Đánh giá chỉ tiêu kỹ thuật của phương pháp pcr để phát hiện tác nhân gây hại hội chứng ahpnd ems ở tôm

N QU N L KHU N NG NGHI P NG NGH O TP HCM Ứ BÁO CÁO NGHI M THU Đ Ỉ TIÊU KỸ THUẬT CỦ ƢƠ Đ PHÁT HI N TÁC NHÂN GÂY HỘI CHỨNG AHPND/EMS Ở TÔM KS Nguyễn Thoại Ân Th nh ph h inh, h ng 01/2017 BAN QU N LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRI N NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO BÁO CÁO NGHI M THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đ ng nghiệm thu) Đ Ỉ TIÊU KỸ THUẬT CỦ ƢƠ Đ PHÁT HI N TÁC NHÂN GÂY HỘI CHỨNG AHPND/EMS Ở TƠM ƠQ Ủ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) Th nh ph CHỦ NHI ĐỀ TÀI (Ký tên) h inh, h ng 01/2017 TĨM TẮT Quy trình P R xây dựng thành công với tiêu kỹ thuật có tính hiệu độ ổn định nhằm phát hội chứng tôm chết sớm - EMS (Early Mortality Syndrome) bệnh hoại tử gan tụy cấp – AHPND (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) xuất tôm năm gần Độ biến thiên nội phản ứng liên phản ứng quy trình P R đạt yêu cầu với % V 10 Độ nhạy chẩn đoán độ đặc hiệu chẩn đốn 100% Từ khóa: Bệnh hoại tử gan tụy cấp, AHPND/EMS, PCR, tiêu kỹ thuật Trang ii BM20-QT.QLKH ABSTRACT Polymerase chain reaction (PCR) was developed with effective and stable technical parameters to detect FMDV Early Mortality Syndrome – EMS or Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease- AHPND which has appeared on shrimp in recent years The intra-assay coefficient of variation and the inter-assay coefficient of variation was acceptable with %CV under 10 Diagnostic sentitivity and specificity were 100% Key word: Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND/EMS, PCR, technical parameters Trang ii BM20-QT.QLKH MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa .i Tóm tắt đề tài .ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vẽ, đồ thị vii TH NG TIN ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU hƣơng - TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 Tình hình ni tơm Việt Nam Hội chứng tôm chết sớm - hoại tử gan tụy cấp (EMS/AHPND) 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu 1.4 Kết nghiên cứu năm 2015 11 hƣơng – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 2.1.1 Thời gian 14 2.1.2 Địa điểm 14 2.2 Vật liệu thiết bị 14 Trang iii BM20-QT.QLKH 2.3 Nội dung nghiên cứu 14 2.4 Phương pháp thực xử lý thống kê 14 hƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Nội dung 1: Khảo sát độ biến thiên nội phản ứng quy trình kỹ thuật phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm phương pháp P R 20 3.2 Nội dung 2: Khảo sát hệ số biến thiên liên phản ứng ứng quy trình kỹ thuật phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm phương pháp P R 21 Trang iii BM20-QT.QLKH 3.3 Nội dung 3: Khảo sát độ nhạy chẩn đoán độ đặc hiệu chẩn đoán ứng quy trình kỹ thuật phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm phương pháp PCR 23 Nội dung 4: Đánh giá quy trình kỹ thuật phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm phương pháp điện di PCR mẫu tôm 26 hƣơng - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 4.1 Kết luận 30 4.2 Đề nghị 30 TÀI LI U THAM KH O 31 PHỤ LỤC 33 Trang iv BM20-QT.QLKH DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt AHPND Thuật ngữ tiếng viết Acute Hepatopancreatic Necrosis Diseasebệnh hoại tử gan tụy cấp Đ S L Đồng sông Cửu Long EMS Early Mortality Syndrome- hội chứng tôm chết sớm IC Internal Control- chứng nội PCR Polymerase chain reaction V parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus Trang v BM20-QT.QLKH DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Tựa bảng Trang 1.1 Trình tự cặp mồi phát EMS 11 1.2 Trình tự cặp mồi chứng nội (IC-internal control) cho hỗn hợp PCR 12 1.3 Trình tự Amplicon chứng dương cho cặp mồi AHDNP3 (B3) 12 1.4 Thành phần nồng độ h a chất phản ứng P R 12 1.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR tối ưu h a nhiệt độ lai 13 Trang vi BM20-QT.QLKH DANH SÁCH HÌNH Hình Tựa hình Trang 1.1 Các tỉnh trọng điểm nuôi tôm Đồng Sông Cửu Long 1.2 Bản đồ vùng nuôi trồng tôm bị nhiễm bệnh EMS/AHPND 1.3 Bản đồ dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm năm 2012, 2013 tháng đầu năm 2014 Việt Nam 1.4 Dấu hiệu tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh Hoại tử gan tụy 3.1 Kết khảo sát biến thiên nội phản ứng quy trình PCR EMS/AHPND 21 3.2 Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình PCR EMS/AHPND đợt 21 3.3 Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình PCR EMS/AHPND đợt 22 3.4 Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình PCR EMS/AHPND đợt 22 3.5 Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình PCR EMS/AHPND đợt 22 3.6 Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình PCR EMS/AHPND đượt 23 3.7 Kết khảo sát độ đặc hiệu chẩn đốn quy trình PCR EMS/AHPND 23 3.8 Kết khảo sát độ nhạy chẩn đoán quy trình PCR EMS/AHPND 24 3.9 Kết gióng cột trình tự sản phẩm PCR với trình tự chuẩn 25 Trang vii BM20-QT.QLKH (a) (b) Hình 3.12: Kết xác định độ quy trình PCR (a) mẫu tôm bệnh (b) mẫu trắng Dựa vào kết chạy điện di, 100% mẫu tôm bệnh phát với vạch xuất kích thước 848bp 333bp đồng thời 100% mẫu trắng phát với vạch 848bp (hình 3.12) Như vậy, quy trình PCR phát EMS/ HPND c độ xác cao - Xác định độ lặp lại phương pháp P R: máy thực người với mẫu chứng dương mẫu chứng âm, máy PCR sử dụng gồm PCR ProFlex, PCR Biorad cửa, PCR Biorad cửa Máy PCR proplex có tốc độ gia nhiệt mẫu: 4,4° ⁄Sec, tốc độ gia nhiệt block: 6,0° ⁄Sec, nhiệt độ xác: ±0,25°C (35°C đến 99,9°C), nhiệt độ đồng nhất: