Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu bào tử linh chi và sản phẩm viên nang từ bào tử linh chi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN MINH ĐĂNG BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA NGUYÊN LIỆU BÀO TỬ LINH CHI VÀ SẢN PHẨM VIÊN NANG TỪ BÀO TỬ LINH CHI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  NGUYỄN MINH ĐĂNG BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA NGUYÊN LIỆU BÀO TỬ LINH CHI VÀ SẢN PHẨM VIÊN NANG TỪ BÀO TỬ LINH CHI CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT Mã ngành: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.DS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình khác Nguyễn Minh Đăng i Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2019 – 2021 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất – Mã số: 8720210 BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA NGUYÊN LIỆU BÀO TỬ LINH CHI VÀ SẢN PHẨM VIÊN NANG TỪ BÀO TỬ LINH CHI Nguyễn Minh Đăng Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY Mở đầu: với phát triển phương pháp chiết, tách phá vỡ vách tế bào, nhà khoa học chứng minh ,bào tử Linh chi mang công dụng thể hạ đường huyết, ổn định huyết áp, kháng histamin chống nhiễm trùng, bảo vệ gan, chống gốc oxy hóa tự Tuy nhiên, chưa có đơn vị xây dựng chuẩn sở bào tử Linh chi viên nang có hoạt chất bào tử Linh chi Vì vậy, việc bước đầu xây dựng tiêu chuẩn sở cho nguyên liệu bào tử Linh chi viên nang có chứa bào tử Linh chi vơ cần thiết cần thiết Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: nguyên liệu bào tử Linh chi viên nang chứa bào tử Linh chi phá vách Phương pháp nghiên cứu: acid ganoderic A định lượng phương pháp HPLC với kỹ thuật rửa giải gradient Xây dựng tiêu chuẩn sở bào tử nấm Linh chi viên nang chứa bào tử Linh chi dựa vào chuyên luận Dược điển Việt Nam V USP 44 Kết quả: nguyên liệu: quy trình định lượng đạt tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính (2,6 – 52,5 ppm, R2 = 1,00), độ xác (RSD = 1,92 %), độ (tỷ lệ phục hồi 98,56 %), khoảng nồng độ xác định (10,60 – 13,00 µg/ml), giới hạn phát 0,40 µg/ml, giới hạn định lượng 1,21 µg/ml, đề nghị hàm lượng acid ganoderic A nguyên liệu ≥ 60 µg/g Xây dựng tiêu chuẩn sở gồm tiêu: tính chất, soi bột, độ ẩm, tro tồn phần, tro không tan acid, chất chiết dược liệu, giới hạn kim loại nặng (pb), định tính, định lượng acid ganoderic A, giới hạn nhiễm khuẩn Viên nang: quy trình định lượng đạt tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính (2,6 – 52,5 ppm, R2 = 0,999), độ xác (RSD = 4,58 %), độ (tỷ lệ phục hồi 93,71 %), khoảng nồng độ xác định (8,90 – 11,00 µg/ml), giới hạn phát 0,58 µg/ml, giới hạn định lượng 1,77 µg/ml, đề nghị hàm lượng acid ganoderic A viên nang ≥ 10 µg/g Xây dựng tiêu chuẩn sở gồm tiêu: tính chất, độ rã, độ ẩm, độ đồng khối lượng, định tính, định lượng acid ganoderic A, giới hạn nhiễm khuẩn Kết luận: Bước đầu xây đựng tiêu chuẩn sở cho nguyên liệu bào tử Linh chi viên nang có chứa bào tử Linh chi phá vách v Master’s Thesis – Academic course: 2019- 2021 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 ESTABLISHING THE STANDARD OF GANODERMA LUCIDUM SPORES AND CAPSULE CONTAINING GANODERMA LUCIUDM SPORES Nguyen Minh Dang Supervisor: Dr NGUYEN HUU LAC THUY Introduction: With the development of extracting, separating and walls breaking methods, scientists have proved that Ganoderma lucidum spores also have effects like fruiting body such as lowering blood sugar, stabilizing blood pressure, and anti-inflammatory, anti-histamine and anti-infection, liver protection, anti-oxidant free radicals However, at present, we not have standard for Ganoderma lucidum spores as well as capsules with active ingredients being Ganoderma lucidum spores Therefore, it is extremely necessary to develop standards for Ganoderman lucidum spores and capsules containing wall - broken Ganoderma lucidum spores Materials and methods: Research object: Ganoderma lucidum sprores and capsules containing wall - broken Ganoderma lucidum spores Research method: ganoderic acid A was quantified by HPLC with gradient elution technique Develop tandards of Ganoderma lucidum spores and capsules containing Ganoderma lucidum spores based on monographs in Vietnam Pharmacopoeia V and USP 44 Results: materials: the method was validated in terms of system suitability, selectivity, linearity (2.6 – 52.5 ppm, R2 = 1.00), accuracy (RSD = 1.92%) ), precision (recovery rate 98,56 %), defined concentration range (10.60 – 13.00 µg/ml), limit of detection 0.40 µg/ml, limit of quantitation 1, 21 µg/ml, recommended content of ganoderic acid A in raw materials ≥ 60 µg/g Basic standards includes : properties, powder detection, moisture, total ash, acid-insoluble ash, extractable substances in medicinal herbs, limit of heavy metals (pb), qualitative and quantitative determination of ganoderic acid A, limiting of bacterial contamination Capsules: the method was validated in terms of system suitability, selectivity, linearity (2.6 – 52.5 ppm, R2 = 0.999), accuracy (RSD = 4.58 %) precision (recovery rate 93.71%), defined concentration range (8.90 – 11.00 µg/ml), detection limit 0.58 µg/ml, limit of quantitation 1.77 µg /ml, recommended concentration of ganoderic acid A in capsules ≥ 10 µg/g Basic standards includes: properties, disintegration, moisture, uniformity of mass, qualitative and quantitative analysis of ganoderic acid A, limit of bacterial contamination Conclusion: Initially, the standards for Ganoderma lucidum spores and capsules containing wallbroken Ganoderma lucidum spores were established MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC CÁC BẢNG ix LỜI CẢM ƠN x Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thực vật học bào tử Linh chi 1.2 Tổng quan thành phần hóa học Bào tử Linh chi 1.3 Tổng quan tác dụng sinh học bào tử Linh chi 15 1.4 Tổng quan acid ganoderic A 18 1.5 Tổng quan tiêu chuẩn nấm Linh chi 21 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 Chương KẾT QUẢ 33 3.1 Xác định đặc điểm thực vật nguyên liệu bào tử Linh chi 33 3.2 Kết thẩm định tiêu chuẩn sở nguyên liệu bào tử Linh chi 36 3.3 Kết thẩm định tiêu chuẩn sở viên nang bào tử Linh chi 43 3.4 Dự thảo xây dựng TCCS nguyên liệu BTLC (Đính kèm phụ lục 6) 51 3.5 Dự thảo xây dựng TCCS viên nang BTLC (đính kèm phụ luc 12) 53 Chương BÀN LUẬN 54 4.1 Xác định đặc điểm thực vật bào tử Linh chi 54 4.2 Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn sở nguyên liệu bào tử Linh chi 54 4.3 Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn sở viên nang bào tử Linh chi 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 i TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst Hình 1.2 Hình chụp kính hiển vi điện tử BTLC Hình 1.3 Thu thập BTLC theo phương pháp Kraft – Paper Hình 1.4 (A) BTLC nấm, (B) BTLC sau trước phá vỡ vách Hình 1.5 Hình ảnh BTLC kính hiển vi SEM Hình 1.6 Biểu đồ thể ảnh hưởng dòng CO2 với polysaccharid Hình 1.7 Ảnh SEM BTLC áp suất thời gian hoạt động Hình 1.8 Hình ảnh SEM BTLC với điều kiện nghiền Hình 1.9 Hình ảnh BTLC khơng ảnh hưởng mơi trường Hình 1.10 Hình ảnh SEM BTLC lên men với Lactobacillus plantarum Hình 1.11 Lucidumol A (Trái), hợp chất từ (2) – (6) 11 Hình 1.12 Cơng thức từ (7) - (19) 11 Hình 1.13 Cấu trúc chung nhóm sterol BTLC 14 Hình 1.14 Cơng thức cấu tạo acid ganoderic A 18 Hình 3.1 Bột bào tử lồi nấm Linh chi 33 Hình 3.2 Bào tử Linh chi - Ganoderma lucidum (x1.000) 33 - 34 Hình 3.3 Cấu tạo BTLC - Ganoderma lucidum (x1.000) 34 - 35 Hình 3.4 Bào tử Linh chi - Ganoderma lucidum (x1.000) 35 Hình 3.5 Bào tử Linh chi KHV SEM (x2.000) (x5.000 x15.000) 36 Hình 3.6 SKĐ mẫu đối chiếu acid ganoderic A 37 Hình 3.7 SKĐ mẫu thử nguyên liệu BTLC 37 Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu trắng 39 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn acid ganoderic A 39 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu thử 39 Hình 3.11 Đồ thị tương quan nồng độ acid ganoderic A Spic ganoderic A 40 ii Hình 3.12 Bột BTLC phá vách (x 5000) 43 Hình 3.13 SKĐ mẫu đối chiếu acid ganoderic A 45 Hình 3.14 SKĐ mẫu thử 45 Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu trắng 46 Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu acid ganoderic A 47 Hình 3.17 Sắc kỳ đồ mẫu thử viên nang BTLC 47 Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu placebo 47 Hình 3.19 Tương quan nồng độ diện tích pic ganoderic A 48 x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm công thức (7) - (19) 12 Bảng 1.2 Các nhóm công thức (2) - (6) 13 Bảng 1.3 Các nhóm polysaccharid BTLC phương pháp phân lập 14 Bảng 1.4 So sáng USP 44 DĐVN V 21 Bảng 2.1 Chương trình dung mơi 25 Bảng 3.1 Kết khảo sát độ ẩm, độ tro, chất chiết dược liệu 37 Bảng 3.2 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống 38 Bảng 3.3 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu thử 38 - 39 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ xác 40- 41 Bảng 3.5 Tỷ lệ phục hồi phương pháp 41 - 42 Bảng 3.6 Kết xác định độ rã viên nang BTLC 43 Bảng 3.7 Kết xác định độ đồng khối lượng viên nang BTLC 44 - 45 Bảng 3.8 Kết lần tiêm lặp lại dung dịch acid ganoderic A 45 - 46 Bảng 3.9 Kết lần tiêm lặp lại dung dịch thử viên nang 46 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ xác 48 - 49 Bảng 3.11 Tỷ lệ phục hồi phương pháp 49 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 11 (Dùng 1,000 g; 105 oC đến khối lượng khơng đổi) 2.4 Tro tồn phần: Thử theo phụ lục 9.8, DĐVN V, phương pháp (Dùng 1,000 g) 2.5 Tro không tan acid: Thử theo phụ lục 9.7, DĐVN V, phương pháp (Dùng 1,000 g) 2.6 Chất chiết dược liệu: Thử theo phụ lục 12.10, DĐVN V (Dùng 4,000 g) 2.7 Giới hạn kim loại nặng: Thử theo phụ lục 9.4.8, phương pháp DĐVN V (Dùng 2,000 g) 2.8 Định tính acid ganoderic A: Trong phần định lượng, sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu với pic acid ganoderic A sắc ký đồ dung dịch chuẩn 2.10 Định lượng acid ganoderic A: Quy trình phân tích Điều kiện sắc ký: - Thiết bị : Máy sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò PDA - Cột : C18 (150 mm x 2,0 mm; µm) tương đương - Bước sóng : 257 nm - Tốc độ dòng : 0,36 ml/ phút - Nhiệt độ cột : 25 oC - Thể tích tiêm : 10 µl - Pha động : gradient Thời gian (phút) Acid acetic 0,1 % Acetonitril 0,0 80,0 20,0 3,0 73,5 26,5 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 12 34,0 73,5 26,5 52,0 61,5 38,5 60,0 80,0 20,0 70,0 80,0 20,0 Quy trình xử lý mẫu - Dung dịch đối chiếu gốc acid ganoderic A: hòa tan khoảng 5,0 mg acid ganoderic A đối chiếu vào bình định mức 50 ml dung mơi methanol Từ dung dịch gốc pha dãy dung dịch đối chiếu có nồng độ từ 2,5; 5,0; 10,0; 25,0 50,0 (µg/ml) - Dung dịch thử: cân xác khoảng g nguyên liệu BTLC phá vách phương pháp hấp 121 OC 30 phút, sau cho vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml ethanol 70 %, siêu âm 60 phút Để nguội định mức đến vạch ethanol 70 %, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Sự phù hợp hệ thống sắc ký Sắc ký lần dung dịch đối chiếu 10 µg/ml dung dịch thử Độ lệch chuẩn tương đối lần tiêm thời gian lưu diện tích pic  2,0 %, Hệ số đối xứng từ 0,8 - 1,2; số đĩa lý thuyết > 2000 Cơng thức tính Hàm lượng acid ganoderic A 1g bào tử, tính theo cơng thức: 𝑋(𝜇𝑔⁄𝑔) = Trong đó: 𝑆𝑡 − 𝑏 50 × 𝑎 𝑚𝑡 × (100% − 𝐻) St : diện tích pic ganoderic A SKĐ dung dịch thử b : hệ số chắn phương trình hồi quy a : độ dốc phương trình hồi quy H : độ ẩm nguyên liệu (%) mt : khối lượng mẫu thử (g) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 13 2.9 Giới hạn nhiễm khuẩn: Thử theo DĐVN V, phụ lục 13.6, trang PL-300 GHI NHÃN – BẢO QUẢN Chế phẩm đựng bao bì kín, tránh ẩm, nhiệt độ khơng q 30 oC Dán nhãn có thơng tin: Bào tử Linh chi (Ganoderma lucidum spore), họ Nấm lim (Ganodermataceace), hàm lượng acid ganoderic A Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 14 Phụ lục 7: Sắc ký đồ liệu thẩm định tính phù hợp hệ thống phần tiêu chuẩn hóa viên nang BTLC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 15 Phụ lục 8: Sắc ký đồ liệu thẩm định tính tuyến tính phần tiêu chuẩn hóa viên nang BTLC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 16 Phụ lục 9: Sắc ký đồ liệu thẩm định độ lặp lại phần tiêu chuẩn hóa viên nang BTLC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 17 Phụ lục 10: Sắc ký đồ liệu thẩm định độ xác trung gian phần tiêu chuẩn hóa viên nang BTLC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 18 Phụ lục 11: Giới hạn nhiễm khuẩn mẫu viên nang BTLC Tổng số vi sinh vật theo phương pháp cấy trộn đĩa thạch ĐPL Hộp Casein Soybean Agar 10-1 10-2 TB Tổng CFU/g Thời gian ủ: 89h50 Kết thúc: 16/01/2022 – 10h30 Sabouraud Dextrose Chloramphenicol Agar Số khuẩn lạc Bắt đầu: 12/01/2022 – 16h40 1 Thời gian ủ: 135h50 Bắt đầu: 12/01/2022 – 16h40 2 1,5 15 CFU/g 1,5 15 CFU/g Kết thúc: 18/01/2022 – 8h30 Kết đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí MT SĐ TSA Độ pha loãng 10-1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 10-2 Mẫu + B subtilis Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 19 Kết đếm tổng số nấm men nấm mốc MT Độ pha loãng Số đĩa 10-1 SA Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 10-2 Mẫu + C albicans Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 20 Xác định vi khuẩn Gram âm dung nạp mật MT Chứng âm Mẫu + vi khuẩn Phân lập mẫu Mẫu + vi khuẩn Phân lập mẫu Mẫu + vi khuẩn Phân lập mẫu VRB A Xác định vi sinh vật gây bệnh khác 3.1 Echerichia coli MT Chứng âm Mac Aga r 3.2 Staphylococcus aureus MT Chứng âm MS A Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 21 3.3 Salmonella MT Chứng âm Mẫu + vi khuẩn XL D Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phân lập mẫu Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 22 Phụ lục 12 DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VIÊN NANG BTLC YÊU CẦU KỸ THUẬT STT Chỉ tiêu Yêu cầu Viên nang cứng có chứa bột mịn màu vàng nâu bên Tính chất Quan sát kính hiển vi SEM (x5000), bột nang phải có mảnh vỡ BTLC phá vách Độ đồng khối lượng Độ rã ± 7,5 % so với KLTB bột thuốc nang Khơng q 15 phút Định tính HPLC acid ganoderic A Định lượng HPLC acid ganoderic A Đúng Hàm lượng acid ganoderic A khơng 10 µg/nang Giới hạn nhiễm khuẩn - Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại Khơng 10.000 CFU/g chế phẩm - Tổng số nấm men nấm mốc sống lại Không 100 CFU/g chế phẩm - Tổng số Enterobacteria vi khuẩn Không 500 CFU/g chế Gram âm khác phẩm - Staphyllococcus aureus, Escherichia Khơng có g chế phẩm coli, Salmonella spp Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 23 PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Mô tả: Bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt yêu cầu nêu 2.2 Độ đồng khối lượng: tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 11.3 2.3 Độ rã: thử theo DĐVN V, phụ lục 11.6, trang PL-226 2.4 Định tính acid ganoderic A: Trong phần định lượng, sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu với pic acid ganoderic A sắc ký đồ dung dịch chuẩn 2.5 Định lượng acid ganoderic A: Quy trình phân tích Điều kiện sắc ký: - Thiết bị : Máy sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò PDA - Cột : C18 (150 mm x 2,0 mm; µm) tương đương - Bước sóng : 257 nm - Tốc độ dòng : 0,36 ml/ phút - Nhiệt độ cột : 25 oC - Thể tích tiêm : µl Pha động : gradient Thời gian (phút) Acid acetic 0,1 % Acetonitril 0,0 80,0 20,0 3,0 73,5 26,5 34,0 73,5 26,5 52,0 61,5 38,5 60,0 80,0 20,0 70,0 80,0 20,0 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 24 Quy trình xử lý mẫu - Dung dịch đối chiếu gốc acid ganoderic A: hòa tan khoảng 5,0 mg acid ganoderic A đối chiếu vào bình định mức 50 ml dung môi methanol Từ dung dịch gốc pha dãy dung dịch đối chiếu có nồng độ từ 2,5; 5,0; 10,0; 25,0 50,0 (µg/ml) - Dung dịch thử: Cân 20 viên nang, xác định khối lượng trung bình bột thuốc nang Cân lượng bột thuốc tương đương g BTLC phá vách cho vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml ethanol 70 %, siêu âm 60 phút Để nguội định mức đến vạch ethanol 70 %, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Sự phù hợp hệ thống sắc ký Sắc ký lần dung dịch đối chiếu 10 µg/ml dung dịch thử, Độ lệch chuẩn tương đối lần tiêm thời gian lưu diện tích pic  2,0 %, Hệ số đối xứng từ 0,8 - 1,2; số đĩa lý thuyết > 2000 Cơng thức tính Hàm lượng acid ganoderic A nang tính theo cơng thức: 𝑋(𝜇𝑔⁄𝑣𝑖ê𝑛) = Trong đó: 𝑆𝑡 − 𝑏 50 ×𝛼× × 𝑀𝑇𝐵 𝑎 𝑚𝑡 St : diện tích pic acid ganoderic Atrong SKĐ dung dịch thử b : hệ số chắn phương trình hồi quy a : độ dốc phương trình hồi quy 𝛼 : độ tinh khiết acid ganoderic A đối chiếu (%) 𝑚𝑡 : khối lượng mẫu thử (g) 𝑀𝑇𝐵 : khối lượng trung bình (g) 2.6 Giới hạn nhiễm khuẩn: Thử theo DĐVN V, phụ lục 13.6, trang PL-300 ĐÓNG GÓI, DÁN NHÃN, BẢO QUẢN Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 25 3.1 Đóng gói - nhãn Đóng gói 30 viên /lọ, có túi hút ẩm có nắp đậy kín phía Trình bày rõ ràng, quy chế nhãn 3.2 Bảo quản Nơi khô mát, tránh ánh sáng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn