ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để phát hiện sớm một số bất thường nhiễm sắc thể trong chẩn đoán trước sinh

Bộ Y Tế TRờng đại học y hà nội Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ ứng dụng kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang để phát hiƯn sím mét sè bÊt th−êng nhiƠm s¾c thĨ Trong chẩn đoán trớc sinh Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Trần Thị Thanh Hơng Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Y Hà Nội Cơ quan chủ quản: Bé Y TÕ 6990 26/9/2008 Hµ Néi - 2008 Bé Y Tế TRờng đại học y hà nội Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ ứng dụng kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang để phát sím mét sè bÊt th−êng nhiƠm s¾c thĨ Trong chÈn đoán trớc sinh Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Trần Thị Thanh Hơng Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Y Hà Nội Cơ quan chủ quản: Bộ Y Tế Thời gian thực từ tháng 9/2005 đến tháng 9/2008 (Quyết định phê duyệt số 3304/QD-BYT ngày tháng năm 2005) Tổng kinh phí thực đề tài: 350 triệu đồng Trong kinh phí SNKH: Hà Nội 2008 350 triệu đồng Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ Tên đề tài ứng dụng kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang để phát sớm số bất thờng nhiễm sắc thể chẩn đoán trớc sinh Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Trần Thị Thanh Hơng Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Y Hà Nội Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y Tế Th ký đề tài: ThS Hoàng Thu Lan Danh sách ngời thực chính: TT Học hàm, học vị, họ tên Cơ quan công tác PGS.TS.Trần Thị Thanh Hơng Đại học Y Hà Nội ThS Hoàng Thu Lan Đại học Y Hà Nội TS.Hoàng Thị Ngọc Lan Đại học Y Hà Nội TS Trần Danh Cờng Bệnh viện Phụ sản Trung ơng ThS Nguyễn Quỳnh Thơ Đại học Y Hải Phòng TS Nguyễn Việt Hùng Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội ThS Bùi Võ Minh Hoàng Đại học Y Dợc T/p Hồ Chí Minh BSCKII Trần Thị Lan Anh Bệnh viện Phụ sản Trung ơng CN Nguyễn Ngân Hà Đại học Y Hà Nội 10 KTV Nguyễn Thị Duyên Đại học Y Hà Nội Thời gian thực đề tài tháng 9/2005 đến tháng 9/2008 Danh sách tác giả đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Tên đề tài: ứng dụng kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang để phát sớm số bất thờng nhiễm sắc thể chẩn đoán tr−íc sinh” Thêi gian thùc hiƯn: Tõ th¸ng 9/2005 đến tháng 9/2008 Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Y Hà Nội Bộ chủ quản: Bộ Y Tế Danh sách tác giả: TT Học hàm, học vị, họ tên Cơ quan công tác PGS.TS.Trần Thị Thanh Hơng Đại học Y Hà Nội ThS Hoàng Thu Lan Đại học Y Hà Nội TS.Hoàng Thị Ngọc Lan Đại học Y Hà Nội TS Trần Danh Cờng Bệnh viện Phụ sản Trung ơng ThS Nguyễn Quỳnh Thơ Đại học Y Hải Phòng TS Nguyễn Việt Hùng Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội ThS Bùi Võ Minh Hoàng Đại học Y Dợc T/p Hồ Chí Minh BSCKII Trần Thị Lan Anh Bệnh viện Phụ sản Trung ơng CN Nguyễn Ngân Hà Đại học Y Hà Nội 10 KTV Nguyễn Thị Duyên Chữ ký Đại học Y Hà Nội Thủ trởng quan chủ trì đề tài Bản tự đánh giá tình hình thực đóng góp đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Tên đề tài: ứng dụng kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang để phát sớm số bất thờng nhiếm sắc thể chẩn đoán trớc sinh Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Trần Thị Thanh Hơng Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Y Hà Nội Thời gian thực từ tháng 9/2005 đến tháng 9/2008 (Quyết định phê duyệt số 3304/QD-BYT ngày tháng năm 2005) Tổng kinh phí thực ®Ị tµi: 350 triƯu ®ång Trong ®ã kinh phÝ SNKH: 350 triệu đồng Tình hình thực đề tài so với đề cơng 7.1 Mức độ hoàn thành khối lợng công việc Đà thực đầy đủ nội dung công việc số lợng, chủng loại đề cơng đặt Hoàn thành mục tiêu đề cơng, cụ thể: Stt Nội dung công việc Theo đề cơng §· thùc hiƯn Ghi chó Hoµn chØnh kü tht FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y - Trên nhân tế bào gian kỳ - Trên NST kỳ mẫu mẫu Do yêu cầu thùc tiƠn (15 - 18 tn) (15 - 18 tn) áp dụng kỹ thuật FISH tuần mẫu thai muén (28-32 (28-32 tuÇn) tuÇn) mÉu mÉu Hoàn chỉnh kỹ thuật Hoàn chỉnh thêm loại FISH với đầu dò ADN mẫu Tel Xp/Yp; Xq/Yq dụng øng dông kü thuËt 65 mÉu tÕ 73 mÉu tÕ FISH để phát bào ối bào ối tr−íc sinh mét sè bÊt c¸c thai phơ c¸c thai phơ th−êng NST 13, 18, cã nguy c¬ cã nguy 21, X, Y đầu dò để ứng 73 thai phụ chẩn đoán trớc sinh: phát 24 thai Turner; thai Down; thai Edward; cao sinh cao sinh thai Patau Theo dâi bÊt th−êng bÊt th−êng sau sinh c¸c tr−êng NST 13, 18, NST 13, 18, hợp kết bình 21, X, Y 21, X, Y thờng có định giữ thai, trờng hợp sinh bất thờng Kết kỹ thuật FISH phù hợp với kết di truyền tế bào phân tích NST nhuộm băng G: 73/73 mẫu (100%) øng dơng kü tht Ngoµi NST 21, X FISH để phát phát rối loạn mét sè rèi lo¹n cÊu tróc NST 21, X mẫu mẫu cấu trúc NST khác (theo yêu cầu lâm sàng) 7.2 Các yêu cầu khoa học tiêu sản phẩm nghiên cứu khoa học Đà thực yêu cầu khoa học tiêu bản: - Hoàn chỉnh, áp dụng kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y nhân tế bào gian kỳ phát ®óng vµ sím tr−íc sinh mét sè héi chøng th−êng gặp: Turner, Down, Edward, Patau (liên quan NST X, Y, 21, 18, 13) - Hoàn chỉnh, áp dụng kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y ADN Tel Xp/Yp; Tel Xq/Yq NST kỳ để xác định số rối loạn NST mà kỹ thuật di truyền tế bào khó không phát đợc Cụ thể nội dung sau: 7.2.1 Hoàn chØnh kü thuËt FISH 7.2.1.1 Hoµn chØnh kü thuËt FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y nhân tế bào gian kỳ nội dung sau: - Thể tích dịch ối cần thiết để làm kỹ thuật FISH tơng ứng với tuần thai (từ 15 - 18 tuần cần ml dịch ối; 28-32 tuần cần 10 ml dịch ối) - Xác định thời gian biến tính ADN dò thời gian lai, nhiệt độ lai phù hợp loại đầu dò (biến tính: 730C/3phút; lai: 420C/20giê ) - Gi¶m diƯn tÝch vïng lai xng 10x10mm để giảm giá thành 7.2.1.2 Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với dầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y đầu dò ADN Tel Xp/Yp; Xq/Yq kỳ giữa: - Xử lý lam lạnh kết hợp với khử nớc kÐo dµi b»ng alcol 70%/ phót, 80%2 phót, 100%/2 phút để NST phân tán tốt tín hiệu lai rõ - Xác định thời gian biến tính thời gian lai đầu dò ADN Tel Xp/Yp Tel Xq/Yq: biÕn tÝnh ë 730C/5 phót, lai ë 420C/24giê 7.2.2 áp dụng kỹ thuật FISH chẩn đoán trớc sinh mét sè bÊt th−êng NST øng dông kü thuËt FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y 73 thai phơ cã nguy c¬ cao sinh bÊt thờng NST, đà phát trớc sinh 24 trờng hợp Turner; tr−êng hỵp Down; tr−êng hỵp Edward; trờng hợp Patau Theo dõi sau sinh, trờng hợp kết bình thờng có định giữ thai, trờng hợp sinh bất thờng Kết FISH phù hợp với di truyền tế bào phân tích NST nhộm băng G: 73/73 (100%) 7.2.3 Đà ứng dụng kỹ thuật FISH để xác định số rối loạn NST mà kỹ thuật di truyền tế bào khó không phát đợc - Khẳng định kết di truyền tế bào trờng hợp sau: + Mất nhánh ngắn, nhân đôi nhánh dài NST X tạo NST bất thờng gây hội chứng Turner: 46, X, i(Xq) + Chuyển đoạn hoà hợp tâm nhánh dài NST 13 gây hội chứng Patau: 46,XX,t(13q;13q) + Chuyển đoạn hoà hợp tâm hai nhánh dài NST 14 vµ NST 21 ë thai phơ cã tiỊn sư sinh Down: 45,XX,t(14q;21q) - Xác định rối loạn di truyền mà di truyền tế bào khó khả phát + Mất đoạn nhánh dài vùng đầu mút nhánh ngắn NST X tạo NST bất th−êng g©y héi chøng Turner: 46, X, del (Xq), del (Tel Xp) + Nhân đoạn đảo ngợc, đầu mút nhánh dài tạo NST 21 hai tâm, dạng soi gơng gây hội chứng Down: 46,XX,idic(21)(pterq22.3::q22.3 pter) + Kết di truyền tế bào 46,XX, không phát đợc gen biệt hoá tinh hoàn Kết FISH xác định có gen biệt hoá tinh hoàn TDF tín hiệu lai NST Y (kết FISH phù hợp với kỹ thuật PCR) 7.3 Tiến độ thực hiện: Bảo đảm tiến độ Những đóng góp đề tài 8.1 Giải pháp khoa học công nghệ - Khẳng định giá trị kỹ thuật FISH đà phát sớm số rối loạn NST chẩn đoán trớc sinh (kết FISH phù hợp với kết di truyền tế bào 100%) Theo dõi sau sinh, trờng hợp có kết bình thờng, có định giữ thai, trờng hợp sinh bất thờng - Đà hợp tác với bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ Sản Hà Nội, khoa Sản bƯnh viƯn B¹ch Mai, øng dơng kü tht di trun tế bào kỹ thuật FISH chẩn đoán trớc sinh , t− vÊn di trun nh»m gi¶m tû lƯ sinh dị tật - áp dụng kỹ thuật FISH phát số rối loạn vật chất di truyền mà kỹ thuật di truyền tế bào phân tích NST khó không phát đợc 8.2 Những đóng góp khác - Đà tham gia báo cáo: + Hội nghị Quốc tế T vấn di truyền - sàng lọc chẩn đoán trớc sinh 8/2007: báo cáo + Hội nghị Nghiên cứu sinh lần XIII, 11-2007: báo cáo - Đà đăng báo tạp chí Nghiên cứu Y học và Báo cáo toàn văn Hội nghị Quốc tế T vấn di truyền - sàng lọc chẩn đoán trớc sinh - Đà đào tạo nghiên cứu sinh với đề tài Sàng lọc chẩn đoán trớc sinh hội chứng Turner, luận văn tốt nghiệp đại học Góp phần hoàn chỉnh kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang bớc đầu ứng dụng để phát số bất thờng nhiễm sắc thể (đà bảo vệ loại xuất sắc) Hội chứng Down Kết chẩn đoán trớc sinh 9/9 thai Down có kết FISH phù hợp với di truyền tế bào, lần khẳng định đợc giá trị kü tht FISH viƯc ph¸t hiƯn c¸c thai bÊt thờng trờng hợp thai hội chứng Down phát trớc sinh bất thờng số lợng NST 21 Với đầu dò phối hợp đà phát tín hiệu lai đặc hiệu với NST 21 bắt màu đỏ với phin lọc orange, tín hiệu không khó quan sát phân tích Để sµng läc tr−íc sinh héi chøng Down, ngoµi viƯc dùa vµo ti mĐ ≥ 35 ti, ti bè ≥ 55 ti, cã tiỊn sư sinh Down; dÊu hiƯu dµy da gáy dấu hiệu điểm siêu âm Trong 19 trờng hợp dày da gáy ®· ph¸t hiƯn: thai Down (31,58%), thai Edward, thai Patau 10 thai bình thờng (52,63%) Tuy nhiên, thai Down có thai dày da gáy, tỷ lệ phát 66,67%; điều phù hợp với tác giả khác [2],[3],[18],[19] Sàng lọc định lợng APF, HCG, uE3 máu mẹ đợc áp dụng để phát thai Down Với ngỡng sàng läc AFP ≤0,7MoM, uE3 ≤0,7 MoM, HCG hc fβHCG ≥2 MoM (MoM bội số giá trị trung vị) đà đợc hiệu chỉnh theo cân nặng, tuổi, tuần thai, bệnh tiểu đờng, hình thức thụ thai (tự nhiên hay IVF), chủng tộc (châu á) đà xác định đợc nguy c¬ sinh Down Víi nguy c¬ sinh Down cao mức 1/250 có định chọc ối Sàng lọc trớc sinh hội chứng Down không áp dụng cho ngời có nguy cao mà áp dụng cho thai phụ tình nguyện tham gia sàng lọc, thực tế có nhiều bà mẹ ë nhãm nguy c¬ thÊp sinh Down [27] 57 Héi chøng Edward Thai bÞ héi chøng Edward víi tû lệ 1/4000 - 1/5000, nguyên nhân hay gặp rối loạn số lợng NST 18 7/7 thai mắc hội chứng Edward có kết FISH phù hợp với kết di truyền tế bào Với cặp mồi Aneuploid hÃng Vysis, hình ảnh NST 18 với tín hiệu lai mầu xanh da trời Đây loại tín hiệu cần có phin lọc Aqua đặc hiệu Theo kết hội chứng Edward đợc phát siêu âm với dấu hiệu chân tay vẹo, bàn tay nắm, dị dạng mặt, dị dạng tim(2/7 trờng hợp) tuần thai sớm 12-15 tuần, siêu âm hội chứng Edward có dấu hiệu dày da gáy nang bạch huyết đơn (4/11 trờng hợp) Kết sàng läc hut mĐ, nång ®é AFP, HCG, uE3 ®Ịu giảm 0,7 MoM, ngỡng sàng lọc thai hội chứng Edward đợc xác định 1/100 Với ngỡng đà phát đợc 7/7 thai hội chứng Edward Trẻ mắc hội chứng Edward thờng chết giai đoạn sơ sinh Nh với đầu dò đặc hiệu, kết FISH có giá trị chẩn đoán xác định hội chứng Edward, điều phù hợp với nhận xét số tác giả khác [19], [35] Hội chứng Patau So với hội chứng trên, hội chứng Patau gặp với tỷ lệ 1/5000 1/10000 Trong nghiên cứu đà phát thai mắc héi chøng Patau sè 73 thai bÊt th−êng Chóng đà phân tích NST áp dụng kỹ thuật FISH chẩn đoán xác định thai bị hội chứng Patau chuyển đoạn hoà hợp tâm NST 13 đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y kỳ Hội chứng Patau loại đa dị tật có khả 58 phát siêu âm, nhng để khẳng định thai bị hội chứng Patau cần có kết phân tích NST FISH [19], [35] Các mẫu nghiên cứu đợc nuôi cấy tế bào ối, phân tích NST kỹ thuật băng G, lập karyotyp theo tiêu chuẩn quốc tế Kết di truyền tế bào lập karyotyp đợc coi tiêu chuẩn để chẩn đoán xác định rối loạn NST [7] Với số lợng 73 trờng hợp nghiên cứu chúng tôi, âm tính giả (theo dõi sau sinh trờng hợp kết bình thờng, có định giữ thai: trờng hợp sinh bất thờng) So sánh kết kỹ thuật FISH với kết DTTB phân tích NST phù hợp 100% (không có dơng tính giả) Nh độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật FISH lớn Điều đà khẳng định đợc giá trị chẩn đoán độc lập, phát sè rèi lo¹n NST cđa kü tht FISH Trong chÈn đoán trớc sinh thai phụ gia đình đợc t vấn rủi ro gặp phải chọc ối nh sảy thai (0,5 1%) Trong nghiên cứu 73 trờng hợp không xảy tai biến chọc ối 4.3 Giá trị kỹ thuật FISH phát rối loạn cấu trúc NST Ưu kỹ thuật FISH chẩn đoán trớc sinh đà đợc khẳng định thời gian trả lời kết nhanh, xác [13],[17] Tuy nhiên kỹ thuật FISH đợc ứng dụng để khẳng định nghi ngờ rối loạn cấu trúc NST mà di truyền tế bào khó xác định không xác định đợc [26],[28] 59 4.3.1 Những trờng hợp di truyền tế bào khó xác định - Trờng hợp bệnh nhân B.T.H 46,X,iXq: NST X bị nhánh ngắn nhân đôi nhánh dài Trên nhánh ngắn NST X có gen liên quan đến chiều cao, gen tạo buồng trứng đà 22 tuổi nhng kinh nguyệt, đặc tính sinh dục phụ phát triển, thấp cao 1m34 cm trờng hợp này, di truyền tế bào kinh nghiệm phân tích NST băng khó phát Kỹ thuật FISH đà khẳng định kết di truyền tế bào Với kết này, đà chẩn đoán xác định hội chứng Turner, t vấn cho bệnh nhân tình trạng bệnh tật, t vấn phơng pháp điều trị Tuy nhiên bệnh nhân đến muộn nên kết điều trị bị hạn chế - Tơng tự nh với kỹ thuật FISH đà khẳng định đợc chắn dạng chuyển đoạn hoà hợp tâm nhánh dài hai NST 13 Thai nhi bị hội chứng Patau víi karyotyp: 46, XY, t(13q;13q) Tõ kÕt qu¶ chÈn đoán xác định đà có định đình thai trẻ mắc hội chứng Patau thờng chết sớm sau sinh - Trờng hợp chuyển đoạn hoà hợp tâm NST 14 NST 21 đợc kiểm định lại kỹ thuật FISH Đây sở để t vấn cho thai phụ, cần thiết phải chọc ối ®Ĩ thùc hiƯn c¸c xÐt nghiƯm chÈn ®o¸n tr−íc sinh v× tû lƯ sinh bÊt th−êng ë thai phơ lớn, lý thuyết tỷ lệ giao tử bình thờng chiếm 1/8 Khi thụ tinh hầu hết hợp tử chết, số thai có khả sống có tới 1/3 thai Down, 1/3 lµ thai lµnh mang gen bƯnh vµ chØ cã 1/3 thai bình thờng Cơ hội sinh bình thờng có chẩn đoán trớc sinh cần thiết [6],[18] 60 4.3.2 Những trờng hợp di truyền tế bào không xác định đợc - Trờng hợp bệnh nhân T.T.M.H (ở Huế) Bằng phơng pháp phân tích NST nhuộm băng G, kết di truyền tế bào không xác định xác dạng rối loạn NST dạng rối loạn gặp Kết FISH đà xác định NST marker NST 21 nhân đoạn đảo ngợc, đầu mút nhánh dài tạo NST hai tâm dạng soi gơng Bệnh nhân đợc chẩn đoán xác định hội chứng Down rối loạn cấu trúc NST 21 idic(21)(pterq22.3::q22.3 pter) - Trờng hợp bệnh nhân L H.N (ở Hải Phòng), viện Sản Trung Ương gửi hội chẩn Bệnh nhân có biểu lâm sàng hội chứng Turner (vô kinh nguyên phát, lùn), kết di truyền tế bào nghi ngờ đoạn nhánh dài NST X Trong hội chứng Turner, đoạn nhánh dài chiếm tỷ lệ (2%) [33] Với trờng hợp kỹ thuật di truyền tế bào không khẳng định chắn NST marker NST X nhánh dài Vì cần thiết phải kết hợp với kỹ thuật FISH Vùng subtelomere vùng chứa nhiều gen đặc hiệu cho NST, vùng không bắt màu kỹ thuật nhuộm băng G khó phát bất thờng vùng [26] Với đầu dò đặc hiệu ADN 13, 18, 21, X, Y Tel Xp/Yp đà khẳng định NST marker NST X đoạn nhánh dài vùng gần đầu mút đầu mút nhánh ngắn Với kết đà chẩn đoán xác định bệnh nhân bị hội chứng Turner, karyotyp 46,X,del(Xq), del (TelXp) - Kü thuËt FISH cã u kỹ thuật di truyền phân tử kỹ thuật phân tích NST có khả phát rối loạn mức di truyền tế bào di truyền phân tử khó phát Bệnh viện Việt Pháp gửi đến trờng hợp chết sơ sinh có quan sinh dục nam, nhng 61 kết di truyền tế bào 46,XX; cần đợc giải thích Với kỹ thuật FISH đà phát trẻ có gen biệt hoá tinh hoàn (TDF) đầu dò NST Y (Yp11.1-q11.1) [8],[40], điều đà giải thích đợc biểu lâm sàng quan sinh dục nam Kết FISH đợc kết PCR khẳng định Đây trờng hợp kết di truyền tế bào phân tích NST không phát đợc rối loạn Với kết đà khẳng định giá trị kỹ thuật FISH đà phát sớm số rối loạn NST chẩn đoán trớc sinh Vì kết hợp với kü thuËt thu thËp mÉu tÕ bµo thai nhi ë giai đoạn sớm nh sinh thiết tua rau, ta trả lời kết chẩn đoán trớc sinh ba tháng đầu với loại đầu dò phù hợp [17] Kỹ thuật FISH đà phát số rối loạn vật chất di truyền mà kỹ thuật di truyền tế bào phân tích NST khó không phát đợc Kỹ thuật FISH thờng đợc ứng dụng để phát biến loạn vật chất di truyền lín h¬n 10Kb Theo Tỉ chøc Y tÕ thÕ giíi tần số hội chứng Down 120150/100000 trẻ sơ sinh sèng [2],[3] TÇn sè chung cđa mét sè héi chøng bất thờng NST gây nên nh: Turner, Edward, Patau, Klinerfelter 0,346% [17] Việt Nam, theo hội nghị Sản phụ khoa quốc tế (2007), tỷ lệ thai dị tật bẩm sinh bệnh viện Phụ Sản Trung Ương 2,7% tổng số đẻ Tỷ lệ bất thờng NST thai dị tật có hình ảnh siêu âm bÊt th−êng lµ 40,96% [1] NÕu chóng ta tiÕn hµnh sàng lọc chẩn đoán trớc sinh dị tật bẩm sinh cộng đồng kết hợp t vấn di truyền giảm tỷ lệ sinh dị tật 62 Kết luËn Hoµn chØnh kü thuËt FISH * Hoµn chØnh kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y nhân gian kỳ: - Thể tích dịch ối tơng ứng với tuần thai (từ 15 - 18 tuần cần ml dịch ối; 28-32 tuần cần 10ml dịch ối) - Xác định thời gian biến tính ADN vµ thêi gian lai: biÕn tÝnh 730C/3phót; lai 420C/20h - Giảm diện tích vùng lai xuống 10 x 10mm để giảm giá thành * Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y đầu dò Tel Xp/Yp; Xq/Yq kỳ giữa: - Xử lý lam lạnh kết hợp với khử nớc kéo dài alcol 70%, 80%, 100% (mỗi bớc phút) để NST phân tán tốt tín hiệu lai rõ - Thời gian biến tính ADN thời gian lai đầu dò Tel Xp/Yp Tel Xq/Yq: biến tính 730C/5phút; lai 420C/20h ) ¸p dơng kü tht FISH chÈn ®o¸n tr−íc sinh mét sè bÊt th−êng NST: øng dơng kỹ thuật FISH với đầu dò 13, 18, 21, X, Y ë 73 thai phơ cã nguy c¬ cao sinh bất thờng NST, đà phát trớc sinh 24 tr−êng hỵp Turner; tr−êng hỵp Down; tr−êng hỵp Edward; trờng hợp Patau Theo dõi sau sinh trờng hợp kết bình thờng có định giữ thai: trờng hợp sinh bất thờng Kết FISH phù hợp với di truyền tế bào phân tích NST băng G: 73/73 mẫu (100%) 63 ứng dụng kỹ thuật FISH để xác định số rối loạn NST mà kỹ thuật di truyền tế bào khó không phát đợc * Khẳng định kết di truyền tế bào trờng hợp sau: - Mất nhánh ngắn, nhân đôi nhánh dài NST X tạo NST bất thờng gây hội chứng Turner: 46, X,i(Xq) - Chuyển đoạn hoà hợp tâm nhánh dài NST 13 gây hội chứng Patau: 46,XX,t(13q;13q) - Chuyển đoạn hoà hợp tâm hai nhánh dài NST 14 vµ NST 21 ë thai phơ cã tiỊn sử sinh Down: 45,XX,t(14q;21q) * Xác định rối loạn di truyền mà di truyền tế bào khó khả phát hiện: - Mất đoạn nhánh dài vùng đầu mút nhánh ngắn NST X tạo NST bÊt th−êng g©y héi chøng Turner: 46, X, del(Xq), del(Tel Xp) - NST 21 nhân đoạn đảo ngợc, đầu mút nhánh dài tạo NST hai tâm dạng soi gơng gây hội chứng Down: 46,XX,idic(21)(pterq22.3::q22.3 pter) - Kết di truyền tế bào 46,XX, kết FISH có gen biệt hoá tinh hoàn TDF tín hiệu lai NST Y (kết FISH phù hợp với kỹ thuật PCR) 64 Những đóng góp đề tài Khẳng định giá trị kỹ thuật FISH đà phát sớm số rối loạn NST chẩn đoán trớc sinh Đà hợp tác với bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ Sản Hà Nội, khoa Sản bệnh viện Bạch Mai ứng dụng kỹ tht di trun tÕ bµo vµ kü tht FISH chẩn đoán trớc sinh, t vấn di truyền nhằm giảm tỷ lệ sinh dị tật áp dụng kỹ thuật FISH phát số rối loạn vật chất di trun mµ kü tht di trun tÕ bµo – phân tích NST khó không phát đợc đề xuất Cần triển khai sàng lọc chẩn đoán trớc sinh dị tật bẩm sinh cộng đồng Trong chẩn đoán trớc sinh cần kết hợp di truyền tế bào phân tích NST, kỹ thuật FISH kỹ thuật di truyền phân tử để phát thai bị rối loạn vật chất di truyền, làm sở cho t vấn di truyền nhằm giảm tỷ lệ sinh dị tật 65 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Trần Danh Cờng (2007), Một số nhËn xÐt vỊ kÕt qu¶ chäc hót n−íc èi chẩn đoán trớc sinh bệnh viện Phụ Sản Trung Ương, Báo cáo toàn văn Hội nghị Sản phụ khoa quèc tÕ”, tr 37-47 Bïi Vâ Minh Hoµng (2003), "Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (FISH) để phát nhanh số bất thờng nhiễm sắc thể chẩn đoán trớc sinh", Luận văn thạc sĩ Y học, Đại học Y Dợc thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Việt Hùng (2007), Xác định giá trị số phơng pháp phát dị tËt bÈm sinh cđa thai nhi ë ti thai 13-26 tuần, Báo cáo toàn văn Hội nghị Sản phụ khoa quốc tế, tr 49-59 Hoàng Thị Ngọc Lan, Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hơng (2007), Sàng lọc thai hội chứng Down định lợng AFP, hCG huyết mẹ, Tạp chí Nghiên cứu Y học, Vol.47 N01, tr 1-4 Hoàng Thị Ngọc Lan, Trần Thị Thanh Hơng, Đoàn Thị Kim Phợng, Trần Danh Cờng (2007), Một số hình ảnh siêu âm thai liên quan với thai hội chứng Down, Tạp chí Nghiên cứu Y học, Vol.47 N02, 2007, tr 51-56 Hoàng Thu Lan, Trần Thị Thanh Hơng, Hoàng Thị Ngọc Lan (2006), Hoàn Chỉnh kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang bớc đầu ứng dụng chẩn đoán trớc sinh hội chứng Down, Tạp chÝ Nghiªn cøu Y häc, ISSN 0868-202X tr 35-41 TiÕng Anh An Internationnal System for Human Cytogenetic Nomenclature ISCN (2005), Published in collaboration with Cytogenetic and Genome Research Aneu Vysion EC DNA Kit Package insert (2001), “LSI 13 SpectrumGreenTM/ 21 SpectrumOrangeTM and CEP 18 SpectrumAquaTM/ CEP X SpectrumGreenTM/ CEP Y- alpha SpectrumOrangeTM DAN probe panel”, A.D.M No R58982 Blancato J K (1999), “Fluorescence in situ hybridization”, The Principles of clinical cytogenetics, Humana Press, New Jersey, pp 443471 10 Bondy CA (2007), “Care of girls and women with Turner syndrome: A guideline of the Turner Syndrome Study Group”, The Journal clinical Endocrinology & metabolism, USA, 92(1), pp 10-25 11 Christopher J., et al (2002), “Maternal serum triple analyte screening in pregnancy”, American family physician, pp.1-8 12 Dhallan R., Guo X., Emche S et al (2007), “A non-invasive test for prenatal diagnosis based on fetal DNA present in maternal blood: a preliminary study”, Lancet 369: 474 – 81 13 Divance A., Carter N.P., Spathar D.H., Ferguson – Smith M.A (2007), “Rapid prenatal diagnosis of aneuploid from uncultured amniotic fluid cells using five colour flouresence in situ hybridization” Prenatal diagnosis ISSN 0197-3851, pp 1061 – 1069 14 Filiz A., Conca K., Kursat O., (2006), “ Significance of FISH method monitoring of minimal residual diseases and hemetological malignancies”, Department of medical biology, institute of health, Istanbul, Turkey 15 Glick B R., Pasternak J.J (2003), Molecular biotechnology: Principles and application of recombinant DNA, ASM press 16 Inbar O., Achiron R., Jaffe R (1999), “Abnormalities of fetal neck and thorax”, Textbook of fetal ultrasound, The Parthenon Publishing Group, pp 129-142 17 Jeffrey M L., Robert H S (2003), “Fluorescence in situ hybridization: past, present and future”, Journal of Cell Science 116, pp.2833-2838 18 JÐrom S., Haissam R et al (2003), “Detection of trisomy 21 by quantitative fluorescent – polymerase chain reaction in uncultured amniocytes” Prenatal Diagnosis 2003, 23, pp 287-191 19 Lim H J et al (2002), "Amniotic fluid interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of aneuploidy; Experiences in 130 prenatal cases", J Korean Med Sci 2002, 17, pp 89 – 92 20 Lyubomira C., Peter F (2008), “Sequential RNA and DNA fluorescence in situ hybridization” Cell biology of genomes, national cancer Institue, USA 21 Nath, J., et al (2000), "A Review of Fluorescence in situ Hybridization (FISH): Current Status and Future Prospects." Biotech Histochem 75, 5478 22 Norma C G et al (2003), “Multicolor fluorescence in situ hybridization studies in multiple myeloma and monoclonal gammapathy of undermined significance”, The Hematology Journal , Vol 4, N0 1, pp 67 – 70 23 Petros T., Triantafillos P (2001), “Automated fluorescence in situ hybridization detection of genetics abnormality” US Patent 24 Prakash H M., David J B (2002), “Use of multicolor Fluorescence in situ hybridization (mFISH) to detect radiation – induced chromosome aberrations in human cells”, Website developed by CE, last modified by MF, October 22, 2002 25 Peter M., Sergi T., Wolfgang H (2002), “Development in Laboratory technique for prenatal diagnosis”, Prenat Diagn., pp 161 - 167 26 Ravnan J B., Tepperberg J H., Papenhausen P., Lamb A N., et al (2006), “Subtelomere FISH analysis of 11 688 cases: an evaluation of the frequency and pattern of subtelomere rearrangements in individuals with developmental disabilities ”Journal of Medical Genetics 2006;43:478-489 27 Robert L.N., Roderck R.M., Huntington F.W (2004), “Genetic counseling and rick assessment”, Genetic in Medecine, pp 375 – 389 28 Schruck E., du Manoir S., Veldman T., Schoell B., Wienberg J., Ferguson-Smith M.A., Ning Y., Ledbetter D.H., , Soenksen D., Garini Y., Ried T (1996), “Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes” Science 273: 494-7 29 Schwarts S., Micale M.A., Beckler L (2001), “Preparation of aminocytes for interphase fluorescence in situ hybridization” University hospital of Cleverland, Cleverland, Ohio, USA 30 Shoko H., Yoshihiko S (2006), “Development and application of fluorescence in situ hybridization (FISH) method for simple and rapid identification of toxic dinoflagellates Alexandrium tamarense nad catenella in cultured and nature seawater” Laboratory of Marine Microbiology, Kyoto university, Japan 31 Speicher M.R., Gwyn Ballard S., Ward D.C (1996), “Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH” Nat Genet 12: 368 32 Spurbeck J L., Adams S., Stupca P., Dewald G (2004), “Primer on Medical Genomics – Part XI: Visualizing Human Chromosomes”, Mayo Clin Proc., 79, pp 58-75 33 Sybert V P., McCauley E (2004), “Turner Syndrome”, The New England Journal of Medicine, 351, the Division of Medical Genetics, University of Washington School of Medicine, pp 1227-1238 34 The-Hung Bui, Roderick F., Kypros H , Richard J (1999), Textbook of fetal ultrasound, The Parthenon Publishing Group, pp 287-303 35 Valdehi J., Kalol K R., Kiran K (2002), “Prenatal detection of aneuploidies using fluorescence in situ hybridization: A preliminary experience in an Indian set up”, J Biosci Vol27, N0 2, March 2002, pp 155 – 163 36 Yan J., Guilbault E., Masse J., et al (2000), “Optimization of the fluorescence in situ hybridization (FISH) technique for high detection efficiency of very small proportions target interphase nuclei”, Clin Genet 2000 Oct, 58(4), pp 309-318 37 Wait T., et all (2003), “Application of fluorescence in situ hybridization for chromosomes analize in amniotic fluid” Japanese Journal of national medical services No 10, pp 625 – 628 38 Werenowicz S., Schofield D.E (2007), “Preparation of cell from Formalin – Fixed, Parafin – embedded tissue for use in FISH” Havard medical School, Boston, Masschusett, USA 39 Xiujin X., Terri R., Xavier A and associator (2007), “Fluorescence in situ hybridization (FISH) using an old World monkey Y chromosomespecific probe combined with immunofluoresence staining on Rhesus monkey tissues” 40 Yorifuji T., Junko M et al (2001), “Analysis of the SRY gene in Turner syndrome patients with Y chromosomal material”, Journal of Medical genetic, Kyoto University Hospital, Kyoto, Japan 41 Yu S., Baker E., Hinton L., Eyre H.J., Waters W., Higgins S., Sutherland G.R., Haan E (2005), “Frequency of truly cryptic subtelomere abnormalities – a study of 534 patient and literature review”, Clinical genetics, 68, pp 436 – 441 42 Zerrin Y., et all (2007), “Comparison of conventional Cytogenetic and Fluorescence in situ hybridization results of prenatal aneuploidy screening” Jurk J medical Science, 37 (2), pp 69-74