Nghiên cứu đa hình gen leptin và tương quan giữa đa hình gen leptin với năng suất chất lượng sữa và một số chỉ tiêu sinh sản trên bò lai hướng sữa có tỷ lệ máu lai holstein friesian trên 87,5 phần trăm

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ PHÂN VIỆN CHĂN NUÔI NAM BỘ TRUNG TÂM CNSH CHĂN NI CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH GENE LEPTIN VÀ TƢƠNG QUAN GIỮA ĐA HÌNH GENE LEPTIN VỚI NĂNG SUẤT, CHẤT LƢỢNG SỮA VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH SẢN TRÊN BÕ LAI HƢỚNG SỮA CÓ TỶ LỆ MÁU LAI HOLSTEIN FRIESIAN TRÊN 87,5% Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: TT CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHĂN NUÔI Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS NGUYỄN NGỌC TẤN Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 i ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHÂN VIỆN CHĂN NUÔI NAM BỘ TRUNG TÂM CNSH CHĂN NI SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH GENE LEPTIN VÀ TƢƠNG QUAN GIỮA ĐA HÌNH GENE LEPTIN VỚI NĂNG SUẤT, CHẤT LƢỢNG SỮA VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH SẢN TRÊN BÕ LAI HƢỚNG SỮA CÓ TỶ LỆ MÁU LAI HOLSTEIN FRIESIAN TRÊN 87,5% (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 29/05/2018) Chủ nhiệm nhiệm vụ TS Nguyễn Ngọc Tấn Cơ quan chủ trì nhiệm vụ ii MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iv CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chiến lƣợc cải thiện tính trạng kinh tế bị sữa Error! Bookmark not defined 1.2 Tổng quan số nghiên cứu sử dụng thị phân tử bò sữa Error! Bookmark not defined 1.3 Thông tin gene leptin chức sinh lý leptin mức độ protein Error! Bookmark not defined 1.4 Tóm lƣợc số chức sinh lý leptin Error! Bookmark not defined 1.5 Một số nghiên cứu giới sử dụng gene Leptin bò Error! Bookmark not defined 1.6 Một số nghiên cứu nƣớc sử dụng thị phân tử vật nuôi Error! Bookmark not defined 1.7 Mục tiêu đề tài Error! Bookmark not defined CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.1 Nội dung 1: Phân tích thăm dị đa hình SNPs gene LEP phƣơng pháp PCR-RFLP Error! Bookmark not defined iii 2.1.1 Đối tƣợng, thời gian địa điểm thực Error! Bookmark not defined 2.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu cho nội dung Error! Bookmark not defined 2.1.3 Phƣơng pháp tách chiết đánh giá DNA hệ gene: Error! Bookmark not defined 2.1.4 Quy trình ly trích DNA từ mẫu máu (sử dụng phƣơng pháp phenolchloroform), bƣớc thực nhƣ sau: Error! Bookmark not defined 2.1.5 Tiến hành định tính định lƣợng DNA Error! Bookmark not defined 2.1.6 Phƣơng pháp lựa chọn, thiết kế primer đặc hiệu đoạn gene LEP: Error! Bookmark not defined 2.1.7 Phƣơng pháp PCR khuếch đại đặc hiệu đoạn gene Error! Bookmark not defined 2.1.8 Các tiêu theo dõi Error! Bookmark not defined 2.1 Nội dung 2: Phân tích đa hình xác định thơng số kiểu hình liên quan suất, chất lƣợng sữa sinh sản bò lai hƣớng sữa số trang trại Error! Bookmark not defined 2.2.1 Đối tƣợng lấy mẫu phƣơng pháp thực phân tích đa hình: Error! Bookmark not defined 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu cho thu thập tiêu kiểu hình Error! Bookmark not defined 2.2.3 Phƣơng pháp chăm sóc ni dƣỡng: Error! Bookmark not defined 2.3 Nội dung Phân tích mối quan hệ đa hình gen LEP với tính trạng kiểu hình sản xuất sữa sinh sản Error! Bookmark not defined CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Nội dung Phân tích thăm dị đa hình SNPs gene LEP phƣơng pháp PCR-RFLP Error! Bookmark not defined 3.1.1 Ly trích DNA tổng số Error! Bookmark not defined iv 3.1.2 Tối ƣu phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene leptin với cặp primer khác theo điều kiện nhiệt độ bám phản ứng sản phẩm PCR mẫu Error! Bookmark not defined Kết Hình 3.6 cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ƣu 64oC sử dụng nhiệt độ để thực phản ứng PCR, kết trình bày Hảng 3.7 Error! Bookmark not defined 3.1.3 Phân tích trình tự gene Error! Bookmark not defined 3.1.4 Kết phản ứng RFLP để nhận biết đa hình Error! Bookmark not defined 3.2 Nội dung Phân tích đa hình xác định thơng số kiểu hình liên quan suất, chất lƣợng sữa sinh sản bò lai hƣớng sữa số trang trại Error! Bookmark not defined 3.2.1 Phân tích đa hình gene Leptin 100 cá thể bò Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kết thực phản ứng PCR phân cắt enzyme Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kết theo dõi suất, chất lượng sữa số tiêu sinh sản bị thí nghiệm Error! Bookmark not defined 3.2.3 Một số tiêu sinh sản bò hai trại Error! Bookmark not defined 3.3 Phân tích tƣơng quan kiểu gene LEP với suất, chất lƣợng sữa số tiêu sinh sản Error! Bookmark not defined 3.3.1 Phân tích ảnh hƣởng đa hình gene leptin locus LEPsig LEPe3.1 đến suất sản lƣợng sữa Error! Bookmark not defined 3.3.2 Phân tích ảnh hƣởng đa hình gene Leptin locus LEPsig LEPe3.1 đến số tiêu chất lƣợng sữa Error! Bookmark not defined 3.3.3 Phân tích ảnh hƣởng đa hình gene Leptin locus LEPsig LEPe3.1 đến số tiêu sinh sản Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined 4.1 Kết luận Error! Bookmark not defined v 4.2 Đề nghị: Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined Phụ lục Nồng độ DNA giá trị t số OD260 280 đo đƣợc mẫu Error! Bookmark not defined Phụ lục 2: Kết phân cắt enzyme cắt giới hạn Error! Bookmark not defined vi PHÂN VIỆN CHĂN NI NAM BỘ CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRUNG TÂM CNSH CHĂN NI Độc lập - Tự - Hạnh phúc Bình dương, ngày 20 tháng 03 năm 2018 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu đa hình gene Leptin tƣơng quan đa hình gene leptin với suất, chất lƣợng sữa số tiêu sinh sản bò lai hƣớng sữa có t lệ máu lai Holstein Friesian 87,5% Thuộc: Chƣơng trình lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Nguyễn Ngọc Tấn Ngày, tháng, năm sinh: 01-01-1968 Nam Nữ: Nam Học hàm, học vị: Tiến sỹ Chức danh khoa học: Giảng viên Chức vụ: Không Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: Mobile: 0948 993 338 Fax: E-mail: ngoctan0068@gmail.com Tên tổ chức công tác: Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh Địa tổ chức: Phƣờng Linh Trung, quận Thủ Đức, Tp Hồ Chí Minh Địa nhà riêng: 439 46 39 đƣờng Nguyễn Văn Khối, phƣờng 8, quận Gị Vấp, Tp Hồ Chí Minh Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Chăn nuôi Điện thoại: 027 825 1811 Fax: E-mail: ttcnshnn@gmail.com Địa chỉ: Phƣờng Phú Mỹ, Tp Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dƣơng vii Họ tên thủ trƣởng tổ chức: ĐÒAN ĐỨC VŨ Số tài khoản: 8123 Kho bạc: Nhà nƣớc tỉnh Bình Dƣơng Tên quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 11 năm 2017 - Thực tế thực hiện: từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 05 năm 2018 - Đƣợc gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng 12 năm 2017 đến tháng 05 năm 2018 (đinh kèm phụ lục) Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 1.145 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 950 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: 195 tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT Theo kếhoạch Thực tế đạt Ghi Thờigian Kinhphí Thờigian Kinhphí (Số đề nghị (Tháng, năm) (Tr.đ) (Tháng, năm) (Tr.đ) toán) T12/2014 475 T12/2014 475 475,54 T6/2016 380 T6/2017 380 380 Đợt cuối 195 T5/2018 20,52 20,52 viii c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số Nội dung TT khoản chi Theo kế hoạch Tổng NSKH Thực tế đạt Nguồn Tổng Nguồn NSKH khác Trả công lao động 454,05 334,05 436,14 436,14 khác 120 325,9 325,9 370,35 370,35 179,81 179,81 876,06 876,06 (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lƣợng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa 75 75 nhỏ Chi khác Tổngcộng 179,81 179,81 1.145 950 195 - Lý thay đổi (nếu có): Giảm chi cho phân tích progesterone theo yêu cầu dừng phân tích này Hội đồng giám định kết Các văn hành q trình thực đề tài dự án: Số Số, thời gian ban TT hành văn Tên văn Ghi Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức Tên tổ chức Nội dung Sản phẩm đăng ký theo tham gia thực tham gia chủ chủ yếu đạt Thuyết minh yếu Viện CNSH Viện CNSH Việt nam Việt nam Nội dung 01 chuyên đề ix Ghi chú* Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân Tên cá nhân Nội dung đăng ký theo tham gia tham gia Thuyết minh thực TS Nguyễn TS Nguyễn Điều hành Ngọc Tấn chung, phân Ngọc Tấn Sản phẩm chủ Ghi yếu đạt chú* tích liệu sữa sinh sản TS Nguyễn Thị Diệu Thúy TS Nguyễn Nội dung Thị Diệu Thúy Chuyên đề thăm dò đa hình gene LEP CN Nguyễn Thị Thủy Tiên CN Nguyễn Phân tích mẫu Tham gia thực Thị Thủy Tiên sữa Viết báo 03 chuyên cáo chuyên đề đề BSTY Nguyễn Triển khai nội Thu thập Văn Điền dung trại liệu kiểu hình An Phú 40 cá thể bò An Phú Ths Phạm Triển khai nội Thu thập Hoàng Minh dung trại liệu kiểu hình TTG 60 cá thể bò TTG Ths Lê Thị Thu Hà Ths Lê Thị Tham gia thực Thu Hà nội dung 2.1 BSTY Thái Xuân Tiến x 40 38 AB Aa 7,66 6,27 8,96 8,92 8,83 7,77 6,97 8,94 8,30 8,07 41 32 AB Aa 12,07 8,53 8,24 8,80 13,54 6,13 10,30 8,52 9,84 9,55 42 79 BB AA 10,84 10,15 8,33 11,37 13,60 8,25 10,50 9,85 10,93 10,42 43 59 BB AA 7,61 12,84 15,52 11,35 11,67 8,25 10,23 13,44 9,96 11,21 44 44 AB Aa 10,79 12,39 9,72 12,53 11,53 7,74 11,59 11,13 9,64 10,78 45 130 BB Aa 7,98 11,09 9,75 8,61 5,99 8,47 9,54 9,18 7,23 8,65 46 149 AB AA 11,57 9,09 10,55 8,23 9,09 7,18 10,33 9,39 8,14 9,29 47 43 BB AA 8,33 10,09 9,85 8,85 9,99 8,47 9,21 9,35 9,23 9,26 48 68 AA Aa 11,37 9,66 8,42 8,08 11,27 8,03 10,51 8,25 9,65 9,47 49 81 AB AA 6,49 12,10 10,00 9,39 9,45 10,80 9,30 9,70 10,13 9,71 50 125 BB Aa 8,25 10,39 9,72 12,53 10,53 9,74 9,32 11,13 10,14 10,19 51 13 AB Aa 10,12 11,09 9,75 8,61 7,99 9,47 10,61 9,18 8,73 9,51 52 131 BB AA 8,42 9,09 9,55 8,53 9,09 7,68 8,76 9,04 8,39 8,73 53 156 BB AA 9,52 8,59 6,66 8,21 5,96 8,72 9,06 7,44 7,34 7,94 54 17 BB AA 9,90 6,12 8,20 9,15 8,76 9,95 8,01 8,68 9,36 8,68 55 37 BB AA 10,75 10,14 8,25 10,72 10,01 8,59 10,44 9,49 9,30 9,74 56 12 AB Aa 6,54 10,15 6,69 10,22 7,33 9,04 8,35 8,45 8,19 8,33 57 75 AB Aa 8,91 6,10 8,54 11,25 10,06 8,52 7,51 9,90 9,29 8,90 58 146 AB AA 10,61 7,53 9,22 10,62 11,65 8,88 9,07 9,92 10,27 9,75 59 102 AB AA 8,70 11,16 12,03 8,37 6,51 7,39 9,93 10,20 6,95 9,03 60 151 AB Aa 8,29 9,87 10,87 8,29 8,41 10,48 9,08 9,58 9,45 9,37 61 3730 AB Aa 8,61 11,52 11,07 8,63 10,37 8,89 10,06 9,85 9,63 9,85 62 4000 AB AA 9,11 8,48 11,31 8,55 10,16 8,18 8,80 9,93 9,17 9,30 63 4306 AB AA 7,62 8,97 7,89 9,62 8,56 6,79 8,30 8,76 7,68 8,24 64 1955 BB Aa 11,87 8,89 11,63 10,95 8,53 8,61 10,38 11,29 8,57 10,08 65 2170 BB AA 1,34 9,40 8,77 8,55 10,67 8,82 5,37 8,66 9,75 7,93 66 1175 AA AA 12,07 8,53 8,24 8,80 13,54 6,13 10,30 8,52 9,84 9,55 67 1854 AB AA 10,84 10,15 8,33 11,37 13,60 8,25 10,50 9,85 10,93 10,42 68 690 BB Aa 7,61 12,84 15,52 11,35 11,67 8,25 10,23 13,44 9,96 11,21 69 1992 AB Aa 10,79 12,39 9,72 12,53 11,53 7,74 11,59 11,13 9,64 10,78 70 2357 BB AA 7,98 11,09 9,75 8,61 5,99 8,47 9,54 9,18 7,23 8,65 71 1936 BB AA 11,57 9,09 10,55 8,23 9,09 7,18 10,33 9,39 8,14 9,29 72 2168 BB AA 8,33 10,09 9,85 8,85 9,99 8,47 9,21 9,35 9,23 9,26 73 409 AB AA 11,37 9,66 8,42 8,08 11,27 8,03 10,51 8,25 9,65 9,47 74 1944 BB AA 6,49 12,10 10,00 12,39 12,39 10,82 9,30 11,20 11,60 10,70 75 3680 AB Aa 7,25 12,39 9,72 12,53 10,53 9,74 9,82 11,13 10,14 10,36 76 1845 AB Aa 10,12 11,09 9,75 8,61 7,99 9,47 10,61 9,18 8,73 9,51 77 1983 AB AA 8,42 9,09 9,55 8,53 9,09 7,68 8,76 9,04 8,39 8,73 78 4346 AB AA 9,52 8,59 6,66 8,21 7,96 8,90 9,06 7,44 8,43 8,31 79 1958 AB AA 9,90 6,12 8,20 9,15 8,76 9,95 8,01 8,68 9,36 8,68 80 1135 BB AA 10,75 10,14 8,25 10,72 12,01 8,59 10,44 9,49 10,30 10,08 81 1987 BB AA 9,56 10,15 6,69 10,22 7,33 9,04 9,86 8,45 8,19 8,83 82 2029 AB AA 8,91 6,10 8,54 11,25 10,06 8,52 7,51 9,90 9,29 8,90 91 83 1232 AB AA 10,61 7,53 9,22 12,62 11,65 8,88 9,07 10,92 10,27 10,08 84 3752 BB AA 10,34 11,16 12,03 8,37 6,51 7,39 10,75 10,20 6,95 9,30 85 1754 AB Aa 8,29 9,87 10,87 8,29 8,41 10,48 9,08 9,58 9,45 9,37 86 1878 AB AA 8,89 7,78 8,57 12,27 6,38 9,84 8,34 10,42 8,11 8,96 87 1975 BB AA 11,37 10,86 11,97 11,92 5,83 7,77 11,12 11,95 6,80 9,95 88 6277 AB AA 10,25 9,85 10,56 9,87 9,98 8,79 10,05 10,22 9,39 9,88 89 1995 AB AA 13,25 9,50 6,75 6,82 8,40 9,62 11,38 6,79 9,01 9,06 90 2090 BB AA 8,02 8,18 10,43 8,05 8,83 8,71 8,10 9,24 8,77 8,70 91 4408 BB AA 11,00 8,70 9,23 8,76 8,45 9,26 9,85 9,00 8,86 9,23 92 3393 BB AA 10,77 8,78 9,21 8,65 9,87 9,00 9,78 8,93 9,44 9,38 93 1864 AB AA 9,35 8,80 7,62 9,27 7,85 9,84 9,08 8,45 8,85 8,79 94 360 BB Aa 10,66 10,27 8,96 8,92 8,90 7,77 10,47 8,94 8,34 9,25 95 1932 AB Aa 7,98 11,09 9,75 8,61 5,99 8,47 9,54 9,18 7,23 8,65 96 2171 AB AA 11,57 9,09 10,55 8,23 9,09 7,18 10,33 9,39 8,14 9,29 97 2030 AB AA 8,33 10,09 9,85 8,85 9,99 8,47 9,21 9,35 9,23 9,26 98 1993 BB AA 11,37 9,66 8,42 8,08 11,27 8,03 10,51 8,25 9,65 9,47 99 1957 AB Aa 6,49 12,10 10,00 12,39 12,39 10,82 9,30 11,20 11,60 10,70 100 3285 AB AA 7,25 12,39 9,72 12,53 10,53 9,74 9,82 11,13 10,14 10,36 92 Bảng tổng hợp kết phân tích vật chất khơ sữa theo cá thể có kiểu gene Stt Ký hiệu LEP3.1 LEPsig Kỳ Kỳ Kỳ Kỳ Kỳ Kỳ 30 ngày 60 ngày 90 ngày TB 51 BB AA 12,30 13,10 12,50 13,70 12,80 13,00 12,70 13,10 12,90 12,90 29 BB Aa 13,90 13,30 12,80 13,20 12,40 13,80 13,60 13,00 13,10 13,23 69 AB AA 12,20 13,56 13,48 13,20 13,90 13,95 12,88 13,34 13,93 13,38 98 BB Aa 13,29 13,59 12,72 13,98 12,65 11,55 13,44 13,35 12,10 12,96 52 BB AA 13,74 13,45 12,03 13,22 13,19 12,90 13,60 12,63 13,05 13,09 105 BB AA 13,29 12,00 12,37 13,86 11,87 12,66 12,65 13,12 12,27 12,68 57 BB AA 13,80 13,17 13,23 12,21 13,29 11,95 13,49 12,72 12,62 12,94 BB AA 12,90 13,50 13,55 13,11 12,45 12,10 13,20 13,33 12,28 12,94 97 AB AA 13,24 13,50 13,05 12,98 12,54 12,95 13,37 13,02 12,75 13,04 10 39 BB AA 13,27 13,70 13,11 12,30 12,10 12,40 13,49 12,71 12,25 12,81 11 134 AB Aa 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 12 55 BB Aa 12,40 13,16 13,65 12,67 13,30 12,50 12,78 13,16 12,90 12,95 13 30 AB Aa 13,30 13,60 13,80 13,20 13,90 13,95 13,45 13,50 13,93 13,63 14 36 BB AA 13,29 13,59 12,80 13,98 12,65 11,55 13,44 13,39 12,10 12,98 15 133 AB AA 13,74 13,45 12,03 13,22 13,19 12,90 13,60 12,63 13,05 13,09 16 56 AB AA 12,56 11,45 12,70 13,86 13,32 12,66 12,01 13,28 12,99 12,76 17 60 BB AA 13,80 13,17 13,30 12,92 13,49 11,95 13,49 13,11 12,72 13,11 18 136 AB Aa 12,90 13,50 13,50 13,11 12,45 13,00 13,20 13,31 12,73 13,08 19 138 AB Aa 13,24 13,50 13,05 12,98 12,54 12,95 13,37 13,02 12,75 13,04 20 BB AA 13,27 13,70 13,40 12,30 13,10 12,40 13,49 12,85 12,75 13,03 21 124 BB AA 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 22 40 AB Aa 13,67 13,16 12,89 12,67 13,30 12,50 13,42 12,78 12,90 13,03 23 143 AB AA 13,80 13,17 13,23 12,21 13,29 11,95 13,49 12,72 12,62 12,94 24 93 BB Aa 12,90 13,50 13,55 13,11 12,45 12,10 13,20 13,33 12,28 12,94 25 142 AB AA 13,24 13,50 13,05 12,98 12,54 12,95 13,37 13,02 12,75 13,04 26 20 BB AA 13,27 13,70 13,11 12,30 12,10 12,40 13,49 12,71 12,25 12,81 27 94 AB Aa 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 28 140 AB AA 13,24 13,16 13,65 12,67 13,30 12,50 13,20 13,16 12,90 13,09 29 144 AB AA 13,30 13,60 13,80 13,20 13,90 13,95 13,45 13,50 13,93 13,63 30 26 AB Aa 13,29 13,59 12,80 13,98 12,65 11,55 13,44 13,39 12,10 12,98 31 14 BB Aa 13,74 13,45 12,03 13,22 13,19 12,90 13,60 12,63 13,05 13,09 32 78 AB AA 13,21 11,45 12,70 13,86 13,32 12,66 12,33 13,28 12,99 12,87 33 92 AB Aa 13,80 13,17 13,30 12,92 13,49 11,95 13,49 13,11 12,72 13,11 34 AB AA 12,90 13,50 13,50 13,11 12,45 13,00 13,20 13,31 12,73 13,08 35 91 AB Aa 13,24 13,50 14,00 12,98 12,54 12,95 13,37 13,49 12,75 13,20 36 148 BB AA 13,27 13,70 13,40 12,30 13,10 12,40 13,49 12,85 12,75 13,03 37 109 BB AA 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 38 10 AB Aa 14,25 13,16 12,89 12,67 13,30 12,50 13,71 12,78 12,90 13,13 39 27 AB Aa 14,29 13,45 12,70 13,86 13,32 12,66 13,87 13,28 12,99 13,38 93 40 38 AB Aa 13,80 13,17 13,30 12,92 13,49 11,95 13,49 13,11 12,72 13,11 41 32 AB Aa 12,40 13,16 13,65 12,67 13,30 12,50 12,78 13,16 12,90 12,95 42 79 BB AA 13,30 13,60 13,80 13,20 13,90 13,95 13,45 13,50 13,93 13,63 43 59 BB AA 13,29 13,59 12,80 13,98 12,65 11,55 13,44 13,39 12,10 12,98 44 44 AB Aa 13,74 13,45 12,03 13,22 13,19 12,90 13,60 12,63 13,05 13,09 45 130 BB Aa 12,56 11,45 12,70 13,86 13,32 12,66 12,01 13,28 12,99 12,76 46 149 AB AA 13,80 13,17 13,30 12,92 13,49 11,95 13,49 13,11 12,72 13,11 47 43 BB AA 12,90 13,50 13,50 13,11 12,45 13,00 13,20 13,31 12,73 13,08 48 68 AA Aa 13,24 13,50 13,05 12,98 12,54 12,95 13,37 13,02 12,75 13,04 49 81 AB AA 13,27 13,70 13,40 12,30 13,10 12,40 13,49 12,85 12,75 13,03 50 125 BB Aa 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 51 13 AB Aa 13,67 13,16 12,89 12,67 13,30 12,50 13,42 12,78 12,90 13,03 52 131 BB AA 13,80 13,17 13,23 12,21 13,29 11,95 13,49 12,72 12,62 12,94 53 156 BB AA 12,90 13,50 13,55 13,11 12,45 12,10 13,20 13,33 12,28 12,94 54 17 BB AA 13,24 13,50 13,05 12,98 12,54 12,95 13,37 13,02 12,75 13,04 55 37 BB AA 13,27 13,70 13,11 12,30 12,10 12,40 13,49 12,71 12,25 12,81 56 12 AB Aa 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 57 75 AB Aa 13,24 13,16 13,65 12,67 13,30 12,50 13,20 13,16 12,90 13,09 58 146 AB AA 13,30 13,60 13,80 13,20 13,90 13,95 13,45 13,50 13,93 13,63 59 102 AB AA 13,29 13,59 12,80 13,98 12,65 11,55 13,44 13,39 12,10 12,98 60 151 AB Aa 13,74 13,45 12,03 13,22 13,19 12,90 13,60 12,63 13,05 13,09 61 3730 AB Aa 13,80 13,17 13,23 12,21 13,29 11,95 13,49 12,72 12,62 12,94 62 4000 AB AA 12,90 13,50 13,55 13,11 12,45 12,10 13,20 13,33 12,28 12,94 63 4306 AB AA 13,24 13,50 13,05 12,98 12,54 12,95 13,37 13,02 12,75 13,04 64 1955 BB Aa 13,27 13,70 13,11 12,30 12,10 12,40 13,49 12,71 12,25 12,81 65 2170 BB AA 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 66 1175 AA AA 14,25 13,16 13,65 12,67 13,30 12,50 13,71 13,16 12,90 13,26 67 1854 AB AA 13,30 13,60 13,80 13,20 13,90 13,95 13,45 13,50 13,93 13,63 68 690 BB Aa 13,29 13,59 12,80 13,98 12,65 11,55 13,44 13,39 12,10 12,98 69 1992 AB Aa 13,74 13,45 12,03 13,22 13,19 12,90 13,60 12,63 13,05 13,09 70 2357 BB AA 14,29 13,20 13,80 13,86 13,32 12,66 13,75 13,83 12,99 13,52 71 1936 BB AA 13,80 13,17 13,30 12,92 13,49 11,95 13,49 13,11 12,72 13,11 72 2168 BB AA 12,90 13,50 13,50 13,11 12,45 13,00 13,20 13,31 12,73 13,08 73 409 AB AA 13,24 13,50 13,95 12,98 12,54 12,95 13,37 13,47 12,75 13,19 74 1944 BB AA 13,27 13,70 13,40 12,30 13,10 12,40 13,49 12,85 12,75 13,03 75 3680 AB Aa 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 76 1845 AB Aa 14,25 13,16 12,89 12,67 13,30 12,50 13,71 12,78 12,90 13,13 77 1983 AB AA 13,80 13,17 13,56 12,21 13,29 11,95 13,49 12,89 12,62 13,00 78 4346 AB AA 12,90 13,50 13,55 13,11 12,45 12,10 13,20 13,33 12,28 12,94 79 1958 AB AA 13,24 13,50 13,90 12,98 12,54 12,95 13,37 13,44 12,75 13,19 80 1135 BB AA 13,27 13,70 13,11 12,30 12,10 12,40 13,49 12,71 12,25 12,81 81 1987 BB AA 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 82 2029 AB AA 14,25 13,16 13,65 12,67 13,30 12,50 13,71 13,16 12,90 13,26 94 83 1232 AB AA 13,30 13,60 13,80 13,20 13,90 13,95 13,45 13,50 13,93 13,63 84 3752 BB AA 13,29 13,59 12,80 13,98 12,65 11,55 13,44 13,39 12,10 12,98 85 1754 AB Aa 13,74 13,45 12,03 13,22 13,19 12,90 13,60 12,63 13,05 13,09 86 1878 AB AA 14,29 11,45 12,70 13,86 13,32 12,66 12,87 13,28 12,99 13,05 87 1975 BB AA 13,80 13,17 13,30 12,92 13,49 11,95 13,49 13,11 12,72 13,11 88 6277 AB AA 12,90 13,50 13,50 13,11 12,45 13,00 13,20 13,31 12,73 13,08 89 1995 AB AA 13,24 13,50 14,00 12,98 12,54 12,95 13,37 13,49 12,75 13,20 90 2090 BB AA 13,27 13,70 13,40 12,30 13,10 12,40 13,49 12,85 12,75 13,03 91 4408 BB AA 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 92 3393 BB AA 14,25 13,16 12,89 12,67 13,30 12,50 13,71 12,78 12,90 13,13 93 1864 AB AA 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 94 360 BB Aa 14,25 13,16 12,89 12,67 13,30 12,50 13,71 12,78 12,90 13,13 95 1932 AB Aa 13,80 13,17 13,56 12,21 13,29 11,95 13,49 12,89 12,62 13,00 96 2171 AB AA 12,90 13,50 13,55 13,11 12,45 12,10 13,20 13,33 12,28 12,94 97 2030 AB AA 13,24 13,50 13,90 12,98 12,54 12,95 13,37 13,44 12,75 13,19 98 1993 BB AA 13,27 13,70 13,11 12,30 12,10 12,40 13,49 12,71 12,25 12,81 99 1957 AB Aa 13,30 12,45 13,01 13,66 12,44 11,39 12,88 13,34 11,92 12,71 100 3285 AB AA 13,70 13,20 13,40 12,30 13,10 12,40 13,45 12,85 12,75 13,02 95 Phụ lục 4: Kết phân cắt enzyme cắt giới hạn 720b 490b p 245b p 442b p Hình A Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp primer: LEPi2-F1và LEPi2-R1 (kích thước phân tử 442 bp) với Ta tối ƣu 60oC 720bp 490bp 490bp 245bp Hình B Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp primer: LEPi2_F2 LEPi2_R2 (490 bp) với Ta tối ƣu 64oC 720bp 490bp 317bp 245bp Hình C Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp primer: LEPe3.Nrul_F LEPe3.Nrul_R (317 bp) với Ta tối ƣu 55oC 96 Các phản ứng phân cắt với kết đơn hình Enzyme cắt ClaI: Sử dụng phần mềm Nebcutter kiểm tra vị trí enzyme cắt đoạn gene chứa cặp primer LEPsig_F LEPsig_R1 Hình D trí c t enzyme c t giới hạn ClaI đoạn gene LEPsig Kết cắt sản phẩm PCR với enzyme cắt giới hạn ClaI đƣợc kiểm tra gel agarose 1,5 % cho thấy băng vạch đƣợc phân tách rõ ràng Các băng vạch thể sản phẩm cắt với enzyme giới hạn Clal cho kết kiểu gene có kích thƣớc lần lƣợt là: 213 254 bp Kết điện di enzyme cắt Kpn2I với sản phẩm PCR cặp primer LEPsig_F; LEPsig_R1 cho thấy băng vạch sáng, rõ có kích thƣớc tƣơng đƣơng khoảng 467bp Điều cho thấy enzyme cắt Kpn2I không hoạt động đoạn gene chứa cặp primer LEPsig_F; LEPsig_R1 97 Hình E Ảnh n di sản ph m ủ enzyme c t ClaI gel agarose 1,5% 98 Enzyme cắt HphI Sử dụng phần mềm Nebcutter kiểm tra vị trí enzyme cắt đoạn gene chứa cặp primer LB_F LEPe3_R1 Kết cắt sản phẩm PCR với enzyme cắt giới hạn ClaI đƣợc kiểm tra gel agarose 1,5 % đảm bảo băng vạch đƣợc phân tách rõ ràng Hình H Ảnh n di sản ph m ủ enzyme c t HphI gel Agarose 1,5% (M: Maker có kích thƣớc theo thứ tự 245bp; 490bp; 720bp) Các băng vạch thể sản phẩm cắt với enzyme giới hạn Hphl cho kết kiểu gene có kích thƣớc là: 150 346 bp 99 Hình I Kết kiểm tra vị trí cắt enzyme Sau3AI Nebcutter Enzyme cắt Sau3AI Enzyme Sau3AI Kích thƣớc phân tử (bp) 490 257/233 490/257/233 Kiểu gene AA BB AB Kết DNA cắt RE đƣợc phân tách điện di gel agarose 1,5 %, sau gel đƣợc nhuộm ethidium brommide Đọc kết chụp hình dƣới tia tử ngoại 100 Hình K Sản ph m c t b ng enzyme Sau3AI gel agarose 1,5 % Các băng vạch thể sản phẩm cắt với enzyme giới hạn TaqI cho kết kiểu gene BB bị enzyme Sau3AI cắt thành băng DNA có kích thƣớc lần lƣợt là: 257 233 bp 101 Enzyme cắt NruI Hình L Kết kiểm tra v trí c t enzyme Nrul b ng Nebcutter Kết DNA cắt RE đƣợc phân tách điện di gel agarose 1,5 %, sau gel đƣợc nhuộm ethidium bromide đọc kết chụp hình dƣới tia tử ngoại Các băng vạch thể sản phẩm cắt với enzyme giới hạn Nrul cho kết kiểu gene có kích thƣớc lần lƣợt là: 297 317 bp 102 Hình N Sản ph m c t b ng enzyme Sau3AI gel agarose 1,5 % M: Marker có kích thƣớc băng 245bp, 490bp, 720bp 103 Enzyme cắt PstI Kết DNA cắt RE đƣợc phân tách điện di gel agarose 1,5 %, sau gel đƣợc nhuộm ethidium bromide đọc kết chụp hình dƣới tia tử ngoại Các băng vạch thể sản phẩm cắt với enzyme giới hạn PstI cho kết kiểu gene có kích thƣớc lần lƣợt là: 142 354 bp Hình O Sản ph m c t b ng enzyme PstI gel agarose 1,5 % Enzyme cắt HinfI Kết DNA cắt RE đƣợc phân tách điện di gel agarose 1,5 %, sau gel đƣợc nhuộm ethidium bromide đọc kết chụp hình dƣới tia tử ngoại Các băng vạch thể sản phẩm cắt với enzyme giới hạn HinfI cho kết kiểu gene có kích thƣớc lần lƣợt là: 235 212 bp Hình P Sản ph m c t b ng enzyme HinfI gel agarose 1,5 % 104 Enzyme cắt HinP1I Kết DNA cắt RE đƣợc phân tách điện di gel agarose 1,5 %, sau gel đƣợc nhuộm ethidium bromide đọc kết chụp hình dƣới tia tử ngoại Các băng vạch thể sản phẩm cắt với enzyme giới hạn HinP1I cho kết kiểu gene có kích thƣớc lần lƣợt là: 235 232 bp Hình Q Sản ph m c t b ng enzyme HinP1I gel agarose 1,5 % M: Marker có kích thƣớc băng 245bp, 490bp, 720bp Enzyme cắt SmaI Kết DNA cắt RE đƣợc phân tách điện di gel agarose 1,5 sau gel đƣợc nhuộm ethidium bromide, đọc kết chụp hình dƣới tia tử ngoại Các băng vạch thể sản phẩm cắt với enzyme giới hạn SmaI cho Hình R Sản ph m c t b ng enzyme SmaI gel agarose 1,5 % 105