Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao trầu không (piper betle l piperaceae)

PHẠM BỀN CHÍ – KHĨA 2019 – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHẠM BỀN CHÍ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO TRẦU KHÔNG (PIPER BETLE L PIPERACEAE) NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHẠM BỀN CHÍ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO TRẦU KHÔNG (PIPER BETLE L PIPERACEAE) NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN ĐINH NGA PGS TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Phạm Bền Chí Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học – Khóa: 2019 – 2021 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất – Mã số: 8720210 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO TRẦU KHÔNG (PIPER BETLE L PIPERACEAE) Phạm Bền Chí Ngƣ i hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Đinh Nga PGS TS V Thị ạch Huệ Từ khóa: Trầu khơng, tiêu chuẩn hóa, kháng vi sinh vật, hydroxychavicol, hóa chất bảo vệ thực vật chì độc tính cấp Mở đầu: Lá Trầu không tinh dầu đƣợc báo cáo rộng rãi khả kháng vi sinh vật gây bệnh khoang miệng (C albicans, S mutans) Các sản phẩm từ Trầu không phổ biến thị trƣ ng nhƣng tiêu chuẩn chất lƣợng cao Trầu khơng chƣa có DĐVN V Do đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở cao Trầu khơng” thực để góp phần kiểm soát chất lƣợng cung cấp nguồn nguyên liệu bào chế sản phẩm chăm sóc miệng Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu: Lá Trầu không đƣợc thu mua Hóc Mơn, Thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 7/2020 Quy trình điều chế cao đặc Trầu khơng (CĐTR K) đƣợc khảo sát phƣơng pháp chiết xuất điều kiện loại tạp cồn 96% Tiêu chuẩn sở đƣợc xây dựng theo hƣớng dẫn DĐVN V gồm: hình thức cảm quan, khối lƣợng làm khô, cắn không tan nƣớc, giới hạn nhiễm khuẩn định tính định lƣợng hydroxychavicol (HC) dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật hàm lƣợng chì, hoạt tính kháng C albicans ATCC 10231 S mutans ATCC 35668 độc tính cấp Các quy trình định lƣợng hydroxychavicol HPLC – PDA, xác định dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật GC – MS/MS định lƣợng Pb AAS với điều kiện phân tích thích hợp đƣợc thẩm định theo hƣớng dẫn ICH Q2(R1), AOAC 2016, EC2018 Hoạt tính kháng vi sinh vật hiệu phối hợp CĐTR K với tinh dầu (Hƣơng nhu trắng ách lý hƣơng vỏ ƣởi Quế) đƣợc thực phƣơng pháp vi pha loãng thạch Kết quả: CĐTR K đƣợc điều chế phƣơng pháp sắc với điều kiện: tỉ lệ dƣợc liệu – nƣớc (1: g/ml), 100 ± oC, gi , loại tạp EtOH 96% (tỉ lệ EtOH 96% - cao đƣợc 1/10 thể tích ban đầu (16:1)) Tiêu chuẩn sở dự kiến cao đặc Trầu không: màu nâu đen đặc, sánh, cắn không tan nƣớc không qua 3% độ ẩm nhỏ 20% hàm lƣợng Hydroxychavicol khơng thấp 15% dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật dƣới 20 ppb hàm lƣợng Pb không 20 μg/ngày tổng số vi sinh vật hiếu khí tổng số nấm không lần lƣợt 104 CFU/g, 102 CFU/g MIC C albicans ATCC 10231 S mutans ATCC 35668 lần lƣợt từ – mg/ml, 62,5 – 125 μl/ml LD50 >5000 mg/kg Kết thẩm định quy trình định lƣợng HC, HCBVTV, Pb chấp nhận đƣợc Phối hợp CĐTR K - tinh dầu ách lý hƣơng (1:1 1:2 1:4) Hƣơng nhu trắng (1:1), vỏ ƣởi (1:32, 1:64) cho hiệu cộng lực C albicans ATCC 10231 Kết luận: Đề tài điều chế đƣợc cao đặc Trầu khơng với dung mơi an tồn (nƣớc, EtOH 96%) Tiêu chuẩn sở CĐTR K phù hợp với hƣớng dẫn DĐVN V CĐTR K an toàn khả kháng C albicans ATCC 10231 tăng lên đáng kể phối hợp với tinh dầu ách lý hƣơng nên ứng dụng để bào chế sản phẩm chăm sóc sức khỏe miệng Master’s Thesis – Academic course: 2019 - 2021 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 STANDARDIZATION OF BETEL’S EXTRACT (PIPER BETLE L PIPERACEAE) Pham Ben Chi Supervisor: Assoc Prof Nguyen Dinh Nga, Assoc Prof Vo Thi Bach Hue Keywords: betel’s leaves standardization antimicrobial activity hydroxychavicol pesticide lead, acute toxic Introduction: etel’s leaves and essential oils were reported widely about the ability of inhibition microbial at oral cavity The products made from betel leaves were popular in Vietnam, but the quality standard of betel’s extract has not been in Vietnamese Pharmacopoeia V So, this topic was conducted to contribute to control their quality and offer a potential natural source for preparing the products that protect oral cavity from microorganisms Materials and methods: etel’s leaves were collected in Hoc Mon province Ho Chi Minh city in July 2020 The procedure of preparing the betel’s extract was surveyed about the extracting and purifying method The betel’s extract standard was built based on Vietnamese Pharmacopoeia V that consists of sensory, moisture content, water - insoluble ash, microbial contamination, hydroxychavicol identification and quantification, pesticide and lead residues, antimicrobial activity (C albicans ATCC 10231 and S mutans ATCC 35668), oral acute toxic The analysis procedures of hydroxychavicol by HPLC – PDA, of pesticide by GC – MS/MS, of lead by AAS in betel’s extract were validated with suitable conditions according to ICH Q2(R1), AOAC 2016, EC 2018 guideline The independent and combined microbial activity of betel’s extract to some essential oils (Thyme, Cinnamon, Basil, Grapefruit peel) were conducted by the agar microdilution method Results: The betel’s extract was prepared by decoction with the ratio of herbal – water (1:5 g/ml), at the temperature of 100 ± oC for hours The liquid extract was concentrated to 1/10 original volume, then was purified by alcohol precipitation method at the ratio of concentrated liquid and 96% EtOH was 1:16 (v/v) Its standard includes in: back – brown color, stiff, viscous texture, less than 20% and 3% of moisture content and water - insoluble ash, respectively Hydroxychavicol content was not less than 15% The pesticide residues, lead content, total of aerobic microorganism total of fungi was not more than 20 ppb 20 μg/day 104 CFU/g, 102 CFU/g, respectively MIC value against C albicans ATCC 10231 and S mutans ATCC 35668 was – mg/ml 62 μg/ml respectively LD50 > 5000 mg/kg The analysis procedures of HC, pesticide and lead could be accepted according to the guidelines Combination of betel’s extract and essential oils: Thyme (1:1, 1:2, 1:4), Basil (1:1), Grapefruit peel (1:32, 1:64) show the additive effect on C albicans ATCC 10231 Conclusion: The research prepared the betel’s extract with safe and cheap solvents (water, 96% of EtOH) Its standard could be accepted according to the guideline of Vietnamese Pharmacopoeia V etel’s extract is safe as well as inhibits strongly microorganisms at oral cavity, especially when combined with Thyme essential oil Therefore, they could be applied to prepare products that take care oral cavity LỜI CẢM ƠN L i đầu tiên, em xin gửi l i biết ơn sâu sắc đến Cô PGS TS Nguyễn Đinh Nga, Cô PGS TS Võ Thị Bạch Huệ, Các Cô quan tâm hƣớng dẫn truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho em Quan trọng hết Cơ động viên, tiếp sức cho em lúc thực nghiên cứu bế tắc Đƣợc học trò Cô điều may mắn vinh dự tháng năm học tập dƣới mái trƣ ng Dƣợc khoa Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn Cô cầu chúc Cô dồi sức khỏe để tiếp tục nghiệp trồng ngƣ i Em gửi l i cảm ơn đến Cô PGS TS Nguyễn Thị Ngọc Vân, Anh Ths Lê Nhơn Đức, tập thể anh, chị, em phận sắc ký công ty cổ phần Warrantek, chi nhánh Cần Thơ Thầy TS Phan Văn Hồ Nam tạo điều kiện hỗ trợ thực nghiên cứu L i cảm ơn em xin gửi đến Ban chủ nhiệm Khoa Dƣợc, Khoa Kỹ thuật xét nghiệm y học Trƣ ng Đại học Nguyễn Tất Thành, Các Chị Thƣ, Yến, Nhi, My, Phúc, anh Khoa tạo điều kiện hỗ trợ em hồn thành cơng việc nơi công tác Cuối cùng, xin gửi l i cảm ơn sâu sắc đến Gia Đình Cảm ơn Ba, Má, Anh, Chị động viên em hồn thành chƣơng trình học Và anh gửi l i cảm ơn xin lỗi nhiều đến vợ Nguyễn Thị Bạch Tuyết gái Phạm An Nhiên Cảm ơn em gánh vác vai trị nặng nề việc chăm sóc gái suốt th i gian anh học Cao học để tốt nghiệp Thạc sĩ MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vi MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG 1.1 TỔNG QUAN Nguyên liệu 1.1.1 Lá Tr.K (Piper betle L Piperaceae) .3 1.1.2 Một số loại tinh dầu hoạt tính kháng vi sinh vật 1.2 Một số vi sinh vật gây bệnh khoang miệng 1.2.1 Candida spp bệnh Candida miệng 1.2.2 Streptococcus mutans bệnh sâu .11 1.3 Nghiên cứu Tr.K chế phẩm 12 1.3.1 Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu sản phẩm từ Tr.K .12 1.3.2 Nghiên cứu định lƣợng Hydroxychavicol Tr.K 14 1.4 Nghiên cứu dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật 14 1.4.1 Tổng quan HCBVTV .14 1.4.2 Các nghiên cứu dƣ lƣợng HCBVTV .16 1.5 Xu hƣớng phối hợp thuốc điều trị bệnh nhiễm 18 CHƢƠNG 2.1 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 Đối tƣợng vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Nguyên liệu 20 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3 Chủng vi sinh vật thử nghiệm .21 2.1.4 Thiết bị dụng cụ .21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .21 2.2.1 Phƣơng pháp phân tích thực vật 22 2.2.2 Phƣơng pháp vật lý .22 2.2.3 Phƣơng pháp hóa học 25 2.2.4 Phƣơng pháp sinh học 36 CHƢƠNG 3.1 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 42 Kết 42 3.1.1 Quy trình điều chế cao CĐTR K 42 3.1.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho cao CĐTR K 50 3.1.3 Tỷ lệ phối hợp cao CĐTR K với số tinh dầu có hoạt tính kháng C albicans ATCC 10231 định hƣớng sản xuất dƣợc phẩm 76 3.2 Bàn luận .78 3.2.1 Quy trình điều chế cao CĐTR K 78 3.2.2 Tiêu chuẩn sở cao CĐTR K .79 3.2.3 Tỷ lệ phối hợp cao CĐTR K với số tinh dầu có hoạt tính kháng C albicans ATCC 10231 định hƣớng sản xuất dƣợc phẩm 84 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .86 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG Ố CĨ LIÊN QUAN 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên gốc AAS Atomic Absorption Spectrometry ACN Acetonitril As Asymmetry Factor ATCC American Type Culture Collection B BHI BLH Tiếng Việt Quang phổ hấp thu nguyên tử Hệ số kéo đuôi ƣởi Brain Heart Infusion ách Lý Hƣơng Đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU Colony Forming Unit CĐTR K Cao Đặc Trầu Không CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CPRd10 Chlorpyrifod d10 DCM Dichloromethan DMSO Dimethyl sulfoxid EI Electron Ionization EtOAc Ethylacetat FIC Fractional Inhibitory Concentration GC Gas Chromatography Sắc ký khí GCB Graphite Carbon Black Than hoạt tính GSH Globally Harmonised System for Classification of Chemicals HC Hydroxychavicol HCBVTV Hóa Chất ảo Vệ Thực Vật HNT Hƣơng Nhu Trắng HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao IS Internal Standard Nội chuẩn IT Identification Transition Ion định tính LOD Limit Of Detection Giới hạn phát Từ viết tắt Từ nguyên gốc Nghĩa tiếng Việt LOQ Limit Of Quantification Giới hạn định lƣợng MFC Minimum Fungicidal Concentration Nồng độ tối thiểu diệt nấm MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ tối thiểu ức chế MS Mass Spectrum Khối phổ N Number of theoretical plate Số đĩa lý thuyết PDA Photodiode – Array Detection Đầu dò dãy diod quang PL Phụ Lục PS Pesticide Standard Chuẩn hóa chất bảo vệ thực vật PSA Primary Secondary Amines Amin thứ cấp Q Quế QT Quantification Transition Ion định lƣợng Quick – Easy – Cheap – Effective – Nhanh dễ dàng rẻ hiệu quản Rugged – Safe ổn định an toàn R Respone Đáp ứng Rf Retention factor Hệ số lƣu giữ RP Reverse Phase Pha đảo Rs Resolution Độ phân giải RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối Rt Retention time Th i gian lƣu SDA Sabouraud Dextrose Agar SKĐ Sắc Ký Đồ SKLM Sắc Ký Lớp Mỏng TCI Tokyo Chemical Industry TD Tinh Dầu TPP Triphenylphosphat Tr.K Trầu Không UV – Vis Ultraviolet – Visible VSV Vi Sinh Vật QuEChERS Tử ngoại - Khả kiến Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 22 Hình PL 6.3 Phiếu phân tích định tính, định lƣợng HC lơ Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 23 Phụ lục Kết khảo sát MIC lô cao CĐTR.K Bảng PL 7.8 Kết MIC lô cao CĐTR.K C albicans ATCC 10231 Nồng Lô Lô Lô độ Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - + + + + - + + + + + + + + + 0,5 + + + + + + + + + 0,25 + + + + + + + + + 0,125 + + + + + + + + + Chứng + + + + + + + + + 2 4 4 MIC (mg/ml) Bảng PL 7.9 Kết MIC lô cao CĐTR.K S mutans ATCC 35668 Nồng độ 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,0313 0,0156 0,0078 Chứng (mg/ml) Lô Lô Lô MIC (mg/ml) - - - - - - - + + + + + 0,125 - - - - - - - - + + + + 0,0625 - - - - - - - - + + + + 0,0625 - - - - - - - + + + + + 0,125 - - - - - - - + + + + + 0,125 - - - - - - - - + + + + 0,0625 - - - - - - - + + + + + 0,125 - - - - - - - - + + + + 0,0625 - - - - - - - - - + + + 0,03125 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 24 Phụ mục Kết khảo sát hiệu phối hợp cao CĐTR.K tinh dầu Bảng PL 8.10 Kết phối hợp cao CĐTR.K – TD Bách lý hƣơng C albicans ATCC 10231 A B C D E F G + + + - Lần + - + + + + + + + + - - Lần 10 + + + + + 11 + + + + Chứng 12 + + + + + + + Bảng PL 8.11 Kết phối hợp cao CĐTR.K – TD Hƣơng nhu trắng C albicans ATCC 10231 A B C D E F G + + + - Lần + + + + + + + + + + + - - Lần 10 + + + + + + + 11 + + + + Chứng 12 + + + + + + + Bảng PL 8.12 Kết phối hợp cao CĐTR.K – TD Bƣởi C albicans ATCC 10231 A B C D E F G + + + - Lần + + + + Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn + + + - - Lần 10 + + + + + + 11 + + + + Chứng 12 + + + + + + + Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 25 Bảng PL 8.13 Kết phối hợp cao CĐTR.K– TD Quế C albicans ATCC 10231 A B C D E F G + + + - Lần + + + + + + + + + + + + Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn + + + + - + + + + Lần 10 + + + + + + + + 11 + + + + Chứng 12 + + + + + + + Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 26 Phụ lục Thông tin chất chuẩn Bảng PL 9.14 Bảng thông tin chất chuẩn HCBVTV nội chuẩn HCBVTV/ Nội chuẩn Số lô Độ tinh khiết HCBVTV/ Nội chuẩn Số lô Độ tinh khiết Chlordan oxy H170141AL 99,6% Fenvalerat 8671600 99% Fenitrothion 9835200 98% Deltamethrin 8993300 99% Pirimiphos methyl 9648800 99% Bromopropylat 9163700 99% Gamma-BHC (Lindan) 8521900 99% Ethion 10211600 99% Heptachlor 0006515169 99% Fonofos 10183900 98% 9448900 99% Parathion 9803000 99% trans-Chlordan ER061906-04 99% 2,4'-DDE 9022100) 99% Endosulfan I BCBS8631 99% 4,4'-DDE GHYQG 99% cis-Chlordan LRAC5008 99% 2,4'-DDD 22599-29 97% Dieldrin 9448800 98% 4,4'-DDD HAN02 99% Endrin 8429200 99% 2,4'-DDT 9610900 99% Endosulfan II 8679900 99% Hexachlorobenzen LC19614V 99% Endosulfan sulfat BCCB0424 99% Methyl parathion 10604100 98% Pentachloroanilin 9776000 98% TPP 8251700 99,5% Alachlor 9477600 99% Cypermethrin G1044258 99% CPR d10 782414 99% Heptachlor epoxid (endo, exo) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 27 Hình PL 9.1 CoA chất chuẩn Hydroxychavicol Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 28 Phụ lục 10 Dự thảo tiêu chuẩn sở cao đặc Trầu không BỘ Y TẾ Dự thảo ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP TIÊU CHUẨN CƠ SỞ HỒ CHÍ MINH CAO ĐẶC TRẦU KHÔNG I Số TC: Hiệu lực từ: YÊU CẦU CHẤT LƢỢNG Mức chất lƣợng Chỉ tiêu Hình thức cảm quan Đặc sánh màu nâu đen có mùi thơm đặc trƣng Cắn khơng tan nƣớc Khơng q 3% (tính lƣợng cao khô kiệt) Mất khối lƣợng làm khô Không đƣợc 20% Dƣ lƣợng HCBVTV Không 20 ng/kg cao (ppb) Giới hạn nhiễm khuẩn Tổng số vi sinh vật hiếu khí Khơng q 104 CFU/g Tổng số nấm Không 102 CFU/g Hàm lƣợng Pb Không 20 μg/ ngày Định tính Sắc ký lớp mỏng SKĐ mẫu thử có vết với giá trị Rf tƣơng ứng với chuẩn Hydroxy chavicol HPLC - PDA Đỉnh SKĐ mẫu thử có th i gian lƣu trùng với Hydroxy chavicol SKĐ mẫu chuẩn Định lƣợng Hàm lƣợng Hydroxychavicol khơng 15% tính chế phẩm khơ Hoạt tính kháng vi sinh vật MIC từ – mg/ml (C albicans ATCC 10231) MIC từ 0,0625 – 0,125 mg/ml (S mutans ATCC 35668) Độc tính cấp Phân suất chuột tử vong 0% Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 29 II PHƢƠNG PHÁP THỬ Hình thức cảm quan Ghi nhận màu sắc, thể chất, mùi, vị Cắn không tan nƣớc Hòa tan 1000 g cao CĐTR K ml nƣớc cất nóng, lọc qua giấy lọc cân bì trƣớc, rửa giấy lọc cắn nƣớc cất nóng đến nƣớc rửa khơng màu, sấy cắn giấy lọc 100 oC gi để nguội bình hút ẩm 30 phút cân nhanh để xác định khối lƣợng cắn Hàm lƣợng phần trăm cắn không tan nƣớc cao CĐTR K đƣợc tính theo cơng thức: ( ) ( ) Trong đó: mcắn: khối lƣợng cắn không tan nƣớc (g) mcân: khối lƣợng cân cao CĐTR K (g) a: độ ẩm cao CĐTR K (%) Mất khối lƣợng làm khô Sử dụng cân hồng ngoại Sartorius với lƣợng mẫu thử 0,100 gam, nhiệt độ cài đặt 1050C để xác định độ ẩm cao Dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật Tiến hành phƣơng pháp GC – MS/MS Điều kiện sắc ký – khối phổ: - Cột HP5 – MS (30 m, 250 µm, 0,25 µm) - Khí mang: Heli 99,99%, tốc độ 1,2 ml/phút - Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 280 oC - Nhiệt độ phận kết nối khối phổ 280 oC - Thể tích tiêm mẫu: µl, chế độ khơng chia dịng - Chƣơng trình nhiệt độ: 70 oC (giữ phút), tăng 40 oC/phút lên 150 oC (0 phút) sau tăng oC/phút lên 250 oC (0 phút) tăng 15 oC/phút lên 280 oC (giữ phút) tăng 30 oC/phút lên 300 oC (giữ phút) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 30 - Th i gian phân tích: 28,333 phút - Nguồn ion hóa: EI 70 eV, chế độ ion dƣơng - Nhiệt độ nguồn ion: 280 oC Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan chất chuẩn HCBVTV nội chuẩn (CPR – d10 TPP) ACN đạt nồng độ 500 ppb Dung dịch chuẩn: Hút xác 400 µl dung dịch chuẩn HCBVTV 500 ppb nội chuẩn 500 ppb (CPR – d10 TPP) cho vào ống nghiệm Thổi dƣới dịng khí nitơ nhiệt độ 45 oC đến cắn Hịa tan cắn với 250 µl iso – octan Dung dịch thử: cân xác khoảng 0000 g cao CĐTR K vào falcon 50 ml Thêm 400 µl nội chuẩn 500 ppb (CPR – d10 TPP) Thêm 10 ml nƣớc 10 ml CH3COOH 1% ACN, lắc 30 phút Bổ sung 4g MgSO4 1g NaCl, lắc xốy vịng phút Ly tâm 4000 vòng/phút phút Lấy ml dịch ly tâm (lớp trên) cho vào ống chiết dSPE có sẵn MgSO4 g, PSA 0,4 g, C18 0,4 g) Lắc xốy 6000 vịng/phút phút Hút ml dịch chiết cho vào falcon 50 ml Bổ sung ml n – hexan 20 ml NaCl 20%, lắc xoáy phút Ly tâm 6000 vòng/ phút phút Hút 2,5 ml lớp n – hexan cho vào ống nghiệm thủy tinh Thổi khơ dƣới dịng khí N2, nhiệt độ 45 oC đến cắn Hòa tan cắn 250 μl iso – octan Lọc qua màng PTFE 22 μm vào lọ chứa mẫu Dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm xác 400 µl dung dịch nội chuẩn 500 ppb (CPR – d10 TPP) thể tích khác dung dịch chuẩn HCBVTV 500 ppb vào 2,0000 g cao CĐTR K falcon 50 ml để đạt đƣợc hàm lƣợng HCBVTV lần lƣợt 20, 50, 80, 100, 150 200 ppb Thực tƣơng tự dung dịch thử Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp hệ thống: tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn Độ lệch chuẩn tƣơng đối diện tích pic th i gian lƣu hóa chất bảo vệ thực vật nội chuẩn thu đƣợc từ lần tiêm lặp lại không lớn 5% Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 31 Tiến hành sắc ký lần lƣợt dung dịch thử thêm chuẩn dung dịch thử Ghi sắc ký đồ xây dựng đƣ ng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan hàm lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật thêm vào tỉ lệ diện tích pic HCBVTV nội chuẩn Hàm lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật cao CĐTR K đƣợc suy từ đƣ ng chuẩn Giới hạn nhiễm khuẩn Tiến hành phƣơng pháp cấy trải bề mặt theo phụ lục 13 DĐVN V, với lƣợng cao CĐTR K 2000 g Hàm lƣợng chì (Pb) Tiến hành phƣơng pháp quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS) Điều kiện triển khai AAS: - Hệ thống thiết bị máy quang phổ hấp thu nguyên tử Z – 2300, Hitachi - ƣớc sóng vạch đo 283 nm - Độ rộng khe đo nm - Cƣ ng độ đèn cathod rỗng Pb 7,5 mA - Hiệu điện 333 V - Khí đốt: hỗn hợp khơng khí – acetylen lƣu lƣợng khí đốt: lít/ phút - Áp suất khí oxy hóa: 160 kPa lƣu lƣợng khí oxy hóa: 15 lít/phút - Chiều cao Burner: 7,5 mm Dung dịch chuẩn C: Cân xác khoảng 0,1000 g Pb(NO3)2 cho vào bình định mức 100 ml Bổ sung nƣớc cất đến vạch thu đƣợc dung dịch chuẩn C có nồng độ 625,6 ppm Pb Dung dịch thử: Cân xác khoảng 5000 g cao CĐTR K cho vào bình nón nút mài 100 ml Thêm 15 ml hỗn hợp HNO3 đđ – H2O2 30% (2:1) Gắn hệ thống sinh hàn đun hồi lƣu bếp điện kín gi Để nguội thêm 20 ml nƣớc cất Lọc qua giấy lọc vào bình định mức 50 ml, tráng giấy lọc Bổ sung nƣớc cất đến vạch thu đƣợc dung dịch thử S Hút ml dung dịch thử S cho vào bình định mức 20 ml, bổ sung nƣớc cất đến vạch thu đƣợc dung dịch thử SP0 Dung dịch thử thêm chuẩn: tiến hành theo bảng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 32 Dung dịch SP1 SP SP3 SP4 SP5 Dung dịch thử S (ml) 1 1 Dung dịch chuẩn C (μl) 25 50 100 150 200 Ct + 4,69 Ct + 6,26 Nƣớc cất vừa đủ (ml) Nồng độ Pb (ppm) 20 Ct + 0,78 C+ 1,56 Ct + 3,13 Cách tiến hành Kiểm tra tính phù hợp hệ thống: tiến hành phân tích lần dung dịch chuẩn SP3 Độ lệch chuẩn tƣơng đối độ hấp thu (A) không 2% Phân tích mẫu SP0, SP1, SP2, SP3, SP4, SP5 Ghi nhận giá trị độ hấp thu A Xây dựng đƣ ng chuẩn thể tƣơng quan lƣợng Pb thêm vào độ hấp thu A Hàm lƣợng Pb cao CĐTR K đƣợc tính tốn theo cơng thức | | ( ) Trong đó: Giá trị a b đƣợc lấy từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính y = ax + b mc: khối lƣợng cân cao CĐTR K (g) x: độ ẩm cao CĐTR K (%) HL Pb: Hàm lƣợng Pb có cao CĐTR K (μg/ g cao) Định tính A Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: silicagel 60 F254 Dung môi khai triển: dichloromethan – ethylacetat (8:2) Dung dịch chuẩn: hòa tan hydroxychavicol acetonitril để đạt nồng độ mg/ml Dung dịch thử: Hòa tan cao CĐTR K nƣớc để đạt nồng độ 50 mg/ml Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên mỏng μl dung dịch Sau triển khai, lấy mỏng để khơ ngồi khơng khí phun FeCl3 5% Quan sát mỏng dƣới ánh sáng thƣ ng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 33 Kết quả: Trên sắc ký đồ thu đƣợc, dung dịch thử có vết có giá trị Rf màu sắc giống với vết sắc ký đồ dung dịch chuẩn B Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao Trong phần định lƣợng, pic sắc ký đồ thu đƣợc dung dịch thử phải có th i gian lƣu tƣơng ứng với th i gian lƣu pic Hydroxychavicol sắc ký đồ dung dịch chuẩn Định lƣợng Tiến hành phƣơng pháp HPLC Điều kiện HPLC – PDA - Pha tĩnh: Cột SphereClone ODS (2) (4 x 250 mm μm) - Pha động: ACN – H3PO4 0,02 % (25:75) - Tốc độ dòng: ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 10 μl - Đầu dị: PDA, phát bƣớc sóng 280 nm Dung dịch chuẩn: Hịa tan xác khoảng 10 mg chất chuẩn HC với pha động bình định mức 10 ml để đạt nồng độ 1000 µg/ml Từ dung dịch này, tiến hành pha loãng với pha động để đƣợc dung dịch chuẩn HC có nồng độ ppm Dung dịch thử: Cân xác khoảng 10 mg cao CĐTR K cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung pha động đến vạch để đạt nồng độ 200 ppm Tiếp tục pha lỗng dung dịch với pha động bình định mức 10 ml để đƣợc dung dịch mẫu thử có nồng độ 20 ppm Các dung dịch chuẩn, thử, thử thêm chuẩn đƣợc siêu âm 15 phút lọc qua màng lọc nylon 45 µm trƣớc phân tích hệ thống HPLC Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp hệ thống: tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn hydroxychavicol ppm Độ lệch chuẩn tƣơng đối thông số sắc ký (th i gian lƣu diện tích pic) thu đƣợc từ lần tiêm lặp lại không lớn 2% Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 34 Tiến hành sắc ký lần lƣợt dung dịch chuẩn dung dịch thử Ghi sắc ký đồ xác định vị trí pic chuẩn hydroxychavicol Hàm lƣợng Hydroxychavicol (HC) cao CĐTR K theo công thức: ( ) ( ) Trong đó: X: Hàm lƣợng phần trăm HC cao CĐTR K (%) Cc: Nồng độ HC mẫu chuẩn (ppm) St: Diện tích pic HC mẫu thử Sc: Diện tích pic HC trog mẫu chuẩn m: Khối lƣợng cân cao CĐTR K (mg) a: Độ ẩm cao CĐTR K (%) Hoạt tính kháng vi sinh vật Tiến hành phƣơng pháp vi pha lỗng mơi trƣ ng thạch Hoạt hóa vi sinh vật thử nghiệm: - C albicans ATCC 10231 SDA, 37 oC điều kiện khí thƣ ng 48 gi - S.mutans ATCC 35668 BHI, ủ 37 oC điều kiện 5% CO2 24 – 48 gi Pha huyền trọc vi sinh vật: - C albicans ATCC 10231: Lấy khoảng – khóm nấm có đƣ ng kính khoảng mm, làm thành huyền trọc với muối sinh lí có 05% Tween 80 Xác định mật độ vi nấm cách đo OD bƣớc sóng 530 nm để đạt – × 106 CFU/ml, tƣơng đƣơng với giá trị OD xấp xỉ 0,1 (0,08 – 0,12) - S mutans ATCC 35668: Điều chỉnh mật độ vi khuẩn đƣợc hoạt hóa HI đạt – × 108 CFU/ml tƣơng đƣơng với giá trị OD xấp xỉ 0,1 (0,08 – 0,12) Tiếp tục pha loãng huyền trọc vi khuẩn 100 lần để đạt đƣợc mật độ – x 106 CFU/ml Điều kiện thử nghiệm: Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 35 - C albicans ATCC 10231: Môi trƣ ng MHA bổ sung 2% D-glucose, mật độ 104 CFU/ giếng, ủ 37 oC khí thƣ ng 48 gi - S mutans ATCC 35668: Môi trƣ ng BHA, mật độ 104 CFU/ giếng, ủ 37 oC, % CO2 24 – 48 gi Cao CĐTR K hịa tan mơi trƣ ng thử nghiệm giảm dần theo cấp số bảng nhựa 96 giếng thành dãy nồng độ thử nghiệm: - C albicans ATCC 10231: 8000 – 125 μg/ml - S mutans ATCC 35668: 8000 – 8125 μg/ml Xác định giá trị MIC nồng độ cao Trầu không tối thiểu ức chế phát triển vi sinh vật quan sát mắt thƣ ng 10 Độc tính cấp Thực theo “Hƣớng dẫn thử nghiệm phi lâm sàng lâm sàng thuốc đông y thuốc từ dƣợc liệu” Bộ Y tế ban hành theo định số 141/QĐ – KTĐT ngày 27/10/2015 Cao CĐTR K đƣợc phân tán dung dịch nƣớc bổ sung 5% Tween 80 để đạt nồng độ 100 mg/ml Sử dụng dung dịch Tween 80 nồng độ 5% nƣớc làm chứng âm Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino, – tuần tuổi, trọng lƣợng trung bình 22 ± g, nhịn đói 12 gi đƣợc chia ngẫu nhiên thành lô, lô gồm (3 đực, cái) Cho chuột uống với thể tích 50 ml/kg trọng lƣợng chuột: - Lô đối chứng sinh lý: uống dung dịch chứng âm - Lô thử: uống cao CĐTR K 100 mg/ml, liều 5000 mg/kg trọng lƣợng chuột Theo dõi ghi nhận cử động tổng quát, biểu hành vi, trạng thái lông ăn uống, tỉ lệ chuột tử vong 72 gi đầu sau uống cao CĐTR K Nếu sau 72 gi , chuột khơng có dấu hiệu bất thƣ ng chết, tiếp tục theo dõi vòng 14 ngày III ĐĨNG GĨI – BẢO QUẢN Đóng gói: Quy cách 20 g Nhãn quy chế Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 36 Bảo quản: nhiệt độ từ 15 – 30 0C, tránh ẩm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn