Chế tạo và nghiên cứu sử dụng các chấm lượng tử cdsezns với các lớp vỏ đã được biến tính làm chất đánh dấu huỳnh quang sinh học phục vụ cho sản xuất và xuất khẩu các sản phẩm nông nghiệp

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC NGHIÊN CỨU CƠ BẢN ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG (6/2009-6/2012) SẢN PHẨM KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC CHẤM LƯỢNG TỬ CdSe/ZnS VỚI CÁC LỚP VỎ ĐÃ ĐƯỢC BIẾN TÍNH LÀM CHẤT ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG SINH HỌC, PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT VÀ XUẤT KHẨU CÁC SẢN PHẨM NÔNG NGHIỆP (MÃ SỐ 1/2/742/2009/HĐ-ĐTĐL) Cơ quan chủ trì: Viện Khoa học Vật liệu, VKHCNVN Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Quang Liêm HÀ NỘI – 7/2012 NỘI DUNG Các quy trình cơng nghệ: (i) Quy trình chế tạo chấm lượng tử CdSe CdTe (ii) Quy trình liên quan đến cơng nghệ xác định nhanh dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo vệ thực vật (iii) Quy trình cơng nghệ phát virus cúm gia cầm H5N1 (iv) Quy trình xác định nhanh, xác số lượng E coli O157:H7 phức hợp kháng thể+QDs phát quang qui mơ phịng thí nghiệm (v) Quy trình tạo phức hợp kháng thể đặc hiệu vi khuẩn E coli O157:H7 +QDs qui mơ phịng thí nghiệm (qui mơ ml/mẻ) Các biên thẩm định quy trình cơng nghệ sản phẩm Danh mục công bố khoa học minh chứng Sách xuất Kết đào tạo (i) Quy trình chế tạo chấm lượng tử CdSe CdTe i.1 Chế tạo chấm lượng tử bán dẫn CdSe TOPO/HDA phát quang hiệu suất cao vùng phổ khả kiến xanh cây-đỏ, quy mô hàng gam/mẻ Các hóa chất có độ phân tích sử dụng trực tiếp để chế tạo chấm lượng tử CdSe, CdSe/ZnS mà không cần tinh chế lại Cụ thể, cần sử dụng hoá chất sau: muối cadmium acetate Cd(CH3COO)2.2H2O, cadmium oxide (CdO) độ 99,5%; tri-n-octylphosphine oxide (TOPO, C24H51PO, Merck) 98%; tri-n-octylphosphine (TOP, C24H51P, Fluka) 90%; hexadecylamine (HDA, C16H35N, Merck) 92%; dodecylphosphonic acid (DDPA, C12H27O3P, polycarbon Inc.); oleic acid (OA, C18H34O2, Mỹ) 98%; 1octadecene (ODE, C18H36, Sigma-Aldrich) 98%; oleylamine (OLA, Merck) 98%; selenium (Poole England) 99%; zinc stearate (C36H70O2Zn, Aldrich); toluen methanol (Merck) i.1.1 Chấm lượng tử CdSe chế tạo từ hợp chất kim Hợp chất cơ-kim (ở phức TOPOCd, nhiều công bố khác Cddimethyl Cd(Me)2) TOPSe phân huỷ mơi trường chất hữu có trọng lượng phân tử lớn nhiệt độ sôi cao (ở chọn TOPOHDA) để chế tạo chấm lượng tử CdSe Tại nhiệt độ cao cỡ 260÷320 o C, tiền chất cơ-kim bị phân huỷ, giải phóng ion Se2- ion Cd2+, ion bị bao bọc môi trường hợp chất chất hữu Trong điều kiện khuấy trộn mạnh, ion Se2- Cd2+ kết hợp với để sinh mầm vi tinh thể đầu tiên; từ với lượng ion Se2và Cd2+ tồn dung dịch phản ứng tiếp tục cung cấp cho mầm vi tinh thể phát triển thành tinh thể kích thước nanơ mét Tuỳ thuộc vào kích thước chấm lượng tử mong muốn, ngừng cung cấp nhiệt cho bể phản ứng (để dừng phát triển tinh thể) thời gian xác định Cụ thể, công nghệ chế tạo chấm lượng tử CdSe từ hợp chất cơ-kim thực theo quy trình sau: - Bước 1: Cân Cd(CH3COO)2.2H2O bột selen theo tỉ lệ mol Cd:Se 1÷1,5:8; - Bước chuẩn bị tiền chất TOPOCd: Hoà tan Cd(CH3COO)2.2H2O TOPO nhiệt độ 80 oC sục khí ni-tơ Khi muối cadmium acetate tan hết thu dung dịch suốt, màu vàng nhạt; - Bước chuẩn bị tiền chất TOPSe: Hoà tan Se TOP tương ứng khoảng 0,2 M nhiệt độ cỡ 80 oC, mơi trường khí trơ (Ar N2) Khi Se tan hết TOP, thu dung dịch suốt, không màu; - Bước thực phản ứng tạo mầm tinh thể: Phun nhanh hỗn hợp hai dung dịch TOPSe TOPOCd vào bình cầu chứa hỗn hợp TOPO HDA gia nhiệt nhiệt độ ~250÷300 oC mơi trường khí N2 Một máy khuấy từ sử dụng để khuấy trộn mạnh liên tục hỗn hợp dung dịch nhiệt độ cao; nhờ đó, mầm vi tinh thể CdSe hình thành từ ion Cd2+ Se2-, ion nằm hỗn hợp dung dịch hợp chất hữu TOPO-HDA có khối lượng phân tử lớn nặng Việc khuấy trộn liên tục làm tăng khả gặp hai loại ion khác dấu Cd2+ Se2- hình thành mầm vi tinh thể đồng Việc khống chế kích thước chấm lượng tử CdSe thực nhờ lúc vào yếu tố: tỷ lệ nhóm chất hoạt động bề mặt TOPO HDA, nhiệt độ phát triển tinh thể thời gian phát triển kích thước chấm lượng tử Ngừng cung cấp nhiệt cho bình phản ứng làm ngừng trình phát triển tinh thể kích thước mong muốn Có thể quan sát thấy trình phát triển/lớn lên tinh thể nanơ, hỗn hợp dung dịch bình phản ứng chuyển màu từ suốt vàng nhạt sang màu vàng chanh, vàng, da cam đỏ, tuỳ thuộc vào nhiệt độ thời gian thực phản ứng i.1.2 Chế tạo chấm lượng tử CdSe từ CdO Qui trình chế tạo chấm lượng tử CdSe chất lượng cao với lượng ~300 mg/mẻ thực Hình i.1: - Bước tạo phức chất Cd với DDPA: Hỗn hợp CdO (2 mmol), DDPA (4,2 mmol), TOPO (8 ml) HDA (12 ml) nạp vào bình cầu cổ dung tích 250 ml Đun nóng chảy hỗn hợp 60 oC hút chân không ~45 phút để loại bỏ ôxi tạp chất dễ bay Sau đó, điền khí N2 để tạo môi trường bảo vệ nâng nhiệt độ lên 300 oC Ở nhiệt độ này, dung dịch nóng chảy TOPO HDA hoà tan CdO, tạo phức Cd với DDPA tạo thành dung dịch suốt màu vàng nhạt Dung dịch giữ 300 oC khoảng 15 phút, sau hạ ổn định nhiệt độ mong muốn phản ứng xảy (240÷300 o C, tuỳ thuộc vào kích thước chấm lượng tử muốn chế tạo) Hình i.1 Sơ đồ chế tạo QDs CdSe hỗn hợp dung môi TOPO/TOP/HDA - Bước chuẩn bị tiền chất TOPSe: Hịa tan hồn tồn mmol Se 20 ml TOP mơi trường khí trơ, thu dung dịch TOPSe 0,4 M - Bước tạo mầm tinh thể: Dung dịch phức Cd2+ với DDPA hỗn hợp dung dịch nóng TOPO HDA tạo thành bình phản ứng cổ giữ 300 oC khoảng 15 phút, sau hạ ổn định nhiệt độ mong muốn phản ứng xảy (240÷300 oC, tuỳ thuộc vào kích thước chấm lượng tử muốn chế tạo) Sau đó, phun nhanh 11 ml dung dịch TOPSe 0,4 M khuấy mạnh máy khuấy từ - Bước phát triển tinh thể: Sau thời gian khoảng vài giây, dung dịch bình phản ứng đổi màu vàng nhạt, cam nhạt đậm tuỳ theo nhiệt độ phản ứng thời gian lấy mẫu khoảng vài chục giây đến vài chục phút Điều khiển trình phát triển tinh thể thời gian giữ bình phản ứng nhiệt độ cao Kích thước hạt vật liệu xác định gián tiếp qua việc đo phổ hấp thụ UV-vis phổ huỳnh quang Khi nhận chấm lượng tử phát quang vùng phổ/màu sắc khác mong muốn, ngừng gia nhiệt để chấm dứt phát triển tinh thể Sản phẩm lấy (hút syringe) ~100 oC - Bước làm sạch: Sản phẩm chấm lượng tử CdSe chế tạo sau phân tán toluene có nồng độ ~5 mg/ml làm dung môi toluene methanol theo quy trình sau: chấm lượng tử CdSe pha lỗng dung mơi toluene đến có nồng độ ~1 mg/ml, rung siêu âm phút li tâm với tốc độ 5000 v/p 10 phút Sau đó, loại bỏ kết tủa sản phẩm dư thừa, lấy dung dịch thêm dung mơi methanol có thể tích với toluen, quay li tâm với tốc độ 5000 v/p 10 phút Gạn bỏ dung dịch, lấy kết tủa phân tán dung môi khác (như n-hexane, toluene, chloroform) làm vài lần chu trình tuỳ theo mục đích sử dụng Sản phẩm chấm lượng tử CdSe phân tán lại dung môi khác n-hexane, toluene, chloroform,…và bảo quản nhiệt độ phòng Kích thước tính chất quang (hấp thụ, huỳnh quang) chấm lượng tử CdSe điều chỉnh thông số công nghệ tỷ lệ TOPO/HDA, Cd/Se, thời gian nhiệt độ phản ứng Trong thực nghiên cứu, nhận thấy nhiệt độ thời gian phát triển tinh thể đóng vai trò quan trọng, nên sử dụng số thông số công nghệ tối ưu công bố lượng sử dụng TOPO/HDA, tỉ lệ Cd/Se, mà dành quan tâm nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ thời gian đến kích thước chất lượng chấm lượng tử CdSe Tuỳ thuộc vào kích thước chấm lượng tử mong muốn, chúng tơi điều chỉnh nhiệt độ phản ứng phức chất chứa Cd với TOPSe thời gian phát triển tinh thể Khoảng nhiệt độ phù hợp để chế tạo chấm lượng tử CdSe xác định khoảng 240–300 o C Kết quan trọng thứ nhiệt độ phản ứng xác định, thời gian phát triển tinh thể dài cho phép hạt tinh thể lớn Thực nghiệm cho thấy thời gian phát triển tinh thể khoảng 1÷3 phút tối ưu Ví dụ, thực phản ứng nhiệt độ ~250 oC, chấm lượng tử CdSe chế tạo có kích thước trung bình ~3,2 nm thời gian phát triển tinh thể phút, có độ bán rộng phổ huỳnh quang hẹp (chỉ 300 mg) dung môi hữu nhiệt độ sôi cao TOPO, HDA,… i.1.3 Chế tạo chấm lượng tử CdSe/ZnS cấu trúc lõi/vỏ Quy trình cơng nghệ bọc vỏ ZnS cho chấm lượng tử CdSe thực theo sơ đồ Hình i.2 QDs CdSe dung Hình i.3: mơi TOPO, HDA Hình i.3 Sơ đồ bọc vỏ ZnS cho chấm lượng tử CdSe - Bước chuẩn bị dung dịch tiền chất ZnS: Dung dịch tiền chất Zn S chuẩn bị cách hòa tan 0,5056 g Zn-stearate ml toluene ~60 oC Sau đó, trộn dung dịch với ml dung dịch 0,2 mmol Znethylxanthate ODE nhiệt độ phòng, thu hỗn hợp dung dịch tiền chất Zn S có nồng độ 0,2 M Lưu ý Zn-ethylxanthate nguồn cung cấp Zn S theo tỷ lệ 1:4 phân hủy nhiệt độ >150oC - Bước 2: 40 mg chấm lượng tử CdSe làm hai lần phân tán ml n-hexane ml HDA đưa vào bình cầu cổ Hỗn hợp hút chân không khoảng 60 phút để loại bỏ ôxi tạp chất dễ bay dung môi n-hexane Sau đó, điền khí N2 để tạo mơi trường bảo vệ nâng nhiệt độ lên 210 oC Dung dịch giữ nhiệt độ khoảng phút, sau nhỏ giọt hỗn hợp dung dịch tiền chất Zn S với nồng độ 0,2 M thời gian 30 phút Sau nhỏ hỗn hợp xong khoảng phút, dung dịch bình phản ứng có màu đậm dần lên theo thời gian lấy mẫu cường độ huỳnh quang tăng đáng kể Điều khiển độ dày lớp vỏ ZnS từ việc đo phổ hấp thụ UV-vis phổ huỳnh quang để nhận chấm lượng tử phát xạ màu sắc khác mong muốn - Bước làm mẫu: Các chấm lượng tử cấu trúc lõi/vỏ CdSe/ZnS sản phẩm làm giống quy trình làm chấm lượng tử lõi CdSe Sau đó, chúng phân tán lại bảo quản dung môi khác n-hexane, i.1.4 Chế tạo chấm lượng tử CdSe CdSe/ZnS dung mơi diesel Các hóa chất sử dụng có độ phân tích, dùng mua từ hãng mà không cần tinh chế lại, để chế tạo chấm lượng tử CdSe như: cadmium oxide (CdO) độ 99,5%; oleic acid (OA, C18H34O2, Mỹ) 98%; selenium (Poole England) 99%; n-hexane, acetone, đặc biệt dầu diesel thương phẩn mua trực tiếp từ trạm xăng dầu, sử dụng không cần tinh chế lại Các chấm lượng tử CdSe chế tạo phương pháp bình phản ứng (one-pot) với quy mô lớn cỡ gam/mẻ nhiệt độ thấp (190-230 oC) Ngoài ưu điểm trên, diesel ứng cử viên tốt để chế tạo chấm lượng tử mơi trường khơng khí, điều khiển tốc độ phản ứng tạo mầm tinh thể trình phát triển tinh thể Thực vậy, động học của trình hình thành phát triển phụ thuộc vào nhiệt độ phản ứng nhiệt độ sơi dung mơi ligand Nói cách khác, động học phản ứng phụ thuộc độ nhớt môi trường phản ứng, ví dụ mơi trường độ nhớt cao paraffin dầu thực vật khuếch tán trao đổi ligand chậm Trong diesel có nhiệt độ sơi (~180÷240 oC) gần với nhiệt độ phản ứng, độ nhớt diesel thấp tạo điều kiện thuận lợi cho trao đổi ligand khuếch tán nguyên tử phân tử Hơn nữa, diesel khơng gây ảnh hưởng xấu tới tính chất quang chấm lượng tử, dù cần độ thương phẩm bán xăng Các chấm lượng tử CdSe với quy mô ~1,1 g/mẻ chế tạo theo sơ đồ trình bày Hình i.4 Hình 1.4 Quy trình chế tạo chấm lượng tử CdTe/MPA môi trường nước - Bước II: tạo mầm vi tinh thể CdTe phản ứng dung dịch chứa Cd2+ MPA với dung dịch NaHTe nhiệt độ phòng Dung dịch chứa Cd2+ 12,5 mM MPA chuẩn bị cách hoà tan muối CdBr2 1000 ml H2O, sau bổ sung MPA; pH điều chỉnh đạt giá trị cách thêm từ từ NaOH 1M Mầm vi tinh thể CdTe tạo thành cách phun nhanh dung dịch NaHTe chuẩn bị bước I vào dung dịch Cd2+ MPA vừa chuẩn bị, nhiệt độ phòng - Bước III: Phát triển tinh thể tới kích thước mong muốn cách ủ mầm vi tinh thể CdTe (chứa cốc lọ thủy tinh chịu nhiệt) nồi hấp 120 oC Nhiệt độ giữ ổn định cách điều chỉnh công suất điện cung cấp cho nồi hấp Kích thước hạt chấm lượng tử bán dẫn CdTe điều khiển theo thời gian ủ nhiệt 1.2.2 Chế tạo chấm lượng tử CdTe với ligand MSA Công nghệ chế tạo chấm lượng tử CdTe quy mô hàng g/mẻ môi trường nước từ bột TeO2 MSA thực tương tự, với hoá chất sử dụng sau: 3,44 g (10 mmol) CdBr2.4H2O; 0,34 g (2,5 mmol) TeO2; 0,57 g (15 mmol) NaBH4; 2,25 g (15 mmol) MSA; 1000 ml nước cất - Bước I tạo phức Cd2+/MSA: Phức Cd2+ MSA tạo thành cốc thủy tinh mở cách bổ sung MSA vào dung dịch Cd2+ (nồng độ 12 [Cd2+] = 10 mM) với tỷ lệ mol Cd:MSA = 2:3, thu dung dịch suốt, khơng màu có pH = 3÷4 Như trình bày trên, dung dịch cần có pH~7 để chuẩn bị cho phản ứng tạo mầm vi tinh thể CdTe Tuy nhiên, thêm từ từ NaOH 1M vào dung dịch chứa phức Cd2+/MSA xuất đám trắng đục polime hóa phức Cd2+/MSA Đến pH 7 dung dịch suốt trở lại Về bản, trình tạo phức Cd2+/MSA khơng khác với tạo phức Cd2+/MPA - Bước II tạo mầm vi tinh thể CdTe: Dung dịch phức Cd2+/MSA thường điều chỉnh có pH = bột TeO2 tan nước tan kiềm tạo thành Na2TeO3 Sau thêm bột TeO2 kết hợp với khuấy mạnh vào dung dịch phức Cd2+/MSA với tỷ lệ Cd:Te=1:0,25, chất trung gian Na2TeO3 phản ứng với NaBH4 tạo thành HTe- Lượng NaBH4 thêm vào lớn hàng chục lần số mol TeO2 NaBH4 phân huỷ phần nước Trong q trình phản ứng, quan sát thấy dung dịch đổi màu dần từ vàng nhạt  cam  đỏ (tùy theo tỷ lệ Cd:Te) - Bước III: phát triển vi tinh thể CdTe tới kích thước mong muốn thực giống qui trình cơng nghệ sử dụng MPA 1.2.3 Chế tạo lớp vỏ CdS cho chấm lượng tử CdTe Sau chế tạo chấm lượng tử CdTe với kích thước hạt tinh thể mong muốn, dung dịch chứa chấm lượng tử CdTe với chất hoạt động bề mặt (MPA MSA) thêm vào 1,2 g (15,65 mmol) thioure với tỷ lệ thioure:Cd 10:1 (Thioure phân hủy nhiệt độ 120 oC tạo thành nguồn cung cấp lưu huỳnh) Hơn nữa, nhiệt độ cao, lưu huỳnh tạo thành phân huỷ MPA MSA từ gốc –SH phân tử ligand Lưu huỳnh sau tác dụng với ion Cd2+ dư dung dịch (do chấm lượng tử bán dẫn CdTe chế tạo dư Cd, theo tỷ lệ Cd:Te khoảng 2÷10) để hình thành lớp vật liệu vỏ CdS Quá trình bọc vỏ CdS thực 120 oC nồi hấp Lượng theo tính tốn CdTe/ligand thioure bổ sung cho vào lọ thuỷ tinh, đặt nồi hấp Nhiệt độ nồi hấp khống chế công suất điện cung 13 cấp cách thích hợp Nhờ tương đồng cấu trúc tinh thể số mạng hai chất gần (CdTe/CdS = 0,648/0,583) nên tinh thể CdS dễ dàng hình thành phát triển bề mặt hạt tinh thể nano CdTe, tạo thành lớp vỏ bao quanh Lớp vỏ có tác dụng thụ động hoá hai loại liên kết hở ion Cd2+ Te2– bề mặt hạt tinh thể CdTe Hình 1.5 trình bày hình ảnh số sản phẩm chấm lượng tử CdTe/CdS chế tạo được, với kích thước khác khoảng 2-4 nm, huỳnh quang hiệu cao 50% Hình 1.5 Chấm lượng tử CdTe chế tạo môi trường nước (mỗi lọ chứa ~100 mg) huỳnh quang ánh sáng thường phịng Quy trình liên quan đến cơng nghệ xác định nhanh dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo vệ thực vật 2.1 Hóa chất Enzyme AChE ATChI mua từ Sigma-Aldrich; ATCh chế tạo từ ATChI theo tài liệu Analyst 134 (2009) 2153; PM (Fluka) hợp chất OP chọn để thử nghiệm hoạt động biosensor 2.2 Thực nghiệm chế tạo biosensor Nguyên lý biosensor: dựa phụ thuộc cường độ huỳnh quang chấm lượng tử bán dẫn vào pH môi trường, mà độ pH thay đổi trình thuỷ phân ATCh bị thay đổi hoạt động xúc tác enzyme AChE bị thuốc trừ sâu ức chế Dựa nguyên lý đó, biosensor huỳnh 14 quang chế tạo từ thành phần (i) chấm lượng tử [CdSe/ZnSe/ZnS (lõi/vỏ/vỏ) CdTe/CdS (lõi/vỏ) làm phân tán lại dung dịch đệm PBS (pH=7,4), phát huỳnh quang tốt ~610 nm], (ii)16,4 u/ml AChE phân tán 1ml dung dịch chấm lượng tử (độ hấp thụ 10-4 tương ứng ~1012 QDs/1ml) (iii) 25 µm ACTh 0,12 mM Hỗn hợp dung dịch thành phần trộn 37 oC 30 phút máy rung siêu âm, hoàn thành trình chế tạo biosensor phát thuốc trừ sâu Thuốc trừ sâu PM pha nước cất với nồng độ 0,05÷3 ng/ml (0,05÷3 ppm) để kiểm tra biosensor chế tạo Phép đo huỳnh quang thực phút sau cho thuốc trừ sâu vào biosensor nhiệt độ phòng Kết cho thấy sử dụng đơn vị AChE biosensor QDs-ATChAChE cường độ huỳnh quang QDs tăng tăng hàm lượng PM Biosensor sử dụng đơn vị AChE phát PM khoảng 0,05÷0,5 ppm dải phát PM mở rộng việc tăng hàm lượng AChE (tức Hình 2.1 Cường độ huỳnh quang tăng tỷ lệ AChE:QDs) Kết cho thấy QDs-AChE-ATCh (dưới kích thích sử dụng đơn vị AChE laser 405 nm) tăng nồng độ thuốc phát PM khoảng từ 0,05÷1 ppm (Hình 2.1) trừ sâu PM với hai nồng độ AChE khác nhau: đơn vị Nghiên cứu biến đổi tính chất bề mặt chấm lượng tử bán dẫn phát quang môi trường hữu ứng dụng xác định dư lượng chất tăng trọng vật nuôi sản phẩm chăn nuôi 3.1 Thực nghiệm chế tạo biosensor Nguyên lý việc chế tạo biosensor xác định dư lượng chất Clenbuterol sở truyền lượng huỳnh quang (Fluoescence Resonance Energe Transfer Biosensor FRET) ghi nhận thay đổi cường độ phát xạ huỳnh 15 quang dung dịch siêu phân tử QDs/Naphthol/Clenbuterol theo nồng độ Clenbuterol dịch mẫu Quy trình cơng nghệ chế tạo biosensor theo hiệu ứng RET tiến hành theo bước sau: (i) diazo hóa Clenbuterol dung dịch NaNO2, ~ oC Dia o-Clenbuterol màu vàng, bảo quản tối nhiệt độ 10 oC; (ii) gắn nhóm nhận biết Clenbuterol bề mặt QDs - Chế tạo siêu phân tử QDs/Naphthol cách hòa tan CdTe/2-Amino 8-Naphthol-6sulfonic acid nước siêu có đệm photphat (pH 7,4) đến nồng độ µg ml-1 Dung dịch làm việc chuẩn bị cách pha lỗng dung dịch µg ml-1, lưu trữ oC nồng độ sử dụng tương đương 0,01 µg ml-1 Hỗn hợp dung dịch QDs/Naphthol ủ 37 oC oC qua đêm; (iii) chế tạo dung dịch sensor xác định hàm lượng Cenbuterol- Chế tạo siêu phân tử QDs/Naphthol/Clenbuterol cách lấy 0,5 ml dung dịch QDs/2-Amino 8-Naphthol-6-sul onic acid nồng độ 0,01 µg ml-1 hịa với 0,5 ml dung dịch Clenbuterol-Diazo với nồng độ khác theo nhu cầu thí nghiệm Khi trộn hai dung dịch, phản ứng cộng hợp Coupling Clenbuterol-Dia o với nhóm Naphthol bề mặt QDs Độ nhạy phương pháp xác định mối quan hệ cường độ huỳnh quang thay đổi nồng độ Clenbuterol-Diazo (Hình 3.1), cho thấy độ nhạy lên tới 10 pg/ml Hình 3.2 hình ảnh số nanosensor dạng dung dịch Hình 3.1 Tương quan nồng độ Hình 3.2 Một số mẫu nanosensor dạng Clenbuterol-với cường độ phát quang dung dịch nanosensor 16 Quy trình chế tạo biosensor phát virus cúm gia cầm H5N1 vi khuẩn E.coli 4.1 Quy trình chế tạo biosensor phát virus cúm gia cầm H5N1 Để chế tạo biosensor phát virus cúm gia cầm H5N1, thực số công đoạn sau: a Tinh chế chromatophore từ tế bào Rhodospirillum rubrum b Sản xuất β-subunit FoF1-ATPase công nghệ tái tổ hợp c Sản xuất kháng thể kháng β-subunit FoF1-ATPase gắn biotin d Đã sản xuất kháng nguyên virus cúm H5N1 e Sản xuất kháng thể kháng cúm H5N1 chủng NIBRG-14 gắn biotin f Sản xuất chromatophore gắn chấm lượng tử CdTe/CdS Các thành phần gắn kết lại để tạo thành biosensor phát virus cúm gia cầm H5N1 theo sơ đồ cấu trúc trình bày Hình 4.1 Hình 4.1 Biosensor huỳnh quang phát virus H5N1 Phần lõi: (1) QDs; (2) Chromatophores với o 1–ATPase; (3) Kháng thể kháng β-subunit; (4) Cầu nối biotin-streptavidin-biotin phần lõi phần ngoại vi; Phần ngoại vi: (5) Kháng thể kháng virus H5N1; (6) Virus H5N1 Nguyên lý hoạt động biosensor phát virus cúm H5N1 dựa phụ thuộc cường độ huỳnh quang chấm lượng tử bán dẫn CdTe/CdS vào thay đổi pH mơi trường Ở đây, pH thay đổi (giảm) dịng proton giải phóng từ chromatophore tổng hợp ATP từ ADP (ADP+PiATP); phản ứng enzyme FoF1-ATPase xúc tác chịu ảnh hưởng virus H5N1 thông qua cầu nối biotin-streptavidin-biotin (do hoạt động xúc tác FoF1-ATPase bị thay đổi) Biosensor phát đặc hiệu virus H5N1 phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể 17 Có thể thấy huỳnh quang chromatophores không thay đổi tăng hàm lượng vi rút H5N1 chromatophores trộn sẵn cảm biến sinh học huỳnh quang hai thành phần cịn lại tăng theo tăng lượng H5N1 Do đó, tín hiệu huỳnh quang tổng cộng biosensor tăng nồng độ virus tăng (Hình 4.2) Hình 4.2 Phổ huỳnh quang cấu phần biosensor (trái) phổ huỳnh quang biosensor phụ thuộc nồng độ virus H5N1 (phải) Việc thử nghiệm biosensor chế tạo để phát virus H5N1đã thực với nồng độ pha loãng khác Kết bước đầu cho thấy biosensor có khả phát virus cúm H5N1 với giới hạn phát 3ng/l, nhiên cần có thêm nghiên cứu để tối ưu hồn thiện biosensor để nâng cao độ nhạy độ đặc hiệu thiết bị 4.2 Qui trình xác định nhanh, xác số lượng E coli O157:H7 phức hợp kháng thể+QDs phát quang qui mơ phịng thí nghiệm 4.2.1 Mơ tả chi tiết quy trình Ngun lý: Sử dụng kháng thể (KT) đặc hiệu gắn kết với QDs CdTe phát quang để phát xác định nhanh số lượng vi khuẩn (VK) E coli O157:H7 theo chế miễn dịch huỳnh quang 18 Nguyên liệu chủng vi sinh vật: - Chủng E coli O157:H7 (ATCC–43888) Viện Đại học Mở Hà Nội cung cấp Dịch ni cấy VK pha lỗng đệm PBS tới OD = 0,35 - Phức hợp KT đặc hiệu cho vi khuẩn E coli O157:H7 + CdTe QDs - Môi trường: cao thịt – pepton dịch thể, dung dịch đệm PBS 0,1 M, pH 7,4 Các bước tiến hành: - Bước 1: Hút 250 µl phức hợp kháng thể đặc hiệu E coli O157:H7 + QDs cho vào ống Eppendof - Bước phản ứng miễn dịch kháng nguyên (KN)-KT: Bổ sung 25 µl dịch huyền phù vi khuẩn đích (OD = 0,35) vào ống eppendof có chứa 250 µl phức hợp KT + QDs nói Sau đó, ủ hỗn hợp 37oC máy lắc ngang, 20 phút - Bước rửa vi khuẩn gắn kết với phức hợp: + Ly tâm 10000 v/phút, 10 phút °C để loại bỏ dịch chứa phức hợp khơng gắn với vi khuẩn đích Thu cặn + Hòa cặn vào 1ml dung dịch đệm PBS 0,1M; pH 7,4 để rửa cặn có chứa vi khuẩn gắn với phức hợp + Ly tâm 10000 v/phút, 10 phút, °C Thu cặn rửa lại lần thứ - Bước 4: Hòa cặn thu bước vào 1,5 ml dung dịch PBS 0,1 M - Bước 5: Đếm số lượng vi khuẩn phát quang kính hiển vi huỳnh quang tổng số vi khuẩn kính hiển vi truyền qua vị trí hiển vi trường Tính tỉ lệ % tế bào phát quang Kết số liệu trung bình 35 lần đếm tế bào 35 vị trí khác Ứng dụng qui trình vào việc phát nhanh vi khuẩn E coli O157:H7 mẫu, tỉ lệ % tế bào gắn phức hợp phát quang đạt >90% 4.2.2 Đánh giá hiệu lực phương pháp sử dụng CdTe QDs phát quang để phát xác định số lượng vi khuẩn đích gây ngộ độc thực phẩm Để đánh giá hiệu lực phương pháp, tiến hành so sánh kết đếm tế bào gắn phức hợp kháng thể+chấm lượng tử kính hiển vi huỳnh quang với kết phát E coli O157:H7 phương pháp đếm khuẩn lạc đĩa thạch đặc hiệu SMAC Phương pháp phát E coli O157:H7 19 thực phẩm mang tính pháp lý Việt Nam sử dụng kỹ thuật làm giàu, xác định khuẩn lạc nghi ngờ E coli O157:H7 đĩa thạch SMAC sau ủ ấm 37 °C 24 Từ khuẩn lạc nghi ngờ, tiến hành kiểm tra tính chất sinh hóa ngưng kết đặc hiệu để khẳng định E coli O157:H7 (Tiêu chuẩn ngành Y tế, 2004) Các kết thu cho thấy 02 phương pháp phát có mặt vi khuẩn gây ngộ độc mẫu; phương pháp đếm tế bào gắn với phức hợp KT+CdTe QDs phát quang kính hiển vi phát vi khuẩn E coli O157:H7 nhanh (Hình 4.3), vịng 60 phút, nhanh nhiều so với phương pháp đếm khối lượng đĩa thạch VN Bộ Y tế ban hành năm 2004 (3 ngày) Hình 4.3 Ảnh TEM ảnh huỳnh quang VK E coli O157:H7 sau 20 phút đánh dấu với phức hợp kháng thể + CdTe QDs Như vậy, với việc sử dụng CdTe QDs Nhánh cung cấp, tạo phức hợp QDs + kháng thể đặc hiệu vi khuẩn E.coli O157:H7 Chất lượng phức hợp tốt, giữ hoạt tính nhận biết liên kết với vi khuẩn đích sau ngày điều kiện bảo quản oC Phức hợp phát vi khuẩn đích theo nguyên lý kháng nguyên-kháng thể sau 20-30 phút 20 Dạng III: Bài báo; Sách chuyên khảo; sản phẩm khác TT Tên sản phẩm Số lượng Bài báo báo cáo khoa học Sách khảo chuyên Chỉ tiêu Kết 03 + Tại HN Khoa học quốc tế, quốc gia 04 02 + Tạp chí quốc tế 01 Bổ sung chương sách chuyên khảo “Polyme chức vật liệu lai cấu trúc nano” 03 (đã đăng) + 02 (đang in) 01 chương sách chuyên khảo “Chấm lượng tử bán dẫn CdSe, CdTe, InP CuInS2: chế tạo, tính chất quang ứng dụng” Kết tham gia đào tạo đại học TT Cấp đào tạo Số lượng Chuyên ngành Kết Thạc sỹ 03 + Khoa học vật liệu cơng nghệ nanơ + Hố học + Công nghệ sinh học 05 Tiến sỹ 02 + Khoa học vật liệu; + Vật lý/Hoá học 02 I Danh mục báo, báo cáo khoa học I.1 Tạp chí nước/Báo cáo Hội nghị Vu Duc Chinh, Nguyen Thi Minh Hieu, Vu Thi Hong Hanh, Le Van Luong, Nguyen Hai Yen, Nguyen Xuan Nghia, Phan Tien Dung, Pham Thu Nga 2010 Tuyển tập 21 báo cáo Hội nghị Vật lý chất rắn Khoa học vật liệu toàn quốc lần thứ (SPMS2009) - Đà Nẵng 8-10/11/2009, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội 5/2010, tr 215-219 Surface functionalization of multishell CdSe quantum dots for well water dispersion and imbedding in SiO2 beads Vu Thi Hong Hanh, Vu Duc Chinh, Khong Cat Cuong, Nguyen Thi Minh Hieu, Nguyen Xuan Nghia, Nguyen Van Hung, Pham Thu Nga 2010, SPMS-2009 - Đà Nẵng 810/11/2009, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội 5/2010, tr 210214 Investigation o the abrication and optical properties o “giant” CdSe/ZnSe/ZnS and CdSe/CdS/ZnS multishell quantum dots Nguyen Ngoc Hai, Vu Duc Chinh, Pheng Xiong, Nguyen Xuan Nghia, Phan Tien Dzung, Nguyen Van Hung, Pham Thu Nga, Nguyen Quang Liem 2010 Proc the 6th National Conference on Optics and Spectroscopy and International Conference on Photonics and Applications, Hanoi, Vietnam, pp 422-425 Optical detection of the pesticide by functionalized CdSe/ZnS quantum dots as fluorescence-based biosensor Nguyễn Thị Hoa, Đồng Văn Quyền, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Thanh Tùng, Lê Phương Hằng, Nguyễn Quang Liêm, Đinh Duy Kháng 2012 Tạp chí Cơng nghệ sinh học 10 (1) 29 Biểu hiện, tinh β-subunit 1-ATPase tạo kháng thể kháng β-subunit tái tổ hợp I.2 Tạp chí quốc tế P T Nga, V D Chinh, V.T H Hanh, N X Nghia, P.T Dzung, C Barthou, P Benalloul, J Laverdant and A Mtre 2011 Int J Nanotechnol 347, ISSN: 15334880 Optical properties o normal and “giant” multishell CdSe quantum dots for potential application in material science Nguyen Ngoc Hai, Vu Duc Chinh, Tran Kim Chi, Ung Thi Dieu Thuy, Nguyen Xuan Nghia, Dao Tran Cao, Pham Thu Nga 2012 Key Engineering Materials 495 314, ISSN1013 – 9826 Optical detection of the pesticide by functionalized quantum dots as fluorescence-based biosensor Chi T T K, Chinh V D, Thuy U T D, Yen N H, Hai N N, Cao D T, Nga P T, and Liem N Q 2012 Adv Nat Sci.: Nanosci Nanotechnol 0350088 Fabrication of fluorescence-based biosensors from functionalized CdSe and CdTe quantum dots for pesticide detection Nguyen Thi Hoa, Ung Thi Dieu Thuy, Vu Thi Hien, Tran Thi Kim Chi, Dinh Duy Khang, Nguyen Quang Liem, Dong Van Quyen 2012 Adv Nat Sci.: Nanosci Nanotechnol xxx Fluorescence biosensor based on CdTe quantum dots for specific detection of H5N1 avian influenza virus 22 Nghia Nguyen Duc, Tung Ngo Trinh, Ha Hoang Mai and Liem Nguyen Quang 2012 Adv Nat Sci.: Nanosci Nanotechnol (accepted) Fabrication of fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based nanosensor for detection of clenbuterol II Sách chuyên khảo chương sách chuyên khảo “Chấm lượng tử bán dẫn CdSe, CdTe, InP CuInS2: chế tạo, tính chất quang ứng dụng” Nguyễn Quang Liêm, 2011, NXB KHTN&CN 2011 TÁC ĐỘNG ĐỐI VỚI KINH TẾ, XÃ HỘI VÀ MÔI TRƯỜNG a) Hiệu khoa học công nghệ: + Về nghiên cứu công nghệ chế tạo chấm lượng tử bán dẫn chất lượng cao nghiên cứu trình độ cao: việc làm chủ công nghệ chế tạo chủng loại vật liệu tiên tiến, có nhiều triển vọng ứng dụng lĩnh vực quang điện tử đánh dấu huỳnh quang cho đối tượng nông-sinh-y thực mang lại hiệu nghiên cứu khoa học công nghệ Hiệu thể chỗ có nguồn mẫu tốt (i) cho nghiên cứu trình quang điện tử chấm lượng tử bán dẫn chất lượng cao, (ii) cho nghiên cứu chi tiết nhằm định hướng ứng dụng chế tạo biosensor + Về công nghệ chế tạo loại biosensor phương pháp phân tích: loại biosensor đề tài nghiên cứu chế tạo sử dụng tổ hợp tính chất/tính tốt vật liệu tiên tiến công nghệ cao thuộc lĩnh vực Khoa học vật liệu Cơng nghệ sinh học, Hố học Do vậy, hiệu khoa học công nghệ thể rõ sản phẩm tổ hợp khoa học công nghệ cao + Về đào tạo nhân lực khoa học cơng nghệ trình độ cao xây dựng đội ngũ, tổ chức thực đề tài liên ngành, quy mơ với phối hợp thực mang tính hiệp trội: hiệu rõ ràng công tác tổ chức mang lại b) Hiệu kinh tế xã hội: + Giá chào bán loại chấm lượng tử bán dẫn CdSe, CdTe thị trường (do Sigma-Aldrich, Evident Technologies chế tạo) >300 USD/mg Viện Khoa học vật liệu cung cấp sản phẩm chất lượng tương đương với 23 giá 1/10÷ 1/2 với thời gian cung cấp nhanh nhiều chủng loại theo yêu cầu kỹ thuật + Các biosensor đề tài chế tạo chưa có bán thị trường, thấy tương lai hãng sản xuất giá cao KẾT LUẬN 1) Đề tài hoàn thành kết nghiên cứu khoa học công nghệ, đào tạo xuất bản, có số nội dung vượt mức đăng ký Cụ thể: i) Đã làm chủ công nghệ, chủ động chế tạo loại chấm lượng tử bán dẫn CdSe, CdTe phát huỳnh quang hiệu suất cao vùng phổ xanh-đỏ mong muốn Các chấm lượng tử bọc vật liệu vỏ (đơn ZnS CdS kép ZnSe/ZnS), biến tính bề mặt (với ligand/lớp phân tử) nghiên cứu chi tiết vi hình thái, cấu trúc, tính chất quang để chuẩn bị sẵn sàng cho việc ứng dụng chế tạo biosensor đánh dấu huỳnh quang ii) Đã nghiên cứu chi tiết ảnh hưởng thuốc trừ sâu, enzyme AChE ATCh lên tính chất huỳnh quang chấm lượng tử đề tài chế tạo được; từ xác định phát triển cấu trúc biosensor ứng dụng phân tích dư lượng thuốc trừ sâu Kết thử nghiệm biosensor chế tạo từ loại chấm lượng tử bán dẫn CdSe/ZnSe/ZnS CdTe/CdS huỳnh quang cho thấy phát thuốc trừ sâu parathion methyl PM đến nồng độ nhỏ ~0,05 ppm điều chỉnh khoảng nồng độ phát PM cách chủ động điều chỉnh thiết kế biosensor iii) Đã nghiên cứu chi tiết q trình diazo hố clenbuterol (chất tăng trọng nguy hại sử dụng bất hợp pháp chăn nuôi) tạo phản ứng cộng hợp với siêu phân tử QDs/Naphthol để hình thành tổ hợp AZO có hiệu ứng truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) chấm lượng tử bán dẫn CdTe/CdS với tổ hợp clenbuterol chức hoá Biosensor theo nguyên lý huỳnh quang phụ thuộc vào truyền lượng cộng hưởng chế tạo, cho phép phát clenbuterol với nồng độ thấp ~pg/ml thử nghiệm mẫu nước thịt có chứa clenbuterol 24 iv) Đã nghiên cứu chế tạo biosensor phát virus cúm gia cầm H5N1và đánh dấu huỳnh quang vi khuẩn E coli Ở đây, chấm lượng tử CdTe/CdS huỳnh quang hiệu suất cao vùng phổ theo thiết kế sử dụng để chế tạo biosensor theo nguyên lý huỳnh quang phụ thuộc pH; mà pH lại thay đổi đặc hiệu theo tác động virus H5N1 thông qua phản ứng hệ enzyme FoF1-ATPase chromatophore Các kỹ thuật công nghệ sinh học liên quan nghiên cứu chi tiết để sản xuất loại kháng thể đặc hiệu, vi khuẩn Rhodospirillum rubrum,…Biosensor chế tạo được thử nghiệm để phát virus H5N1 phịng thí nghiệm với nồng độ thấp ~3 ng/µl Quy trình đánh dấu vi khuẩn E coli chấm lượng tử huỳnh quang CdTe/CdS cho thấy quan sát rõ ràng đếm số lượng vi khuẩn kính hiển vi huỳnh quang Có thể thấy đề tài giải trọn vẹn vấn đề khoa học công nghệ cao, liên ngành Khoa học vật liệu Cơng nghệ sinh học, Hố học Đề tài triển khai nghiên cứu chế tạo vật liệu tiên tiến (các chấm lượng tử huỳnh quang) để áp dụng thử nghiệm chế tạo số loại biosensors tinh tế, tận dụng ưu vật liệu phương pháp ghi nhận/phân tích tín hiệu; cho phép biosensor có độ nhạy cao, đặc hiệu phân tích nhanh v) Đã xuất số báo khoa học góp phần hồn thành sách thuộc “Bộ sách chuyên khảo ứng dụng phát triển công nghệ cao” Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, đạt mức đăng ký 2) Đã tổ chức phối hợp thực nhánh/chuyên mơn khác cách hiệu quả, mang tính hiệp trội Đây kết quan trọng, có ý nghĩa công tác tổ chức huy động nguồn lực để thực vấn đề khoa học công nghệ liên ngành địi hỏi nhiều tập thể với chun mơn khác tham gia Trong trình phối hợp triển khai thực đề tài, trình độ chun mơn cán lực nghiên cứu nhóm tham gia đề tài nâng cao 3) Đã quản lý tài chính, chi tiêu quy định 25 KIẾN NGHỊ Thành công chế tạo chấm lượng tử bán dẫn huỳnh quang chất lượng cao kết thử nghiệm chế tạo số loại biosensor đề tài cho thấy khả chủ động chế tạo biosensor nước định hướng ứng dụng cụ thể thực tế Tuy nhiên, để sử dụng cách thuận lợi, dễ dàng tin cậy loại biosensor hoạt động sản xuất nơng nghiệp, kiểm sốt an tồn/chất lượng nơng sản thực phẩm góp phần kiểm sốt dịch bệnh, nghiên cứu chi tiết cần tiếp tục triển khai thực Chúng kiến nghị nhánh đề tài chế tạo biosensor phát thuốc trừ sâu, phát dư lượng chất tăng trọng, phát virus cúm gia cầm cần tiếp tục thực đề tài độc lập, với phối hợp nhánh đề tài chế tạo cung cấp chấm lượng tử bán dẫn huỳnh quang kỹ thuật đo quang Chúng tin phối hợp nghiên cứu liên ngành mang tính hiệp trội cho kết tốt nữa, có ứng dụng thật thực tế, sau định hướng đề tài cụ thể 26