Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh và tổng hợp saponin của rễ và mô sẹo giảo cổ lam gynostemma pentaphyllum nuôi cấy bằng hệ thống bioreactor

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TĂNG SINH VÀ TỔNG HỢP SAPONIN CỦA RỄ VÀ MÔ SẸO GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum) NUÔI CẤY BẰNG HỆ THỐNG BIOREACTOR ThS Phạm Cao Khải CN Kha Nữ Tú Uyên Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2018 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đờng nghiệm thu) KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TĂNG SINH VÀ TỔNG HỢP SAPONIN CỦA RỄ VÀ MÔ SẸO GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum) NUÔI CẤY BẰNG HỆ THỐNG BIOREACTOR CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) Thành phớ Hờ Chí Minh, tháng 01/2018 TĨM T T Gi o c lam (Gynostemma pentaphyllum) lo i dân gian s d ng th i gian dài cho vi c hi i, Gi o c lam th hi n nhi u thu c li u quý hi c u tr b nh Theo nghiên c u y h c ch ng oxy u hịa chuy n hóa lipid, c ch kh i u, b o v th n kinh, ch nhiên, vi c b o t c li u v ng Tuy c qu n lý ch t ch nghiên c u ng d ng cơng ngh sinh h c lồi v n cịn h n ch d ng cơng ngh t bào b o t n, phát tri n nhân sinh kh i mô l n ph c v cho ngành công nghi b nh, tr ( ng r c h t s c c n thi t ut ng v i 10 g/ ng ( ar b ng mô s o ng v i 20 g/ bioreactor s c khí th tích lít lít v i cho s h p kho ng s nh 40 g/l H th ng bioreactor s c khí v i ni c y huy n phù t bào, tr 1,0 g/ ng ng sucrose t 0,2 vvm phù h p nh t cho s a t bào n 0,3 vvm ut quy i v i nuôi c y r kh i 0,5 g/ 50 ml ng) Hàm saponin c a sinh kh i r b ng ng nh ng iv i t bào ng) Nuôi c y b ng h th ng ng 0,2 vvm 0,3 vvm thích h p nh ng khí thích i v i bình ni c y lít Trangii BM20-QT.QLKH ABSTRACT Giao co lam (Gynostemma pentaphyllum) was a rarely valuable medicinal plant that people has been traditionally used for disease treatment in a long time Modern medical research has also shown that it exhibits a variety of pharmacological properties, including anti-inflammatory, antioxidative, lipid metabolism regulatory, antiproliferative, neuroprotective and anxiolytic activities However, conservation and exploiting this medicinal plant were not managed properly and studies of biotechnology on this medicinal plant were till limited Therefore, the application of plant cell biotechnology in conservation, development and biomass proliferation of Giao co lam in large scale for providing materials in pharmaceutical industry is extremely necessary For adventitious root cultures, the initial fresh weight of root optimum for the biomass proliferation was 0.5 g/50 mL medium (corresponding to 10 g/1 L medium) The optimum sucrose content for the saponin accumulation of the adventitious root biomass was 40 g/L The bioreactor system aerated with a flow rate of 0.2 vvm was best for the proliferation and saponin accumulation of the adventitious roots For cell suspension culture, the initial fresh weight of callus optimal for cell proliferation was 1.0 g/50 mL medium (corresponding to 20 g/1 L medium) The bioreactor in L and L aerated with a flow rate of 0.2 vvm and 0.3 vvm was suitable for cell proliferation and accumulation of saponins The flow rates from 0.1 vvm to 0.3 vvm was not optimal for cell proliferation and saponin accumulation in liter bioreactor M CL C Trangiii BM20-QT.QLKH Trang Trang ph bìa i Tóm t tài ii Abstract iii M c l c iv Danh sách ch vi t t t vi Danh sách b th vii Danh sách hình viii TÀI M U - T NG QUAN TÀI LI U cv ng nghiên c u 1.1.1 Phân lo i c tính sinh h c 1.1.3 Tác d ng y h c 1.2 Các nghiên c c 1.2.1 Các nghiên c u nhân sinh kh i kích thích t ng h p ho t ch t th c p 1.2.2 ng d ng bioreactor nuôi c y t bào th c v t 10 -N U 16 2.1 Nghiên c u m t s y u t saponin c a r b n s nhân sinh kh nh 16 2.1.1 Kh o sát ng c a tr ng r ns b t nh 16 2.1.2 Kh o sát saponin c a ng c r ng sucrose lên s tích b nh gi o c lam 17 Trangiv BM20-QT.QLKH 2.1.3 Kh o sát ng c a h th ng nuôi c y lên s saponin c a r b t nh 18 2.2 Nghiên c u y u t ns at ng l ng 19 2.2.1 Kh o sát tr ng mô s u cho trình ni c kh i 19 2.2.2 Kh o sát ng c u ki n nuôi c y lên s saponin c a t bào 20 2.3 u 21 - K T QU VÀ TH O LU N 23 3.1 Nghiên c u y u t c a r n s nhân sinh kh b nh Gi o c lam 23 3.1.1 Kh o sát nh ng c a tr Gi o ng r c ns lam b t (Gynostemma pentaphyllum) 23 Trangv BM20-QT.QLKH 3.1.2 Kh o sát nh h saponin c a ng c ng sucrose lên s r b nh Gi o c lam 25 3.1.3 Kh o sát ng c a h th ng nuôi c ns a r b nh Gi o c lam 27 3.2 Nghiên c u y u t bào gi o ns at c ng l ng 32 3.2.1 Kh o sát tr ng mô s u cho q trình ni c kh i 32 3.2.2 Kh o sát ng c u ki n nuôi c y lên s saponin sinh kh i c a t bào Gi o c lam 35 - K T LU N VÀ KI N NGH 39 4.1 K t lu n 39 ngh 39 TÀI LI U THAM KH O 40 PH L C 49 Trangvi BM20-QT.QLKH DANH SÁCH CÁC CH Vi t t t VI T T T Thu t ng ti ng Vi t i ch ng TN Thí nghi m NT Nghi m th c BA - Benzyl adenine KIN Kinetin 2,4-D 2,4-Dichloropheonoxyacetic acid IAA Indole-3-acetic acid NAA Naphthalene acetic acid IBA Indole butyric acid MS ng MS (Murashige & Skoog, 1962) SH ng SH (Schenk Hilderbrant) B5 Gamborg (1968) medium TLT Tr MJ Methyl jasmonate Ctv C ng tác viên Vvm T /phút TIS Trangvii BM20-QT.QLKH DANH SÁCH B NG TH S Tên b ng Trang 1.1 M t s nghiên c u nuôi c y r b nh b ng lo i bioreactor khác Các tr ng m u c u s d ng cho q trình ni c y sinh kh i r Gi o c lam Kh ng sucrose lên s c ar b nh gi o c lam Các lo i h th ng nuôi c y s d ng cho q trình ni c y sinh kh i r Gi o c lam Các tr ng m u c u s d ng cho q trình ni c y sinh kh i mô s o Gi o c lam Các lo i h th ng nuôi c y s d ng cho q trình ni c y sinh kh i t bào Gi o c lam 13 ng c a tr r Gi o c lam sinh kh i 23 a 26 ng tích 28 sinh 33 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 r b 3.3 3.4 ng r ng c a n sucrose lên s nh Gi o c lam ng c a h th ng nuôi c ns c a sinh kh i r Gi o c lam ng c a tr ng m u c kh i t bào Gi o c lam 3.5 kh ns ns ng c a lo i h th ng nuôi c ns a t bào Gi o c lam 16 17 18 19 20 36 Trangviii BM20-QT.QLKH DANH SÁCH HÌNH S Tên hình nh Trang 1.1 Bioreactor s c khí 12 1.2 H th ng RITA® 15 2.1 Các lo i h th ng nuôi c y s d ng cho q trình ni c y sinh kh i r Gi o c lam Mơ hình bioreactor s c s d ng thí nghi m nh ng c a tr ng r ns b t nh Gi o c lam sau tu n nuôi c y ng c a n sucrose lên s c ar b nh Gi o c lam 19 ng c a h th ng nuôi c ns ng c a sinh kh i r Gi o c lam ng c a qu ng cách gi a l n ng ns ng c a sinh kh i r Gi o c lam h th ng TIS ng c ns ng c a sinh kh i r Gi o c lam bình ni c y lít ng c n s phát sinh r bên Gi o c lam Mô s o c y chuy n l n th sau tu n nuôi c y ng c a tr ng m u c ns sinh kh i t bào Gi o c lam sau tu n nuôi c y C m t bào Gi o c lam hình thành v i kích c khác ng l ng ng c a lo i h th ng nuôi c ns i c a t bào Gi o c lam sau tu n nuôi c y 29 2.2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 21 25 27 30 31 31 32 34 34 38 Trangix BM20-QT.QLKH [80] Zhao D., Xing J., Li M., Lu D., Zhao Q (2001), Optimization of growth and jaceosidin production in callus and cell suspension cultures of Saussurea medusa, Plant Cell Tiss Org, 67(3): 227-234 [81] Zhao J., Davis L.C., Verpoorte R (2005), Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites, Biotechnology Advances, 23: 283-333 [82] Zhong J.J., Yoshida M., Fujiyama K., Seki T., Yoshida T (1993), Enhancement of anthocyanin production by Perilla frutescens cells in a stirred bioreactor with internal light irradiation, J Ferment Bioengr., 75:299-303 [83] Zhong J J (2001), Biochemical engineering of the production of plant-specific secondary metabolites by cell suspension cultures, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology J., 72:1 26 Tài li u internet [84] https://en.wikipedia.org/wiki/Gynostemma_pentaphyllum PH L C Ph l c 1: Qui trình ni c y in vitro mơ s o Gi o c lam b ng Bioreactor s c khí M u in vitro ng MS + 0,5mg/l 2,4-D + 30 mg/l sucrose (th ch) Mô s o (1 g) C y chuy ng MS + 0,5mg/l 2,4-D c d a (th ch) sinh kh i mô s o C y g mô s o vào 50 ml m ng MS + 0,5mg/l 2,4-D c d a (l ng) Nuôi c y huy n phù t bào ng MS + 0,5mg/l 2,4-D c d a (l ng) Nuôi c y b ng bioreactor s c khí lít v Ph l c 2: Qui trình ni c y in vitro r b ng 0,1 vvm nh Gi o c lam b ng Bioreactor s c khí M u in vitro ng SH + 0,5mg/l IBA (th ch) R b nh (10 g r ng) Nuôi c y bioreactor s c khí (1 lít) v ng 0,2 vvm ng SH + 0,5mg/l IBA + 40 mg/l sucrose (l ng) sinh kh i r ng SH + 0,5mg/l IBA + c thu ho ch ngày Kích thích t ng h p saponin Ph l c 3: X lý th ng kê