Bước đầu xây dựng quy trình ứng dụng hạt nano từ fe3o4 sio2 để loại bỏ tế bào lympho t

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu 8/12/2015) BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ỨNG DỤNG HẠT NANO TỪ Fe3O4@SiO2 ĐỂ LOẠI BỎ TẾ BÀO LYMPHO T TRẦN VĂN HIẾU TẠ THỊ KIỀU HẠNH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2015 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ỨNG DỤNG HẠT NANO TỪ Fe3O4@SiO2 ĐỂ LOẠI BỎ TẾ BÀO LYMPHO T TRẦN VĂN HIẾU TẠ THỊ KIỀU HẠNH Cơ quan chủ trì Chủ nhiệm đề tài Trần Văn Hiếu Tạ Thị Kiều Hạnh Cơ quan quản lý THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2015 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tóm tắt TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Với nhu cầu phát triển điều kiện sẵn có khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp phân tách tế bào đời, ứng dụng rộng rãi hiệu quả, phải kể đến phương pháp phân tách tế bào dựa vào từ tính (Magnetic-Activated Cell sorting – MACS) Kỹ thuật MACS vừa khai thác đặc tính hạt từ (kích thước nano-mét đến kích thước micro-mét) dễ phân tách thu nhận nam châm, vừa sở hữu khả nhận biết chuyên biệt kháng thể với phân tử mục tiêu, dấu ấn tế bào gọi Cell Differentiation (CD) diện bề mặt tế bào Nhờ kết hợp đó, hạt từ mang tính miễn dịch bám lên tế bào mục tiêu dễ dàng thu nhận lại tế bào từ trường tạo nam châm vĩnh cửu nam châm điện mà không ảnh hưởng đến sức sống chức tế bào Tuy nhiên ứng dụng sinh học việc để hạt từ (bản chất lõi Fe3O4) tiếp xúc trực tiếp với phân tử sinh học hay tế bào gây nên tác động khơng mong muốn; để hạn chế tác động hạt từ trần cần bọc lớp vỏ mà nghiên cứu sử dụng vỏ SiO2 Ngoài ra, để tăng khả gắn kết với kháng thể chúng tơi cịn thực thêm hai biến đổi khác là: i) thêm cầu nối (GPS-CDI) giúp làm tăng khoảng cách độ linh động với phân tử sinh học ii) gắn thêm protein A/G nhằm tăng khả gắn kháng thể, từ tăng cường khả ứng dụng hạt từ miễn dịch việc phân tách tế bào Do đó, với mục tiêu hướng đến phát triển ứng dụng kỹ thuật MACS Việt Nam, đề tài định hướng gắn kết protein A/G lên bề mặt hạt nano từ tính phịng thí nghiệm để tăng cường khả bắt kháng thể Ở kết thử khả tương thích sinh học, hạt từ Fe3O4@SiO2 không gây ảnh hưởng đến tỷ lệ sống khả tăng sinh, khơng gây kích thích biệt hóa tế bào gốc tạo máu TF-1 Lượng protein A/G gắn mg hạt 22,4 g protein Hạt từ gắn kết protein A/G có khả bắt khoảng 8,7 g kháng thể IgG thỏ Sau gắn kết kháng thể kháng CD3, hạt từ miễn dịch có khả thu nhận khoảng 43,5% tế bào Jurkat T (CD3+) từ dung dịch tế bào Những kết cho thấy tính khả thi ứng dụng hạt từ phân tách tế bào, đặc biệt phân tách tế bào T khỏi mô ghép tủy trước ghép để ngăn ngừa bệnh vật ghép chống chủ Việt Nam Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tóm tắt SUMMARY OF RESEARCH With the rapid pace of science and technology development, there are many methods for cell separation invented and successfully applied One of these methods is Magnetic-Activated Cell sorting – MACS MACS exploits both characters of magnetic beads (easily magnetical separation) and antibody [specificity to target antigens on cell surface named Cell Differentiation (CD)] With the combination, immune-magnetic beads can bind to target cells and easily magnetically separated by a permenant or electric magnet without impacts on cell’s functions and survival However, in biological applications, the touch of naked magnetic beads (Fe3O4-based core) to macro molecules or cells could lead to unexpected effects; hence to minimize the effects the naked magnetic beads need to be covered by a shell like SiO2 as used in this project Moreover, to enhance antibody-bound capacity, we conducted two more modifications: i) adding linker bridge (GPS-CDI, in this case) to widen space and add more flexibility to biological molecules; and ii) adding protein A/G to enhance antibody-conjugating capability thereby increasing cell separation efficiency, protein A/G is an ideal choice because of its abundant of antibody-binding sites and wide range of species specificity Therefore, for improving and boosting MACS application in cell-separating in Vietnam, our collaboration aims to develop laboratory’s magnetic particles (MPs) coupled protein A/G to enhance antibody-conjugating capacity Regarding bio-compatibility aspect, the results presented here incidated that our MPs showed no cytotoxicity, as well as no proliferation and differentiation’s inhibition on TF-1 cell line, a type of hematopoietic stem cell Besides, MPs could bind 22.4 g protein A/G per mg MPs The A/G MPs could conjugate approximately 8.7 g rabbit IgG antibody Furthermore, in cell-separating experiment, α-CD3-conjugated MPs could bind and separate about 43.5% Jurkat cell (CD3+) from cell suspension Taken together, our MPs indicated high feasibility in cell-separating application in Vietnam, especially in ex vivo T cell-depleting application for bone marrow transplantation in graftversus-host disease prevention Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Mục lục MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT I DANH MỤC CÁC BẢNG II DANH MỤC CÁC HÌNH III QUYẾT TỐN KINH PHÍ V CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lý thuyết từ học 1.1.1 Mômen từ 1.1.2 Các khái niệm .1 1.1.3 Phân loại vật liệu từ 1.1.4 Chu trình từ trễ đường cong từ trễ .4 1.1.5 Bản chất đơn đơmen tính chất siêu thuận từ .5 1.2 Phân tách tế bào: nhu cầu động lực phát triển lĩnh vực y sinh 1.2.1 Ý nghĩa phân tách tế bào lĩnh vực y sinh 1.2.2 Một số phương pháp phân tách tế bào 1.3 Hạt từ tính phân tách tế bào 12 1.3.1 Đặc điểm hạt từ tính phân tách tế bào 12 1.3.2 Ứng dụng hạt từ tính phân tách tế bào thách thức 19 1.4 Phân tách tế bào T kỹ thuật MACS cấy ghép tủy xƣơng .24 1.4.1 Cấy ghép tủy xương, biến chứng khắc phục .24 1.4.2 Phân tách tế bào lympho T kỹ thuật hạt từ 27 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Nội dung 1: Bao phủ hạt nano Fe3O4 lớp SiO2 32 2.1.1 Tạo hạt nano Fe3O4 xử lí bề mặt hạt nano Fe3O4 32 2.1.2 Bao phủ lớp vỏ SiO2 lên hạt nano Fe3O4 36 2.2 Nội dung 2: Chức hóa bề mặt hạt Fe3O4@SiO2 CDI .38 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ .38 2.2.2 Hóa chất 39 2.2.3 Phương pháp chế tạo 39 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Mục lục 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu 44 2.3 Nội dung 3: Thử nghiệm khả tƣơng thích sinh học 44 2.3.1 Nguyên vật liệu 44 2.3.2 Hóa chất 44 2.3.3 Quy trình tạo 45 2.4 Nội dung 4: Thử nghiệm khả gắn kết với kháng thể 47 2.4.1 Nội dung làm thêm: Tạo kháng thể IgG kháng protein màng tế bào Jurkat T .47 2.4.2 Thử nghiệm khả gắn kết với kháng thể bắt tế bào mục tiêu .54 2.5 Nội dung 5: Thử nghiệm khả bắt giữ tế bào mục tiêu 56 2.5.1 Thiết bị, dụng cụ .56 2.5.2 Hóa chất 56 2.5.3 Quy trình tạo 56 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1 Nội dung 1: Bao phủ hạt nano Fe3O4 lớp SiO2 58 3.1.1 Kết chụp ảnh TEM 58 3.1.2 Kết đo phổ FTIR: .59 3.1.3 Kết đo đường cong từ hóa .61 3.1.4 Giãn đồ nhiễu xạ tia X hạt nano Fe3O4 62 3.1.5 Kết đo điện bề mặt (thế zeta 63 3.2 Nội dung 2: Chức hóa bề mặt hạt nano Fe3O4@SiO2 CDI 64 3.2.1 Kết phân tích phổ FTIR 64 3.2.2 Kết đo điện bề mặt hạt nano sau quy trình chức 64 3.2.3 Thử nghiệm gắn kết protein lên bề mặt hạt từ PTN .66 3.3 Nội dung 3: Thử nghiệm khả tƣơng thích sinh học 69 3.4 Nội dung 4: Thử nghiệm khả gắn kết với kháng thể 72 3.4.1 Nội dung làm thêm: Tạo kháng thể IgG kháng protein màng tế bào Jurkat T .72 3.4.2 Thử nghiệm khả gắn kết với kháng thể 80 3.5 Nội dung 5: Thử nghiệm khả bắt giữ tế bào mục tiêu hỗn hợp tế bào 83 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 87 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Mục lục 4.1 Kết luận 87 4.2 Đề nghị 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Danh mục chữ viết tắt DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ BSA Bovine Serum Albumin CAC Cell-Affinity Chromatography CCK-8 Cell Counting Kit-8 CD Cluster of Differentiation CDI Carbonyldiimidazole FACS Fluorescence-Activated Cell Sorting FBS Fetal Bovine Serum GVHD Graft-Versus-Host Disease hGM-CSF human Granulocyte Macrophage - Colony Stimulating Factor MACS Magnet-Activated Cell Sorting MRI Magnetic Resonance Imaging OD Optical Density PBS Phosphate Buffered Saline RMPI Roswell Park Memorial Institute medium ROS Reactive Oxygen Species SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis TBST Tris Buffered Saline with Tween-20 WST-8 Water Soluble Tetrazolium-8 I Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Danh mục bảng DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các đại lượng đơn vị từ hệ đơn vị SI CGS .2 Bảng 1.2 Phân loại loại vật liệu từ Bảng 2.1 Bảng mô tả thang mức độ gây độc tế bào 45 Bảng 2.2 Bảng mô tả lô thí nghiệm thử nghiệm độc tính hạt nano sắt từ lên tế bào TF-1 47 Bảng 2.3 Thành phần gel điện di SDS-PAGE .48 Bảng 2.4 Các nghiệm thức kiểm tra diện protein CD3 màng tế bào Jurkat T 50 Bảng 2.5 Các nghiệm thức nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể tinh 54 Bảng 3.1 Bảng tương quan dao động số sóng mẫu M3 M3_S 60 Bảng 3.2 Kết đo đường cong từ hóa M3 M3_S 61 Bảng 3.3 Giá trị Zeta mẫu M3 M3_S 63 Bảng 3.4 Giá trị Zeta mẫu sau trình chức .65 Bảng 3.5 Kết gắn protein BSA lên hạt từ tính PTN 67 Bảng 3.6 Kết tái sử dụng hạt từ tính A/G PTN 82 Bảng 3.7 Kết bắt tế bào Jurkat T hạt từ miễn dịch kháng Jurkat T 82 Bảng 3.8 Kết loại bỏ tế bào Jurkat T hỗn hợp tế bào .85 II Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Danh mục hình DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Đồ thị M(H) chất sắt từ (đường cong liền nét), chất phản sắt từ (đường chấm), chất thuận từ (đường đứt nét) [1] .4 Hình 1.2 Đường cong từ hóa vật liệu siêu thuận từ [1] .6 Hình 1.3 Cấu trúc tinh thể Fe3O4 [1] 14 Hình 1.4 Sự xếp spin phân tử sắt từ Fe3O4 [1] 14 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học bề mặt silica 16 Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo GPS .17 Hình 1.7 Cơ chế phản ứng silane hóa [2] 18 Hình 2.1 Quy trình tổng hợp hạt nano Fe3O4 33 Hình 2.2 Quy trình xử lí bề mặt hạt nano Fe3O4 axit nitric 34 Hình 2.3 Quy trình xử lí bề mặt hạt nano Fe3O4 axit oleic .34 Hình 2.4 Quy trình tổng hợp hạt nano Fe3O4 xử lí bề mặt axit oleic trực tiếp trình tổng hợp .35 Hình 2.5 Mơ tả bọc SiO2 quanh hạt sắt từ Fe3O4 .37 Hình 2.6 Quy trình bao phủ hạt nano Fe3O4 lớp vỏ SiO2 38 Hình 2.7 Quy trình xử lý bề mặt lớp vỏ SiO2 hạt Fe3O4@SiO2 piranha 40 Hình 2.8 Mơ tả q trình bọc GPS lên bề mặt hạt 40 Hình 2.9 Quy trình hoạt hóa bề mặt SiO2 GPS 41 Hình 2.10 Mơ tả q trình giải vịng epoxy GPS 41 Hình 2.11 Quy trình mở vịng epoxy thành nhóm hydroxyl 42 Hình 2.12 Cơ chế gắn kết cầu nối GPS CDI .42 Hình 2.13 Quy trình chức hóa bề mặt hạt nano Fe3O4@SiO2 CDI 43 Hình 2.14 Thứ tự thành phần chuyển potein lên màng lai 51 III Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Chương III Kết thảo luận Hình 3.18 Biểu đồ thể số lượng tỷ lệ loại tế bào pha dịch sau lượt phân tách nghiệm thức khác Hình 3.19 Biểu đồ thể số lượng tỷ lệ loại tế bào pha hạt sau lượt phân tách nghiệm thức khác Bảng 3.8 Kết loại bỏ tế bào Jurkat T hỗn hợp tế bào Không ủ hạt Nghiệm thức Lượt phân tách Ủ hạt gắn kháng thể Ủ hạt gắn trực tiếp qua protein A/G kháng thể 85 3 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Phần trăm tế bào Jurkat T (%) Phần trăm tế bào TF-1 (%) Chương III Kết thảo luận 65,2 64,3 61,8 56,6 46,9 30,6 50,0 33,3 54,5 34,8 35,7 38,2 43,4 53,1 69,4 50,0 66,7 45,5 Phần trăm tế bào Jurkat T bị loại - 81,7 80,0 - 80,6 32,3 bỏ sau lượt (%) Hiệu suất thu hồi tế bào TF-1 sau lượt (%) Qua kết thu từ thử nghiệm, hạt từ gắn kết kháng thể kháng tế bào Jurkat T thơng qua protein A/G có khả ứng dụng phân tách tế bào T khỏi quần thể tế bào gốc tạo máu Cụ thể, loại hạt có khả bắt giữ loại bỏ khoảng 80% tế bào Jurkat T sau lượt phân tách mà thu hồi khoảng 80% tế bào gốc tạo máu TF-1 86 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Chương IV Kết luận Đề nghị CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Nội dung 1: Bao phủ hạt nano Fe3O4 lớp SiO2 Đã tổng hợp cấu trúc lõi/vỏ Fe3O4@SiO2 với đường kính hạt trung bình 150 nm, có tính siêu thuận từ với độ từ hóa cực đại 27 emu/g Cấu trúc ứng dụng để chức hóa nhóm chức nhằm ứng dụng việc chọn lọc tế bào từ trường Nội dung 2: Chức hóa bề mặt hạt nano Fe3O4@SiO2 CDI Thông qua phép đo điện bề mặt cho thấy vai trị quy trình biến tính bề mặt hạt nano mà chúng tơi sử dụng Trên sở thay đổi giá trị điện đó, chúng tơi kết luận chức bề mặt lớp vỏ SiO2 cấu trúc Fe3O4@SiO2 GPS CDI Đồng thời, mg hạt Fe3O4@SiO2-GPS-CDIcó khả gắn tối đa23,5g protein A/G Nội dung 3: Thử nghiệm khả tƣơng thích sinh học Qua thử nghiệm tính tương thích sinh học, khả gây độc tế bào ảnh hưởng đến khả tăng sinh, biệt hóa lên tế bào TF-1 hạt từ Fe3O4@SiO2-GPSCDI ngưỡng cho phép (