Xây dựng quy trình chiết xuất acid gallic từ cây mai dương mimosa pigara l ở quy mô pilot

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ *** BÁO CÁO NGHIỆM THU (theo góp ý hội đồng nghiệm thu ngày 3/11/2015) NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH TIẾT  - LACTAMASE PHỔ RỘNG CỦA E.COLI VÀ KLEBSIELLA SPP TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN Ở THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ACID GALLIC TỪ CÂY MAI DƯƠNG (MIMOSA PIGRA L.) Ở QUY MƠ PILOT Chủ nhiệm đề tài: ThS ĐẶNG HỒNG PHÚ Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ TP Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2015 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU (theo góp ý hội đồng nghiệm thu ngày 3/11/2015) XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ACID NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH TIẾT  - LACTAMASE PHỔ GALLIC TỪ CÂY DƯƠNG (MIMOSA RỘNG CỦ A E.COLI VÀMAI KLEBSIELLA SPP TẠ I MỘT SỐ BỆNH VIỆ N Ở Ở THÀ NH PHỐ HỒ CHÍ MINH PIGRA L.) QUY MÔ PILOT CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI Đặng Hồng Phú CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Trần Công Luận CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) TP Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2015 MỤC LỤC TĨM TẮT ABSTRACT DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ THÔNG TIN ĐỀ TÀI CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 10 1.1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI: 11 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI: 17 CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.1 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ ACID GALLIC TỪ CÂY MAI DƯƠNG 19 2.1.1 Nguyên liệu: 19 2.1.2 Hóa chất thiết bị: 19 2.1.3 Quy trình thực nghiệm 20 2.1.3.1 Điều chế mẫu cao: 20 2.1.3.2 Xác định phương pháp đánh giá acid gallic methyl gallat dịch chiết HPLC 20  Khảo sát bước sóng hấp thu 20  Khảo sát thành phần pha động 21  Xây dựng đường chuẩn: 25  Định lượng acid gallic methyl gallate có mẫu cao chiết 27 2.1.3.3 Xây dựng quy trình chiết xuất – tinh chế: 28 2.2 TIẾN HÀNH THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT – TINH CHẾ, THU SẢN PHẨM (TỐI THIỂU ~ 150 G, ĐỘ TINH KHIẾT ≥ 95%) 32 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 48 TÓM TẮT Mục tiêu: Chiết xuất tinh chế acid gallic từ Mai dương Đối tượng phương pháp: Mẫu Mai dương thu hái số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh định danh Thạc sĩ Hoàng Việt, Khoa Sinh học – ĐH Khoa học Tự nhiên ĐHQG Tp.HCM Sử dụng kỹ thuật trích nóng với hệ dung môi khác kết hợp kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò UV (HPLC/UV) dùng để định lượng acid gallic methyl gallat tự do, từ xác định phương pháp đánh giá hàm lượng hai hợp chất dịch chiết Tiến hành điều chế mẫu cao với lượng lớn sử dụng hệ dung mơi ly trích tối ưu Tiến hành chuyển hóa methyl gallat tannin thành acid gallic, sau sử dụng phương pháp ly trích lỏnglỏng để chiết xuất acid gallic thô Acid gallic thô xử lí loại màu, kết tinh lại để thu sản phẩm tinh khiết Độ tinh khiết sản phẩm xác định kĩ thuật HPLC Kết quả: Xác định phương pháp đánh giá acid gallic dịch chiết HPLC nhằm thu tổng lượng acid gallic methyl gallat tự lớn từ Mai dương Cách thức thực chiết xuất acid gallic có tính ổn định cao, nhằm thu sản phẩm acid gallic với độ tinh khiết ≥95% Kết luận: Qua nghiên cứu đưa rút cách thức chiết xuất có độ ổn định cao sản phẩm thu có độ tinh khiết lớn Từ đó, chúng tơi thấy tận dụng nguồn sinh khối Mai dương để thu acid gallic Việc làm góp phần giải lượng sinh khối lồi này, đồng thời nêu bật lên mặt ích lợi loài xâm thực nguy hại Tuy nhiên nghiên cứu số hạn chế định số lí khách quan ABSTRACT Objectives: Extraction and purification of gallic acid from the leaves of Mimosa pigra L (Fabaceae) Materials and Methods: The leaves of M pigra were collected at HCMc and were identified by Ms Hoang Viet – Faculty of Biology, VNU – University of Science, HCMc Refluxing with different solvent systems together with HPLC technique use UV detector to quantitative determination of free gallic acid and methyl gallate, to deduce the evaluation of these compounds from the extracts And then the final extract was prepared and gallic acid was derived from methyl gallate and tannin in this extract Using the liquid-liquid partition to obtain the crude gallic acid, and it was decolorized then was recrystallized to yield the pure gallic acid HPLC technique was applied to determine the purity of these last products Results: The extraction of free gallic acid and methyl gallate from M pigra Finally, we gain the stable extraction and purification of gallic acid (with purity ≥95%) from the leaves of M pigra Conclusion: With these results, we have the stable extraction and gallic acid with high purity Therefore, we can take advantage the biomass of this plant to obtain gallic acid and highlight the usefulness of the dangerous invasive plant – Mimosa pigra However, this method still have a number of restrictions due to some objective reasons DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MeOH: Methanol AcMe: Aceton AcOH: Acid acetic HPLC: Sắc kí lỏng hiệu cao (High-Performance Liquid Chromatography) HPLC/UV: Sắc kí lỏng hiệu cao sử dụng đầu dị tử ngoại (UV) PDA: PhotoDiode Array LOD: Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) SD: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1: Khối lượng cao ứng với hệ chiết 20 Bảng 2: Kết diện tích tín hiệu tương ứng với nồng độ acid gallic 26 Bảng 3: Kết diện tích tín hiệu tương ứng với nồng độ methyl gallate 27 Bảng 4: Tổng hàm lượng acid gallic methyl gallate mẫu cao chiết 28 Bảng 5: Hàm lượng acid gallic có mẫu sản phẩm 31 Bảng 6: Kết thử nghiệm quy trình hiệu suất chiết 32 Bảng 7: Độ tinh khiết sản phẩm acid gallic 32 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1: Cấu trúc hóa học hợp chất có Mai dương 12 Hình 2: Độ hấp thu dung dịch acid gallic methyl gallat theo bước sóng 21 Hình 3: Sắc kí đồ sử dụng pha động CH3COOH 0.5%:MeOH (85-15) 22 Hình 4: Sắc kí đồ sử dụng pha động CH3COOH 0.5%:MeOH (87-13) 22 Hình 5: Sắc kí đồ sử dụng pha động CH3COOH 0.5%:MeOH (90-10) 22 Hình 6: Sắc kí đồ sử dụng pha động CH3COOH 0.5%:MeOH (92-8) 23 Hình 7: Sắc kí đồ sử dụng pha động CH3COOH 0.5%:MeOH (95-5) 23 Hình 8: Sắc kí đồ sử dụng pha động CH3COOH 0.5%:MeOH (65-35) 24 Hình 9: Sắc kí đồ sử dụng pha động CH3COOH 0.5%:MeOH (70-30) 24 Hình 10: Sắc kí đồ sử dụng pha động CH3COOH 0.5%:MeOH (75-25) 24 Hình 11: Sắc kí đồ sử dụng pha động CH3COOH 0.5%:MeOH (80-20) 25 Hình 12: Phương trình đường chuẩn acid gallic 26 Hình 13: Phương trình đường chuẩn methyl gallate 27 Hình 14: Phổ đồ xác định độ tinh khiết vết sản phẩm acid gallic 30 Hình 15: Phổ đồ sắc kí lỏng sản phẩm acid gallic 30 Hình 16: Quy trình chiết xuất – tinh chế acid gallic từ Mai dương 33 THÔNG TIN ĐỀ TÀI Thông tin chung đề tài: Tên đề tài/dự án: “Xây dựng quy trình chiết xuất acid gallic từ Mai dương (Mimosa pigra L.) quy mô pilot” Chủ nhiệm đề tài/dự án: ThS Đặng Hoàng Phú Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Cơng nghệ Trẻ Thời gian thực hiện: 12 tháng, từ tháng 11 năm 2014 đến tháng 11 năm 2015 Kinh phí duyệt: 80.000.000 đồng theo Quyết định số 786/QĐ-SKHCN Kinh phí cấp: 40.000.000 đồng theo Hợp đồng số 186/2014/HĐ-SKHCN Mục tiêu: 2.1 Mục tiêu tổng quát: Xây dựng quy trình chiết xuất acid gallic từ Mai dương, Mimosa pigra L quy mô pilot 2.2 Mục tiêu cụ thể: Một quy trình chiết xuất acid gallic quy mơ pilot có tính ổn định cao, có khả xử lí kg khơ/mẻ, nhằm thu sản phẩm acid gallic với độ tinh khiết ≥95% Tiến hành mẻ thử nghiệm thu tối thiểu ~150 g acid gallic (độ tinh khiết ≥95%) PHỤ LỤC 5: SẮC KÍ ĐỒ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID GALLIC TINH KHIẾT TRONG SẢN PHẨM Mẫu thử nghiệm lần 1/RT7.235/7.231/447528 20.0 mV Detector A:272nm 15.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 Mẫu thử nghiệm lần mV Detector A:272nm 1/RT7.238/7.233/470643 20.0 15.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 mV Detector A:272nm 15.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 60 1/RT7.230/7.232/395725 Mẫu thử nghiệm lần 7.5 10.0 PHỤ LỤC 6: PHỔ NMR CỦA METHYL GALLATE CHUẨN Phổ 1H NMR Phổ 13C NMR 61 PHỤ LỤC 7: PHỔ NMR CỦA SẢN PHẨM ACID GALLIC Phổ 1H NMR Phổ 13C NMR 62 PHỤ LỤC SẢN PHẨM: QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT – TINH CHẾ ACID GALLIC TỪ CÂY MAI DƯƠNG LÁ CÂY ~5 kg Trích nóng Hệ dung mơi MeOH:H2O (70-30) CAO THƠ ~ kg 1000 mL NaOH 2M Đun hoàn lưu, 4h DUNG DỊCH THỦY PHÂN Để nguội HCl đậm đặc, pH ~ DUNG DỊCH THỦY PHÂN ĐÃ ACID HÓA %H ~ 2% Chiết với EtOAc DỊCH CHIẾT EtOAc Làm khan Thu hồi dung mơi ACID GALLIC THƠ ~150 g 100 mL NaOH 2M, pH~ 11 200 mL H2O2 5% Đun hoàn lưu 24h DUNG DỊCH ĐÃ QUA XỬ LÍ HCl đậm đặc, pH ~ Lóng với EtOAc DỊCH CHIẾT EtOAc Kết tinh lại ACID GALLIC TINH KHIẾT ~ 100 g BƯỚC 1:  Mẫu sau thu hái rửa sạch, phơi khơ, xay nhỏ  Quy trình xử lý kg mẫu khô/mẻ  Sử dụng trích nóng với bếp đun, bình cầu L hệ hoàn lưu nước  Ứng với trích nóng: ~1 kg mẫu khơ, L hệ dung môi MeOH:H2O (70:30), nhiệt độ 100-120oC, thời gian ly trích h  Tồn dịch trích quay thu hồi dung mơi thu cao thơ ~1 kg BƯỚC 2: Hịa tan tồn cao thô vào 1000 mL NaOH M, cho tất vào bình cầu L, đun hồn lưu hỗn hợp thời gian h BƯỚC 3: Dung dịch sau thủy phân với NaOH để nguội, acid hóa pH ~ HCl đậm đặc BƯỚC 4: Sử dụng bình lóng L để tiến hành chiết lỏng – lỏng dung dịch acid hóa với dung môi EtOAc, lần chiết sử dụng 100 mL dung mơi BƯỚC 5: Tồn dịch chiết EtOAc làm khan Na2SO4 rắn cô quay thu hồi dung môi thu sản phẩm acid gallic thô ~ 150 g BƯỚC 6:  Tồn acid gallic thơ hòa tan vào 100 mL NaOH M, dùng dung dịch NaOH M để chỉnh pH hỗn hợp ~11  Thêm vào hỗn hợp 200 mL dung dịch H2O2 5%  Cho tất vào bình cầu L, lắp hệ thống đun hoàn lưu thời gian 24 h BƯỚC 7:  Dung dịch sau phản ứng loại màu để nguội, dùng HCl đậm đặc để acid hóa dung dịch pH ~  Sử dụng bình lóng L để tiến hành chiết lỏng – lỏng dung dịch acid hóa với dung môi EtOAc, lần chiết sử dụng 100 mL dung mơi BƯỚC 8: Gom tồn dịch chiết EtOAc lại, dùng bếp đun cách thủy để làm bay dung mơi nhằm thu dung dịch bão hịa acid gallic Để nguội làm lạnh dung dịch để acid gallic kết tinh Tiến hành lọc thu sản phẩm hệ thống lọc áp suất Toàn dịch lọc làm bay dung môi tiếp tục kết tinh lại thêm 1-3 lần Gom toàn sản phẩm acid gallic, để khơ tự nhiên khơng khí; sau lưu trữ bình hút ẩm Khối lượng sản phẩm thu ~ 100 g Y HỌC ISSN 1859-1779 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỘI NGHỊ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 2015 ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH Chuyên Đề Dược NGHIÊN CỨU Y HỌC 10 độc tế bào ung thư gan hepg2 cao chiết ứng dụng điều trị ung thư bí kỳ nam (hydnophytum formicarum jack) * Nguyễn Kim Thạch, Đỗ Đình Hồ, Lê Quang Huấn * Mai Nguyễn Ngọc Trác, Nguyễn Ngọc Anh Thơ, 45 Khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan củ nghệ phương tối thiểu phần PLS (curcuma longa) phòng ngừa tổn thương rối * Huỳnh Minh Châu, Lý Dự Thư, Hà Kiều My, loạn lipid gây dòng tế bào HepG2 Nguyễn Thị Ngọc Trinh, Nguyễn Ánh Mai * Đỗ Thị Hồng Tươi, Lê Xuân Lộc, Huỳnh Thị Kim Loan Chiết xuất tinh chế acid gallic từ mai 53 Xây dựng mơ hình chuột nhắt trắng mơ * Đặng Hồng Phú, Ngũn Xn Hải, tình trạng hoại tử da tác nhân hóa trị Nguyễn Thị Thanh Mai, Nguyễn Trung Nhân doxorubicin * Đỗ Thị Hồng Tươi, Nguyễn Thị Thu Hà Nghiên cứu ứng dụng phổ cận hồng ngoại để định tính bán định lượng azithromycin viên 32 Trần Thị Vân Anh, Đỗ Thị Hồng Tươi Xác định đồng thời thiamine, riboflavin dương (mimosa pigra l.) Họ đậu (fabaceae) 22 Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa in vitro khả Nghiên cứu tạo hạt nano chitosan chứa paclitaxel pyridoxine phương pháp trắc quang bình 15 38 60 Khảo sát tình hình bệnh viêm da địa sử dụng nén viên nang thuốc điều trị tại bệnh viện da liễu thành * Nguyễn Thị Hoa, Trần Thị Bích Vân, phố Hồ Chí Minh Trần Việt Hùng, Đồn Cao Sơn, Bùi Văn Trung * Đỡ Thị Hờng Tươi, Hồng Kim Long Phân tích sơ thành phần hóa học, khảo sát hoạt 68 Mơ hình agar block chuột nhắt trắng mơ tính ức chế α-amylase, α-glucosidase in vitro bệnh xơ gan người nghiện rượu độc tính cấp đường uống trà thảo mộc * Tất Chí Hùng, Đỗ Thị Hồng Tươi karantina * Mai Thị Cúc, Đỗ Thị Hồng Tươi 74 Đánh giá kết chỉnh sửa mũi ngắn sụn tự thân silicon dẻo tại Khoa Tạo hình – Thẩm mĩ BV Chợ Rẫy * Đỗ Quang Hùng Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 NGHIÊN CỨU TẠO HẠT NANO CHITOSAN CHỨA PACLITAXEL ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Nguyễn Kim Thạch*, Đỗ Đình Hồ*, Lê Quang Huấn** XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI THIAMINE, RIBOFLAVIN VÀ PYRIDOXINE BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRẮC QUANG VÀ BÌNH PHƯƠNG TỐI THIỂU TỪNG PHẦN PLS 10 Huỳnh Minh Châu*, Lý Dự Thư, Hà Kiều My*, Nguyễn Thị Ngọc Trinh*, Nguyễn Ánh Mai* 10 CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ ACID GALLIC TỪ LÁ CÂY MAI DƯƠNG (MIMOSA PIGRA L.) HỌ ĐẬU (FABACEAE) 15 Đặng Hoàng Phú*, Nguyễn Xuân Hải*, Nguyễn Thị Thanh Mai*, Nguyễn Trung Nhân* 15 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHỔ CẬN HỒNG NGOẠI ĐỂ ĐỊNH TÍNH VÀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG VIÊN NÉN VÀ VIÊN NANG 22 Nguyễn Thị Hoa*, Trần Thị Bích Vân*, Trần Việt Hùng*, Đoàn Cao Sơn*, Bùi Văn Trung* 22 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HĨA HỌC, KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ α-AMYLASE, αGLUCOSIDASE IN VITRO VÀ ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG CỦA TRÀ THẢO MỘC KARANTINA 32 Mai Thị Cúc*, Đỗ Thị Hồng Tươi* 32 SÀNG LỌC HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA IN VITRO VÀ KHẢ NĂNG ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ GAN HepG2 CỦA CAO CHIẾT BÍ KỲ NAM (Hydnophytum formicarum Jack) 38 Mai Nguyễn Ngọc Trác*, Nguyễn Ngọc Anh Thơ*, Trần Thị Vân Anh*, Đỗ Thị Hồng Tươi* 38 KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA CỦ NGHỆ (Curcuma longa) PHÒNG NGỪA TỔN THƯƠNG DO RỐI LOẠN LIPID GÂY RA TRÊN DÒNG TẾ BÀO HepG2 45 Đỗ Thị Hồng Tươi*, Lê Xuân Lộc*, Huỳnh Thị Kim Loan** 45 XÂY DỰNG MƠ HÌNH CHUỘT NHẮT TRẮNG MƠ PHỎNG TÌNH TRẠNG HOẠI TỬ DA DO TÁC NHÂN HÓA TRỊ DOXORUBICIN 53 Đỗ Thị Hồng Tươi*, Nguyễn Thị Thu Hà** 53 KHẢO SÁT TÌNH HÌNH BỆNH VIÊM DA CƠ ĐỊA VÀ SỬ DỤNG THUỐC TRONG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN DA LIỄU THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 60 Đỡ Thị Hờng Tươi*, Hồng Kim Long** 60 MƠ HÌNH AGAR BLOCK TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG MÔ PHỎNG BỆNH XƠ GAN Ở NGƯỜI NGHIỆN RƯỢU 68 Tất Chí Hùng*, Đỡ Thị Hờng Tươi** 68 ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ CHỈNH SỬA MŨI NGẮN BẰNG SỤN TỰ THÂN VÀ SILICON DẺO TẠI KHOA TẠO HÌNH - THẨM MỸ BV CHỢ RẪY 74 Đỗ Quang Hùng* 74 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ ACID GALLIC TỪ LÁ CÂY MAI DƯƠNG (MIMOSA PIGRA L.) HỌ ĐẬU (FABACEAE) Đặng Hoàng Phú*, Nguyễn Xuân Hải*, Nguyễn Thị Thanh Mai*, Nguyễn Trung Nhân* TÓM TẮT Mục tiêu: Chiết xuất tinh chế acid gallic từ Mai dương Đối tượng phương pháp: Mẫu Mai dương thu hái số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh định danh Thạc sĩ Hoàng Việt, Khoa Sinh học – ĐH Khoa học Tự nhiên ĐHQG Tp.HCM Sử dụng kỹ thuật trích nóng với hệ dung môi khác kết hợp kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò UV (HPLC/UV) dùng để định lượng acid gallic methyl gallat tự do, từ xác định phương pháp đánh giá hàm lượng hai hợp chất dịch chiết Tiến hành điều chế mẫu cao với lượng lớn sử dụng hệ dung mơi ly trích tối ưu Tiến hành chuyển hóa methyl gallat tannin thành acid gallic, sau sử dụng phương pháp ly trích lỏng-lỏng để chiết xuất acid gallic thơ Acid gallic thơ xử lí loại màu, kết tinh lại để thu sản phẩm tinh khiết Độ tinh khiết sản phẩm xác định kĩ thuật HPLC Kết quả: Xác định phương pháp đánh giá acid gallic dịch chiết HPLC nhằm thu tổng lượng acid gallic methyl gallat tự lớn từ Mai dương Cách thức thực chiết xuất acid gallic có tính ổn định cao, nhằm thu sản phẩm acid gallic với độ tinh khiết ≥95% Kết luận: Qua nghiên cứu đưa rút cách thức chiết xuất có độ ổn định cao sản phẩm thu có độ tinh khiết lớn Từ đó, chúng tơi thấy tận dụng nguồn sinh khối Mai dương để thu acid gallic Việc làm góp phần giải lượng sinh khối lồi này, đồng thời nêu bật lên mặt ích lợi loài xâm thực nguy hại Tuy nhiên nghiên cứu phải hiệu chỉnh để đạt hiệu mặt kinh tế Từ khóa: Mai dương, Mimosa pigra, acid gallic, nghiên cứu quy trình chiết xuất ABSTRACT EXTRACTION AND PURIFICATION OF GALLIC ACID FROM THE LEAVES OF MIMOSA PIGRA L (FABACEAE) Dang Hoang Phu, Nguyen Xuan Hai, Nguyen Thi Thanh Mai, Nguyen Trung Nhân * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 19 - No - 2015: 15 - 21 Objectives: Extraction and purification of gallic acid from the leaves of Mimosa pigra L (Fabaceae) Materials and Methods: The leaves of M pigra were collected at HCMC and were identified by Ms Hoang Viet – Faculty of Biology, VNU – University of Science, HCMC Refluxing with different solvent systems together with HPLC technique use UV detector to quantitative determination of free gallic acid and methyl gallate, to deduce the evaluation of these compounds from the extracts And then the final extract was prepared and gallic acid was derived from methyl gallate and tannin in this extract Using the liquid-liquid partition to obtain the crude gallic acid, and it was decolorized then was recrystallized to yield the pure gallic acid HPLC technique was applied to determine the purity of these last products Results: The extraction of free gallic acid and methyl gallate from M pigra Finally, we gain the stable extraction and purification of gallic acid (with purity ≥95%) from the leaves of M pigra * Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Đặng Hoàng Phú ĐT: 01659772537 Email: dhphu@hcmus.edu.vn Chuyên Đề Dược 15 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Conclusion: With these results, we have the stable extraction and gallic acid with high purity Therefore, we can take advantage the biomass of this plant to obtain gallic acid and highlight the usefulness of the dangerous invasive plant – Mimosa pigra However, this method must be adjusted to achieve economic efficiency Key words: leaves of Mimosa pigra, gallic acid, study on extration and purification methods EGCG, ECG(11), 3,3’,4-tri-O-methylellagic acid(1) ĐẶT VẤN ĐỀ obovatol.(6) Cây Mai Dương (Mimosa pigra L.) cịn gọi Với tất lí nêu Trinh nữ nhọn, Mắc cỡ Mỹ, Ngưu Ma Vương; thấy tận dụng nguồn sinh khối thuộc chi Mimosa, họ phụ Mimosoideae, họ Mai dương để thu acid gallic - hợp Fabaceae (họ Đậu), có nguồn gốc từ Nam Mỹ chất có giá trị sử dụng cao Việc nghiên Tại Việt Nam, Mai Dương báo cáo xuất cứu quy trình chiết xuất tinh chế acid gallic lần huyện Mộc Hóa, tỉnh Long từ Mai dương góp phần giải An vào năm 1979 Cây Mai dương nằm lượng sinh khối lồi này, đồng thời nhóm 100 xâm thực nguy hiểm nêu bật lên mặt ích lợi lồi giới Hiện nay, Mai dương xâm thực nguy hại xâm lấn nhiều vùng miền đất nước ta, ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU gây mối đe dọa nghiêm trọng lên hệ sinh thái Cây có sức sống mạnh mẽ khả lây Nguyên liệu lan phát tán dễ dàng, cộng thêm điều kiện khí Mẫu Mai dương thu hái hậu địa lí đất nước ta thuận lợi cho số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh phát triển cây, việc ngăn chặn phát định danh Thạc sĩ Hoàng Việt, Khoa triển tiêu diệt Mai dương chủ đề Sinh học – ĐH Khoa học Tự nhiên ĐHQG quan tâm(3) TP.HCM Hiện nay, giới số lượng nghiên cứu Phương pháp thành phần hóa Mai dương ít, Điều chế mẫu cao chất tìm thấy số triterpen saponin flavonoid glycosid(4,12) Tại Việt Nam, có Với kết thu trước cơng bố thành phần hóa học thành phần hóa học Mai dương Mai dương bao gồm flavonoid, flavonoid Nhóm chúng tơi nhận thấy Mai glycosid, lignan, neolignan số phenolic dương có hàm lượng lớn acid gallic đơn giản(2,9,10) Đặc biệt nhóm chúng tơi methyl gallat(2) Tham khảo tài liệu cô lập lượng lớn acid gallic methyl thấy việc ly trích acid gallic, methyl gallat (2,10) gallat từ Mai dương tự tannin thường sử dụng với hệ dung môi methanol : H2O aceton : H2O(5) Từ Acid gallic hợp chất có hoạt tính đó, chúng tơi định khảo sát hỗn hợp sinh học đa dạng: gây “hiện tượng tự chết” dung môi tương tự để xác định hệ dung môi ly ngăn chặn di số dòng tế bào trích tối ưu ung thư(8) Bên cạnh đó, acid gallic dẫn xuất có khả kháng nấm kháng khuẩn ngồi cịn nhân tố chống đột biến gen, ung thư(11), tiềm chống bệnh đái tháo đường(7) Trong tổng hợp, acid gallic tác chất quan trọng nhằm tổng hợp số sản phẩm có hoạt tính sinh học đa dạng 16 Mẫu khơ cho vào bình cầu, đun hoàn lưu với hỗn hợp methanol : H2O (60-100% MeOH) aceton : H2O (60-100% aceton) Mỗi lần ly trích sử dụng lượng mẫu (chính xác, khoảng 5g mẫu khô), tỉ lệ dung môi mẫu (mỗi lần 200 mL dung môi), nhiệt độ (100-120oC) thời Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 gian ly trích (4 h) đồng Dịch trích đem quay thu hồi dung môi thu cao tương ứng Xác định phương pháp đánh giá acid gallic methyl gallat dịch chiết HPLC Pha dung dịch acid gallic methyl gallat chuẩn (nồng độ ~10ppm), quét phổ hấp thu hai dung dịch với máy Shimadzu UV1800 series Xác định bước sóng hấp thu cực đại acid gallic methyl gallat Cân lượng mẫu cao xác, tiến hành hịa tan pha lỗng mẫu với MeOH H2O cất lần với tổng thể tích định Sau đó, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 μm, thu mẫu tiêm vào máy HPLC Chọn mẫu cao trích với 100% MeOH làm mẫu đại diện để tiến hành khảo sát thành phần pha động tối ưu cho việc định lượng acid gallic methyl gallat có mẫu cao Pha dung dịch chuẩn acid gallic methyl gallat (nồng độ 1, 2, 5, 10 ppm) Dùng kĩ thuật sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) đầu dò UV với hệ pha động tối ưu để tiến hành xây đựng đường chuẩn acid gallic methyl gallat có dạng A = (a ± εa)C + (b ± εb) (A: diện tích peak, C: nồng độ chất, ε: sai số) với R2 ~ 0,999, giá trị LOD LOQ xác định Tiến hành chạy HPLC/UV (cột C18-150 mm, tốc độ dòng 1ml/phút, nhiệt độ phòng, chạy chế độ đẳng dòng) mẫu cao kết hợp với phương trình đường chuẩn xác định nồng độ phần acid gallic methyl gallat có mẫu cao tương ứng Tính toán nồng độ tổng chất, từ xác định hệ dung mơi ly trích tối ưu Xây dựng quy trình chiết xuất Tiến hành điều chế mẫu cao với lượng lớn (khoảng kg mẫu khô) sử dụng hệ dung môi ly trích tối ưu, điều kiện tỉ lệ dung mơi : mẫu, nhiệt độ thời gian ly trích không thay đổi Tiến hành thủy phân methyl gallat tannin có mẫu cao (đun hồn lưu mẫu với dung Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học dịch NaOH 2M); acid hóa dịch thủy phân (pH ~ 1) sau lóng với ethyl acetat; quay dịch ethyl acetat thu hồi dung môi thu acid gallic thô Acid gallic thơ xử lí loại màu dung dịch H2O2 5% pH = 11 đun hoàn lưu 24 h Dung dịch acid gallic qua xử lí loại màu kết tinh lại để thu sản phẩm tinh khiết Sản phẩm xác định acid gallic cách so sánh thời gian lưu (tR) với chất chuẩn HPLC Độ tinh khiết sản phẩm xác định kĩ thuật HPLC KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Điều chế mẫu cao Bảng 1: Khối lượng cao ứng với hệ chiết STT Tên cao chiết Cao 60% aceton Cao 70% aceton Cao 80% aceton Cao 100% aceton Cao 60% methanol Cao 70% methanol Cao 80% methanol Cao 100% methanol mcao (g) 0,82 0,88 0,91 0,42 1,10 1,03 0,89 0,49 Dựa vào bảng kết (Bảng 1) nhận thấy cao chiết có methanol tăng thành phần dung mơi hữu khối lượng cao thu giảm Điều giải thích tăng hàm lượng nước làm tăng độ phân cực hệ chiết nên làm hịa tan nhiều chất vào hệ chiết nên kết khối lượng cao thu tăng dần từ thành phần methanol theo thứ tự: 100-80-70-60 Còn cao chiết có chứa dung mơi aceton lại khơng tn theo quy luật đó, khối lượng cao thu tăng dần theo phần trăm acetone đạt cực đại hệ chiết 80-20 Sau lại giảm dần với hệ chiết aceton 100% Điều giải thích thân aceton hợp chất phân cực methanol nên khả hòa tan hợp chất phân cực mẫu thấp nên khối lượng cao thu nhỏ Đồng thời, giảm dần hàm lượng nước theo thứ tự 40-30-20, lại thu khối lượng cao tăng dần 17 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 nhiên chiết với aceton 100% lượng cao thu lại thấp Xác định phương pháp đánh giá acid gallic methyl gallat dịch chiết HPLC Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại Hình 1: Sự biến thiên mật độ quang dung dịch acid gallic methyl gallat theo bước sóng dài (~30 phút) tách tương đối so với Acid gallic methyl gallat có độ hấp thu mẫu Đối với pha động 92-8 95-5, tăng vùng bước sóng từ 255-280 nm (Hình 1), thành phần đệm lên chất phân cực kết hợp tài liệu tham khảo định rửa giải lâu nên sau làm cho chọn bước sóng để khảo sát kĩ thuật HPLC thời gian phân tích dài (~40-50 phút) Chúng 272 nm giá trị độ hấp thu gallic định chọn thành phần pha động 90-10 acid methyl gallate khơng bị ảnh hưởng hệ tách chất tương đối tốt thời gian dung môi phân tích khơng q dài (Hình 2) Khảo sát thành phần pha động Đối với định lượng methyl gallat Tiến hành khảo sát thành phần pha động tối ưu cho việc định lượng acid gallic methyl gallate mẫu cao đại diện mẫu cao 100% MeOH Hệ dung môi sử dụng 0,5% CH3COOH:MeOH Đối với định lượng acid gallic Với thành phần pha động 85-15, tín hiệu chất phân tích có xu hướng chập với tín hiệu bị kéo đuôi mạnh tốc độ rửa giải dung môi mạnh Với thành phần pha động 87-13, hàm lượng đệm tăng không đủ để tách cách tương mẫu Đối với thành phần pha động 90-10, thời gian phân tích khơng 18 Thành phần pha động 65-35 cho thời gian phân tích ngắn chồng chập với peak nền, gây nhiễu tín hiệu chất cần phân tích Thành phần pha động 70-30 cho kết tách tốt, thời gian lưu khơng q dài ~15 phút khả tách tín hiệu so với mẫu tốt Thành phần pha động 75-25 80-20 cho kết tách tốt cho thời gian phân tích dài (~20-30 phút) peak methyl gallate có tượng kéo Vì vậy, định chọn thành phần pha động 70-30 để định lượng methyl gallat (Hình 3) Chuyên Đề Dược 1.0 0.0 10 20 30 Nghiên cứu Y học 2/RT32.537/32.537/3316112/41663 2.0 Acid gallic 3.0 1/RT7.514/7.514/464828/18371 mV(x10) Detector A:272nm 4.0 Methyl gallat Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 40 10.0 RT16.026/16.026/424248 Acid gallic mV 12.5 Detector A:272nm Methyl gallat Hình 2: Sắc ký đồ sử dụng thành phần pha động 0,5% CH3COOH:MeOH (90-10) 7.5 5.0 2.5 0.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Hình 3: Sắc ký đồ sử dụng thành phần pha động 0,5% CH3COOH:MeOH (70-30) Ứng với hai pha động tối ưu khảo sát, tiến hành xây dựng hai đường chuẩn acid gallic methyl gallat (Hình 4) Phương trình đường chuẩn hai hợp chất xác định sau: Đối với acid gallic A = (-22588,3265 ± 19498,7497) + (83128,1438 ± 2199,3008)*C LOD = 0,638 ppm LOQ = 2,128 ppm Đối với methyl gallat: A = (18722,6194 ± 18827,9961) + (72408,4319 ± 3305,9549)*C LOD = 0,4460 ppm LOQ = 1,4867 ppm Chuyên Đề Dược Tiếp tục tiến hành định lượng hợp chất có mẫu cao bảng 1, từ tính toán để suy hàm lượng tổng Qua giá trị hàm lượng tổng, định phương pháp đánh giá acid gallic methyl gallat dịch chiết nhằm đạt tổng hàm lượng hai hợp chất lớn Kết phân tích trình bày bảng Qua kết thấy hệ chiết 70% methanol có lượng tổng methyl gallat gallic acid nhiều nên chọn để thực công đoạn Tiến hành điều chế mẫu cao với lượng lớn (khoảng kg mẫu khô) sử dụng hệ dung mơi ly trích 70% methanol, điều 19 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học kiện tỉ lệ dung môi : mẫu, nhiệt độ thời gian ly trích khơng thay đổi Hình 4: Đường chuẩn acid gallic methyl gallat TT Cao 100% aceton 80% aceton 70% aceton 60% aceton 100% methanol 80% methanol 70% methanol 60% methanol mgallic acid 0,0112 0,0176 0,0257 0,0116 0,0158 0,0663 0,1199 0,0210 mmethyl gallat 0,0096 0,0070 0,0066 0,0055 0,0112 0,0066 0,0065 0,0062 mtổng 0,0208 0,0246 0,0323 0,0171 0,0270 0,0729 0,1264 0,0272 Thủy phân methyl gallat tannin có mẫu cao cách đun hồn lưu mẫu với dung dịch NaOH 2M; acid hóa dịch thủy phân pH ~ sau lóng với ethyl acetat; cô quay dịch ethyl acetat thu hồi dung môi thu acid gallic thơ, hiệu suất tồn q trình ~ 15% Acid gallic thơ xử lí loại màu dung dịch H2O2 5% pH = 11 đun hoàn lưu Từ hỗn hợp màu đen nâu, sau h đun thu dung dịch màu nâu đỏ, sau 14 h thu dung dịch màu vàng đậm, sau 20 h thu dung dịch màu vàng nhạt sau 24 h thu dung dịch không màu Dung dịch acid gallic qua xử lí loại màu (pH ~ 11) acid hóa HCl 10% pH ~ 1, sau dùng ethyl acetat để chiết acid gallic khỏi dung dịch Tiếp tục kết tinh lại để thu sản phẩm tinh khiết Sản phẩm xác định acid gallic cách so sánh thời gian lưu (tR) với chất chuẩn HPLC (Hình 5) 20 20.0 mV Detector A:272nm 1/RT7.231/7.231/420567 Bảng 2: Hàm lượng acid gallic methyl gallat mg mẫu mẫu cao 15.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 Hình 5: Sắc kí đồ đánh giá độ tinh khiết acid gallic chiết Xác định độ tinh khiết vết sản phẩm thu kĩ thuật HPLC/PDA (Hình 6) Hình 6: Phổ đồ xác định độ tinh khiết vết sản phẩm acid gallic Độ tinh khiết sản phẩm xác định ≥95% cách tính tốn hàm lượng thơng qua đường chuẩn acid gallic Tiến hành khảo sát độ lặp ổn định q trình chiết xuất, chúng tơi thu kết khả quan (Bảng 3) Hiệu suất thu sản phẩm tinh khiết toàn trình ~ 2% Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Bảng 3: Tính lặp lại ổn định trình chiết xuất STT mmẫu khô 5,02 kg 5,05 kg 5,04 kg macid gallic tinh khiết 100,53 g 104,27 g 102,30 g H% 2,00 2,06 2,03 KẾT LUẬN Đề nghị quy trình chiết xuất acid gallic từ Mai dương có tính lặp lại tốt, sản phẩm thu có độ tinh khiết cao ≥95% Từ đó, chúng tơi thấy tận dụng nguồn sinh khối Mai dương để thu acid gallic, đồng thời nêu bật lên mặt ích lợi lồi xâm thực nguy hại Tuy nhiên quy trình chưa thể áp dụng rộng rãi sử dụng nhiều hóa chất, dung môi nên giá thành sản phẩm thu cao LỜI CÁM ƠN Bài nghiên cứu tài trợ chương trình “Vườn ươm Sáng tạo Khoa học Công nghệ Trẻ” năm 2014 - 2015 Sở Khoa học Công nghệ Tp.HCM với tên đề tài “Xây dựng quy trình chiết xuất acid gallic từ Mai dương (Mimosa pigra L.) quy mô pilot” TÀI LIỆU THAM KHẢO Ashraful A, Sadao T (2007), “Total synthesis of 3,3’,4-tri-Omethylellagic acid from gallic acid”, Tetrahedron, 63, pp 10454-10465 Dang Hoang Phu, Nguyen Thi Phuong Vi, Phan Nguyen Huu Trong, Nguyen Trung Nhan (2012), “The α-glucosidase inhibitory activity of phenolic compounds from ethyl acetate extract of the leaves of Mimosa pigra L (Fabaceae)”, Vietnam Journal of Chemistry, Vol.50 (5A), pp 365-368 Chuyên Đề Dược 10 11 12 Nghiên cứu Y học Duong Van Chin (2008), “Mimosa pigra L – a dangerous invasive weed affect to agricultural ecology in Vietnam”, International Seminar on Management of Major Plant Pests in Agriculture in the Asian and Pacific Region Englert J, Weniger B, Lobstein A, Anton R, Krempp E, Guillaume D, Leroy Y (1995), “Triterpenoid saponins from Mimosa pigra”, Journal of Natural Products, 58 (8), pp 12651269 FAO/IAEAWorking Document (2000) “Quantification of Tannins in Tree Foliage: A Laboratory Manual”, IAEA, Vienna, Austria Jae-Hwan K, Seul L, Eun-Seok P, Jin-Kyung I, Jiho S, Young JK, Nam SC, Heesoon L, Yeo-Pyo Y, Jin TH, Young-Shin K, Kyung HM, Jae-Kyung J (2011), “Synthesis and anti-platelet activity of obovatol derivatives”, Archives of Pharmacal Research, 34 (7), pp 1107-1112 Jason JD, Prema PD, Farhan F, Ashish K, Harshith PB, Manjeshwar SB (2014), “Anti-diabetic effects of the Indian indigenous fruit Emblica officinalis Gaertn: active constituents and modes of action”, Food & Function, (4), pp 635-644 Ke W, Xue Z, Kai Z, Ling Z, Fanfan Z (2014), “Investigation of gallic acid induced anticancer effect in human breast carcinoma MCF-7 cells”, Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, (DOI: 10.1002/jbt.21575) Lại Thị Kim Dung, Lê Nghiêm Anh Tuấn, Nguyễn Thị Thanh Thủy (2010), “Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết etyl acetat Mai Dương Mimosa pigra L (Mimosaceae)”, Tạp chí Hóa học, T.48 (4B), tr 481-485 Nguyễn Thị Phương Vi (2013), “Khảo sát thành phần hóa học Mai Dương (Mimosa pigra) họ Đậu (Fabaceae)”, Luận văn Thạc sĩ, Bộ mơn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM Yin-Yin O, Ieva S (2003), “Gallic Acid and Gallic Acid Derivatives: Effects on drug metabolizing enzymes”, Current Drug Metabolism, 4, pp 241-248 Yusuf UK, Abdullah N, Bakar B, Itam K, Abdullah F., Sukari M A (2003), “Flavonoid glycosides in the leaves of Mimosa species”, Biochemical Systematics and Ecology, 31 (4), pp 443445 Ngày nhận báo: 30/10/2014 Ngày phản biện nhận xét báo: 25/11/2014 Ngày báo đăng: 15/05/2015 21