thầu nhiệm vụ khoa học công nghệ: “Nghiên cứu phát triển dạng bào chế cho thuốc điều trị vết thương mạn tính dựa protein PDGF-BB tái tổ hợp” Số 349/QĐ-SKHCN Quyết định việc điều chỉnh định số ngày 20/4/2020 1076/QĐ-SKHCN ngày 09 tháng 11 năm 2017 Sở Khoa học Công nghệ Số 05/2020/PLHĐ- Phụ lục hợp đồng thực nhiệm vụ nghiên SKHCN ngày cứu khoa học công nghệ 24/4/2020 Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Công ty Cổ phần dược phẩm dược liệu Pharmedic Tên tổ chức tham gia thực Công ty Cổ phần dược phẩm dược liệu Pharmedic Nội dung tham gia chủ yếu Xây dựng tiêu chuẩn sở phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu chế phẩm gel rhPDGF-BB 0,01% Xây dựng công thức quy trình bào chế gel rhPGDF-BB 0,01% Báo cáo đánh giá chế phẩm mơ hình động vật Sản phẩm chủ yếu đạt Bộ tiêu chuẩn sở, thẩm định phương pháp đánh giá hoạt lực sinh học Cơng thức quy trình bào chế gel rhPDGF-BB 0,01% đạt tiêu chuẩn sở Đã báo cáo chế phẩm khơng gây kích ứng da có hiệu làm lành vết thương mơ hình chuột đái tháo đường Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, khơng 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực Nội dung tham gia iii Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi * TS Nguyễn Trí Nhân PGS.TS Đặng Thị Phương Thảo ThS Lê Mai Hương Xuân Xây dựng thuyết minh TS đề tài, báo cáo tổng kết Nguyễn Trí Tham gia quản lý thực Nhân tất nội dung nghiên cứu Góp ý báo cáo tổng kết PGS.TS Xây dựng tiêu chuẩn Đặng Thị phương pháp kiểm Phương nghiệm nguyên liệu Thảo Xây dựng quy trình lên ThS Lê men thu nhận nguyên Mai Hương liệu thô đáp ứng quy Xuân mô sản xuất 1000 tuýp gel Xây dựng quy trình lên men thu nhận nguyên liệu thô đáp ứng quy ThS Ngô mô sản xuất 1000 tuýp Thị Huyền gel Trang Nghiên cứu điều kiện bảo quản protein rhPDGF-BB nguyên liệu Xây dựng quy trình tinh chế thu nhận ThS rhPDGF-BB có độ tinh Nguyễn >= 95% đáp ứng Hiếu Nghĩa quy mô sản xuất 1000 tuýp gel ThS Ngô Thị Huyền Trang ThS Nguyễn Hiếu Nghĩa TS Nguyễn Thị Mỹ Trinh CN Đoàn CN Đoàn Thúy Vân Thúy Vân TS Nguyễn Thị Mỹ Trinh Thuyết minh đề tài Báo cáo tổng hợp kết Bộ tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu rhPDGF-BB dựa Dược điển Việt Nam V Dược điển Mỹ USP40 Quy trình lên men sản xuất trung bình 9,77±1,63g rhPDGFBB Quy trình lên men sản xuất trung bình 9,77±1,63g rhPDGFBB Điều kiện bảo quản nguyên liệu thô rhPDGF-BB dịch lên men - 20oC tuần Quy trình tinh chế sắc ký trao đổi cation cột tự nhồi 400 ml thu trung bình 3,08 ± 0,16g rhPDGF-BB có độ tinh ≥95%/1 mẻ tinh chế Xây dựng tiêu chuẩn Bộ tiêu chuẩn kiểm phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu nghiệm nguyên liệu dựa Dược điển Việt Nam V Dược điển Mỹ USP40 Thẩm định phương pháp đánh giá hoạt lực Nghiên cứu điều kiện Điều kiện bảo quản bảo quản protein nguyên liệu rhPDGFrhPDGF-BB nguyên BB tinh sạch: trữ liệu đệm acetate 100 mM pH 4,5, đệm citrate mM pH 6,5, đệm phosphate mM pH 4,5 4oC 12 tuần iv DS Nguyễn Xuân Thảo DS Nguyễn Xuân Thảo DS Bùi Huỳnh Quốc Đạt DS Bùi Huỳnh Quốc Đạt 10 TS Vũ Thanh Thảo TS Vũ Thanh Thảo Xây dựng tiêu chuẩn sở phương pháp kiểm nghiệm gel rhPDGF-BB 0,01% Thiết lập quy trình tạo sản phẩm gel chứa 0,01% rhPDGF-BB quy mô 1000 tuýp Đánh giá độ an toàn hiệu sản phẩm mơ hình chuột Cố vấn khoa học TS.DS TS.DS Thiết lập quy trình tạo 11 Trần Cát Trần Cát sản phẩm gel chứa Đông Đông 0,01% rhPDGF-BB quy mô 1000 Tình hình hợp tác quốc tế: Khơng có Bộ tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm gel rhPDGF-BB 0,01% dựa Dược điển Việt Nam V Dược điển Mỹ USP40 Thẩm định phương pháp đánh giá hoạt lực Cơng thức quy trình bào chế gel rhPDGFBB 0,01% đạt tiêu chuẩn sở ổn định sau tháng bảo quản Báo cáo cho thấy gel rhPDGF-BB 0,01% khơng gây kích ứng da có khả làm lành vết thương hiệu mơ hình chuột đái tháo đường Cơng thức quy trình bào chế gel rhPDGFBB 0,01% đạt tiêu chuẩn sở Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Khơng có Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Xây dựng quy trình lên men thu nhận ngun liệu thơ đáp ứng qui mô sản xuất 1000 tuýp gel Xây dựng quy trình tinh chế thu nhận rhPDGFBB có độ tinh ≥95% đáp ứng qui mô sản xuất 1000 tuýp gel Nghiên cứu điều kiện bảo quản protein rhPDGF-BB nguyên liệu Yêu cầu khoa học cần đạt Ghi Theo kế hoạch Thực tế đạt Thu nhận 6-12g nguyên liệu rhPDGFBB thơ Thu trung bình 9,77±1,63g Đạt u cầu đặt Thu nhận 3g rhPDGF-BB có độ tinh ≥95% Thu trung bình 3,08 ± 0,16g ≥95% Đạt yêu cầu đặt Nguyên liệu rhPDGF-BB ổn định tối thiểu 12 tháng Nguyên liệu ổn định 12 tuần Theo dõi thêm đến 12 tháng v Xây dựng tiêu chuẩn phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu rhPDGF-BB Bộ tiêu chuẩn phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với yêu cầu USP 40 BP 2016 Báo cáo thẩm định phương pháp Thiết lập quy trình tạo sản phẩm gel chứa 0,01% rhPGDF-BB quy mô 1000 tuýp 1000 tuýp gel chứa 0,01% rhPDGF-BB đạt tiêu chuẩn sở ổn định tối thiểu 12 tháng Bộ tiêu chuẩn phương pháp kiểm Xây dựng tiêu chuẩn nghiệm gel chứa sở phương pháp kiểm rhPDGF-BB theo quy nghiệm gel rhPDGF-BB định Được điển Việt 0,01% Nam IV Báo cáo thẩm định phương pháp Báo cáo tính an Đánh giá độ an tồn tồn tính kích ứng hiệu sản phẩm da mơ hình chuột Báo cáo hiệu mơ hình động vật Bộ tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V USP 40 Đạt yêu Báo cáo thẩm định cầu đặt phương pháp đánh giá hoạt lực sinh học 1000 tuýp gel chứa 0,01% Theo dõi rhPDGF-BB đạt thêm độ ổn tiêu chuẩn sở định ổn định sau 12 tháng tháng bảo quản Bộ tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V USP 40 Báo cáo thẩm định phương pháp đánh giá hoạt lực sinh học Đạt yêu cầu đặt Báo cáo tính kích ứng da thỏ Báo cáo hiệu mơ hình chuột đái tháo đường Đạt yêu cầu đặt III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu rhPDGF-BB nguyên liệu, độ tinh ≥95%, hoạt lực ≥106 IU/mg Gel rhPDGF-BB 0,01%, đạt tiêu chuẩn sở ổn định ≥12 tháng Số lượng Theo kế Thực tế hoạch đạt Đơn vị đo Gram 3,08 Tuýp 1000 1000 Ghi Hoạt lực đạt 2,04x105 IU/mg Ổn định sau tháng bảo quản - Hoạt lực đặt ban đầu ≥106 IU/mg, cao hoạt lực chất chuẩn rhPDGF-BB WHO 7,5x105 IU/mg Mẫu thực tế thu có hoạt lực 2,04x105 IU/mg, thấp chất chuẩn cao mẫu tương tự Ấn Độ sản xuất gấp nhiều lần (mẫu rhPDGF-BB Ấn Độ có hoạt tính tương đương 47% mẫu rhPDGF-BB sản xuất) b) Sản phẩm Dạng II: vi Số TT Tên sản phẩm Quy trình lên men thu nhận nguyên liệu thô rhPDGF-BB đáp ứng qui mô sản xuất 1000 gel bơi Quy trình tinh chế thu nhận rhPDGF-BB có độ tinh ≥95% đáp ứng qui mô sản xuất 1000 tuýp gel bôi Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi Thu nhận 6-12g nguyên liệu rhPDGFBB thô Thu 9,77 ± 1,63g nguyên Đạt yêu cầu liệu rhPDGFBB thơ Thu nhận 3g rhPDGFBB có độ tinh ≥95% Thu 3,08 ± 0,16g rhPDGFĐạt yêu cầu BB có độ tinh ≥95% Nghiên cứu điều kiện bảo quản protein rhPDGF-BB nguyên liệu thô nguyên liệu tinh Báo cáo liệu theo dõi độ ổn định nguyên liệu Tiêu chuẩn sở phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu Bộ tiêu chuẩn phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với yêu cầu USP 40 BP 2016 Báo cáo thẩm định phương pháp Chế phẩm Gel rhPDGF-BB 0,01% đạt tiêu chuẩn sở Công thức bào chế và kiểm nghiệm xây dựng quy trình bào độc lập Viện Kiểm chế gel chứa rhPGDF- nghiệm thuốc BB TP.HCM Báo cáo liệu theo dõi độ ổn định chế phẩm Bộ tiêu chuẩn phương pháp kiểm Tiêu chuẩn sở nghiệm gel chứa phương pháp kiểm rhPDGF-BB theo quy nghiệm gel chứa định Dược Điển Việt rhPDGF-BB Nam Báo cáo thẩm định phương pháp vii Báo cáo liệu theo dõi độ ổn định nguyên liệu thô nguyên liệu tinh Bộ tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V USP 40 Báo cáo thẩm định phương pháp đánh giá hoạt lực sinh học Theo dõi thêm độ ổn định nguyên liệu tinh đến 12 tháng Đạt yêu cầu Chế phẩm gel rhPDGF-BB 0,01% đạt tiêu chuẩn sở ổn định sau tháng bảo quản Tiến hành thêm kiểm nghiệm độc lập theo dõi độ ổn định chế phẩm gel 12 tháng Bộ tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V USP 40 Báo cáo thẩm định phương pháp đánh giá Đạt yêu cầu Báo cáo đánh giá chế phẩm mơ hình động vật Báo cáo tính an tồn Báo cáo tính kích ứng da Báo cáo hiệu mơ hình động vật hoạt lực sinh học Báo cáo tính kích ứng da thỏ Báo cáo hiệu mơ hình chuột đái tháo đường Đạt u cầu c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Bài báo Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt 01 quốc tế, 02 03 báo báo đăng kỉ yếu nước hội nghị Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) Int J Life Sci Scienti Res., Hội nghị CNSH Toàn quốc 2018 2020 d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sỹ Tiến sỹ Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt 0 Ghi (Thời gian kết thúc) đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu cơng nghiệp: Khơng có e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế: Khơng có Đánh giá hiệu nhiệm vụ mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: Làm chủ công nghệ lên men tinh protein tái tổ hợp quy mô 25 L Làm chủ công nghệ bào chế gel rhPDGF-BB 0,01% Làm chủ phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu protein tái tổ hợp chế phẩm gel rhPDGF-BB 0,01% b) Hiệu kinh tế xã hội: Chế phẩm gel rhPDGF-BB 0,01% công ty Pharmedic khảo sát sơ nhu cầu thị trường trước công ty đề xuất hợp tác với Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐHQG-HCM Ngoài trình bày phần mở đầu, số lượng bệnh nhân mắc vết thương mạn tính chiếm tỉ lệ lớn so với vết thương thông thường (theo thống kê Khoa Liền Vết Thương - Viện Bỏng Quốc Gia vào năm 2014 430 bệnh nhân theo dõi, viii -8 68,8 ± 15,0 103.0 62.5 4,22 ± 0,21 4.63 4.13 -4 147,2 ± 25,9 117.8 93.5 4,98 ± 0,17 4.77 4.54 232,0 ± 10,5 158.8 132.0 5,45 ± 0,04 5.07 4.88 209,6 ± 27,7 150.7 154.0 5,34 ± 0,14 5.02 5.04 229,8 ± 7,6 146.9 158.4 5,44 ± 0,03 4.99 5.06 12 225,5 ± 7,5 150.1 162.8 5,42 ± 0,03 5.01 5.09 16 232,9 ± 4,7 145.1 173.9 5,45 ± 0,02 4.98 5.16 20 245,5 ± 1,3 140.8 149.5 5,50 ± 0,01 4.95 5.01 24 263,8 ± 17,5 151.4 149.7 5,57 ± 0,07 5.02 5.01 28 264,5 ± 26,4 141.5 140.8 5,57 ± 0,10 4.95 4.95 32 270,1 ± 22,8 137.0 130.1 5,60 ± 0,08 4.92 4.87 36 277,9 ± 14,2 128.0 129.0 5,63 ± 0,05 4.85 4.86 40 279,6 ± 7,7 124.9 101.1 5,63 ± 0,03 4.83 4.62 44 278,8 ± 15,0 117.5 80.6 5,63 ± 0,05 4.77 4.39 48 295,3 ± 14,7 78.1 85.7 5,69 ± 0,05 4.36 4.45 52 304,2 ± 9,4 5,72 ± 0,03 56 310,6 ± 14,5 5,74 ± 0,05 60 316,9 ± 10,8 5,76 ± 0,03 64 339,3 ± 24,6 5,83 ± 0,07 68 347,8 ± 14,9 5,85 ± 0,04 72 342,1 ± 27,3 5,83 ± 0,08 R Phụ lục Kết biểu protein theo thời gian cảm ứng lên men thể tích 25 L Lần (KDa) 94 67 43 LWM 12 24 Lần 36 48 12 24 36 48 30 20 14.4 Phụ lục Kết biểu protein lên men thể tích 25 L so sánh với thực thể tích 7,5 L (mg/mL) Giờ cảm 25 L ứng (h) 7,5 L PDGF Khác PDGF Khác 0 41,75 ± 3,79 80,09 ± 2,24 12 40,57 ± 11,95 76,68 ± 25,74 69,58 ± 7,55 89,22 ± 6,60 24 31,68 ± 14,40 62,87 ± 4,48 104,70 ± 1,34 104,15 ± 11,86 36 38,16 ± 29,80 48,48 ± 1,94 144,72 ± 8,64 116,41 ± 16,90 48 47,01 ± 1,43 96,58 ± 46,39 172,25 ± 5,76 143,62 ± 13,44 60 228,82 ± 8,02 188,80 ± 24,73 72 312,92 ± 20,33 280,14 ± 33,02 Phụ lục Sinh khối tươi chủng P pastoris cải thiện lên men thể tích 25 L so với trước cải thiện Giờ cảm ứng (h) WCW (g/L) 25 L ln WCW 25 L cải 25 L cải 25 L 25 L cải 25 L cải thiện (1) thiện (1) thiện (2) S thiện (2) -36 10.8 14.1 2.38 2.65 -32 21 13.7 3.04 2.62 -28 29.1 22.3 3.37 3.10 -24 7.7 ± 1.8 36.3 28.5 2.03 ± 0.24 3.59 3.35 -20 13.4 ± 2.3 47.3 30 2.58 ± 0.18 3.86 3.40 -16 12.5 ± 75.9 44.1 2.51 ± 0.24 4.33 3.79 -12 19.7 ± 1.8 107 78.8 2.98 ± 0.09 4.67 4.37 -8 30.1 ± 8.9 140.4 126.6 3.38 ± 0.3 4.94 4.84 -4 46.6 ± 16.9 173 156.6 3.81 ± 0.37 5.15 5.05 82.8 ± 28.6 208.8 187.4 4.38 ± 0.35 5.34 5.23 105.7 ± 17.2 190 198.3 4.65 ± 0.16 5.25 5.29 145.4 ± 19 187.5 186.6 4.98 ± 0.13 5.23 5.23 12 152.4 ± 2.3 185.3 186 5.03 ± 0.02 5.22 5.23 16 152.7 ± 8.1 179 183.7 5.03 ± 0.05 5.19 5.21 20 156.5 ± 188.4 189.4 5.05 ± 0.06 5.24 5.24 24 159.5 ± 20.4 189.6 198.6 5.07 ± 0.13 5.24 5.29 28 145.2 ± 6.2 191.3 185.5 4.98 ± 0.04 5.25 5.22 32 150.6 ± 1.2 191.1 190.4 5.01 ± 0.01 5.25 5.25 36 141.2 ± 0.5 192.1 193.8 4.95 ± 5.26 5.27 40 133.6 ± 4.9 204.5 203.2 4.89 ± 0.04 5.32 5.31 44 128.5 ± 0.7 195 201.5 4.86 ± 0.01 5.27 5.31 48 113 ± 16.8 192.2 203.4 4.72 ± 0.15 5.26 5.32 52 187.4 207.5 5.23 5.34 56 191.4 209.5 5.25 5.34 T 60 193 209.6 5.26 5.35 64 194.3 195.7 5.27 5.28 68 200.3 209.3 5.30 5.34 72 191.2 209.3 5.25 5.34 Phụ lục 10 Kết biểu protein cải thiện lên men thể tích 25 L (mg/L) Giờ cảm ứng (h) PDGF Protein khác 0±0 77.05 ± 80.93 12 28.53 ± 8.7 111.11 ± 84.67 24 83.34 ± 3.01 116.49 ± 69.29 36 97.76 ± 4.14 110.88 ± 56.14 48 135.96 ± 0.11 109.56 ± 40.46 60 155.66 ± 15.44 93.41 ± 24.44 72 143.88 ± 27 93.69 ± 29.57 U Phụ lục 11 Kết biểu protein theo thời gian cảm ứng cải thiện lên men thể tích 25 L Phụ lục 12 Sinh khối tươi chủng P pastoris lên men thể tích 25 L phương pháp xung methanol pha cảm ứng 25 L xung methanol (1) 25 L xung methanol (2) Giờ Giờ cảm WCW ứng ln WCW cảm WCW ứng ln WCW -32 10.3 2.33 -32 12.0 2.48 -28 11.7 2.46 -28 12.8 2.55 -24 20.9 3.04 -24 16.9 2.83 -20 24.4 3.19 -20 33.3 3.51 -16 34.6 3.54 -16 44.1 3.79 V -12 52.3 3.96 -12 53.2 3.97 -8 79.7 4.38 -8 86.9 4.46 -5 114.4 4.74 -4 118.2 4.77 187.4 5.23 194 5.27 178.3 5.18 190.2 5.25 187.9 5.24 200.6 5.30 13 182.5 5.21 12 194.4 5.27 16 190.4 5.25 16 199.2 5.29 20 188.4 5.24 20 201.8 5.31 24 197.4 5.29 24 199.0 5.29 29.25 207.4 5.33 28 204.8 5.32 32 201.7 5.31 32 196.9 5.28 36 211.6 5.35 36 209.5 5.34 40 220.9 5.40 40 209.5 5.34 44 222.0 5.40 44 205.8 5.33 48 228.2 5.43 48 211.9 5.36 52 235.8 5.46 52 218.5 5.39 56 227.5 5.43 56 222.0 5.40 60 235.6 5.46 60 229.0 5.43 64 240.2 5.48 64 231.3 5.44 68 240.1 5.48 68 229.5 5.44 72 252.3 5.53 72 235.2 5.46 76 255.9 5.54 76 239.3 5.48 80 254.5 5.54 80 243.7 5.50 W 84 262.1 5.57 84 240.6 5.48 88 261.1 5.56 88 243.7 5.50 92 268.0 5.59 92 247.8 5.51 96 271.1 5.60 95.5 257.5 5.55 100 274.2 5.61 100 262.5 5.57 104 281.9 5.64 104 263.5 5.57 108 272.8 5.61 110 261.8 5.57 112 270.3 5.60 112 262.1 5.57 116 276.8 5.62 116 259.1 5.56 120 276.6 5.62 120 269.3 5.60 Phụ lục 13 Kết biểu protein lên men thể tích 25 L phương pháp xung methanol pha cảm ứng (mg/L) Giờ cảm ứng (h) PDGF Protein khác 0.3 ± 0.18 55.04 ± 22.62 12 34.85 ± 4.65 69.54 ± 11.84 24 80.16 ± 17.59 93.9 ± 12.54 36 105.66 ± 19.08 120.31 ± 14.57 48 138.08 ± 15.76 132.34 ± 11.38 60 158.09 ± 7.62 169.39 ± 2.16 72 193.15 ± 18.91 195.97 ± 13.53 84 233.61 ± 32.56 229.28 ± 10.8 96 246.23 ± 25.14 255.89 ± 5.59 108 254.14 ± 31.29 288.13 ± 9.76 120 310.31 ± 27.39 281.34 ± 15.38 X Phụ lục 14 Kết biểu protein theo thời gian cảm ứng lên men thể tích 25 L phương pháp xung methanol pha cảm ứng (lần 2) Phụ lục 15 Mức độ bảo toàn hàm lượng rhPDGF-BB dịch sau lên men bảo quản -20oC mà không sử dụng chất bảo vệ % so với tuần trung bình sai số Lần Lần Lần Tuần 100 100 100 Tuần 113,1 128,4 70,7 104,1 24,4 Tuần 104,4 117,6 134,9 119,0 12,5 Tuần 68,7 143,9 154,5 122,4 38,2 Phụ lục 16 Mức độ thay đổi hoạt tính rhPDGF-BB tinh chế từ dịch sau lên men có phối trộn thêm chất bảo vệ % so với NONE NONE EDTA+GLY PMSF+GLY EDTA+PMSF+GLY Lần 100 95,8 101,9 111,9 Lần 100 100,0 104,4 102,8 Y Lần 100 102,0 106,7 98,8 Trung bình 100 99,2 104,4 104,5 2,6 2,0 5,5 Sai số Phụ lục 17 Đáp ứng tế bào NIH/3T3 với rhPDGF-BB chuẩn Z Phụ lục 18 Đáp ứng tế bào NIH/3T3 với nguyên liệu rhPDGF-BB AA BB Phụ lục 19 Đáp ứng tế bào NIH/3T3 với gel rhPDGF-BB 0,01% sau phối trộn CC Phụ lục 20 Đáp ứng tế bào NIH/3T3 với gel rhPDGF-BB 0,01% sau tháng DD Phụ lục 21 Đáp ứng tế bào NIH/3T3 với gel rhPDGF-BB 0,01% sau tháng Phụ lục 22 Đường chuẩn Bradford tháng EE Phụ lục 23 Đáp ứng tế bào NIH/3T3 với gel Healace (Ấn Độ) Nồng độ thử nghiệm (ng/ml) 160 80 40 20 10 2.5 1.25 0.625 0.313 0.156 Kết đo OD 570 nm 2.204119983 1.903089987 1.602059991 1.301029996 0.698970004 0.397940009 0.096910013 -0.20411998 -0.50445566 -0.8068754 0.793 1.066 0.649 0.452 0.335 0.281 0.174 0.163 0.153 0.168 0.160 24.8 ED50 (ng/ml) Hoạt tính đáp ứng so với chuẩn (IU/mg) x 10^5 0.91 FF