Khảo sát sự hình thành ngoại khuẩn căn giữa thông ba lá đà lạt pinus kesiya và nấm matsutake tricholoma matsutake ở quy mô phòng thí nghiệm

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH THÀNH ðỒN TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ
* BÁO CÁO NGHIỆM THU (ðã chỉnh sửa theo góp ý Hội ñồng nghiệm thu ngày 22 tháng 01 năm 2010) KHẢO SÁT SỰ HÌNH THÀNH NGOẠI KHUẨN CĂN GIỮA THƠNG BA LÁ ðÀ LẠT (PINUS KESIYA) VÀ NẤM MATSUTAKE (TRICHOLOMA MATSUTAKE) Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM Chủ nhiệm đề tài: CN PHẠM NGUYỄN ðỨC HỒNG Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ TP Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2010 LỜI CẢM ƠN Với lịng biết ơn sâu sắc xin gửi ñến: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ trẻ - Thành đồn Tp Hồ Chí Minh Sở Khoa học Cơng nghệ TP.HCM tạo điều kiện cung cấp kinh phí để tơi thực nghiên cứu Các thầy hội đồng xét duyệt: PGS TSKH Ngô Kế Sương, PGS TS Phạm Thành Hổ, PGS TS Lê Xuân Thám, TS Trần Thanh Thủy, TS Trần Thị Dung đóng góp ý kiến q báu ñể phát triển nghiên cứu Các bạn anh chị làm việc Trung tâm Phát triển Khoa học Cơng nghệ trẻ - Thành đồn Tp Hồ Chí Minh Phịng quản lý khoa học – Sở Khoa học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh tận tình hường dẫn, giúp đỡ để tơi có điều kiện thuận lợi tiếp cận, tham gia chương trình Vườn ươm sáng tạo khoa học kỹ thuật trẻ Các thầy cơ, lãnh đạo ñồng nghiệp Bộ môn Vi Sinh – Khoa Sinh ðại học Khoa học Tự nhiên, Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh Viện Sinh học Tây Nguyên, ðà Lạt, Lâm ðồng ñã hỗ trợ giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi phát triển nghiên cứu Trân trọng I Lời giới thiệu Tricholoma matsutake (S.Ito& Imai) Singer thị trường ñược gọi nấm Matsutake Thực ñây tên gọi chung cho nhiều lồi nấm có liên quan T bakamatsutake Hongo, T.caligartum (Viv.) Richken, T magnivelare (Peck) Redhead, v.v ( Hosford cộng sự, 1997; Rowe, 1997) [3] mà T matsutake loại ñắt ngon Loại nấm ñược xem nấm truyền thống Nhật Bản ñược dùng làm quà tặng cho bạn bè Ở vài thời ñiểm năm, kg nấm tươi có giá đến 500 USD Với mục đích đưa nấm Matsutake vào Việt Nam, chúng tơi chọn thông ba Pinus kesiya Royle ex Gordon ñối tượng nghiên cứu khả cộng sinh với T matsutake điều kiện sinh dưỡng - khí hậu loại rừng giống với khu vực có nhiều nấm Matsutake Nhật Bản tương ñồng phân loại học với P densiflora [6,7] P kesiya phân bố khắp vùng cao nguyên Việt Nam, trải dài từ Lâm ðồng ñến Lào Cai Về hệ thống học, P kesiya P densiflora thuộc nhóm phụ Pinus L., nhóm Pinus L., giống phụ Pinus L., giống Pinus L., họ Pinaceae Vì vậy, chưa có ghi nhận cộng sinh Pinus kesiya T matsutake, ý tưởng có nhiều hội thành cơng Introduction Tricholoma matsutake (S.Ito & Imai) Singer is known in the commercial name as Matsutake mushroom which includes some other related mushrooms liked T bakamatsutake Hongo, T caligartum (Viv.) Richken, T magnivelare (Peck) Redhead, etc… (Hosford et al, 1997; Rowe, 1997) [3] However, T matsutake is the most expensive and delicious This mushroom can be called the traditional mushroom of Japan and can be used as the valuable gift for friend At some period in year, its price can be about 500USD/1kg of fresh mushroom With the aim to bring Matsutake to Vietnam, we choose Pinus kesiya Royle ex Gordon (Vietnamese: thong ba la) for investigating the symbiotically ability with T matsutake because of the large of this forest, the similar weather with Matsutake area in Japan, and the close between it with P densiflora in taxonomy [6,7] The distribution of P kesiya is all over the plateaus in Vietnam from Lam Dong Province to Lao Cai Province About taxonomy, P kesiya and P densiflora are in the same subsection Pinus L., section Pinus L., subgenus Pinus L., genus Pinus L., family Pinaceae Thus, although there are not any records until now about the symbiosis between Pinus kesiya and T matsutake, this idea still has the big chance to success II MỤC LỤC Trang I Lời cảm ơn Lời giới thiệu/Introduction Mục lục Danh sách bảng Danh sách sơ ñồ Danh sách biểu đồ Danh sách hình Bảng tốn II III VI VI VII VII VIII PHẦN MỞ ðẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 1.1.1 1.1.2 1.2 1.2.1 1.2.1.1 1.2.1.2 1.2.1.3 1.2.2 1.2.2.1 1.2.2.2 1.2.2.3 1.2.3 1.2.3.1 1.2.3.2 1.2.4 1.3 1.3.1 1.3.2 2.1 2.1.1 2.1.2 NẤM CỘNG SINH VÀ KHUẨN CĂN Nấm cộng sinh Khuẩn (mycorrhiza) cộng sinh khuẩn NGOẠI KHUẨN CĂN (ECTOMYCORRHIZAS – ECM) Các nguồn nhiễm tạo ECM Bào tử Các ñoạn khuẩn Hệ sợi nấm bên ngồi khuẩn Một số đặc ñiểm hình thái ngoại khuẩn Mạng lưới Hartig 11 Lớp mơ nấm bao bên ngồi rễ 13 Hệ sợi nấm đất 13 Sự hình thành ngoại khuẩn 13 Sự tiếp xúc chế tiếp xúc nấm rễ 13 Sự phát triển ngoại khuẩn 15 Hình thành thể loài nấm ngoại cộng sinh 15 NẤM MATSUTAKE (TRICHOLOMA MATSUTAKE) VÀ TIỀM 17 NĂNG PHÁT TRIỂN TẠI VIỆT NAM Vị trí phân loại nấm Tricholoma matsutake (S.Ito& Imai) Singer Tiềm ứng dụng Việt Nam 17 17 CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG 21 PHÁP VẬT LIỆU 21 ðối tượng nghiên cứu 21 Hóa chất 21 III 2.1.2.1 2.1.2.2 2.1.2.3 2.2 2.2.1 2.2.2 Môi trường Các loại ñường Các thành phần khác PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM Nhân giữ giống nấm Tricholoma matsutake Tìm mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc ni cấy hệ sợi nấm Tricholoma matsutake ñiều kiện in vitro 2.2.2.1 So sánh tăng trưởng hệ sợi nấm nuôi cấy loại môi trường PGA, MMN FDA 2.2.2.2 Khảo sát khả sử dụng loại ñường hệ sợi nấm 2.2.2.3 Khảo sát khả tăng trưởng hệ sợi nấm bổ sung vitamin B1 vào mơi trường nồng độ khác 2.2.3 Khảo sát khả tăng sinh môi trường lỏng nấm Tricholoma matsutake 2.2.4 Khảo sát khả cộng sinh hệ sợi nấm Tricholoma matsutake với thông ba Pinus kesiya điều kiện in-vitro mơ hình ống nghiệm 2.2.5 Xác định đặc điểm hình thái giải phẫu đặc trưng ngọai khuẩn hình thành Tricholoma matsutake Pinus kesiya 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu CHƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 NHÂN VÀ GIỮ GIỐNG NẤM TRICHOLOMA MATSUTAKE 21 21 21 22 22 22 22 22 22 23 23 24 24 25 25 TÌM MƠI TRƯỜNG DINH DƯỠNG THÍCH HỢP CHO VIỆC 25 NI CẤY HỆ SỢI NẤM TRICHOLOMA MATSUTAKE ðIỀU KIỆN IN VITRO So sánh tăng trưởng hệ sợi nấm nuôi cấy loại môi 25 trường PGA, MMN FDA 27 Khảo sát khả sử dụng loại ñường hệ sợi nấm 29 Khảo sát khả tăng trưởng hệ sợi nấm bổ sung vitamin B1 vào mơi trường nồng độ khác 3.3 3.4 3.4.1 3.4.2 3.5 KHẢO SÁT KHẢ NĂNNG TĂNG SINH TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG CỦA NẤM TRICHILOMA MATSUTAKE KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỘNG SINH CỦA HỆ SỢI NẤM TRICHOLOMA MATSUTAKE VỚI THÔNG BA LÁ PINUS KESIYA TRONG ðIỀU KIỆN IN VITRO TRÊN MƠ HÌNH ỐNG NGHIỆM 31 32 32 Mơ hình thí nghiệm 33 Mơ hình thí nghiệm XÁC ðỊNH CÁC ðẶC ðIỂM HÌNH THÁI GIẢI PHẪU ðẶC IV TRƯNG CỦA NGOẠI KHUẨN CĂN HÌNH THÀNH GIỮA TRICHOLOMA MATSUTAKE VÀ PINUS KESIYA CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC V 36 DANH SÁCH BẢNG SỐ 1.1 TRANG Một số loại nấm ngoại cộng sinh (Mỗi giống có 1.2 ghi nhận có lồi nấm có tượng ngoại cộng sinh) Tốc độ lan tơ mơi trường thạch in vitro khả nuôi cấy số loài nấm ngoại cộng sinh So sánh tăng trưởng hệ sợi nấm nuôi cấy loại môi trường PGA, MMN FDA 3.1 TÊN BẢNG SỐ LIỆU 25 3.2 ðường kính khuẩn lạc trung bình (mm) hệ sợi nấm ni cấy mơi trường MMN với loại ñường khác 90 ngày 27 3.3 ðường kính khuẩn lạc trung bình (mm) hệ sợi nấm nuôi cấy môi trường MMN bổ sung vitamin B1 với nồng ñộ khác 90 ngày 30 3.4 Trọng lượng khơ trung bình (mg) hệ sợi nấm nuôi cấy môi trường MMN bổ sung vitamin B1 5µg/l 75 ngày tỉ lệ nhiễm tổng số chai sử dụng nghiệm thức 31 3.5 Số lượng có diện ngọai khuẩn sau 30, 60, 90, 120 ngày từ rễ tiếp xúc với nấm 33 DANH SÁCH SƠ ðỒ SỐ 1.1 1.2 1.3 3.1 TÊN SƠ ðỒ Sự phân loại ñơn giản dạng khuẩn Sự tạo thành khuẩn từ nguồn nhiễm khác Cấu trúc mạng lưới Hartig phụ thuộc vào loại chủ Con ñường hấp thu màng qua màng (apoplast) thực vật nấm quan hệ ngoại công sinh VI TRANG 11 29 DANH SÁCH BIỂU ðỒ SỐ 1.1 1.2 3.1 3.2 3.3 TÊN SƠ ðỒ TRANG Sản lượng nấm Matsutake Nhật Bản theo năm từ 1970 18 ñến 2001 Sản lượng nấm Matsutake nhập từ nước vào Nhật Bản năm 1998-1999 Sự tăng trưởng hệ sợi nấm nuôi cấy loại môi trường PGA, MMN FDA 90 ngày Sự tăng trưởng hệ sợi nấm nuôi cấy mơi trường MMN với loại đường khác 15 ngày Sự tăng trưởng hệ sợi nấm nuôi cấy môi trường MMN bổ sung vitamin B1 với nồng ñộ khác 15 ngày 20 26 28 30 DANH SÁCH HÌNH SỐ 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 TÊN HÌNH ẢNH Ngoại khuẩn tạo thành môi trường in vitro Eucalyptus Pisolithus tinctorius Tơ nấm từ khuẩn chết (dr) xâm nhập vào rễ Một số cấu trúc phân đơi ngoại khuẩn Một số ngoại khuẩn thơng (Pinus) bạch đàn (Eucalyptus) Hình chụp kính hiển vi quang học ngoại khuẩn tạo thành Eucalyptus pilularis Pisolithus tinctorius TRANG 10 10 1.6 Cấu trúc mạng lưới Hartig lớp mơ nấm bên ngồi phần khác chóp rễ cộng sinh 12 1.7 1.8 Sự hình thành lớp mơ nấm bao bên ngồi rễ Diễn loài nấm ngoại cộng sinh phát triển hệ thực vật Nấm Matsutake (Tricholoma matsutake (S.Ito& Imai) Singer) Hàn Quốc Hệ sợi Tricholoma matsutake lọai môi trường sau 60 ngày nuôi cấy Hệ sợi Tricholoma matsutake môi trường MMN lỏng bổ sung 5µg/l vitamin B1sau 75 ngày ni cấy Mơ hình thí nghiệm Mơ hình thí nghiệm ðặc ñiểm ngoại khuẩn nấm Tricholoma matsutake thông ba Pinus kesiya 14 16 1.9 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 VII 19 26 32 33 34 35 1.1 NẤM CỘNG SINH VÀ KHUẨN CĂN 1.1.1 Nấm cộng sinh Trong tự nhiên, mối quan hệ ký sinh hoại sinh, nấm cịn có mối quan hệ cộng sinh với loài sinh vật khác Mối quan hệ thể cách rõ rệt qua hình thành địa y, khuẩn nấm mối • ðịa y: thể mối quan hệ cộng sinh nấm tảo hay vi khuẩn lam Tảo vi khuẩn lam tổng hợp chất hữu từ trình quang hợp cung cấp cho nấm, ngược lại nấm đóng vai trị giá thể hấp thu khống, nước từ mơi trường cung cấp cho tảo ðây dạng cộng sinh tiên phong phát triển vùng đất khắc nghiệt • Nấm mối: tiêu biểu cho mối quan hệ cộng sinh nấm trùng Khi mối tha gỗ tổ đồng thời mang theo tơ nấm phát tán tổ Enzym nước bọt mối làm tan vách bào tử nấm giúp bào tử nẩy mầm Tơ nấm phát triển tổ mối hình thành hạch nấm làm nguồn thức ăn tốt cho mối • Khuẩn căn: thể mối quan hệ cộng sinh rễ thực vật nấm Trong mơi trường tự nhiên, khuẩn có mặt rộng khắp thành phần quan trọng tất hệ sinh thái sinh 1.1.2 Khuẩn (mycorrhiza) cộng sinh khuẩn Mycorrhiza bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa “rễ nấm” Năm 1885 A.B.Frank ñã ñưa khái niệm lần để mơ tả quan hoa cúc Cupaliferae Thuật ngữ mycorrhiza sau ñó ñược mở rộng dần ñược dùng ñể tất cấu trúc có liên kết cộng sinh nấm rễ Một khuẩn gồm có phần: hệ tơ nấm bào tử bên ngồi mơi trường, cấu trúc tơ nấm bên rễ cấu trúc rễ Trong đó, cấu trúc tơ nấm phát triển rễ ñặc điểm đóng vai trị định dạng khuẩn Năm 1969, Peyronel cộng ñưa thuật ngữ nội khuẩn (endomycorrhiza) ngoại khuẩn (ectomycorrhiza) dựa vào cấu trúc tơ nấm bên rễ ñể thay thuật ngữ khuẩn nội dinh dưỡng khuẩn ngoại dinh dưỡng A.B.Frank đưa trước (1887) Hiện nay, nhà sinh học chia -1- khuẩn làm nhóm :vesicular-arbuscular mycorrhiza, arbutoid mycorrhiza, ericoid mycorrhiza, orchid mycorrhiza, monotropoid mycorrhiza, ectendomycorrhiza, ectomycorrhiza Trong đó, vesicular-arbuscular mycorrhiza, arbutoid mycorrhiza, ericoid mycorrhiza, monotropoid mycorrhiza nội khuẩn Ectendomycorrhiza coi dạng trung gian ngoại khuẩn nội khuẩn Có thể phân loại so sánh cách ñơn giản nhóm khuẩn dựa vào sơ đồ Sự cộng sinh khuẩn có vai trị quan trọng việc trì ổn định phát triển hệ sinh thái rừng Khuẩn giúp thực vật hấp thu nước dưỡng chất từ đất, tăng đường kính chiều dài rễ con, bảo vệ hệ thống rễ khỏi mầm bệnh Ngồi ra, khuẩn ty nấm cịn giúp thực vật hút dinh dưỡng nồng ñộ thấp dạng dinh dưỡng hữu khơng có sẵn (Stribey & Read, 1980) [5] Ngược lại, thực vật cung cấp ñường số dinh dưỡng cho nấm Những nghiên cứu gần ñây ñã ñặt số giả thuyết cho có trao đổi qua lại chất kích thích tăng trưởng khuẩn ty nấm rễ thực vật Trong tự nhiên, hai dạng khuẩn phổ biến vesicular - arbuscular mycorrhiza ectomycorrhiza ðây hai dạng khuẩn ñược nghiên cứu nhiều có giá trị ứng dụng lớn nơng nghiệp lâm nghiệp -2- Hình 3.2: Hệ sợi Tricholoma matsutake môi trường MMN lỏng bổ sung 5µg/l vitamin B1sau 75 ngày ni cấy A ni tĩnh; B ni cấy lắc 100-110 vịng/phút 3.4 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỘNG SINH CỦA HỆ SỢI NẤM TRICHOLOMA MATSUTAKE VỚI THÔNG BA LÁ PINUS KESIYA TRONG ðIỀU KIỆN IN VITRO TRÊN MƠ HÌNH ỐNG NGHIỆM Do thời gian tiến hành thí nghiệm dài (120 ngày) thường xuyên thao tác với mẫu, nhóm tác giả lựa chọn mơ hình ống nghiệm để tiến hành khảo sát khả cộng sinh nấm Tricholoma matsutake với thông ba Pinus kesiya ñể hạn chế tối ña khả nhiễm từ mơi trường từ thao tác thí nghiệm Một số ưu mơ hình sử dụng ống nghiệm:
Sử dụng nút silicon (silicon plugs) hạn chế xâm nhập vi sinh vật từ bên ngồi đồng thời giữ độ ẩm cho mơi trường
Dễ thao tác
Chiếm diện tích nhỏ hệ thống ủ lạnh chiếu sáng 3.4.1 Mơ hình thí nghiệm Sau thời gian 120 ngày, có 02 tổng số 10 ñược giải phẫu có dày lên lớp tế bào biểu bì xuất lớp mô nấm bao bên ngịai rễ (Hình 3.5A) ðây đặc ñiểm ngọai khuẩn Tuy nhiên, quan sát ñược mạng lưới Hartig phẫu thức mẫu rễ nhỏ - 32 - mềm Tỉ lệ 2/10 số lượng có diện ngoại khuẩn sau 120 ngày từ rễ tiếp xúc với nấm tổng số thấp Bảng 3.5: Số lượng có diện ngọai khuẩn sau 30, 60, 90, 120 ngày từ rễ tiếp xúc với nấm Số lượng có diện ngọai khuẩn căn/tổng số (10 cây) 30 ngày 60 ngày 90 ngày 120 ngày 0/10 0/10 0/10 2/10 * * Biểu không rõ ràng Kết luận: Khơng thể kết luận có hay khơng có hình thành ngọai khuẩn thơng ba Pinus kesiya nấm Tricholoma matsutake thí nghiệm B A Hình 3.3: Mơ hình thí nghiệm A thông sau 120 ngày tiếp xúc với hệ sợi nấm; B hệ sợi nấm bao quanh rễ thông 3.4.2 Mơ hình thí nghiệm Trong hầu hết tất nghiệm thức, rễ thông xuyên qua lớp bơng gịn để tiếp xúc với hệ sợi nấm Sau 90 ngày có 7/48 nghiệm thức có tiếp xúc nấm rễ thông nhiên hầu hết rễ có tượng nước khơng có nghiệm thức có đặc điểm ngoại khuẩn giải phẫu hình thái - 33 - B A Hình 3.4: Mơ hình thí nghiệm A thông sau 120 ngày gieo bơng gịn; B thơng nảy mầm bơng gịn thấm mơi trường MS 0%glucose, phía hệ sợi nấm Tricholoma matsutake môi trường MMN thạch nghiêng Kết luận: Mơ hình khơng phù hợp cho việc khảo sát cộng sinh Tricholoma matsutake Pinus kesiya 3.5 XÁC ðỊNH CÁC ðẶC ðIỂM HÌNH THÁI GIẢI PHẪU ðẶC TRƯNG CỦA NGOẠI KHUẨN CĂN HÌNH THÀNH GIỮA TRICHOLOMA MATSUTAKE VÀ PINUS KESIYA ðặc điểm thơ đại: Chóp rễ thứ cấp phần phía chóp rễ có màu sắc đậm so với phần cịn lại (Hình 3.4B) ðây ñặc ñiểm ngọai khuẩn thông [5,7] Tuy nhiên không thấy rõ diện hệ sợi nấm phát triển từ rễ ðặc điểm hiển vi: có xuất lớp mơ nấm bao bên ngồi rễ (Hình 3.5 A) Khơng quan sát mang lưới Hartig dạng cấu trúc tơ nấm phát triển từ rễ thông - 34 - B A Hình 3.5: ðặc điểm ngoại khuẩn nấm Tricholoma matsutake thông ba Pinus kesiya A phẫu thức ngang khuẩn căn, (mũi tên) lớp mơ nấm bao bên ngồi rễ, Bar 10µm; B rễ thứ cấp phần chóp rễ (mũi tên) có màu sậm - 35 - 4.1 KẾT LUẬN 4.1.1 Tìm mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc ni cấy hệ sợi nấm Tricholoma matsutake điều kiện in vitro Mơi trường MMN với đường glucose nồng độ 10g/lít, vitamin B1 với nồng độ 5µg/l cho phát triển tốt hệ sợi so với nghiệm thức khác 4.1.2 Khảo sát khả cộng sinh hệ sợi nấm Tricholoma matsutake với thông ba Pinus kesiya điều kiện in-vitro mơ hình ống nghiệm Số lượng có diện ngọai khuẩn sau 120 ngày từ rễ tiếp xúc với nấm 2/10 (20%) mơ hình thí nghiệm Các nghiệm thức khác khơng có ghi nhận có diện ngọai khuẩn 4.1.3 Xác ñịnh ñặc ñiểm hình thái giải phẫu ñặc trưng ngọai khuẩn hình thành Tricholoma matsutake Pinus kesiya ðặc điểm thơ đại: Chóp rễ thứ cấp phần phía chóp rễ có màu sắc ñậm so với phần lại ðặc ñiểm hiển vi: có xuất lớp mơ nấm bao bên ngồi rễ Khơng xác định đặc điểm lại 4.2 ðỀ NGHỊ Tiếp tục triển khai khảo sát khả cộng sinh nấm Tricholoma matsutake với thơng ba Pinus kesiya mơ hình thí nghiệm khác - 36 - PHỤ LỤC I CÔNG THỨC CÁC MƠI TRƯỜNG Mơi trường PGA (Potatoses Glucose Agar) [9] Potato extract 4g Glucose 20g Agar 15g Nước cất 1000 ml Môi trường FDA (Ferry and Das Agar, 1968) [9] NH4Cl 500mg KH2PO4 500mg MgSO4.7H2O 500mg Glucose 20g Malt extract 5g pH 5,0 Agar 15g Nước cất 1000ml Môi trường MMN (Modified Melin Norkans medium, Marx 1969) [9] (NH4)2HPO4 250mg KH2PO4 500mg MgSO4.7H2O 150mg NaCl 25mg CaCl2.2H2O 50mg PL1 FeEDTA 20mg Glucose 10g Malt extract 3g pH 5,8 Agar 15g Nước cất 1000ml Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) [19] Thành phần khống đa lượng (mg/l) KNO3 1900 NH4NO3 1650 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Thành phần khoáng vi lượng (µg/l) MnSO4.4H2O 22.300 ZnSO4.7H2O 8.600 H3BO3 6.200 KI 830 CuSO4.5H2O 25 CoCl2.6H2O 25 Na2MoO4.2H2O 250 FeSO4.7H2O 27.800 Na2EDTA.2H2O 37.250 Thành phần vitamin (µg/l) PL2 Inositol 100.000 Thiamine HCl 100 Nicotinic acid 500 Pyridoxine HCl 500 PL3 PHỤ LỤC II CÁC BẢNG SỐ LIỆU XỬ LÝ BẰNG PHẦN MỀM SPSS 15.0 Các nghiệm thức ñược xếp theo thứ tự tăng dần từ xuống giá trị trung bình 30 lần lặp lại nghiệm thức Các số trung bình xếp cột khơng có giá trị khác biệt mặt thống kê mức 0,05 theo phương pháp Duncan Các số trung bình xếp cột khác có giá trị trung bình khác biệt mặt thống kê mức 0,05 theo phương pháp Duncan NGHIỆM THỨC LOẠI MÔI TRƯỜNG 30 ngày ANOVA Sum of Squares Between Groups df Mean Square 48.017 24.008 Within Groups 164.383 87 1.889 Total 212.400 89 F Sig 12.706 000 F 11.734 Sig .000 F Sig Duncana N Treat PGA Subset for alpha = 05 30 FDA 30 MMN 30 Sig 7.9833 9.2833 9.7000 1.000 375 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 45 ngày ANOVA Sum of Squares 151.817 Between Groups df Mean Square 75.908 6.469 Within Groups 562.808 87 Total 714.625 89 a Duncan N Treat PGA Subset for alpha = 05 30 FDA 30 MMN 30 Sig 9.4000 12.0333 13.2567 1.000 338 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 60 ngày ANOVA Sum of Squares Between Groups df Mean Square 816.450 408.225 Within Groups 1188.075 87 13.656 Total 2004.525 89 a Duncan N Treat Subset for alpha = 05 PL4 29.893 000 PGA 30 FDA 30 MMN 30 10.5400 15.5667 18.6667 Sig 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 75 ngày ANOVA Sum of Squares df Mean Square Between Groups 1705.139 852.569 Within Groups 1869.817 87 21.492 Total 3574.956 89 F 39.669 Sig .000 a Duncan N Treat PGA Subset for alpha = 05 30 FDA 30 MMN 30 12.9967 20.5233 23.3167 Sig 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 90 ngày ANOVA Sum of Squares df Mean Square Between Groups 3584.022 1792.011 Within Groups 3389.758 87 38.963 Total 6973.781 89 F Sig 45.993 000 F 29.204 Sig .000 a Duncan N Treat PGA Subset for alpha = 05 30 FDA 30 MMN 30 14.2267 24.9500 30.4567 Sig 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 NGHIỆM THỨC ðƯỜNG – MÔI TRƯỜNG MMN 30 ngày ANOVA Sum of Squares 823.250 Between Groups Within Groups Total df Mean Square 164.650 981.000 174 5.638 1804.250 179 a Duncan N Treat Galactose Lactose Subset for alpha = 05 30 7.9200 30 8.4833 PL5 Maltose 30 11.5333 Fructose 30 12.4200 12.4200 Saccharose 30 12.9333 12.9333 Glucose-ðC 30 12.9500 Sig .828 107 322 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 45 ngày ANOVA Sum of Squares df Mean Square Between Groups 3822.974 764.595 Within Groups 2521.275 174 14.490 Total 6344.249 179 F Sig 52.767 000 a Duncan N treat Galactose Subset for alpha = 05 30 8.5000 Lactose 30 9.1000 Maltose 30 15.4233 Fructose 30 17.8267 Saccharose 30 Glucose-ðC 30 18.2700 21.4567 Sig .542 773 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 60 ngày ANOVA Sum of Squares df Mean Square Between Groups 7273.161 1454.632 Within Groups 4017.833 174 23.091 11290.994 179 Total F 62.996 Sig .000 a Duncan N Treat Galactose Subset for alpha = 05 30 8.6233 Lactose 30 9.1667 Maltose 30 18.4833 Fructose 30 22.0167 Saccharose 30 22.6500 Glucose-ðC 30 25.3167 Sig .583 141 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 75 ngày ANOVA Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square 12642.446 2528.489 5665.292 174 32.559 18307.738 179 a Duncan PL6 076 F 77.658 Sig .000 N Treat Galactose Subset for alpha = 05 30 8.6667 Lactose 30 9.9300 Maltose 30 Fructose 30 26.4667 Saccharose 30 28.4333 Glucose-ðC 30 22.0500 28.4333 29.9233 Sig .332 1.000 062 199 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 90 ngày ANOVA Between Groups Sum of Squares 26667.324 Mean Square 5333.465 5791.925 174 33.287 32459.249 179 Within Groups Total df F 160.227 Sig .000 Duncana N Treat Galactose Subset for alpha = 05 30 8.6500 Lactose 30 9.9200 Maltose 30 Fructose 30 28.9533 Glucose-ðC 30 30.0033 Saccharose 30 24.0667 30.0033 28.5000 Sig .284 1.000 780 052 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 NGHIỆM THỨC VITAMIN – MÔI TRƯỜNG MMN 30 ngày ANOVA Between Groups Sum of Squares 36.700 df Mean Square 9.175 1.748 F 5.248 Within Groups 253.508 145 Total 290.208 149 N Subset for alpha = 05 a Duncan Treat MMN-DC (0ml/l) 30 12.9500 2,0ml/l 30 1,0ml/l 30 9.8833 9.8833 1,5ml/l 30 10.0033 10.0033 0,5ml/l 30 Sig 10.0833 12.0000 12.0000 559 099 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 45 ngày ANOVA PL7 099 Sig .001 Sum of Squares Between Groups df Mean Square 85.607 21.402 Within Groups 1196.633 145 8.253 Total 1282.240 149 F 2.593 Sig .039 a Duncan N Treat MMN-DC (0ml/l) Subset for alpha = 05 30 21.4567 2,0ml/l 30 1,0ml/l 30 9.8833 9.8833 1,5ml/l 30 13.8233 13.8233 0,5ml/l 30 099 099 14.1833 19.2000 Sig .559 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 60 ngày ANOVA Sum of Squares Between Groups df Mean Square 246.960 61.740 Within Groups 2122.808 145 14.640 Total 2369.768 149 F 4.217 Sig .003 a Duncan N Treat MMN-DC (0ml/l) Subset for alpha = 05 30 25.3167 2,0ml/l 30 17.8700 1,0ml/l 30 16.2833 1,5ml/l 30 0,5ml/l 30 19.1733 27.1200 Sig .559 099 099 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 75 ngày ANOVA Between Groups Sum of Squares 312.743 Within Groups Total df Mean Square 78.186 3082.125 145 21.256 3394.868 149 F 3.678 a Duncan N Treat MMN-DC (0ml/l) Subset for alpha = 05 30 29.9233 2,0ml/l 30 23.6833 1,0ml/l 30 21.9667 1,5ml/l 30 0,5ml/l 30 Sig 25.3200 31.8067 559 099 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 PL8 099 Sig .007 90 ngày ANOVA Between Groups Sum of Squares 371.560 Within Groups Total df Mean Square 92.890 7971.033 145 54.973 8342.593 149 F 1.690 a Duncan N Treat MMN-DC (0ml/l) Subset for alpha = 05 30 2,0ml/l 30 1,0ml/l 30 1,5ml/l 30 0,5ml/l 30 30.0033 28.2233 30.6733 30.6733 28.5967 31.8700 Sig .559 099 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 PL9 099 Sig .155 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Brundrett, M., N Bougher, B Dell, T Grove, N Malajczuk, 1996 Working with mycorrhizas in forestry and agriculture Autralian Centre for International Agriculture Research (ACIAR) Trang 43-140, 173-215, 217-253 [2] Chang ST, 1005 Selected Features of Wild Mushrooms Including Tricholoma Matsutake CFNA, Trung Quốc [3] Laguette AG, LM Vaario, WM Gill, F Lapeyrie, N Matsushita, K Suzuki, 2000 Rapid in vitro infection on Pinus densiflora roots by Tricholoma matsutake Mycosciences 41: 389-393 [4] Norris, J.R., D.J Read Techniques for mycorrhizal research Academic Press, 1994 [5] Smith, S.E., D.J.Read, 1997 Mycorrhizal symbiosis Academic Press Trang 1-254, 379-452 [6] Rolf Singer, 1986 The Agaricales in Modern Taxonomy, 4th edn, Koeltz Scientific Books, Koenigstein, Germany [7] Yamada A, S Kanekawa, M Ohmasa, 1999 Ectomycorrhiza formation of Tricholoma matsutake on Pinus densiflora Mycosciences 40: 193-198 [8] Yamada A, H Kobayashi, T Ogura and M Fukada, 2007 Sustainable fruit-body formation of edible mycorrhizal Tricholoma species for years in open pot culture with pine seedling hosts Mycosciences 48:104-108 [9] Yamanaka K, 2006 Tricholoma matsutake at Yanbian Korean Autonomuos Prefector, Jiling, China Poster 72 Hội nghị nấm học thường niên lần thứ 50 hội nấm học Nhật Bản (The 50th Anniversary Meeting of The Mycological Society of Japan) Tháng 6, 2006 Tại Chiba, Nhật Bản Tóm tắt, tài liệu hội thảo, trang 76 Internet [10] The gymnosperm database, Pinus densiflora http://conifers.org/pi/pin/densiflora.htm [11] The gymnosperm database, Pinus kesiya http://conifers.org/pi/pin/kesiya.htm