Nghiên cứu tạo peptide tat ha2 dung hợp với protein vp3 của virus thiếu máu gà chicken anemia virus hướng đến trị liệu khối u

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NGHIÊN CỨU TẠO PEPTIDE TAT-HA2 DUNG HỢP VỚI PROTEIN VP3 CỦA VIRUS THIẾU MÁU GÀ (Chicken Anemia Virus) HƯỚNG ĐẾN TRỊ LIỆU KHỐI U Đơn vị chủ trì đề tài: Phịng CNSH Động vật Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Trọng Bình Cán tham gia: TS Trịnh Như Thùy ThS Bùi Quốc Thắng ThS Nguyễn Thị Thanh Giang ThS Nguyễn Thị Nhật Uyên CN Phan Ngọc Uyên Phương Tp Hồ Chí Minh, tháng 4/2018 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v TÓM TẮT vi PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh ung thư giới Việt Nam 2.1.1.Trên giới 2.1.2.Ở Việt Nam 2.2 Các phương pháp trị liệu ung thư 2.2.1 Điều trị phẫu thuật 2.2.2 Điều trị tia xạ 2.2.3 Điều trị hoá chất 2.2.4 Điều trị nội tiết 2.2.5 Điều trị miễn dịch 2.3 Sơ lược protein apoptin virus thiếu máu gà (CAV) 11 2.3 Protein VP3 (apoptin) 11 2.3 Cấu trúc apoptin chức 12 2.4 Hoạt động protein apoptin tế bào 13 2.4 Sự định vị apoptin tế bào bình thường tế bào khối u 13 2.4 Cơ chế chết tế bào theo chương trình cảm ứng apoptin 15 2.4 Sự phosphoryl hóa apoptin đặc hiệu cho tế bào khối u 18 2.5 Tiềm peptide TAT-HA2 20 III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu 22 3.1.1 Thiết bị, dụng cụ 22 3.1.2 Hoá chất 22 3.2 Phương pháp 23 3.2.1 Nhân dịng gene mã hóa protein dung hợp apoptin, TAT-apoptin, TAT-HA2-apoptin TAT-HA2-EGFP 23 i 3.2.2 Biểu hiện, tinh phát protein dung hợp apoptin, TAT-apoptin, TATHA2-apoptin TAT-HA2-EGFP 25 3.2.3 Định vị protein tế bào 26 3.2.4 Đánh giá khả sống tế bào ung thư phổi A549 xử lý protein dung hợp 26 IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 27 4.1 Nhân dịng gene mã hố protein dung hợp apoptin, TAT-apoptin, TAT-HA2-apoptin TAT-HA2-EGFP 27 4.2 Biểu hiện, tinh phát protein dung hợp apoptin, TAT-apoptin, TAT-HA2apoptin TAT-HA2-EGFP 29 4.3 Định vị protein tế bào 41 4.4 Đánh giá khả sống tế bào ung thư phổi A549 sau xử lý protein dung hợp 47 V ĐÁNH GIÁ CHUNG 49 VI ĐỀ NGHỊ 49 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 50 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 57 ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT APC1 Anaphase-promoting complex subunit CAV Chicken Anemia Virus DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DNA Deoxyribonucleic acid E coli Escherichia coli ER Endoplasmic reticulum FADD Fas associated via death domain HAMLET Human Alpha-lactalbumin Made Lethal to Tumor cells HIV Human immunodeficiency virus IPTG Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside MBP Mannose-binding protein MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide NES Nuclear export signal NLS Nuclear localization signal PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase chain reaction PML Progressive multifocal leukoencephalopathy PKTC Proteins killing tumors cells PUMA p53 upregulated modulator of apoptosis TAT Trans-acting activator of transcription TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1 Đa dạng trị liệu dùng kết hợp apoptin với trị liệu khác 10 Hình 2.2 Cấu trúc trình tự apoptin 13 Hình 2.3 Mơ hình kích hoạt apoptin tế bào khối u tế bào bình thường 14 Hình 2.4 Mơ hình thể hoạt động apoptin tế bào khối u 17 Hình 4.1 Điện di sản phẩm PCR gene apoptin (VP3), TAT-apoptin, TATHA2-apoptin EGFP 28 Hình 4.2 Điện di sản phẩm cắt vector pET28a mang gene mục tiêu: apoptin, TAT-apoptin, TAT-HA2-apoptin TAT-HA2-EGFP (A B) 29 Hình 4.3 Điện di SDS-PAGE protein biểu trước hòa tan urea (A) sau hòa tan urea (B) 31 Hình 4.4 Kết điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh (A) sắc ký đồ tinh protein Apoptin với gel Ni Sepharose High Performance (B) 34 Hình 4.5 Kết điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh (A) sắc ký đồ tinh protein TAT-Apoptin với gel Ni Sepharose High Performance (B) 35 Hình 4.6 Kết điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh (A) sắc ký đồ tinh protein TAT-HA2-Apoptin với gel Ni Sepharose High Performance (B) 36 Hình 4.7 Kết điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh (A) sắc ký đồ tinh protein TAT-HA2-EGFP với gel Ni Sepharose High Performance (B) 37 Hình 4.8 Đồ thị thể độ tinh protein phân đoạn 38 Hình 4.9 Phát protein dung hợp Western Blotting với kháng thể chuột đơn dòng chống His (A) kháng thể chuột đa dòng chống Apoptin (B) 39 Hình 4.10 Định vị protein tế bào sau xử lý protein dung hợp 4h 43 Hình 4.11 Định vị protein tế bào sau xử lý protein dung hợp 12h 45 Hình 4.12 Định vị protein tế bào sau xử lý protein dung hợp 24h 46 Hình 4.13 Biểu đồ khả sống tế bào ung thử phổi A549 sau xử lý protein dung hợp 46 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1 Các khuynh hướng trị liệu apoptin Bảng 3.1 Trình tự mồi thiết kế 24 Bảng 4.1 Độ tinh tính theo % protein phân đoạn 38 v TÓM TẮT Ung thư nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tật tử vong toàn giới nghiên cứu điều trị ung thư nhận quan tâm lớn Apoptin biết đến với khả đặc biệt gây chết tế bào ung thư người, mã hóa gene VP3 có nguồn gốc từ virus thiếu máu gà (CAV) Tuy nhiên protein khó xâm nhập vào tế bào Protein apoptin dung hợp với peptide TAT (trans-acting activator of transcription) làm tăng hiệu vận chuyển protein apoptin vào tế bào đích, bị giữ bào quan làm giảm hiệu tiêu diệt tế bào khối u Để làm tăng hiệu thoát khỏi bẫy bào quan, tăng hiệu tiêu diệt tế bào khối u, trình tự HA2 kết hợp với TAT để giải nhược điểm Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành tạo dịng đoạn gene mã hóa protein apoptin, TAT-apoptin, TAT-HA2-apoptin, TATHA2-EGFP vào vector pET28a biểu protein dung hợp His-apoptin, HisTAT-apoptin, His-TAT-HA2-apoptin, His-TAT-HA2-EGFP Escherichia coli BL21 (DE3) (RIL), thu nhận protein sau cảm ứng 0.2 mM IPTG 180C 16 h Những protein dung hợp tinh cột sắc ký lực HisTrapTM HP Protein trước sau tinh phân tách chạy điện di SDSPAGE phát chúng nhuộm Coomassie Brillian Blue G-250 kháng thể chuột đơn dòng chống 6Histag kháng thể chuột đa dòng chống apoptin Cuối sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence) để kiểm tra định vị protein tế bào khả gây apoptosis protein dung hợp dòng tế bào ung thư Các kết có cho thấy chúng tơi nhân dịng biểu thành công protein dung hợp Đặc biệt nhận thấy lượng protein TAT-HA2-Apoptin tăng gấp lần so với TAT-Apoptin sau trình biểu tinh Sự định vị protein dung hợp dòng tế bào ung thư phổi A549 cho thấy tiềm trình tự TAT-HA2 đóng vai trò hỗ trợ cho vận chuyển protein apoptin vào nhân Thêm vào đó, thí nghiệm MTT cho thấy TAT-HA2-apoptin có vi hiệu gây chết tế bào ung thư phổi A549 sau 72h xử lý Điều cho thấy TATHA2-apoptin có triển vọng sử dụng protein dược liệu để ức chế khối u vii PHẦN THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: Nghiên cứu tạo peptide TAT-HA2 dung hợp với protein VP3 virus thiếu máu gà (Chicken Anemia Virus) hướng đến trị liệu khối u (Mã số: DV01/16-17) Đơn vị chủ trì: Phịng CNSH Động vật Đơn vị phối hợp chính: Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Trọng Bình Cán tham gia thực hiện: - Thành viên (TS Trịnh Như Thùy, ThS Bùi Quốc Thắng CN Phan Ngọc Uyên Phương) - Kỹ thuật viên (ThS Nguyễn Thị Thanh Giang, ThS Nguyễn Thị Nhật Uyên) Thời gian thực hiện: … tháng (Từ tháng 01/2016 đến tháng 12 /2017 ) Kinh phí: - Tổng dự tốn: 800.000.000 VNĐ - Kinh phí sử dụng: 791.461.100 VNĐ Mục tiêu đề tài: Mục tiêu tổng quát: Tạo protein dung hợp dùng điều trị khối u Mục tiêu cụ thể: So sánh hiệu ức chế khối u TAT-HA2-apoptin với TATapoptin Các nội dung công việc thực so với đăng ký STT Thời gian (bắt Kết thực Đánh giá đầu – kết thúc) - Nhân dòng, biểu Tháng 2/2016- - Đã nhân dòng gene Đạt hiện, tinh 10/2016 mã hóa protein dung phát protein hợp His-apoptin, Hisdung hợp HisTAT-apoptin, Hisapoptin, His-TATTAT- HA2-apoptin apoptin His-TATHis-TAT- HA2-EGFP HA2-apoptin - Đã biểu protein dung hợp Hisapoptin, His-TATapoptin, His-TATNội dung đăng ký HA2-apoptin HisTAT- HA2-EGFP - Đã tinh protein dung hợp His-apoptin, His-TAT-apoptin, His-TATHA2apoptin His-TATHA2-EGFP (độ tinh >90%) - Đã xác định Đạt khả xâm nhập vào bên dòng tế bào ung thư phổi A549 định vị protein dung hợp - Bước đầu đánh giá khả gây chết protein dung hợp dòng tế bào ung thư phổi A549 - Đánh giá hiệu Tháng gây chết tế bào ung 11/2016thư protein dung 11/2017 hợp apoptin, TATapoptin TATHA2-apoptin in vitro PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết đề tài Ung thư coi bệnh mà nhóm tế bào bất thường tăng sinh khơng kiểm sốt cách vượt khỏi quy tắc phân chia tế bào thông thường [20], sau xâm nhập vào phận liền kề thể lây lan đến quan khác (di căn) Hiện có khoảng 200 loại bệnh ung thư Ung thư nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tật tử vong toàn giới, với khoảng 14 triệu trường hợp 8,2 triệu ca tử vong liên quan đến bệnh ung thư vào năm 2012 [8] Số lượng trường hợp dự kiến tăng khoảng 70% thập kỷ tới Tỷ lệ mắc tử vong ung thư dự báo tăng vài thập kỷ tới tất khu vực giới, tăng nhanh nước thu nhập thấp [53] WHO ước tính từ năm 2008 đến PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Tên sản phẩm STT Escherichia coli BL21 DE3 Số Chỉ tiêu kinh tế - lượng kỹ thuật RIL chứa gen mã hóa protein Biểu dung hợp apoptin, TATapoptin, Ghi Đạt protein dung hợp TAT-HA2-apoptin TAT-HA2-EGFP Protein dung hợp tinh Đạt Hiệu ức chế khối u Đạt - thạc sĩ CNSH Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Tp.HCM (Luận văn xếp loại giỏi) Đào tạo thạc sĩ - Kỹ sư CNSH Tường ĐH Bách Khoa Tp.HCM Tường ĐH Nông lâm Tp.HCM (Khóa luận xếp loại giỏi) - Đã tham gia hội nghị CNSH khu vực phía Bài báo đăng hội nghị Nam năm 2016 dạng khoa học tạp chí chuyên poster ngành nước nước Đã gửi đăng tạp chí ngồi CƠNG NGHỆ SINH HỌC – JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 50 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Activation of the Tumor-Specific Death Effector Apoptin and Its Kinase by an N-Terminal Determinant of Simian Virus 40 Large T Antigen: http://jvi.asm.org/content/78/18/9965.full Accessed: 2017-11-21 [2] Adair, B.M (2000), “Immunopathogenesis of chicken anemia virus infection”, Developmental and Comparative Immunology, 24(2–3), 247–255 [3] Alwan, A and World Health Organization (2011), Global status report on noncommunicable diseases 2010., World Health Organization, Geneva, Switzerland [4] Bouwman, P and Jonkers, J (2012), “The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance”, Nature Reviews Cancer, 12(9), 587–598 [5] Bullenkamp, J., Gäken, J., Festy, F., Chong, E.Z., Ng, T and Tavassoli, M (2015), “Apoptin interacts with and regulates the activity of protein kinase C beta in cancer cells”, Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death, 20(6), 831–842 [6] Bullenkamp, J and Tavassoli, M (2014), “Signalling of Apoptin”, Advances in Experimental Medicine and Biology, 818, 11–37 [7] Burek, M., Maddika, S., Burek, C., Daniel, P., Schulze-Osthoff, K and Los, M (2006), “Apoptin-induced cell death is modulated by Bcl-2 family members and is Apaf-1 dependent”, Oncogene, 25(15), 2213–2222 [8] BW, S and CP, W (2014), World Cancer Report 2014 [9] Cleeland, C.S., Allen, J.D., Roberts, S.A., Brell, J.M., Giralt, S.A., Khakoo, A.Y., Kirch, R.A., Kwitkowski, V.E., Liao, Z and Skillings, J (2012), “Reducing the toxicity of cancer therapy: recognizing needs, taking action”, Nature Reviews Clinical Oncology, 9(8), 471–478 [10] Downward, J (1998), “Mechanisms and consequences of activation of protein kinase B/Akt”, Current Opinion in Cell Biology, 10(2), 262–267 [11] Dubendorff, J.W and Studier, F.W (1991), “Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor”, Journal of Molecular Biology, 219(1), 45–59 [12] Dyson, N., Howley, P.M., Münger, K and Harlow, E (1989), “The human papilloma virus-16 E7 oncoprotein is able to bind to the retinoblastoma gene product”, Science (New York, N.Y.), 243(4893), 934–937 [13] Flinterman, M., Farzaneh, F., Habib, N., Malik, F., Gäken, J and Tavassoli, M (2009), “Delivery of therapeutic proteins as secretable TAT fusion products”, 51 Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 17(2), 334–342 [14] Fuller, R.C (1999), “Microbial inclusions with special reference to PHA inclusions and intracellular boundary envelopes”, International Journal of Biological Macromolecules, 25(1–3), 21–29 [15] Globocan 2012: (2014), http://globocan.iarc.fr/Default.aspx Accessed: 2017- 11-20 [16] Grimm, S and Noteborn, M (2010), “Anticancer genes: inducers of tumour- specific cell death signalling”, Trends in Molecular Medicine, 16(2), 88–96 [17] Guelen, L., Paterson, H., Gäken, J., Meyers, M., Farzaneh, F and Tavassoli, M (2004), “TAT-apoptin is efficiently delivered and induces apoptosis in cancer cells”, Oncogene, 23(5), 1153–1165 [18] zur Hausen, H (1991), “Viruses in human cancers”, Science (New York, N.Y.), 254(5035), 1167–1173 [19] Heilman, D.W., Teodoro, J.G and Green, M.R (2006), “Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies”, Journal of Virology, 80(15), 7535–7545 [20] Hejmadi, M (2010), Introduction to Cancer Biology, Cancer Biology [21] Huo, D.-H., Yi, L.-N and Yang, J (2008), “Interaction with Ppil3 leads to the cytoplasmic localization of Apoptin in tumor cells”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 372(1), 14–18 [22] Janssen, K., Hofmann, T.G., Jans, D.A., Hay, R.T., Schulze-Osthoff, K and Fischer, U (2007), “n ”, Oncogene, 26(11), 1557–1566 [23] Jiang, J., Cole, D., Westwood, N., Macpherson, L., Farzaneh, F., Mufti, G., Tavassoli, M and Gäken, J (2010), “Crucial roles for protein kinase C isoforms in tumor-specific killing by apoptin”, Cancer Research, 70(18), 7242–7252 [24] Jiang, J., Cole, D., Westwood, N., Macpherson, L., Farzaneh, F., Mufti, G., Tavassoli, M and Gäken, J (2010), “Crucial roles for protein kinase C isoforms in tumor-specific killing by apoptin”, Cancer Research, 70(18), 7242–7252 [25] Johansson, C and Schwartz, S (2013), “Regulation of human papillomavirus gene expression by splicing and polyadenylation”, Nature Reviews Microbiology, 11(4), 239–251 52 [26] Kaplan, I.M., Wadia, J.S and Dowdy, S.F (2005), “Cationic TAT peptide transduction domain enters cells by macropinocytosis”, Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society, 102(1), 247–253 [27] Lee, M.-S., Sun, F.-C., Huang, C.-H., Lien, Y.-Y., Feng, S.-H., Lai, G.-H., Lee, M.-S., Chao, J., Chen, H.-J., Tzen, J.T.C and Cheng, H.-Y (2012), “Efficient production of an engineered apoptin from chicken anemia virus in a recombinant E coli for tumor therapeutic applications”, BMC biotechnology, 12, 27 [28] Leliveld, S.R., Dame, R.T., Mommaas, M.A., Koerten, H.K., Wyman, C., Danen-van Oorschot, A.A.A.M., Rohn, J.L., Noteborn, M.H.M and Abrahams, J.P (2003), “Apoptin protein multimers form distinct higher-order nucleoprotein complexes with DNA”, Nucleic Acids Research, 31(16), 4805–4813 [29] Leliveld, S.R., Noteborn, M.H.M and Abrahams, J.P (2003), “Prevalent conformations and subunit exchange in the biologically active apoptin protein multimer”, European Journal of Biochemistry, 270(17), 3619–3627 [30] Leliveld, S.R., Zhang, Y.-H., Rohn, J.L., Noteborn, M.H.M and Abrahams, J.P (2003), “Apoptin induces tumor-specific apoptosis as a globular multimer”, The Journal of Biological Chemistry, 278(11), 9042–9051 [31] Li, X., Jin, N., Mi, Z., Lian, H., Sun, W., Li, X and Zheng, H (2006), “Antitumor effects of a recombinant fowlpox virus expressing Apoptin in vivo and in vitro”, International journal of cancer Journal international du cancer, 119, 2948–57 [32] Lin, B., Kolluri, S.K., Lin, F., Liu, W., Han, Y.-H., Cao, X., Dawson, M.I., Reed, J.C and Zhang, X (2004), “Conversion of Bcl-2 from protector to killer by interaction with nuclear orphan receptor Nur77/TR3”, Cell, 116(4), 527–540 [33] Los, M., Panigrahi, S., Rashedi, I., Mandal, S., Stetefeld, J., Essmann, F and Schulze-Osthoff, K (2009), “Apoptin, a tumor-selective killer”, Biochimica Et Biophysica Acta, 1793(8), 1335–1342 [34] Maddika, S., Bay, G.H., Kroczak, T.J., Ande, S.R., Maddika, S., Wiechec, E., Gibson, S.B and Los, M (2007), “Akt is transferred to the nucleus of cells treated with apoptin, and it participates in apoptin-induced cell death”, Cell Proliferation, 40(6), 835–848 [35] Maddika, S., Panigrahi, S., Wiechec, E., Wesselborg, S., Fischer, U., Schulze- Osthoff, K and Los, M (2009), “Unscheduled Akt-triggered activation of cyclindependent kinase as a key effector mechanism of apoptin’s anticancer toxicity”, Molecular and Cellular Biology, 29(5), 1235–1248 53 [36] Maddika, S., Wiechec, E., Ande, S.R., Poon, I.K., Fischer, U., Wesselborg, S., Jans, D.A., Schulze-Osthoff, K and Los, M (2008), “Interaction with PI3-kinase contributes to the cytotoxic activity of apoptin”, Oncogene, 27(21), 3060–3065 [37] Miller, M.M and Schat, K.A (2004), “Chicken infectious anemia virus: an example of the ultimate host-parasite relationship”, Avian Diseases, 48(4), 734–745 [38] Natesan, S., Kataria, J.M., Dhama, K., Bhardwaj, N and Sylvester, A (2006), “Anti-neoplastic effect of chicken anemia virus VP3 protein (apoptin) in Rous sarcoma virus-induced tumours in chicken”, The Journal of General Virology, 87(Pt 10), 2933–2940 [39] Nicholson, K.M and Anderson, N.G (2002), “The protein kinase B/Akt signalling pathway in human malignancy”, Cellular Signalling, 14(5), 381–395 [40] Noteborn, M.H and Koch, G (1995), “Chicken anaemia virus infection: molecular basis of pathogenicity”, Avian Pathology: Journal of the W.V.P.A, 24(1), 11–31 [41] Noteborn, M.H., Todd, D., Verschueren, C.A., de Gauw, H.W., Curran, W.L., Veldkamp, S., Douglas, A.J., McNulty, M.S., van der EB, A.J and Koch, G (1994), “A single chicken anemia virus protein induces apoptosis.”, Journal of Virology, 68(1), 346–351 [42] Noteborn, M.H.M (2009), “Proteins selectively killing tumor cells”, European Journal of Pharmacology, 625(1–3), 165–173 [43] Oorschot, A.A.A.M.D.-V., Eb, A.J van der and Noteborn, M.H.M (1999), Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma III, Springer, Boston, MA [44] Oorschot, A.A.A.M.D.-V., Fischer, D.F., Grimbergen, J.M., Klein, B., Zhuang, S.-M., Falkenburg, J.H.F., Backendorf, C., Quax, P.H.A., Van der Eb, A.J and Noteborn, M.H.M (1997), “Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94(11), 5843–5847 [45] Page, W.J and Cornish, A (1993), “Growth of Azotobacter vinelandii UWD in Fish Peptone Medium and Simplified Extraction of Poly-beta-Hydroxybutyrate”, Applied and Environmental Microbiology, 59(12), 4236–4244 [46] Pavet, V., Portal, M.M., Moulin, J.C., Herbrecht, R and Gronemeyer, H (2011), “Towards novel paradigms for cancer therapy”, Oncogene, 30(1), 1–20 [47] Pietersen, A.M., van der Eb, M.M., Rademaker, H.J., van den Wollenberg, D.J., Rabelink, M.J., Kuppen, P.J., van Dierendonck, J.H., van Ormondt, H., Masman, D., van de Velde, C.J., van der Eb, A.J., Hoeben, R.C and Noteborn, M.H (1999), 54 “Specific tumor-cell killing with adenovirus vectors containing the apoptin gene”, Gene Therapy, 6(5), 882–892 [48] Poon, I.K.H., Oro, C., Dias, M.M., Zhang, J and Jans, D.A (2005), “Apoptin nuclear accumulation is modulated by a CRM1-recognized nuclear export signal that is active in normal but not in tumor cells”, Cancer Research, 65(16), 7059–7064 [49] Poon, I.K.H., Oro, C., Dias, M.M., Zhang, J.-P and Jans, D.A (2005), “A Tumor Cell-Specific Nuclear Targeting Signal within Chicken Anemia Virus VP3/Apoptin”, Journal of Virology, 79(2), 1339–1341 [50] PTD4-apoptin induces Bcl-2-insensitive apoptosis in human ce  : Anti-Cancer Drugs: http://journals.lww.com/anti- cancerdrugs/Abstract/2016/11000/PTD4_apoptin_induces_Bcl_2_insensitive_apoptos is.6.aspx Accessed: 2017-12-27 [51] Rohn, J.L., Zhang, Y.-H., Aalbers, R.I.J.M., Otto, N., Den Hertog, J., Henriquez, N.V., Van De Velde, C.J.H., Kuppen, P.J.K., Mumberg, D., Donner, P and Noteborn, M.H.M (2002), “A tumor-specific kinase activity regulates the viral death protein Apoptin”, The Journal of Biological Chemistry, 277(52), 50820–50827 [52] Roukas, T and Mantzouridou, F (2001), “An improved method for extraction of beta-carotene from Blakeslea trispora”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 90(1), 37–45 [53] The Economist Intelligence Unit (2009), Breakaway: The global burden of cancer— challenges and opportunities [54] Thomas, M.C and Chiang, C.-M (2005), “E6 oncoprotein represses p53- dependent gene activation via inhibition of protein acetylation independently of inducing p53 degradation”, Molecular Cell, 17(2), 251–264 [55] Van Hee, P., Middelberg, A.P.J., Van Der Lans, R.G.J.M and Van Der Wielen, L.A.M (2004), “Relation between cell disruption conditions, cell debris particle size, and inclusion body release”, Biotechnology and Bioengineering, 88(1), 100–110 [56] Wadia, J.S., Stan, R.V and Dowdy, S.F (2004), “Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis”, Nature Medicine, 10(3), 310–315 [57] Wadia, J.S., Wagner, M.V., Ezhevsky, S.A and Dowdy, S.F (2004), “Apoptin/VP3 Contains a Concentration-Dependent Nuclear Localization Signal (NLS), Not a Tumorigenic Selective NLS”, Journal of Virology, 78(11), 6077–6078 55 [58] Walker, S.G and Lyddiatt, A (1999), “Processing of nanoparticulate bioproducts: application and optimisation of aqueous two-phase systems”, Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 74(3), 250–255 [59] Wangsa-Wirawan, N.D., O’Neill, B.K and Middelberg, A.P (2001), “Physicochemical characteristics of LR3-IGF1 protein inclusion bodies: electrophoretic mobility studies”, Biotechnology Progress, 17(4), 786–790 [60] Ye, S., Kang, N., Chen, M., Wang, C., Wang, T., Wang, Y., Liu, Y., Li, D and Ren, L (2015), “Tat/HA2 Peptides Conjugated AuNR@pNIPAAm as a Photosensitizer Carrier for Near Infrared Triggered Photodynamic Therapy”, Molecular Pharmaceutics, 12(7), 2444–2458 [61] Yuasa, N., Taniguchi, T and Yoshida, I (1979), “Isolation and Some Characteristics of an Agent Inducing Anemia in Chicks”, Avian Diseases, 23(2), 366– 385 [62] Zhuang, S.M., Landegent, J.E., Verschueren, C.A., Falkenburg, J.H., van Ormondt, H., van der Eb, A.J and Noteborn, M.H (1995), “Apoptin, a protein encoded by chicken anemia virus, induces cell death in various human hematologic malignant cells in vitro”, Leukemia, Suppl 1, S118-120 [63] Zhuang, S.M., Shvarts, A., van Ormondt, H., Jochemsen, A.G., van der Eb, A.J and Noteborn, M.H (1995), “Apoptin, a protein derived from chicken anemia virus, induces p53-independent apoptosis in human osteosarcoma cells”, Cancer Research, 55(3), 486–489 ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Phòng CNSH Động vật Chủ nhiệm đề tài ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Phó Giám đốc phụ trách Phịng QLKH-HTQT ………, ngày tháng năm 20 Giám đốc 56 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Protein apoptin - Trình tự gene apoptin sau tối ưu hoá ATGAACGCTCTCCAGGAGGATACCCCGCCGGGGCCATCAACAGTGTTTC GTCCCCCGACGTCTTCGCGCCCACTGGAGACCCCGCATTGTCGTGAGAT TCGTATCGGAATTGCGGGCATTACTATCACCTTAAGCCTGTGCGGATGC GCGAACGCACGCGCACCTACTCTGCGTTCGGCTACAGCCGACAACTCTG AATCGACCGGTTTTAAAAATGTCCCAGACCTGCGTACTGATCAGCCGAA ACCGCCGTCTAAAAAACGCTCTTGCGACCCTAGCGAATACCGTGTTTCT GAGTTGAAAGAGAGCCTGATCACCACGACCCCGAGTCGCCCGCGTACC GCCCGGCGTTGCATTCGCTTGTAA - Giải trình tự với mồi T7 promoter 57 - Giải trình tự với mồi T7 terminator 58 59 Phụ lục 2: Protein TAT-Apoptin - Giải trình tự với mồi T7 promoter 60 - Giải trình tự với mồi T7 terminator 61 62 Phụ lục 3: Protein TAT-HA2-Apoptin - Giải tình tự với mồi T7 promoter 63 64