Đang tải... (xem toàn văn)
Microsoft Word 6702 doc viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam viÖn c«ng nghÖ sinh häc B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi khoa häc cÊp nhµ n−íc Nghiªn cøu t¹o interleukin 2 t¸i tæ hîp dïng cho ®iÒu trÞ bÖnh ung th−[.]
viện khoa học công nghệ việt nam viện công nghệ sinh học Báo cáo tổng kết đề tài khoa học cấp nhà nớc Nghiên cứu tạo interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung th M số KC 04.33 Chủ nhiệm đề tài: PGs, ts trơng nam hải 6702 24/12/2007 hà nội - 2007 Bộ Khoa học Công nghệ Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Công nghệ Sinh học Báo cáo tổng kết Đề tài độc lập cấp Nhà nớc M số: KC 04 33 Nghiên cứu tạo interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung th Chủ nhiệm Đề tài: PGS TS Trơng nam hải 01 / 2005 06 / 2007 BỘ KHOA HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BKHCN V.CNSH BKHCN V.CNSH ÂÂÂ VKHCNVN V.CNSH Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật Đề tài NGHIÊN CỨU TẠO INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP DÙNG CHO ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Mã số: KC. 04. 33 Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học Cơ quan chủ quản: Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện: 01/2005 ‐ 06/2007 Hà Nội - 2007 Bản báo cáo viết xong ngày 15 / 12/ 2007 Tài liệu chuẩn bị sở kết thực Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC 04 33 Mọi chép phải đồng ý Viện Công nghệ sinh học Báo cáo Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Lời cảm ơn Ch nhim ti KC 04.33 xin chân thành cảm ơn cán nghiên cứu thuộc quan nghiên cứu khoa học (i) Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, (ii) Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN, Bộ Giáo dục Đào tạo (iii) Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin Sinh phẩm y tế, Bộ Y tế tham gia thực đề tài Chủ nhiệm đề tài KC 04.33 xin chân thành cám ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học khoa học tự nhiên Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin Sinh phẩm y tế ủng hộ tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị kinh phí cho tập thể cán chủ trì tham gia thực đề tài Chủ nhiệm tập thể cán nghiên cứu thực đề tài xin chân thành cảm ơn Vụ Quản lý Khoa học Công nghệ ngành KT-KT Bộ Khoa học Công nghệ Ban chủ nhiệm chương trình KC 04 tạo điều kiện thuận lợi kinh phí quản lý suốt thời gian thực đề tài CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS TS TRƯƠNG NAM HẢI Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 Báo cáo Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 MỤC LỤC DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP BÀI TÓM TẮT 11 LỜI MỞ ĐẦU 15 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC 17 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGỒI 17 1.1.1 Ung thư liệu pháp chữa trị ung thư 17 1.1.2 Ung thư thận u hắc tố .18 1.1.3 Các liệu pháp chữa trị ung thư 19 1.1.4 Interleukin-2 ứng dụng điều trị ung thư 19 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 23 CHƯƠNG LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 26 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CẦN THỰC HIỆN 26 2.2.1 Tạo dòng gen IL-2 26 2.2.2 Tạo đột biến điểm gen IL-2 .26 2.2.3 Biểu gen IL-2 hệ biểu khác 27 2.2.4 Nghiên cứu tối ưu điều kiện lên men cho chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang gen IL-2 27 2.2.5 Tách chiết, tinh chế IL-2 từ dịch lên men nghiên cứu tính chất IL-2 27 2.2.6 Đánh giá chất lượng IL-2 27 2.3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 2.3.1 Vật liệu 29 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 30 CHƯƠNG NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN 47 3.1 KẾT QUẢ TẠO DÒNG GEN IL-2 47 3.1.1 Tách chiết RNA tổng số từ người tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2 .47 3.1.2 Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1-TA 48 3.1.3 Xác định trình tự nucleotide gen IL-2 49 3.1.4 Kết luận 50 3.2 KẾT QUẢ TẠO ĐỘT BIẾN GEN IL-2 .51 3.2.1 Tạo đột biến điểm làm điểm glycosyl hóa thay Cys125 Ser125 51 3.2.2 Gây hồi biến Ser25 thành Leu25 54 3.2.3 Kết luận 58 3.3 KẾT QUẢ BIỂU HIỆN IL-2 TRONG CÁC HỆ BIỂU HIỆN KHÁC NHAU 59 3.3.1 Biểu gen lai Trx-rhIL2MN tế bào vi khuẩn E coli 59 3.3.2 Biểu gen lai Trx-rhIL2MN nấm men P pastoris .63 3.3.3 Biểu gen rhIL2 dạng riêng lẻ nấm men P pastoris 65 3.3.4 Kết luận 68 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 Báo cáo Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 3.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TÁI TỔ HỢP MANG GEN IL-2 Ở BÌNH TAM GIÁC VÀ TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN 5L, 14L .69 3.4.1 Kết lên men tổng hợp IL-2 tái tổ hợp bình tam giác .69 3.4.2 Kết lên men sản xuất IL-2 tái tổ hợp hệ thống Bioflo 110 dung tích 5, 14L .73 3.4.3 Kết luận 74 3.5 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ IL-2 TỪ DỊCH LÊN MEN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT 75 3.5.1 Tách chiết tinh chế IL-2 sắc ký lực 75 3.5.2 Cắt protein lai Enterokinase lọc IL-2 qua cột sắc ký lực kiểm tra khả bắt cặp đặc hiệu IL-2 Western blot 76 3.5.3 Kết luận 77 3.6 KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU VỀ BẢO QUẢN MẪU IL-2 78 3.7 THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MƠ HÌNH TẾ BÀO NI CẤY CTLL-2 79 3.7.1 Điều kiện tối ưu để nhân bảo quản dòng tế bào CTLL-2 79 3.7.2 Xác định hoạt tính sinh học mẫu rhIL2MN biểu E coli BL21 .80 3.7.3 Xác định hoạt tính sinh học mẫu rhIL2 biểu P pastoris .82 3.7.4 Kết luận 83 3.8 THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MƠ HÌNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 84 3.8.1 Kết nghiên cứu 84 3.8.2 Kết luận 97 3.9 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG IL-2 .98 3.9.1 Hiệu giá sản phẩm IL-2 98 3.9.2 Tính vơ trùng sản phẩm IL-2 98 3.9.3 Tính an tồn sản phẩm IL-2 98 3.9.4 Chất gây sốt sản phẩm IL-2 98 3.9.5 Tính chất lý hóa sản phẩm 99 3.9.6 Kết luận 99 CHƯƠNG TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 100 4.1 KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC 100 4.2 TỔNG HỢP CÁC SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC SO VỚI ĐĂNG KÝ 102 4.3 TRÌNH ĐỘ CƠNG NGHỆ .104 4.4 KHẢ NĂNG ÁP DỤNG 104 4.5 ĐÀO TẠO 105 4.6 HỢP TÁC QUỐC TẾ 105 4.7 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ 106 4.8 DANH SÁCH CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ .106 4.9 HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI 107 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 110 5.1 KẾT LUẬN 110 5.2 ĐỀ NGHỊ 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO 112 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 Báo cáo Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 MỤC LỤC CÁC HÌNH Hình Sự phát triển tế bào ung thư 18 Hình Cấu trúc không gian Interleukin-2 20 Hình Sự tác động ProleukinRIL-2 lên tế bào ung thư 23 Hình Tóm tắt nội dung nghiên cứu theo sơ đồ .28 Hình Điện di RNA tổng số tách từ mẫu mô lách người Việt Nam 47 Hình Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 .48 Hình Kết cắt kiểm tra DNA plasmid enzyme EcoR I .48 Hình Kết so sánh trình tự IL-2 nhận với trình tự ngân hàng gen quốc tế NCBI 49 Hình So sánh trình tự amino acid dịch mã gen IL-2 nhận .50 Protein_IL-2) trình tự amino acid đăng kí ngân hàng liệu gen 50 quốc tế với số đăng ký NP_000577 50 Hình 10 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 0,8% 52 Hình 11 Kết cắt kiểm tra DNA plasmid dòng biến nạp Not I Nco I .53 Hình 12 Kết đọc trình tự nucleotide dịng số chứa gen rhIL2 54 Hình 13 Cấu trúc hai plasmid pTZ600 pTZ900 56 Hình 14 Sơ đồ mơ tả q trình tạo đột biến điểm định hướng tạo gen Trx-rhIL2-MN 57 Hình 15 Kết đọc trình tự gen hồi biến (phải) so với gen chưa hồi biến (trái) 58 Hình 16 Điện di SDS-PAGE protein Trx-rhIL2MN gel polyacrylamide 12,5% .60 Hình 17 Western blot với kháng thể kháng hIL-2 61 Hình 18 Điện di protein rhIL2 dạng tan không tan gel polyacrylamide 12,5% 61 Hình 19 Ảnh phổ MS/MS mảnh peptide 634,4 dalton mang điện tích +2 Trx nhận dạng A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS 62 Hình 20 Ảnh phổ TOF MS MS/MS mảnh peptide 874,6 dalton mang điện tích 2+ IL-2 nhận dạng A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS 63 Hình 21 Các peptide nhận dạng qua khối phổ từ băng protein .63 có kích thước 32 kDa .63 Hình 22 Ảnh biểu gen Trx-rhIL2MN 64 Hình 23 Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2 64 Hình 24 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 0,8% 66 Hình 25 Điện di SDS-PAGE sản phẩm biểu rhIL2 nấm men P pastoris 67 Hình 26 Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2 67 Hình 27 Ảnh hưởng IPTG tới biểu protein rhIL2MN 70 Hình 28 Ảnh hưởng nồng độ Amp tới biểu protein .71 Hình 29 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy 71 Hình 30 Khảo sát thời gian thu mẫu biểu .72 Hình 31 Quá trình phát triển chủng E coli Bl21 sinh tổng hợp Interleukin-2 73 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 Báo cáo Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Hình 32 Điện di protein tái tổ hợp Trx-rhIL2-MN polyacryamide gel 12,5% .73 Hình 33 Điện di protein tinh lần 755 Hình 34 Điện di protein tinh lần 755 Hình 35 Điện di sản phẩm protein cắt enterokinase gel polyacrylamide 12,5% 766 Hình 36 Mẫu Trx-rhIL2MN giữ dạng đông khô sau khoảng thời gian 78 bảo quản khác 78 Hình 37 Hình ảnh tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro 79 Hình 38 Xác định so sánh hoạt tính mẫu IL-2 thử nghiệm 81 Hình 39 Đồ thị minh hoạ phát triển tế bào CTLL-2 tác động 82 IL-2 khác (rhIL2: VN, TQ1: Trung Quốc, US: Mỹ) 82 Hình 40 Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường (Chụp kính lúp) 85 Hình 41 Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .86 Hình 42 Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường 86 Hình 43 Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .87 Hình 44 Tiêu hiển vi mô học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bình thường: 87 Hình 45 Tiêu hiển vi mô bệnh học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bị ung thư tác động AOM: 88 Hình 46 Tế bào biểu mơ niêm mạc bị giải biệt hóa, chuyển dạng 88 thành ung thư, có nhân lớn tăng sắc bắt màu kiềm đậm (PĐ: 100 x 10) .88 Hình 47 Tế bào mơ liên kết lõi lơng nhung bị giải biệt hóa, phân bố lộn xộn, chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn tăng sắc (PĐ: 100 x 10) .89 Hình 48 Chuột nhắt trắng Swiss khoẻ mạnh (a) mang u báng Sarcoma 180 90 sau 12 ngày cấy truyền (b) .90 Hình 49 Ảnh minh họa sinh khối tế bào ung thư Sarcoma 180: 91 Hình 50 Sự giảm sinh khối u báng Sarcoma 180 tác động IL2 tái tổ hợp 92 Hình 51 Biểu đồ so sánh tỷ số phát triển u lơ thí nghiệm 92 Hình 52 Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 lô đối chứng (x1000) 93 Hình 53 Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 lô tiêm chế phẩm IL2.VN .93 Hình 54 Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 tác động chế phẩm IL2.TQ 94 Hình 55 Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 bình thường kính .94 hiển vi điện tử truyền qua (x10.000) 94 Hình 56 Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 tác động IL2 VN (x10.000) .95 Tế bào chết theo kiểu hoại thư 95 Hình 57 Tế bào u báng Sarcoma 180 tác động IL2 TQ (x10.000) 95 Hình 58 Đồ thị biểu diễn thời gian sống thêm lơ chuột thí nghiệm 96 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 Báo cáo Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 MỤC LỤC CÁC BẢNG Bảng Danh sách người chủ trì thực Bảng Kết tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dịch thô 77 Bảng Dữ liệu kiểm tra hoạt tính mẫu rhIL-2MN tái tổ hợp .80 Bảng Đơn vị hoạt tính mẫu IL-2 thử nghiệm 81 Bảng Khả hoạt hoá tế bào CTLL-2 phát triển mẫu nồng độ thử khác .82 Bảng Đơn vị hoạt tính mẫu rhIL-2 thử nghiệm 82 Bảng Số trung bình u ruột chuột lơ thí nghiệm 85 Bảng Định lượng khối u báng Sarcoma 180 mổ chuột thí nghiệm 90 Bảng Tác động chế phẩm IL2-TQ IL2-VN lên thời gian sống thêm .96 chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180 96 Bảng 10 Các dòng gen dòng vector tạo đề tài 102 Bảng 11 Sản phẩm khoa học đề tài 102 Bảng 12 Danh sách học viên đào tạo 105 Bảng 13 Danh sách cán nâng cao trình độ .105 Bảng 14 Danh sách quan hợp tác quốc tế 105 Bảng 15 Kinh phí phân bổ cho hạng mục 106 Bảng 16 Tóm tắt nội dung công việc thực nội dung xin điều chỉnh 108 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 Báo cáo Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN Số TT Họ tên Học hàm, học vị PGS TS Trương Nam Hải PGS TS Phan Văn Chi TS Phạm Thị Bích Hợp PGS TS Đỗ Khắc Hiếu TS Đinh Duy Kháng PGS TS Trần Công Yên GS TS Nguyễn Đình Bảng Trần Bình Duyên GS TS Nguyễn Bá Đức Chức vụ, đơn vị Phó Viện trưởng, Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, Viện CNSH Trách nhiệm đề tài Chương mục báo cáo Chủ nhiệm đề tài Toàn nội Chủ đề mục dung báo cáo Phó Viện trưởng, Trưởng phịng Hố sinh protein, Chủ đề mục Viện CNSH Phó Phịng Cơng nghệ lên men Viện CNSH Trưởng phòng Tế bào động vật, Viện CNSH Trưởng phòng Vi sinh phân tử, Viện CNSH Trường Đại học khoa học tự nhiên, ĐHQGHN Trung tâm Quốc gia Kiểm định Vaccin sinh phẩm y học Công ty CP dược TW Mediplantex Bệnh viện K Hà Nội Chủ đề mục Chủ đề mục Chủ đề mục Chủ đề mục Chủ trì đề tài nhánh Chủ trì đề tài Chưa thực nhánh Chủ trì đề tài Chưa thực nhánh Bảng Danh sách người chủ trì thực Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Bảng 10 Sản phẩm khoa học đề tài TT Tên sản phẩm đăng ký Quy trình tạo chủng E coli có khả tổng hợp IL-2 tái tổ hợp Quy trình tạo chủng P pastoris có khả tổng hợp IL-2 tái tổ hợp dạng ngoại bào Số lượng 01 01 Các thông số điều kiện cảm ứng biểu gen IL-2 E coli Quy trình biểu gen IL-2 E coli 01 Quy trình biểu gen IL-2 P pastoris 01 Quy trình lên men chủng E coli tái tổ hợp 01 Quy trình lên men chủng P pastoris tái tổ hợp 01 Kế hoạch Kết đạt Quy trình tạo chủng 01 quy trình tạo chủng E coli biểu E coli đạt 40 μg gen IL-2 đạt khoảng 90 mg/L ILprotein/lit 2, cao gấp 2000 lần so với dự kiến Quy trình tạo chủng P pastoris đạt 50 μg protein tái tổ hợp/lit Quy trình tách chiết tinh chế protein tái tổ hợp từ chủng E coli Quy trình cơng nghệ tổng hợp sản xuất interleukin-2 Chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật 01 01 Thực từ 01/2005 – 06/2007 01 quy trình tạo chủng P pastoris tái tổ hợp có khả tổng hợp IL-2 đạt khoảng mg/L, cao gấp 100 lần so với dự kiến 01 quy trình biểu gen IL-2 E coli với điều kiện thích hợp cảm ứng với nồng độ IPTG mM, nhiệt độ nuôi cấy 30oC thời gian thu mẫu sau cảm ứng 01 quy trình biểu gen IL-2 Các thông số điều P pastoris với điều kiện cảm ứng kiện cảm ứng biểu biểu nhiệt độ 300C, nồng độ gen IL-2 methanol 0,5% thu mẫu sau 72 P pastoris cảm ứng 01 quy trình lên men chủng E coli tái tổ hợp chứa gen IL-2 hệ thống lên men Bioflo110 dung tích Các thơng số L 14 L với thông số tối ưu điều kiện lên men cho q trình lên men pH mơi tối ưu trường 6,0; nhiệt độ 37oC; sục khí chủng E coli tái tổ 0,5 vvm (lít khí/ lít mơi trường/ hợp phút); tốc độ khuấy 200 vòng/ phút, nhiệt độ cảm ứng 300C OD bắt đầu đạt 0,6 01 quy trình lên men chủng P pastoris tái tổ hợp chứa gen IL-2 hệ thống lên men Bioflo110 Các thơng số dung tích L 14 L với điều kiện lên men thông số tối ưu cho trình lên tối ưu men pH môi trường 6,0; nhiệt chủng P pastoris độ 30 oC; sục khí vvm (lít khí/ lít tái tổ hợp môi trường/ phút); tốc độ khuấy 200 vòng/ phút, nhiệt độ cảm ứng 300C OD bắt đầu đạt Quy trình tách chiết 01 quy trình tách chiết tinh chế tinh chế protein protein tái tổ hợp từ chủng E coli đạt tái tổ hợp đủ độ độ tinh 99% đặc hiệu với độ đặc hiệu cao kháng thể kháng IL-2 người Quy trình tổng thể 01 quy trình tổng thể sản xuất IL-2 sản xuất IL-2 tái tái tổ hợp tế bào E coli P tổ hợp pastoris 32 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 10 Phương pháp nghiên cứu tác động IL-2 tái tổ hợp lên động vật thực nghiệm tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro 01 Đánh giá chất lượng IL-2 tái tổ hợp theo tiêu chuẩn quốc tế Các thông số tác dụng IL-2 động vật thực nghiệm 01 phương pháp nghiên cứu tác động IL-2 tái tổ hợp lên động vật thực nghiệm 01 phương pháp nghiên cứu tác động IL-2 tái tổ hợp tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro Chế phẩm IL-2 an tồn, khơng có chất gây sốt, đảm bảo điều kiện vô trùng Trung tâm Quốc gia kiểm định vacxin đánh giá chế phẩm IL-2 đạt tiêu chuẩn hiệu giá, tính vơ trùng, tính an tồn, đạt u cầu tính chất lý hóa hàm lượng chất gây sốt ngưỡng cho phép 11 Interleukin-2 tái tổ hợp dạng đột biến thương phẩm Proleukin-2 Độ tinh khiết đạt 99% Liều lượng đủ để thử nghiệm với 10 200 mg bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn pha II 12 Chủng E coli mang gen IL-2 chủng 40 μg IL-2/L 13 Chủng P pastoris mang gen IL-2 chủng 50 μg IL-2/L 14 Đào tạo 15 Bài báo 16 Tổng kết đánh giá đề tài Đã tổng hợp đủ 200 mg IL-2 tái tổ hợp đạt độ tinh khiết 99% để đưa thử nghiệm động vật thực nghiệm, tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro đánh giá chất lượng IL-2 01 chủng E coli mang gen IL-2 đạt hiệu suất 90 mg IL-2/L 01 chủng P pastoris mang gen IL2 đạt hiệu suất mg IL-2/L, tăng 100 lần so với đăng ký - thạc sỹ (sẽ bảo vệ năm 02 thạc sỹ 2007 2008) 06 cử nhân - cử nhân - kỹ thuật viên nâng cao trình độ - Trong nước: đăng bài, Trong nước: 3-5 đăng thêm đăng ký Nước ngoài: 1-2 Bằng độc quyền giải pháp hữu ích Báo cáo tổng kết đề tài Được hội đồng khoa hội đồng nghiệm thu cấp sở học chấp nhận chấp nhận 4.3 TRÌNH ĐỘ CƠNG NGHỆ Trong trình thực đề tài trình độ công nghệ phân lập biểu gen hệ biểu khác E coli, nấm men P pastoris cán tham gia đề tài đạt trình độ quốc tế Lần Việt Nam hoàn thiện quy trình biểu hiện, lên men, tách chiết, tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ chủng vi khuẩn nấm men Đây sở quan trọng để xây dựng quy trình cơng nghệ tổng hợp sản xuất IL-2 tiến tới phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm IL-2 tái tổ hợp quy mô công nghiệp nước ta Các phương pháp nghiên cứu sử dụng đề tài từ khâu phân lập gen, đến biểu hiện, thu hồi tinh chế, nghiên cứu tác động IL-2 tái tổ hợp lên mơ hình động vật thí nghiệm tế bào CTLL-2 ni cấy in vitro đạt trình độ quốc tế, số liệu, hình ảnh bảng biểu báo cáo đưa đáng tin cậy Thực từ 01/2005 – 06/2007 33 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Các kết nghiên cứu thu đề tài khẳng định trình độ cán nghiên cứu khoa học nước ta lĩnh vực công nghệ sinh học đại ngang tầm với nước khu vực giới Các kết khoa học đề tài khơng có ý nghĩa khoa học mà cịn có ý nghĩa thực tiễn cao, góp phần phục vụ cho y học Việt Nam tương lai 4.4 KHẢ NĂNG ÁP DỤNG Chế phẩm Interleukin-2 đề tài tạo Viện CNSH chứng minh có hoạt tính tương đương với sản phẩm nước ngồi Điều mở triển vọng sản xuất ứng dụng chế phẩm việc điều trị bệnh ung thư bệnh nhân Việt Nam 4.5 ĐÀO TẠO Bảng 11 Danh sách học viên đào tạo TT Năm Họ tên Tên luận án Bậc đào tạo Đào tạo thạc sỹ 20052007 Lê Thị Thanh 2006Vũ Minh Đức 2008 20063 Đặng Trần Hoàng 2008 Đào tạo cử nhân 2006 Nguyễn Lê Hải Ly 2006 Vũ Đình Quang 2006 Kiều Thị Thu Hà TT Gây tạo mơ hình ung thư đường ruột chuột nhắt trắng dòng Swiss hóa chất nghiên cứu mơ bệnh học Nghiên cứu biểu Interleukin-2 hệ nấm men P pastoris GS115 Nghiên cứu biểu Interleukin-2 E coli BL21 (DE3) Nghiên cứu điều kiện lên men chủng E coli tái tổ hợp dùng cho sản xuất Interleukin-2 người Gây u thực nghiệm đường ruột chuột hóa chất Azoxymethane Sự biến đổi cấu trúc niêm mạc ruột non chuột nhắt trắng Swiss tác động hóa chất Azoxymethane hiệu ứng kháng u chế phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp Bảng 12 Danh sách cán nâng cao trình độ Thời gian Họ tên Nội dung đào tạo đào tạo Nâng cao kỹ thuật làm 2005-2007 Nguyễn Thị Nga Bioassay nuôi cấy tế bào động vật invitro Nâng cao kỹ thuật làm 2005-2007 Nguyễn Thị Trang Bioassay nuôi cấy tế bào động vật invitro Thực từ 01/2005 – 06/2007 Thạc sỹ Thạc sỹ Thạc sỹ Cử nhân Cử nhân Cử nhân Cơ quan Viện CNSH Viện CNSH 34 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 4.6 HỢP TÁC QUỐC TẾ Bảng 13 Danh sách quan hợp tác quốc tế Cơ quan Tên đối tác Nội lai tác Viện CNSH - Biomedical Center, - Hợp tác nghiên cứu công nghệ lên Fermentation Pilot Plant of men chủng vi sinh tái tổ hợp Uppsala University, Sweden thu hồi sản phẩm Viện CNSH GS J.M Pezzuto, trường Đại - Cung cấp dòng tế bào CTLL-2 để học Hawaii, Hoa kỳ thử nghiệm hoạt tính sinh học IL2 tái tổ hợp 4.7 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ Tổng kinh phí SNKH: 100 000 000 đồng (Hai tỷ trăm triệu đồng) Kinh phí đề tài nhận: - Năm 2005: 450 000 000 đồng - Tháng 1/ 2006 - 6/2007: 550 000 000 đồng Tổng kinh phí toán: 000 000 000 đồng Bảng 14 Kinh phí phân bổ cho hạng mục STT Mục Hạng mục chi Số tiền(đồng) Ghi 114 (*) Thuê khốn chun mơn 493 000 000 (*) theo biểu HĐ5 số CV 102+119 Nguyên vật liệu + Năng lượng 312 904 700 204/cnsh ngày 7/6/2007 117 Sửa chữa nhỏ 10 500 000 định số 1202/QĐ145 Thiết bị máy móc 21 000 000 BKHCN ngày 03/7/07 102+111+112(*) Chi phí khác 162 595 300 +115+134 Tổng 000 000 000 4.8 DANH SÁCH CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ Đặng Trần Hồng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005), Biểu gen Interleukin-2 người bị đột biến điểm glycosyl hóa gốc Cys 125 E coli Tạp chí Cơng nghệ sinh học 3(2): 149-154 Đặng Trần Hoàng, Bùi Thị Huyền, Vũ Minh Đức, Đặng Thành Nam, Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Phan Văn Chi, Trương Nam Hải (2005), Biểu gen mã hóa Interleukin-2 người (rh-IL2MN) E coli hệ pET32 nhận dạng protein tái tổ hợp phương pháp khối phổ Tạp chí Cơng nghệ sinh học 3(4): 439-444 Vũ Minh Đức, Nguyễn Tiến Minh, Đặng Trần Hoàng, Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Đinh Duy Kháng, Trương Nam Hải (2005) Gây hồi biến thay Ser25 thành Leu biểu protein lai Thioredoxin rhInterleukin-2 (Trx-rhIL2MN) P pastoris Tạp chí Cơng nghệ sinh học 3(4): 445-452 Thực từ 01/2005 – 06/2007 35 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phạm Thị Bích Hợp, Trương Nam Hải (2006) Nghiên cứu điều kiện biểu Interleukin-2 người chủng E coli BL21 Tạp chí Cơng nghệ sinh học 4(2): 1-8 Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005) Tách dịng gen mã hóa Interleukin-2 người Tạp chí Y học Việt Nam, 310 (5): 26-30 Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Vũ Minh Đức, Đặng Trần Hoàng, Trương Nam Hải (2006) Xác định hoạt tính sinh học Interleukin (IL-2) tái tổ hợp phép thử sinh học tế bào CTLL2 Đã gửi đăng Tạp chí Cơng nghệ sinh học Trần Công Yên, Nguyễn Thị Quỳ, Lê Thị Thanh, Bùi Thị Vân Khánh, Kiều Thị Thu Hà, (2007) Nghiên cứu hoạt tính chống ung thư Interleukin-2 tái tổ hợp mơ hình ung thư thực nghiệm in vivo Sẽ gửi đăng tạp chí Sinh học số đặc biệt Hội nghị Khoa học Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống năm 2007 Đã đăng ký Bằng độc quyền giải pháp hữu ích “Chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả tổng hợp Interleukin-2 người” Cục sở hữu trí tuệ, Bộ Khoa học Công nghệ (tháng 10/2006) 4.9 HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI Với cố gắng nỗ lực tập thể cán nghiên cứu, đề tài hoàn thành hầu hết nội dung nghiên cứu thuyết minh hợp đồng nghiên cứu Các kết thu đề tài có ý nghĩa quan trọng việc triển khai sản xuất ứng dụng chế phẩm IL-2 điều trị cho bệnh nhân ung thư Tuy nhiên, thời gian ngắn kinh phí cung cấp muộn nên việc thực đề tài gặp số khó khăn ảnh hưởng đến việc thực nội dung đăng ký Vì vậy, số nội dung đề tài điều chỉnh so với đăng ký ban đầu Kết đạt đề tài bước đầu, số nội dung đề tài cần phải tiếp tục nghiên cứu để hồn thiện Dưới bảng tóm tắt nội dung thực theo đăng ký ban đầu số nội dung xin điều chỉnh Bảng 15 Tóm tắt nội dung cơng việc thực nội dung xin điều chỉnh Nội dung đăng ký TT Các nội dung xin điều chỉnh (theo thuyết minh đề tài 01/2005) Tạo dịng gen IL-2 Khơng Tạo đột biến gen IL-2 Không Biểu gen IL-2 hệ biểu khác Không Nghiên cứu điều kiện lên men chủng vi sinh Không vật tái tổ hợp mang gen IL-2 quy mơ 14 lít Tách chiết tinh chế IL-2 từ dịch lên men Không nghiên cứu tính chất Xây dựng cơng nghệ thu hồi, bảo quản đóng Xin điều chỉnh chưa thực gói chế phẩm IL-2 Thử nghiệm IL-2 mơ hình tế bào ni cấy Khơng CTLL-2 động vật thí nghiệm Đánh giá chất lượng IL-2 theo tiêu chuẩn quốc tế Không Nghiên cứu thử nghiệm khả sử dụng IL9 tái tổ hợp điều trị bệnh ung thư Xin điều chỉnh chưa thực đường tiêu hoá giai đoạn muộn bệnh viện K Thực từ 01/2005 – 06/2007 36 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Trong trình thực đề tài chúng tơi có đề nghị điều chỉnh số nội dung đăng ký ban đầu, cụ thể sau: - Không thực tiếp phần tạo chủng nấm men mang gen Trx-rhIL2MN: lý sau biểu nấm men protein lai Trx-rhIL2MN bị protease tế bào nấm men phân hủy khơng thể sử dụng chủng nấm men để tổng hợp Il-2 thực bước lên men tinh chế sản phẩm nhận Sự điều chỉnh Bộ KH&CN chấp thuận đợt kiểm tra định kỳ vào cuối năm 2005 (Báo cáo định kỳ HD5 (kỳ I) ngày 27/11/2005 Bộ KH&CN phê duyệt) - Do thời gian thực đề tài có 30 tháng nên đề tài chưa kịp thực trọn vẹn nội dung “Xây dựng công nghệ thu hồi, bảo quản đóng gói chế phẩm IL-2” “Nghiên cứu thử nghiệm khả sử dụng IL-2 tái tổ hợp điều trị bệnh ung thư đường tiêu hoá giai đoạn muộn bệnh viện K” Hồ sơ xin phép Hội đồng Y đức Bộ Y tế thử nghiệm chế phẩm IL-2 bệnh nhân địi hỏi thời gian lâu, năm nên đề tài thực kịp Việc điều chỉnh Bộ KH&CN chấp nhận (Quyết định số 1202/QĐ-BKHCN ký ngày 03/07/2007 Bộ KH&CN) Phần kinh phí (100 triệu đồng) để thực nội dung hoàn trả lại ngân sách - Theo kế hoạch đề tài định tổ chức tham quan học tập CHLB Đức, tổ chức sang Công ty sản xuất IL-2 thành phố Thẩm Dương, Tỉnh Liêu Ninh Trung Quốc Bộ KH&CN chấp thuận điều chỉnh (Quyết định số 1202/ QĐ-BKHCN ký ngày 03/07/2007 Bộ KH&CN) Thực từ 01/2005 – 06/2007 37 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Đề tài đạt kết sau: - Phân lập gen mã hóa cho protein IL-2 người từ ARN tổng số tách từ tế bào lách người kỹ thuật RT-PCR - Đã thành công việc tạo gen IL-2 đột biến khả glycosyl hoá đầu N gốc Cys vị trí 125 để hạn chế việc tạo sai cầu disulfide phân tử Il-2 Hồi biến thành công đột biến Ser vị trí 25 thành Leu dịng gen IL-2 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam - Thiết kế thành công vector pET32-rhIL2MN chứa gen IL-2 đột biến để biểu E coli - Thiết kế thành công vectơ pPIC-rhIL2MN để biểu IL-2 dạng riêng lẻ nấm men P pastoris - Đã tạo thành công chủng E coli tái tổ hợp có khả biểu gen rhIL2MN với lượng IL-2 đạt khoảng 90 mg/L, cao gấp 2000 lần so với dự kiến - Đã tạo thành cơng chủng P pastoris tái tổ hợp có khả tổng hợp rhIL2MN đạt khoảng mg/L, cao gấp 100 lần so với dự kiến - Đã xây dựng quy trình biểu IL-2 tái tổ hợp E coli P pastorisvới qui mô lên men dung tích 5L 14L với điều kiện thích hợp cho q trình lên men - Đã xây dựng quy trình tách chiết tinh chế protein tái tổ hợp từ chủng E coli đạt độ tinh cao (99%) đặc hiệu với kháng thể kháng IL-2 người Chế phẩm IL-2 nhận đáp ứng điều kiện kiểm định có hoạt tính tương đương với sản phẩm nước - Đã xây dựng phương pháp nghiên cứu tác động IL-2 tái tổ hợp lên động vật thực nghiệm tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro - Đề tài công bố báo, gửi tới tạp chí khoa học đăng thời gian tới Đề tài tiến hành đăng ký Bằng độc quyền giải pháp hữu ích “Chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả tổng hợp Interleukin-2 người” tháng 10 năm 2006 nhận công văn Cục Sáng chế nhận đơn để xem xét - Đề tài góp phần việc đào tạo Thạc sỹ khoa học, Cử nhân công nghệ sinh học nghiên cứu viên nâng cao tay nghề 5.2 ĐỀ NGHỊ Để tiếp tục phát triển tiếp kết nghiên cứu, đề xuất số kiến nghị sau: 01 Tiếp tục hoàn thiện nâng cao hiệu quy trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp hệ biểu E coli tế bào nấm men P pastoris quy mô lớn làm sở cho việc triển khai sản xuất sản phẩm ứng dụng thực tiễn 02 Tiến hành tiếp tục nội dung nghiên cứu i) Công nghệ thu hồi, bảo quản, đóng gói IL-2, ii) Thử nghiệm lâm sàng chế phẩm IL-2 tái tổ hợp bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn bệnh viện K giai đoạn Thực từ 01/2005 – 06/2007 38 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 10 Nguyễn Thanh Đạm (2004) Miễn dịch điều trị bệnh ung thư Nhà xuất Y học Nguyễn Văn Đạt, Nguyễn Thanh Thuỷ, Nguyễn Huy Hồng, Nơng Văn Hải, Lê Trần Bình, Trương Nam Hải, (2000) Biểu gien mã hoá cho protein bất hoạt ribôxôm mướp đắng nấm men P pastoris Báo cáo khoa học Hội nghị Sinh học Quốc Gia, 44-47 Nguyễn Thị Trung, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thanh Thuỷ, Phạm Thuý Hồng, Trương Nam Hải, (2002) Biểu gen mã hóa cho β-amylaza từ hạt đậu tương nấm men P pastoris Tạp Khoa học Cụng nghệ, 40(3): 14-19 Hà Văn Huân, Lê Thị Bích Thảo, Phan Văn Chi (2003) Biểu tinh chế protein lai HSP2 Y học Việt Nam 284(5): tr 6-9 Nguyễn Thuý Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu & Phan Văn Chi (2003) Khả ức chế dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro Trichobakin tái tổ hợp Y học Việt Nam 284(5): 26-30 Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005) Tách dịng gen mã hóa Interleukin-2 người Tạp chí Y học Việt Nam 310(5): 26-30 Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005) Biểu gen Interleukin-2 người rhIL2 MM bị đột biến điểm glycosyl hóa gốc Cys 125 E coli Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 3(2): 149-154 Đặng Trần Hoàng, Bùi Thị Huyền, Vũ Minh Đức, Đặng Thành Nam, Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Phan Văn Chi, Trương Nam Hải (2005) Biểu gen mã hóa Interleukin-2 người (rh-IL2 MN) E colibằng hệ pET32 nhận dạng protein tái tổ hợp phương pháp khối phổ Tạp chí rhIL2ghệ Sinh học 3(4): 439-444 Vũ Minh Đức, Nguyễn Tiến Minh, Đặng Trần Hoàng, Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Đinh Duy Kháng, Trương Nam Hải (2005) Gây hồi biến thay Ser 25 thành Leu biểu protein dung hợp thioredoxin-rhInterleukin-2 (Trx-rhIL2MN) P pastoris Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 3(4): 445-452 Trần Cơng Yên, Nguyễn Thị Quỳ (2001) Một chặng đường nghiên cứu ung thư thực nghiệm (1987-2001), Hội thảo Quốc tế Sinh học, Hà nội tháng 7/2001 285-290 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Ardizzoni A, Bonavia M, Viale M, Baldini E, Mereu C, VeRNA A, et al (1994) Biologic and clinical effects of continuous infusion interleukin-2 in patients with non-small cell lung cancer Cancer 73:1353–1360 Armstrong A, Eaton D, Ewing J (2001) Cellular immuno therapy for cancer Br Med J 323:1289–1293 Atzpodien J, Kirchner H (1990) Cancer, cytokine, and toxic cells: Interleukin-2 in the immuno therapy of human neoplasms Klin Wochenscher 68(1): 1-11 Atzpodien J, Kirchner H, Illiger HJ, Metzner B, Ukena D, Schott H, Funke PJ, Gramatzki M, Jurgenson S, Wandert T, Patzelt T, Reitz M (2001) IL-2 in combination with IFN- alpha and 5-FU versus tamoxifen in metastatic renal cell carcinoma: long-term results of a controlled randomized clinical trial Br J Cancer 19;85(8):1130-6 Atzpodien J, Kirchner H, Illiger HJ, Metzner B, Ukena D, Schott H, Funke PJ, Gramatzki M, Jurgenson S, Wandert T, Patzelt T, Reitz M (2001) IL-2 in combination with IFN- alpha and 5-FU versus tamoxifen in metastatic renal cell carcinoma: long-term results of a controlled randomized clinical trial Br J Cancer 19;85(8): 1130-6 Baneyx F (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli Curr Opin Biotech 10:411-421 Bayer AL, Yu A, Adeegbe D, Malek TR (2005) Essential role for interleukin -2 for CD4+ CD25+ T regulatory cell development during the neonatal period J Exp Med 201: 769-777 Bazan, J.F (1992) Unraveling the structure of IL-2 Science 257: 410–413 Bergmann L (1990) The clinical significance of interleukin-2 Onkologie, 13(6): 416-422 10 Bordin V, Giani L, Meregalli S, Bukovec R, Vaghi MM, Mandala M, Paolorossi F, Ardizzoia A, Tancini G, BRNAi S, Frigerio F, Fumagalli L, Bordoni A, Valsuani G, Di Felice G, Lissoni P (2000) Five-year survival results of subcutaneous low-dose immuno therapy with interleukin-2 alone in metastatic renal cell cancer patients Urol Int 64(1):3-8 11 Buzio C, Andrulli S, Santi R, Pavone L, Passalacqua R, Potenzoni D, Ferrozzi F, Giacosa R, Vaglio A (2001) Long-term immuno therapy with low-dose interleukin-2 and interferon-alpha in the treatment of patients with advanced renal cell carcinoma Cancer 1;92(9):2286-2296 12 Brivio F, Lissoni P, Tisi E, Erba L, BRNAi S, Tancini G, et al.(1992) Effects of a preoperative therapy with interleukin-2 on surgeryinduced lymphocytopenia in cancer patients Oncology 49:215–218 13 Buccheri G, Marino P, Preatoni A, Ferrigno D, Moroni GA (1991) Soluble interleukin-2 receptor in lung cancer An indirect marker of tumor activity Chest 99:1433–1437 14 Bukowski RM (1997) Natural history and therapy of metastatic renal cell carcinoma: the role of interleukin-2 Cancer 80:1198–1220 15 Chomczynski P, Sacchi N (1987) Anal Biochem 162:156–160 16 Degrave W, Tavernier J, Duerinck F, Plaetinck G, Devos R, Fiers W (1983) Cloning and structure of the human interleukin chromosomal gen EMBO J 2(12): 2349- 2353 17 Devos R, Plaetinck G, Cheroute H, Simons H, Degrave W, Tavernier J, Remaut E, Fiers W (1983) Molecular cloning of human interleukin cDNA and its expression in E coli Nucleic Acids Res 11: 4307-4323 18 Dillman R.O., Church C., Barth N.M., Oldham R.K and Wiemann M.C (1997) Long-term survival after continuous infusion interleukin-2 Cancer Biother Radiopharm 12(4):243-248 19 Dore JM, Gras E, Wijdenes (1997) Expression and activity of a recombinant chimeric protein composed of pokeweed antiviral protein and of human interleukin-2 FEBS Letters 402(1): 50-52 20 De Vita F, Turitto G, Di Gracia M, Frattolillo A, Catalano G (1998) Analysis of interleukin-2/interleukin-2 receptor system in advanced non-small cell lung cancer Tumori 84:33–38 21 Dutcher JP, Creekmore S, Weiss GR, Margolin K, Markowitz AB, Roper M, et al.(1989) A phase II study of interleukin-2 and LAK cells in patients with metastatic malignant melanoma J Clin Oncol 7:477–485 Thực từ 01/2005 – 06/2007 39 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 22 Fujita T, Takaoka C, Matsui H, Taniguchi T (1983) Structure of the human interleukin gen Proc Natl Acad Sci 80:7437-7441 23 Fukushima K, Yamashita K (2001) Interleukin-2 carbonhydrate recognition modulates CTLL-2 cell proliferation J Biol Chem 276(10): 7351-7356 24 Fisher RI, Rosenberg SA, Fyfe G (2000) Long-term survival update for high-dose recombinant interleukin-2 in patients with renal cell carcinoma Cancer J Sci Am (Suppl 1):S55–S57 25 Gaffen SL, Liu KD (2004) Overview of interleukin -2 function, production and clinical applications Cytokine 28: 109- 123 26 Gez E, Rubinov R, Gaitini D, Meretyk S, Best LA, Native O, Stein A, Erlich N, Beny A, Zidan J, Haim N, Kuten A (2002) Interleukin-2, interferon-alpha, 5-fluorouracil, and vinblastine in the treatment of metastatic renal cell carcinoma: a prospective phase II study: the experience of Rambam and Lin Medical Centers 1996-2000 Cancer 15;95(8):1644-1649 27 http://www.aidsmeds.com/news/ 28 http://www.cytoshop.com/ 29 http://www.microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/Tutorials/cytokines.html, 30 http://www.microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/Tutorials/cytokines.html 31 http://www.proleukin.com/index.html 32 http://www.proleukin.com/index.html 33 Javier CS, Foucras G, Guo L, Chiodetti L, Young HA, Jane HL, Zhu J, Paul WE (2004) Interleukin plays a central role in Th2 differentiation PNAS 101(11): 3880-3885 34 Jansen RL, Slingerland R, Goey SH, Franks CR, Bolhuis RL, Stoter G (1992) Interleukin-2 and interferon-alpha in the treatment of patients with advanced non small cell lung cancer J Immunol, 12:70–73 35 Ju G et al (1987) Structure-function analysis of human interleukin J Bio Chem 262(12): 5723-5731 36 Kimura H, Yamaguchi Y (1995) Adjuvant immuno therapy with interleukin-2 and lymphokine-activated killer cells after noncurative resection of primary lung cancer Lung Cancer, 13:31–44 37 Kradin RL, Kurnick JT, Lazarus DS, Preffer FI, Dubinett SM, Pinto CE, et al (1989); Tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in treatment of advanced cancer Lancet 18:577–580 38 Krastev Z, Koltchakov V, Tomov B, Koten JW (2003), Non-melanoma and non-renal cell carcinoma malignancies treated with interleukin-2 Hepatogastroenterology 50:1006–1016 39 Liang SM, Lee N, Zoon KC, Manischewitz JF, Chollet A, Liang CM, Quinnan GV (1988) Biological characterization of human interleukin mutant proteins J Biol Chem 263(10): 4768-4772 40 Liang SM, Thatcher DR, Liang CM, Allet B (1985) Studies of structure-activity relationships of human interleukin-2 J Biol Chem 261(1): 334-337 41 Liu Y Liu Y, Su C, Hu YH, Ouyang KQ, Cai SX (2005) Studies on fermentation conditions and purification of mutant human interleukin -2 expressed in P pastoris Sheng Wu Gong Cheng Xued Bao 21(3): 430-434 42 Legha SS, Buzaid AC (1993) Role of recombinant interleukin-2 in combination with interferon and chemotherapy in the treatment of advanced melanoma Semin Oncol 2:27–32 43 Lissoni P, BRNAi S, Ardizzoia A, Paolorossi F, Tisi E, Crispino S, Tancini G (1992) Intracavitary administration of interleukin-2 as palliative therapy for neoplastic effusions Tumori 78:118–120 44 Lissoni P, BRNAi S, Rovelli F, Tancini G (1991) Lower survival in metastatic cancer patients with reduced interleuin-2 blood concentrations Preliminary report Oncology 48:125–127 45 Lissoni P, BRNAi S, Tancini G, Ardizzoia A, Ricci G, Aldeghi R, et al (1994), A randomized study with subcutaneous low-dose interleukin-2 alone vs interleukin-2 plus the pineal neurohormone melatonin in advanced solid neoplasms other than renal cancer and melanoma Br J Cancer 69:196–199 46 Lissoni P, Bordin M, Vaghi L, Fumagalli L, Bordoni A, Mengo S, et al (2002), Ten-year survival results in metastatic renal cell carcinoma patients treated with monoimmuno therapy with subcutaneous low-dose interleukin-2 Anticancer Res 22:1061–1064 47 Lissoni P, Mandala M, Curigliano G, Ferretti G, Moro C, Ardizzoia A, et al (2001), Progress report on the palliative therapy of 100 patients with neoplastic effusions by intracavitary low-dose interleukin-2 Oncology 60:308–312 48 Lissoni P, Meregalli S, Fossati V, Paolorossi F, BRNAi S, Tancini G, Frigerio F (1994) A randomized study of immuno therapy with low-dose subcutaneous interleukin-2 plus melatonin vs chemotherapy with cisplatin and etoposide as first-line therapy for advanced nonsmall cell lung cancer Tumori 80:464–467 49 McDermott D F, Atkins M B (2004) Application of IL-2 and other cytokines in renal cancer Expert Opin Bio Ther 4(4): 455-468 50 Mantovani G, Maccio A, Mulas C, Massa E, Madeddu C, Mura L, et al (2002) Dose-intense phase II study of weekly cisplatin and epidoxorubicin plus medroxyprogesterone acetate and recombinant interleukin-2 in stage IIIB-IV non-small cell lung cancer Oncology Rep 9:661–670 51 Masotti A, Fumagalli L, Morandini GC (1997) Intrapleural administration of recombinant interleukin-2 in non-small cell lung cancer with neoplastic pleural effusion Monaldi Arch Chest Dis 52:225-228 52 Melioli G, Ratto GB, Ponte M, Guastella M, Semino C, Fantino G, et al (1999) Treatment of stage IIIB non-small-cell lung cancer with surgery followed by infusion of tumor infiltrating lymphocytes and recombinant interleukin-2: a pilot study J Immunology 1996; 19:224–230 53 Mier JW, Atkins MB (2001) Pharmacology of cancer biotherapeutics Interleukin-2 Cancer principles and practice of oncology, 6th edition Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; pp 471–477 54 Nelson B H, Willerford D M (1998) Biology of the interleukin-2 receptor Adv Immunol 70: 1-81 55 Neri B, Doni L, Gemelli MT, Fulignati C, Turrini M, Di Cello V, Dominici A, Maleci M, Mottola A, Ponchietti R, Raugei A, Valsuani G, Cini G (2002) Phase II trial of weekly intravenous gemcitabine administration with interferon and interleukin-2 immuno therapy for metastatic renal cell cancer J Urol 168(3):956-958 56 Naumnik W, Chyczewska E (2001) The clinical significance of serum soluble interleukin receptor (s IL-2R) concentration in lung cancer Folia Histochem Cytobiol 39:185–186 57 Parkinson D, Abrams J, Wiernick P, Rayner AA, Margolin KA, Van Echo DA, et al.(1990) Interleukin-2 therapy in patients with metastatic malignant melanoma: a phase II study J Clin Oncol 1990; 8:1650–1656 58 Pectasides D, Varthalitis J, Kostopoulou M, Mylonakis A, Triantaphyllis D, Papadopoulou M, Dimitriadis M, Athanassiou A Thực từ 01/2005 – 06/2007 40 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 (1998) An outpatient phase II study of subcutaneous interleukin-2 and interferon-alpha-2b in combination with intravenous vinblastine in metastatic renal cell cancer Oncology 55(1):10-15 59 Ravaud A, Trufflandier N, Ferriere JM, Debled M, Palussiere J, Cany L, Gaston R, Mathoulin-Pelissier S, Bui BN (2003) Subcutaneous interleukin-2, interferon alpha-2b and 5-fluorouracil in metastatic renal cell carcinoma as second-line treatment after failure of previous immuno therapy: a phase II trial Br J Cancer 15;89(12):2213-8 60 Robb RJ, Kutny RM, Panico M, Morris HR, Chowdhry V (1984) Amino acid sequence and post-translational modification of human interleukin Proc Nat Acad Sci Mỹ.81: 6486-6490 61 Ryan CW, Vogelzang NJ, Stadler WM (2002) A phase II trial of intravenous gemcitabine and 5-fluorouracil with subcutaneous interleukin-2 and interferon-alpha in patients with metastatic renal cell carcinoma Cancer 15; 94(10):2602-2609 62 Ratto GB, Melioli G, Zino P, Mereu C, Mirabelli S, Fantino G, et al (1995) Immuno therapy with the use tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 as adjuvant treatment in stage III non-small-cell lung cancer A pilot study J Thorac Cardiovasc Surg; 109:1212–1217 63 Ratto GB, Zino P, Mirabeli S, Minuti P, Aquilina R, Fantino G, et al (1996) A randomized trial of adoptive Immuno therapy with tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 versus standard therapy in the postoperative treatment of resected non-small cell lung carcinoma Cancer 78:244–251 64 Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Chang AE, Avis FP, Leitman S, et al (1997) A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high dose interleukin-2 alone N Engl J Med 316:889– 897 65 Rubin J (1993) Interleukin-2: its biology and clinical application in patients with cancer Cancer Invest 11:460–472 66 Sambrook J, Russell DW (2001) Cold spring laboratory Harbor Press 67 Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 68 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Habor laboratory, Cold Spring Habor Laboratory Press, New York 69 Schiller JH, Morgan-Ihrig Ch, Levitt ML.(1995) Concomitant administration of interleukin-2 plus tumor necrosis factor in advanced non-small cell lung cancer Am J Clin Oncol 18:47–51 70 Steiner G, Tschachler E, Tani M, Malek TR, Shevach EM, Holter W, et al (1986) Interleukin-2 receptors on cultured marine epidermal Langerhans cells J Immunol 137:155–159 71 Smith KA, Cantrell DA (1985) Interleukin regulates its own receptors Proc Natl Acad Sci 82:864-868 72 Soori G, Dillman RO, Wiemann MC, Stark JJ, Tai F, DePriest CB, Church CK and Schulof R (2002) Phase II trial of subcutaneous interleukin-2, subcutaneous interferon-alfa, 5-fluorouracil and cis-retinoic acid in the treatment of renal cell carcinoma: final results of cancer biotherapy researcg group 94-10 Cancer Biother Radiopharm 17(2): 165-173 73 Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, Hatakeyama M, Kashima N, Fuse A, Hamuro J, Nishi-Takaoka C, Yamada G (1986) Molecular analysis of the interleukin-2 system Immunol Rev 92: 121-133 74 Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, Takaoka C, Kashima N, Yoshimoto R, Hamuro J (1983) Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2 Nature 302: 305-310 75 Testa U, Montesoro E, Bulgarini D, Samoggia P, Masciulli R, Habetswallner D, Care A, Mariani G, Giannella G, Boccoli G, et al (1990) Interleukin-2 in cancer therapy Ann Ist Super Sanita 26(3-4): 283-334 76 Tester WJ, Kim KM, Krigel RL, Bonomi PD, Glick JH, Asbury RF, et al (1999) A randomized phase II study of interleukin-2 with or without beta-interferon for patients with advanced non-small cell lung cancer A Eastern Cooperative Oncology Group study (PZ586) Lung Cancer; 25:199–206 77 Yang JC, Sherry RM, Steinberg SM, Topalian SL, Schwartzentruber DJ, Hwu P, et al (2003) Randomized study of high-dose and low-dose interleukin-2 in patients with metastatic renal cancer J Clin Oncol; 21:3127–3132 78 Yang SC, Gimm EA, Parkinson DR, Carinhas J, Fry KD, Mendiguren-Rodriguez A, et al (1991) Clinical and immunomodulatory effects of combination immuno therapy with low-dose interleukin-2 and tumor necrosis factor in patients with advanced non-small cell lung cancer: a phase I trial Cancer Res 51:3669–3676 79 Yano T, Sugio K, Yamazaki K, KAse S, Yamaguchi M, Ondo K, et al (1999) Postoperative adjuvant adoptive immuno therapy with lymph node-LAK cells and IL-2 for pathologic stage I non-small cell lung cancer Lung Cancer 26:143–148 80 Yasumoto K, Miyazaki K, Nagashima A, Ishida T, Kuda T, Yano T, Sugimachi K, et al (1987) Induction of lymphokine-activated killer cells by intrapleural instillation of recombinant interleukin-2 in patients with pleurisy due to lung cancer Cancer Res 47:2184–2187 Thực từ 01/2005 – 06/2007 41 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGỒI 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC CHƯƠNG 2.LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CẦN THỰC HIỆN 2.3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Vật liệu 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu CHƯƠNG NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN 3.1 KẾT QUẢ TẠO DÒNG GEN IL-2 3.1.1 Kết tách chiết RNA tổng số từ người tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2 3.1.2 Xác định trình tự nucleotide gen IL-2 3.2 KẾT QUẢ TẠO ĐỘT BIẾN GEN IL-2 3.2.1 Tạo đột biến điểm làm điểm glycosyl hóa thay Cys125 Ser125 3.2.2 Gây hồi biến Ser25 thành Leu25 10 3.3 KẾT QUẢ BIỂU HIỆN IL-2 TRONG CÁC HỆ BIỂU HIỆN KHÁC NHAU 11 3.3.1 Biểu gen lai Trx-rhIL2MN tế bào E coli 11 3.3.2 Biểu gen lai Trx-rhIL2MN nấm men P pastoris 13 3.3.3 Kết biểu gen rhIL2 dạng tự nhiên nấm men P pastoris 14 3.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CÁC CHỦNG TÁI TỔ HỢP MANG GEN IL-2 Ở BÌNH TAM GIÁC VÀ TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN 5L, 14L 16 3.4.1 Kết lên men tổng hợp IL-2 tái tổ hợp bình tam giác 16 3.4.2 Kết lên men sản xuất IL-2 tái tổ hợp hệ thống Bioflo 110 dung tích 5L 14L 16 3.5 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ IL-2 TỪ DỊCH LÊN MEN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT 17 3.5.1 Tách chiết tinh chế IL-2 sắc ký lực 17 3.5.2 Cắt protein dung hợp Enterokinase lọc IL-2 qua cột sắc ký lực kiểm tra khả bắt cặp đặc hiệu IL-2 Western blot 17 3.6 KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU VỀ BẢO QUẢN MẪU IL-2 19 3.7 THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MƠ HÌNH TẾ BÀO CTLL2 19 3.7.1 Điều kiện tối ưu để nhân bảo quản dòng tế bào CTLL2 19 3.7.2 Xác định hoạt tính sinh học mẫu IL-2 tái tổ hợp 20 3.7.3 Xác định hoạt tính sinh học mẫu rhIL2 biểu P pastoris 21 3.8 THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MƠ HÌNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 22 3.8.1 Gây ung thư thực nghiệm đường tiêu hóa cho chuột nhắt trắng hóa chất AOM .22 3.8.2 Kết nghiên cứu 24 3.9 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG IL-2 29 3.9.1 Hiệu giá sản phẩm IL-2 29 Thực từ 01/2005 – 06/2007 42 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 3.9.2 Tính vơ trùng sản phẩm IL-2 29 3.9.3 Tính an tồn sản phẩm IL-2 29 3.9.4 Chất gây sốt sản phẩm IL-2 29 3.9.5 Tính chất lý hóa sản phẩm 29 CHƯƠNG TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 30 4.1 KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC 30 4.2 TỔNG HỢP CÁC SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC SO VỚI ĐĂNG KÝ 31 4.3 TRÌNH ĐỘ CƠNG NGHỆ 33 4.4 KHẢ NĂNG ÁP DỤNG 33 4.5 ĐÀO TẠO 34 4.6 HỢP TÁC QUỐC TẾ 35 4.7 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ 35 4.8 DANH SÁCH CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ 35 4.9 HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI 36 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1 KẾT LUẬN 38 5.2 ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 MỤC LỤC CÁC BẢNG Bảng Kết tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dịch thô 19 Bảng Dữ liệu kiểm tra hoạt tính mẫu IL-2 tái tổ hợp 20 Bảng Đơn vị hoạt tính mẫu IL-2 thử nghiệm .21 Bảng Khả hoạt hoá tế bào CTLL-2 phát triển mẫu thí nghiệm nồng độ thử khác 21 Bảng Đơn vị hoạt tính mẫu rhIL2 thử nghiệm .22 Bảng Số trung bình u ruột chuột lơ thí nghiệm 24 Bảng Định lượng khối u báng Sarcoma 180 mổ chuột thí nghiệm 27 Bảng Tác động chế phẩm IL2-TQ IL2-VN lên thời gian sống thêm .28 chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180 28 Bảng Các dòng gen dòng vector tạo đề tài 31 Bảng 10 Sản phẩm khoa học đề tài 32 Bảng 11 Danh sách học viên đào tạo 34 Bảng 12 Danh sách cán nâng cao trình độ .34 Bảng 13 Danh sách quan hợp tác quốc tế 35 Bảng 14 Kinh phí phân bổ cho hạng mục 35 Bảng 15 Tóm tắt nội dung cơng việc thực nội dung xin điều chỉnh 36 Thực từ 01/2005 – 06/2007 43 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 MỤC LỤC CÁC HÌNH Hình Tóm tắt nội dung nghiên cứu theo sơ đồ .6 Hình Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 .7 Hình Kết cắt kiểm tra DNA plasmid enzyme EcoR I Hình Kết so sánh trình tự IL-2 nhận với trình tự ngân hàng gen quốc tế NCBI Hình So sánh trình tự amino acid dịch mã gen IL-2 nhận (Protein_IL-2) trình tự amino acid đăng kí ngân hàng liệu gen quốc tế với số đăng ký NP_000577 Hình Điện di sản phẩm PCR gel agarose 0,8% .9 Hình Kết cắt kiểm tra DNA plasmid dòng biến nạp Not I Nco I Hình Kết đọc trình tự nucleotide dịng số chứa gen rhIL2 10 Hình Kết đọc trình tự gen hồi biến (phải) so với gen chưa hồi biến (trái) 11 Hình 10 Điện di SDS-PAGE protein rhIL2 gel polyacrylamide 12,5% 11 Hình 11 Điện di protein rhIL2 dạng tan không tan gel polyacrylamide 12,5% 11 Hình 12 Western blot với kháng thể kháng hIL-2 12 Hình 13 Ảnh phổ MS/MS mảnh peptide 634,4 dalton mang điện tích +2 Trx nhận dạng A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS 12 Hình 14 Ảnh phổ TOF MS MS/MS mảnh peptide 874,6 dalton mang điện tích 2+ IL-2 nhận dạng A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS .13 Hình 15 Các peptide nhận dạng qua khối phổ từ băng protein có kích thước 32 kDa .13 Hình 16 Ảnh biểu gen Trx-rhIL-2MN .13 Hình 17 Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2 14 Hình 18 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 0.8% 15 Hình 19 Điện di SDS-PAGE sản phẩm biểu rhIL2 nấm men P pastoris 15 Hình 20 Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2 15 Hình 21 Khảo sát nồng độ IPTG .16 Hình 22 Khảo sát nồng độ Amp 16 Hình 23 Khảo sát nhiệt độ 16 Hình 24 Thời gian thu mẫu 16 Hình 25 Quá trình phát triển chủng E coli Bl21 sinh tổng hợp Interleukin-2 17 Hình 26 Điện di protein tái tổ hợp Trx-rhIL2MN polyacryamide gel 12,5% 17 Hình 27 Điện di protein tinh lần 18 Hình 28 Điện di protein tinh lần 18 Hình 29 Điện di sản phẩm protein cắt enterokinase .18 Hình 30 Mẫu Trx-IL2MN giữ dạng đông khô sau khoảng thời gian bảo quản khác 19 Hình 31 Hình ảnh tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro 20 Hình 32 Xác định so sánh hoạt tính mẫu IL-2 thử nghiệm 20 Thực từ 01/2005 – 06/2007 44 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Hình 33 Đồ thị minh hoạ phát triển tế bào CTLL-2 tác động chất thử .21 nồng độ khác .21 Hình 34 Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường 24 Hình 35 Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .24 Hình 36 Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường 24 Hình 37 Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .24 Hình 38 Tiêu hiển vi mơ học lơng nhung ruột chuột nhắt trắng bình thường: 25 Hình 39 Tiêu hiển vi mô bệnh học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bị ung thư tác động AOM 25 Hình 40 Tế bào biểu mơ niêm mạc bị giải biệt hóa, chuyển dạng 25 Hình 41 Tế bào mô liên kết lõi lông nhung bị giải biệt hóa, phân bố lộn xộn, chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn tăng sắc (PĐ: 100 x 10) 25 Hình 42 Chuột nhắt trắng Swiss khoẻ mạnh (a) mang u báng Sarcoma 180 sau 12 ngày cấy truyền (b) 26 Hình 43 Ảnh minh họa sinh khối tế bào ung thư Sarcoma 180: 26 Hình 44 Sự giảm sinh khối u báng Sarcoma 180 tác động IL2 tái tổ hợp 26 Hình 45 Biểu đồ so sánh tỷ số phát triển u lơ thí nghiệm 26 Hình 46 Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 lơ đối chứng (x1000) 27 Hình 47 Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 lô tiêm chế phẩm IL2.VN .27 Hình 48 Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 tác động chế phẩm IL2.TQ 27 Hình 49 Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 bình thường kính hiển vi điện tử truyền qua 28 Hình 50 Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 tác động IL2 VN (x10.000) .28 Hình 51 Tế bào u báng Sarcoma 180 tác động IL2 TQ (x10.000) 28 Hình 52 Đồ thị biểu diễn thời gian sống thêm lơ chuột thí nghiệm 28 Thực từ 01/2005 – 06/2007 45 Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học K thut ti KC.04.33 Lời cảm ơn Ch nhim đề tài KC 04.33 xin chân thành cảm ơn cán nghiên cứu thuộc quan nghiên cứu khoa học (i) Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, (ii) Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN, Bộ Giáo dục Đào tạo (iii) Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin Sinh phẩm y tế, Bộ Y tế tham gia thực đề tài Chủ nhiệm đề tài KC 04.33 xin chân thành cám ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học khoa học tự nhiên Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin Sinh phẩm y tế ủng hộ tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị kinh phí cho tập thể cán chủ trì tham gia thực đề tài Chủ nhiệm tập thể cán nghiên cứu thực đề tài xin chân thành cảm ơn Vụ Quản lý Khoa học Công nghệ ngành KT-KT Bộ Khoa học Công nghệ Ban chủ nhiệm chương trình KC 04 tạo điều kiện thuận lợi kinh phí quản lý suốt thời gian thực đề tài CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS TS TRƯƠNG NAM HẢI Thực từ 01/2005 – 06/2007 46