Nghiên cứu sử dụng đuôi ái lực carbohydrate binding module 20 cbm20 ứng dụng vào việc tinh sạch protein tái tổ hợp

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ (NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ĐUÔI ÁI LỰC CARBONHYDRATEBINDING MODULE 20 (CBM20) ỨNG DỤNG VÀO VIỆC TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: Trần Lê Phương Duy Thành phố Hồ Chí Minh tháng 02 - 2018 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ (NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ĐUÔI ÁI LỰC CARBONHYDRATEBINDING MODULE 20 (CBM20) ỨNG DỤNG VÀO VIỆC TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP) (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 25/01/2018) Chủ nhiệm nhiệm vụ: (ký tên) Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu (Ký ghi rõ họ tên) Trần Lê Phương Duy Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Đồn Kim Thành Thành phố Hồ Chí Minh tháng 02 - 2018 THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN Độc lập - Tự - Hạnh phúc KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 01 năm 2017 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: “Nghiên cứu sử dụng đuôi lực Carbohydrate-binding module 20 (CBM20) ứng dụng vào việc tinh protein tái tổ hợp” Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Vườn ươm Sáng tạo Khoa học Cơng nghệ trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Trần Lê Phương Duy Ngày, tháng, năm sinh: 12/06/1993 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Chức danh khoa học: Chức vụ: Nhân viên Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: Mobile: 0965653068 Fax: E-mail: phuongduytranle@gmail.com Tên tổ chức công tác: Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT Địa tổ chức: 298A Nguyễn Tất Thành phường 13 quận Tp Hồ Chí Minh Địa nhà riêng: 42 đường B phường Hiệp Bình Chánh quận Thủ Đức Tp.Hồ Chí Minh Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Điện thoại: 08 39 411 211 Fax: 08 39 404 759 E-mail: research@ntt.edu.vn Website: ntt.edu.vn Địa chỉ: 300A Nguyễn Tất Thành phường 13 quận Tp Hồ Chí Minh Họ tên thủ trưởng tổ chức: PGS TS Nguyễn Mạnh Hùng Số tài khoản: 0531002492514 Kho bạc: Vietcombank chi nhánh Bình Thạnh Tên quan chủ quản đề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học Cơng nghệ Trẻ II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 06 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017 - Thực tế thực hiện: từ tháng 06 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 80 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 80 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi Thời gian Kinh phí Thời gian Kinh phí (Số đề nghị (Tháng, năm) (Tr.đ) (Tháng, năm) (Tr.đ) toán) 6/2017 40 6/2017 40 9/2017 24 9/2017 24 12/2017 16 12/2017 16 TT c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số Nội dung TT khoản chi Theo kế hoạch Tổng NSKH Thực tế đạt Nguồn Tổng NSKH khác Trả công lao động khác 56,8337 56,8337 56,8337 56,8337 21,7786 21,7786 21,7786 21,7786 (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, Nguồn lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng 1,3877 1,3877 80 1,3877 80 1,3877 80 80 - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ cơng đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số Số, thời gian ban TT hành văn Tên văn 13/2017/HĐ – Hợp đồng thuê khoán thực đề KHCN – VƯ ngày tài Sở Khoa học Cơng nghệ 18/04/2017 Tp Hồ Chí Minh Trung tâm Ghi Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức Tên tổ chức Nội dung Sản phẩm đăng ký theo tham gia thực tham gia chủ chủ yếu đạt Thuyết minh yếu Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, khơng q 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân Tên cá nhân đăng ký theo tham gia thực Thuyết minh Nội dung tham gia Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* CN Trần Lê CN Trần Lê Phương Duy Phương Duy Quản lý chung Thuyết minh, chứng từ toán, toán… ThS Nguyễn ThS Nguyễn Tổng hợp tài Lương Hiếu Hòa Lương Hiếu Hòa liệu, báo cáo Báo cáo nghiệm thu đề nghiệm thu tài ThS Lê Quỳnh ThS Lê Quỳnh Tổng quan tài Thuyết minh Loan Loan liệu đề tài TS Vũ Văn Vân TS Vũ Văn Vân Tạo dòng Dòng tế bào biểu gene mang vector mục tiêu chứa gene mục tiêu TS Nguyễn TS Nguyễn Tinh Protein có độ Hồng Dũng Hồng Dũng protein đánh tinh cao giá kết quy trình CN Lê Phương CN Lê Phương Chuẩn bị vật Chuẩn bị hóa Un Un liệu thí nghiệm chất, tạo tế bào khả nạp - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: Theo kế hoạch Thực tế đạt Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa TT điểm, tên tổ chức hợp tác, số điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Số Theo kế hoạch Thực tế đạt TT (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa (Nội dung, thời gian, kinh Ghi chú* điểm ) phí, địa điểm ) - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Thời gian Số TT Các nội dung, công việc (Bắt đầu, kết thúc Người, chủ yếu - tháng … năm) quan (Các mốc đánh giá chủ yếu) Xây dựng thuyết minh đề tài Theo kế Thực tế đạt hoạch 06/2017 06/2017 07/2017 07/2017 06/2017 06/2017 07/2017 07/2017 10/2017 10/2017 09/2017 09/2017 10/2017 10/2017 11/2017 11/2017 thực Trần Lê Phương Duy Nội dung 1: Nghiên cứu tạo dịng gene mã hóa cho số protein mục tiêu Nội dung 1.1: Tạo dòng thành cơng đoạn gene bao gồm gene mã hóa protein CBM20 vào Vũ Văn Vân plasmid Nội dung 1.2: Biến nạp vào chủng vi khuẩn E.coli DH5α Lê Phương Uyên Nội dung 2: Nghiên cứu biểu protein mục tiêu có mang CBM20 Nội dung 2.1: Biến nạp plasmid vào tế bào khả nạp Nội dung 2.2: Biểu thành công protein tái tổ hợp thu nhận protein thô Nội dung 3: Nghiên cứu phương Lê Quỳnh Loan Nguyễn Lương Hiếu Hịa Nguyễn Hồng pháp tinh protein tái tổ hợp Dũng nhờ đuôi CBM20, sử dụng loại sắc ký (cột sắc ký amylopectinvà sắc ký rây phân tử) Nội dung 4: Khảo sát đánh giá độ tinh protein tái tổ hợp 12/2017 12/2017 vừa thu nhận Trần Lê Phương Duy - Lý thay đổi (nếu có): III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Đơn Theo kế Thực tế hoạch đạt 01 loại 01 loại 01 loại protein tái protein tái protein tái tổ tổ hợp có độ tinh tổ hợp có độ hợp có độ >70% tinh tinh >70% >90% Số lượng vị đo Sản phẩm protein tái tổ hợp có độ tinh % cao - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Yêu cầu khoa học Số TT Tên sản phẩm cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Quy trình ứng dụng 01 Quy trình 03 Quy trình lực CBM20 để biểu hiệu để thu hiệu để thu tinh protein tái tổ hợp nhận protein có nhận protein có độ tinh cao độ tinh cao (>70%) - Lý thay đổi (nếu có): (>70%) Ghi c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Bài báo khoa học quốc tế Yêu cầu khoa học Số lượng, nơi cần đạt cơng bố Theo Thực tế (Tạp chí, nhà kế hoạch đạt xuất bản) Tạp chí quốc tế 01 Bài báo có ISSN - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: Số Cấp đào tạo, Chuyên ngành TT đào tạo Thạc sỹ Số lượng Theo kế hoạch Ghi Thực tế đạt (Thời gian kết thúc) 01 Hỗ trợ đào tạo 01 - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: Số Tên sản phẩm TT đăng ký Kết Ghi Theo Thực tế (Thời gian kết kế hoạch đạt thúc) - Lý thay đổi (nếu có): e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế Số Tên kết TT ứng dụng Địa điểm Thời gian Đánh giá hiệu nhiệm vụ mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ (Nêu rõ danh mục công nghệ mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ cơng nghệ so với khu vực giới…) b) Hiệu kinh tế xã hội: (Nêu rõ hiệu làm lợi tính tiền dự kiến nhiệm vụ tạo so với sản phẩm loại thị trường…) Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra nhiệm vụ: Số Nội dung TT I Thời gian thực Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Báo cáo tiến độ Lần 10/2017 Đạt nội dung 1-3; Tiến độ cấp kinh phí hạn; Kiến nghị đẩy nhanh tiến độ thực II Nghiệm thu sở Chủ nhiệm đề tài Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký) (Họ tên, chữ ký đóng dấu) Trần Lê Phương Duy Nghiên cứu trước cho rằng, có khả đuôi Hisx6 bị cắt protease tiết dịch ni N crassa Do đó, Hisx6 không phù hợp việc tinh với protein tái tổ hợp với N.crassa Từ đó, chúng tơi dự đốn Hisx6 bị cắt protease tiết dịch nuôi N.crassa Đuôi Hisx6 chưa bị cắt sau 24h, thời điểm lượng PMO tạo thấp Sau 34 giờ, lượng PMO tiết gần đạt mức cao Hisx6 bị cắt hồn tồn Do vậy, đuôi Hisx6 không phù hợp cho protein biểu tái tổ hợp với N crassa 3.5.2 Biểu tinh protein NCU08746 đuôi CBM20 3.5.2.1 Tinh amylose resin Cột nhồi với amylose rửa 50mM acetate buffer pH 5.0 Dịch nuôi thu nhận cô đặc lại hệ thống TFF để thu nhận phần dịch Dịch nuôi tiến hành chạy qua cột, sau rửa liên tục với 100ml buffer 50mM acetate pH 5.0 Theo rửa lại 100ml buffer 50mM acetate pH 5.0 có bổ sung 50mM maltose thu phân đoạn 2ml đem phân tích SDS-PAGE Hình 3.8 Tinh chế NCU08746 với cột amylose Kết từ Hình 3.8 cho thấy khả tinh cột amylose với đuôi CBM20 tốt protein tái tổ hợp từ N.crassa Trong phân đoạn từ – 25, protein không mang đuôi CBM20 có mặt dịch ni nên khơng thể bám amylose resine bị loại bỏ hoàn tồn (khơng có protein diện phân đoạn từ 10 – 25) Tuy nhiên, rửa giải 100 mL 50 mM acetate buffer pH5.0 chứa 50 mM maltose CBM20 tách khỏi resin phân tách protein tái tổ hợp mong muốn 30 3.5.2.2 Tinh với cột S75 16/600 Hình 3.9 Tinh chế NCU08746 với cột S75 sau cột amylose, phân đoạn 0.5 mL - Các phân đoạn từ 20-50 Hình 3.9 gộp chung lại đặc xuống khoảng mL ống Vivaspin 20 (Satorius), lọc qua syring filter 0.45 μm trước đưa lên cột - Hệ thống FPLC Akta Purifier 10 phần mềm Unicorn sử dụng để điều khiển trình chạy cột Chương trình chạy: isocratic, fraction size 0.5 mL, tốc độ dòng 0.5 mL/phút 3.6 Xác định độ tinh Hình 3.10 Phân tích độ tinh phần mềm Image Lab 6.0 BioRad Phân tích độ tinh sau chạy với cột S75 16/600 phần mềm Image Lab 6.0 BioRad thể Hình 3.10 cho thấy peak 14 cho kết có độ tinh cao >90% Trong hình, peak 14 có chân rộng NCU08746 có có gắn nhiều đoạn oligosaccharide vị trí khác 31 Hình 3.11 Phổ UV/Vis NCU 08746 tinh - Các phân đoạn từ – 19 Hình 3.10 thu nhận đặc lại Vivaspin 20 cịn lại khoảng 0,7ml Sau tiến hành đo phổ UV/Vis protein sau tinh - Kết thể Hình 3.10 cho thấy độ hấp thụ phân tử 280 nm NCU08746: 280 = 74.5 mM-1.cm-1 1.9013 (mg/mL)-1.cm-1 - A280 = 0.265388 - C = 0.265388x100/74.5 = 0.356 mM C = 0.265388x100/1.9013 = 13.95 mg/mL Hình 3.12 Sắc ký đồ sản phẩm khảo sát hoạt tính NCU08746 tinh A: M NCU08746, 50 mg/mL amylose từ khoai tây, mM ascorbic acid, 50 mM acetate buffer pH 5.0 B: 50 mg/mL amylose từ khoai tây, mM ascorbic acid, 50 mM acetate buffer pH 5.0 32 Cả hai mẫu ủ 420C Kết thể Hình 3.12 cho thấy NCU08746 có hoạt tính mạnh thủy phân tinh bột phản ứng A Ngược lại mẫu đối chứng B lại khơng có ghi nhận phản ứng cắt tinh bột Do kết luận protein NCU08746 thu nhận sau q trình tinh cịn hoạt tính tốt Từ kết trình bày phía trên, chúng tơi kết luận lực CBM20 sử dụng hiệu việc dùng để tinh chế protein NCU08746 tái tổ hợp Chỉ sau hai cột thu protein có hoạt tính tốt với độ tinh >90% 3.7 Tìm hiểu tương tác CBM20 với carbohydrate khác Hình 3.13 Kiểm tra độ tương tác CBM20 với phosphoric acid swollen cellulose (PACS), beta-cyclodextrin (BCyD) có/khơng có bổ sung ascorbic acid (Asc) PACS = phosphoric acid swollen cellulose; Asc = ascorbic acid, BCyD = beta-cyclodextrin (7 đơn vị glucose) Pellet: nước sau rửa; Supernant: dịch thu sau nuôi cấy Kết thể Hình 3.13 Hình 3.14 cho thấy việc sử dụng chất nhồi cột (Phosphoric acid swollen cellulose; beta-cyclodextrin; amylopectin; cornstarch) khác cho thấy việc rửa giải đuôi lực khác Đối với mẫu nhồi cột PASC, dịch nuôi sau nuôi cấy cho lượng protein lớn Tuy nhiên, sau điện di sau ba lần rửa liên tiếp buffer acetate không bổ sung maltose lần rửa thứ nhất, lượng protein bị rửa trôi khỏi cột (đối với mẫu có bổ sung Asc khơng bỏ sung Asc) Tương tự PACS, BCyD số nghiên cứu trước công bố chất bám nhiều loại CBM Tuy nhiên, trình khảo sát với đuôi lực CBM20, lần đầu rửa buffer lượng lớn protein 33 sau ba lần rửa khơng thu protein mục tiêu Điều cho thấy NCU08746 không bám vào PACS hay BCyD Hình 3.14 Kiểm tra tương tác NCU08746 với amylopectin (AMYL) tinh bột bắp (COST) có khơng có bổ sung ascobic acid Đối với mẫu chạy qua cột nhồi tinh bột bắp, lượng protein sau ba lần rửa thu nhận lượng tương đối Tuy nhiên, mẫu chạy qua cột nhồi amylopectin cho khả bám tốt Đáng ý, NCU08746 bám tốt vào amylose khơng có mặt ascorbic acid Khi bổ sung ascorbic acid NCU08746 bám tự cắt polysaccharide nó, dẫn đến khả rửa giải amylopectin tốt Từ kết trên, chúng tơi kết luận amylopectin khảo sát chất phù hợp việc tinh chế NCU08746 34 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đề tài thực việc sử dụng đuôi lực CBM20 ứng dụng protein NCU08746 biểu chủng N crassa - Hiệu suất tinh cao, thu nhận protein tinh >90% Protein thu nhận sau tinh có hoạt tính cao - Khảo sát hoạt tính sau tinh nguồn chất khác cho kết hoạt tính sau tinh amylose từ khoai tây cho protein có hoạt tính tốt - Khảo sát sơ lực đuôi CBM20 với carbohydrate khác thấy amylopectin vật liệu phù hợp việc tinh chế NCU08746 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục hồn thiện quy trình thơng qua việc sử dụng đuôi lực CBM20 protein khác - Thử nghiệm tinh chế NCU08746 sử dụng amylopectin-vật liệu có chi phí thấp nhiều so với nhựa amylose Chủ nhiệm đề tài (Ký ghi rõ họ tên) Trần Lê Phương Duy 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] D Weinacker et al (2014), Applications of recombinant Pichia pastoris in the healthcare industry, Braz J Microbiol., 44(4), 1043-1048 [2] U Martin (2016), New record of biologics sales in 2015 exceeding the USD 150 bln threshold, La Merie Publishing, Germany [3] U Martin (2017), 2016 was another record year of biologics sales with antibodies accounting fort wo-thirds, La Merie Publishing, Germany [4] M.R Ladisch (2001), Bioseparations Engineering: Principles, Practice, and Economics, Wiley, New York [5] M Kavoosi et al (2004), Inexpensive one-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with the family carbohydrate-binding module of xylanase 10A from T maritime, Journal of Chromatography B, 807(1), 87-94 [6] K Terpe (2003), Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems, K Appl Microbiol Biotechnol, 60(5), 523-533 [7] J Arnau et al (2006), Current strategies for the use of affnity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins, Protein Expression and Purification 48 (2006) 1–13 [8] Milton T W Hearn and Danilo Acosta (2001), Applications of novel affinity cassette methods: use of peptide fusion handles for the purification of recombinant proteins, J Mol Recognit., 14, 323–369 [9] P Tomme, H Van Tilbeurgh, G Pettersson, J Van Damme, J Vandekerckhove, J Knowles, and M Teeri Claeyssens (1988), Studies of the cellulolytic system of Trichoderma reesei QM 9414 Analysis of domain function in two cellobiohydrolases by limited proteolysis, Eur J Biochem, 170, 575-581 [10] A B Boraston, D N Bolam, H J Gilbert, and G J Davies (2004), Carbohydratebinding modules: fine-tuning polysaccharide recognition, Biochem J., 382, 769-781 [11] P Tomme, A Boraston, B McLean, J Kormos, A L Creagh, K Sturch, N R Gilkes, C A Haynes, R A Warren, and D G Kilburn (1998) Characterization and affinity applications of cellulose-binding domains, J Chromatogr B, 715, 283-296 [12] V.V Vu, W T Beeson, C.M Phillips, J.H.D Cate, M.A Marletta (2014), Determinants of regioselective hydroxylation in the fungal polysaccharide monooxygenases, J Am Chem Soc., 136(2), 562–565 [13] Zhu Y, Zhang M, Kelly AR, Cheng A (2014), The carbohydrate-binding domain of overexpressed STBD1 is important for its stability and protein-protein interactions, Biosci Rep., 34(4) 36 [14] Jia X, Guo Y, Lin X, You M, Lin C, Chen L, Chen J (2017), Fusion of a family 20 carbohydrate-binding module (CBM20) with cyclodextrin glycosyltransferase of Geobacillus sp CHB1 improves catalytic efficiency, J Basic Microbiol., 57(6), 471-480 [15] Vu, V V.; Beeson, W T.; Phillips, C M.; Cate, J H D.; Marletta, M A (2014), Determinants of Regioselective Hydroxylation in the Fungal Polysaccharide Monooxygenases J Am Chem Soc., 136, 562-565 [16] Bardiya, N.; Shiu, P K T., (2007) Cyclosporin A-resistance based gene placement system for Neurospora crassa Fungal Genet Biol., 44, 307-314 [17] Margolin, B.S., Freitag, M., Selker, E.U., 1997 Improved plasmids for gene targeting at the his-3 locus of Neurospora crassa by electroporation Fungal Genet Newsl 44, 34–36 [18] "Biofuels Make a Comeback Despite Tough Economy" Worldwatch Institute 2011-0831 Retrieved 2011-08-31 [19] Regalbuto JR, (2009) Engineering Cellulosic biofuels got gasoline?, Science 14;325(5942):822-4 [20] Mahendra Rai and Silvio Silvério da Silva (2017),Nanotechnology for Bioenergy and Biofuel Production, Spinger International Publishing, Pages 300-304 [21] Foo JL, Jensen HM, Dahl RH1, George K, Keasling JD, Lee TS, Leong S, Mukhopadhyay A (2014), Improving microbial biogasoline production in Escherichia coli using tolerance engineering, MBio 2014 Nov 4;5(6):e01932 [22] Dogaris I, Mamma D, Kekos D (2013) Biotechnological production of ethanol from renewable resources by Neurospora crassa: an alternative to conventional yeast fermentations?, Appl Microbiol Biotechnol 2013 Feb;97(4):1457-73 [23] Vu VV, Beeson WT, Span EA, Farquhar ER, Marletta MA, (2014), A family of starchactive polysaccharide monooxygenases, Proc Natl Acad Sci U S A 2014 Sep 23;111(38):13822-7 [24] M.Y Noraini, Hwai Chyuan Ong, Mohamed Jan Badrul, W.T Chong, (2014), A review on potential enzymatic reaction for biofuel production from algae, Renewable and Sustainable Energy Reviews, Volume 39, November 2014, Pages 24-34 37 Phụ lục 1: Tạo dịng vi khuẩn mã hóa gene mục tiêu tế bào E.coli DH5α Tế bào E.coli DH5α sử dụng làm chủng tạo dòng phương pháp hóa biến nạp sau: Bước 1: Tạo dịng tế bào E.coli DH5α khả nạp Calcium Magnesium Sơ đồ Quy trình tạo tế bào E.coli DH5α khả nạp Calcium Magnesium - Chủng E.coli DH5α trữ tủ -800C rã đông từ từ đá lạnh Sau hút 2ml dịch vi khuẩn vào ống chứa 10ml môi trường LB lỏng (không chứa kháng sinh) ủ 370C đến OD600 đạt khoảng 0,4 chuyển ống mơi trường sang đá lạnh giữ lạnh 30 phút - Chuyển 1ml môi trường vào eppendorf 1,5ml ly tâm 6000 vòng/15 phút 40C - Loại bỏ dịch nổi, thêm 1ml MgCl2 100mM lạnh, trộn sau ly tâm 6000 vòng/15 phút 40C - Loại bỏ dịch nổi, thêm 1ml CaCl2 100mM lạnh , trộn sau ly tâm 6000 vịng/15 phút 40C - Thêm 100µl hỗn hợp 85% CaCl2 100mM 15% glycerol vào ống eppendorf giữ chủng tủ -800C 38 Bước 2: Sử dụng phương pháp sinh học phân tử tạo plasmid mang gene mã hóa mục tiêu Sơ đồ 2: Quy trình tạo dịng vi khuẩn E.coli DH5α mang plasmid pCSR-1 - Bào tử nấm M thermophile thu nhận sau q trình ni ủ 450C sau ngày tiến hành phản ứng PCR primer 1a primer 1b với chu trình nhiệt sau: 980C – 30 giây; 980C – 30 giây; 600C – 30 giây; 720C – 45 giây; 720C – 12 phút; giữ 40C (lặp lại 35 chu kỳ) Tiến hành chạy điện di tinh pGAP có kích thước khoảng 1kb - Bào tử nấm Neucrospora crassa nuôi môi trường phù hợp, sau tách genomic phương pháp CTAB Tiến hành phản ứng PCR primer 2a primer 2b với chu trình nhiệt sau: 980C – 30 giây; 980C – 30 giây; 600C – 30 giây; 720C – phút 45 giây; 720C – 12 phút; giữ 40C (lặp lại 35 chu kỳ), bổ sung DMSO từ – 10% tổng thể tích phản ứng Tiến hành chạy điện di tinh NCU08746 có kích thước khoảng 1,2kb - Chạy phản ứng Overlap Extension PCR với hai đoạn nucleotide thu nhận bên để nôi thành đoạn polynucleotide pGAP-NCU08746 với hai mồi 1a, 2b chu trình nhiệt sau: 980C – 30 giây; 980C – 30 giây; 600C – 30 giây; 720C – phút 30 giây; 720C – 12 phút; giữ 40C (lặp lại 35 chu kỳ) Tiến hành chạy gel tinh đoạn pGAP-NCU08746 39 - Plasmid pCSR-1 pGAP-NCU08746 xử lý enzyme cắt giới hạn NotI Sau thực phản ứng nối T4 ligase Bước 3: Chuyển plasmid vào tế bào E.coli DH5α phương pháp hóa biến nạp - Tế bào E.coli DH5α giữ tủ -800C rã đông việc giữ đá lạnh 30 phút - Sau hút 5µl plasmid trộn với 50µl dịch vi khuẩn vào ống eppendorf 1,5 ml, giữ đá 20 phút Shock nhiệt 420C 30 giây sau chuyển lại đá phút Thêm 950µ LB lỏng khơng chứa kháng sinh ủ lắc 370C - Sau ủ, lấy 100µl dịch vi khuẩn cấy đĩa thạch LB chứa kháng sinh ampicillin, ủ qua đêm 370C - Các khuẩn lạc mọc tiến hành chạy PCR để kiểm tra diện pGAPNCU086746 chiều đoạn nucleotide 40 Phụ lục 2: Quy trình biến nạp vào chủng biểu Neucrospora crassa Các tế bào nấm N crassa sử dụng làm chủng biểu biến nạp DNA phương pháp điện biến nạp E.coli DH5α mang plasmid 50ml Vogel’s agar Neucrospora crassa 320C, – tuần Tách plasmid Xử lý BssHII 50ml sorbitol 1M 300 ng DNA thẳng Bào tử nấm Lọc giấy lọc Rửa lần sorbitol 1M Ly tâm 3000 vòng/3 phút 50ml sorbitol 1M Thu tủa Đếm tế bào 2,5x109 bào tử/ml sorbitol 1M 40µ bào tử Giữ đá phút Điện biến nạp Điện áp: 1,55kV/cm Điện dung: 25 uFD; trở kháng 600 ohms 1ml sorbitol 1M 250µ hỗn hợp Trải đĩa Ủ 320C, – ngày Nấm mang plasmid Sơ đồ 3: Quy trình biến nạp vào chủng biểu Neucrospora crassa 41 Bước 1: Chuẩn bị DNA thẳng Các tế bào E.coli DH5α mọc đĩa thạch tách plasmid sau đo nồng độ Tiến hành cắt enzyme BssHII tinh chế lại để loại bỏ protein Bước 2: Thu nhận bào tử Neucrospora crassa - Ni chủng N crassa bình chứa 50ml mơi trường Vogel’s agar từ – tuần Sau thêm 50ml sorbitol 1M hòa tan bào tử lọc lại giấy lọc - Sau thu nhận bào tử tiến hành rửa lại với sorbitol 1M ba lần, ly tâm 3000 vòng/3 phút, thu tủa hòa tan lại với 50ml sorbitol 1M - Pha loãng đếm bào tử số lượng bào tử đạt 2,5x109 bào tử/ml sorbitol 1M Bước 3: Phương pháp điện biến nạp - Trộn 40µl bào tử (1x108) với 300 ng DNA chuyển hỗn hợp vào cuvette điện biến nạp 0,2cm (BioRad) sau giữ đá lạnh phút - Tiến hành điện biến nạp điện áp 1,5kV/cm; điện dung: 25 uFD; trở kháng 600 ohms Sau thêm 1m sorbitol 1M vào cuvette trộn pipette - Hút 250µl hỗn hợp trải đĩa thạch môi trường phù hợp ủ 320C từ -5 ngày Bước 4: Sàng lọc chủng N Crassa biểu tốt - Các khuẩn lạc mọc đĩa sau ủ qua đêm cấy chuyển sang ống thạch nghiêng chứa môi trường Vogel’s Sau ni ngày 300C tối, sau chuyển sang ni nhiệt độ phịng, sáng từ – ngày để thu lấy bào tử tương tự phụ lục - Lấy – 3ml dd chứa bào tử, vortex sau chuyển sang bình tam giác có chứa 100ml mơi trường Vogel’s có bổ sung 3% glucose, ni ủ lắc ngày 300C - Lấy 1ml dịch môi trường từ bình khuẩn lạc, đem ly tâm, thu dịch Sau tiến hành chạy SDS-PAGE để kiểm tra biểu protein 42 Nấm mang plasmid Ống thạch nghiêng ngày, 300C, tối 3-5 ngày, nhiệt độ phòng, sáng 100ml Vogel’s + 3% glucose 2ml dd bào tử ngày, 300C Thu 1ml dịch nuôi Thu dịch Kết SDSPAGE Sơ đồ 4: Quy trình kiểm tra biểu protein chủng N.crassa 43 Phụ lục 3: Tinh protein cột sắc ký lực sắc ký rây phân tử Bước 1: Xử lý cột trước sử dụng - Cột sắc ký lực nhồi cột (10ml, bán kính 1cm) amylopectin rửa 50mM acetate buffer pH 5.0 - Cột S75 tích 120 mL bảo quản dung dịch ethanol 20% Trước sử dụng, cột rửa với 240 mL nước cất lần sau rửa với 240 mL dung dịch pha động (50 mM acetate buffer pH 5.0, 150 mM NaCl) Các dung dịch lọc với màng lọc 0.45 μM khử khí chân khơng trước dùng Bước 2: Tinh cột sắc ký lực amylose - Dịch nuôi thu nhận lại lọc bỏ sinh khối cô đặc lại hệ thống Tangential Flow Filtration (TFF, Minimata System, Pall) Ly tâm thu lấy phần dịch - Rửa cột liên tục với 100ml buffer 50mM acetate pH 5.0 - Rửa giải cột 100ml buffer 50mM acetate pH 5.0 có bổ sung 50mM maltose - Thu phân đoạn rửa giải buffer có chứa Maltose Bước 3: Tinh cột S75 16/600 - Dung dịch protein sau tinh cột amylopectin tiến hành cô đặc ống Vivaspin 20 tiến hành đưa lên cột - Pha động hỗn hợp 50 mM acetate buffer pH 5.0, 150 mM NaCl Sử dụng hệ thống FPLC Akta Purifier 10 phần mềm Unicorn sử dụng để điều khiển trình chạy cột Chương trình chạy: isocratic, fraction size 0.5 mL, tốc độ dòng 0.5 mL/phút 44