Bo giao duc va dao tao1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHỊNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC o0o CHUYÊN ĐỀ MÔN SINH LÝ SINH SẢN DỊNG HĨA BỊ GVHD: PGS TS TRẦN THỊ DÂN HVTH: HÀN YẾN PHƯƠNG Lớp: TY2010 TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 MỤC LỤC MỤC LỤC i Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Mục đích: Phần2 TỔNG QUAN 2.1 Lịch sử nghiên cứu công nghệ chuyển cấy phôi 2.2 Chu trình tế bào 2.2.1 Chu trình tế bào 2.2.2 Các yếu tố tham gia điều hịa chu trình tế bào Phần DỊNG HĨA BỊ 11 3.1 Giới thiệu dịng hóa 11 3.2 Các kỹ thuật dịng hóa 12 3.2.1 Dịng hóa từ tế bào sinh dưỡng trưởng thành 16 3.2.2 Dịng hóa từ tế bào phơi thai 19 3.3 Tiêu chuẩn chọn thú cho phôi, thú nhận phôi khả áp dụng dịng hóa 22 3.4 Các sản phẩm dịng hóa bị 23 Phần KẾT LUẬN 25 4.1 Qui trình thực 25 4.2 Các yếu tố ảnh hưởng 25 i TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 ii Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: Theo FAO (2009), quốc gia châu Á có khoảng 3,3 tỷ người sản xuất 17g protein động vật/người/ngày Trong Mỹ, trung bình người tiêu thụ khoảng 65-70g protein động vật/ngày Ước tính, nhu cầu đạm động vật tồn giới khoảng 55g/người/ngày Không thể sử dụng kỹ thuật chăn nuôi năm 1940’s để cung cấp đủ nhu cầu đạm động vật cho gần 7,4 tỷ người Dân số giới tiếp tục tăng nhanh đến mức khoảng tỷ vào năm 2020 10 tỷ vào năm 2030, nhu cầu thịt, trứng, sữa ngày gia tăng Trong đó, ứng dụng cơng nghệ sinh học (CNSH) chăn ni, nhanh chóng cải thiện khả sinh trưởng, sản xuất sinh sản gia súc, từ khơng sản xuất nhiều sản phẩm chăn ni có giá trị dinh dưỡng cao (thịt, trứng, sữa) mà cịn sản xuất chế phẩm sinh học có giá trị lĩnh vực sức khoẻ người (http://iascnsh.org/CNSH%C4%90%E1%BB%99ngV%E1% BA%ADt/CNSHTrongTh%C3%BAY/tabid/60/EntryID/4/Default.aspx) Ngày nay, dòng hóa tế bào số kỹ thuật quan tâm phát triển sau thành công việc cho đời cừu Dolly Kỹ thuật chuyển nhân (nuclear transfer- NT) phương pháp dịng hóa ngày sử dụng rộng rãi chăn ni bị Nhằm nâng cao hiểu biết cơng nghệ dịng hóa động vật (bị), chúng tơi tiến hành chun đề “Dịng hóa bị” 1.2 Mục đích: Nâng cao hiểu biết cơng nghệ dịng hóa chăn ni Nắm vững ngun lý, quy trình thực yếu tố ảnh hưởng đến trình dịng hóa Phần TỔNG QUAN 2.1 Lịch sử nghiên cứu công nghệ chuyển cấy phôi Công nghệ phôi công nghệ tiên tiến, đại, ứng dụng triển khai số nước phát triển Mỹ, Pháp, Anh, Canada, Nhật…Cấy truyền phôi (CTP) q trình đưa phơi tạo từ cá thể (cái cho phôi) vào cá thể khác (cái nhận phơi) phơi sống, phát triển bình thường sở trạng thái sinh lý sinh dục nhận phôi phù hợp với trạng thái sinh lý sinh dục cho phôi phù hợp với tuổi phôi ( gọi phù hợp đồng pha) Một số mốc lịch sử trình phát triển cơng nghệ cấy truyền phơi: Năm 1890, thí nghiệm CTP thành công thỏ Walter Heap, ông xem người sáng tạo công nghệ CTP Năm 1932, Warwick Berry thành công dê Năm 1933, Nicholas thành công CTP chuột cống, năm 1934 thành công cừu (Warwick Berry Tiếp đến năm 1951 bê đời công nghệ CTP Willet cộng Năm 1970 thành công việc bảo quản phôi đông lạnh, 1972 :Bilton More; Wilmut Rowson thành công CTP đơng lạnh bị Năm 1978, em bé đời thụ tinh ống nghiệm (TTON) CTP Steptoe Edward 1982: vi phẫu thuật phơi bị thành cơng phịng thí nghiệm (theo Vlahov, 1987), 1984: William cộng thành công cấy phơi sau chia bị 1987 theo Vlahov có bê sinh cấy ghép gene tăng trưởng nhanh 1992: kỹ thuật cloning từ phơi bị cho phôi (viện Inra Pháp) 1997: Một cừu đời trưởng thành từ nhân tế bào tuyến vú cừu năm tuổi Scotland (Wilmut ctv) Hình 2.1: Sự đời cừu Dolly mở đầu cho công nghệ dịng hóa động vật Cho đến có khoảng 20 loài động vật khác nhân thành công bao gồm: Cá chép: nhân thành công vào năm 1963, cách 10 năm nhà khoa học Tong Dizuo lại tái nhân thành công cá chép châu Âu (European crucian carp) Cừu Dolly: nhân thành công năm 1996, sống đến tuổi xem loài hữu nhủ nhân thành cơng Chuột Cumulina: lồi chuột nhân thành công vào năm 2000 Hawaii sống đến năm tháng Bò Noto Kaga: nhân thành công Nhật, mở đường cho việc nhân thành công diện rộng để tạo gia súc sản xuất sữa, thịt tốt Dê Mira chị em nó: nhân thành cơng năm 1998 phịng thí nghiệm Mỹ, mở đường cho việc nhân kết hợp với chuyển gene nhằm sản xuất sản phẩm dược sinh học phục vụ cho người Gia đình heo gồm Millie, Alexis, Christa, Dotcom Carrel: nhân thành công năm 2000 công ty dược Mỹ nhằm sản xuất tế bào quan mà người sử dụng Cừu hoang dã Embretta: năm 2000, minh chứng ứng dụng nhân để bảo vệ loài động vật hoang dã có nguy tuyệt chủng Khỉ Rhesus Tetra: nhân thành công năm 2000, sử dụng nghiên cứu bệnh học người, chủ yếu tiểu đường Bị rừng Noah: lồi bị rừng châu Á có nguy bị thối hóa dần, nhân thành cơng năm 2001, sống ngày chết bệnh lỵ 10 Thỏ: nhân thành công năm 2001 11 Mèo Copy Cat: nhân thành công năm 2001, mở đầu cho lĩnh vực nhân thú nuôi trở thành ngành cơng nghiệp tương lai 12 Chuột Ralph: nhân thành công 2002, qua 15 lần nhân khác tử cung 13 La Idaho Gem: la lồi vơ sinh nhân vơ tính, điều chứng minh nhà khoa học Mỹ nhân thành công la Idaho Gem năm 2003 14 Ngựa Prometea: nhà khoa học Ý nhân thành công ngựa Prometea năm 2003 với hy vọng sản xuất nhiều ngựa giống cách này, cố gắng học thất bại, Prometea sinh năm 2008 15 Mèo hoang dã châu phi Diteaux: giống mèo khơng có nguy tuyệt chủng, nhà khoa học Mỹ nhân thành công năm 2003 để làm khuôn mẫu cho việc nhân số loài động vật hoang dã khác, loài dễ bị nguy hại 16 Nai Dewey: loại đuôi trắng, nhân thành công năm 2003 trường đại học A&M Texas, nhằm mục đích nghiên cứu gen loài nai chuẩn bị sản xuất đàn nai phục vụ cho săn bắn 17 Chồn sương Libby Lilly: nhân thành cơng năm 2004, nhằm mục đích phục vụ nghiên cứu bệnh hô hấp người, số lồi có nguy tuyệt chủng 18 Trâu Murrah: nhân thành công Ấn độ, gia súc sản xuất sữa chủ yếu quốc gia 19 Chó Snuppy: nhân thành công năm 2005 nhà khoa học Hàn quốc, nhằm mục đích phục vụ nghiên cứu bệnh người 20 Chó sói Snuwolf Snuwloffy: nhân thành công năm 2005 nhà khoa học Hàn quốc, trường đại học quốc gia Seoul, dự án bảo tồn thiên nhiên (theo Chung Anh Dũng - http://www.ias- cnsh.org/TrangCh%E1%BB%A7/tabid/36/EntryID/220/Default.aspx) * Ở Việt Nam: Năm 1978 trung tâm khoa học tự nhiên cơng nghệ quốc gia có phận bắt đầu nghiên cứu CTP thỏ; năm 1980, CTP bị Tháng năm 1989, Viện chăn ni quốc gia, môn CTP thành lập, gồm nghiên cứu viên đào tạo thực tập từ nước Những thỏ đời công nghệ cấy truyền phôi vào năm 1979 Năm 1986, bê nước ta đời từ cơng nghệ Năm 1994, bị sinh đơi có bê trứng rụng tự nhiên chu kỳ động dục bê cấy truyền phôi Đây trường hợp sinh nước ta cán Viện chăn nuôi thực cấy phôi Năm 1996-1997, 150 phôi đông lạnh với chuyên gia Newzealand đến Việt Nam để tiến hành thí nghiệm cấy truyền phơi bị sữa đàn bị miền nam Hà nội Kết khả quan, 40-45% bị cấy phơi đơng lạnh có chửa Đến nay, bê sinh từ công nghệ cấy truyển phôi sinh trưởng, phát triển tốt, sinh sản bình thường cho sữa vượt tồn đàn 20-30% Năm 2006, viên công nghệ sinh học bước đầu thành cơng nhân phơi số lồi động vật hoang dã, q la, bị tót… Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn cho biết nhân vơ tính gia súc giai đoạn 2006-2010 vấn đề quan tâm hàng đầu 17/4/2008, bà Trương Kim Thiệp địa 10/5A ấp xã Đông Thạnh- huyện Hóc Mơn TP.HCM cho tiến hành cấy phơi đơng lạnh vào bị độ tuổi sinh sản, bò tạo từ tế bào trứng đơng lạnh nói thức “chào đời” Cuối năm 2005 đến 2009, Phan Kim Ngọc cộng phịng thí nghiệm tế bào gốc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia TPHCM vừa thành công việc tạo bò từ tế bào trữ lạnh trước thời gian dài Đây bị VN tạo từ tế bào làm đông lạnh từ trước ( http://www.vusta.vn/Temps/Home/template2/default.asp?nid=84EC) 2.2 Chu trình tế bào 2.2.1 Chu trình tế bào Để thực nhân đôi phân chia ADN, tế bào trải qua trình tự kiểm sốt chặt chẽ kiện gọi chu trình tế bào Chu trình tế bào biến đổi tế bào xảy từ lúc bắt đầu lần phân chia thứ đến lúc bắt đầu lần phân chia thứ hai, gồm pha:  Pha G0 giai đoạn chu kỳ tế bào (cell cycle) mà tế bào trạng thái nghỉ  Pha G1: pha phát triển chu kỳ Tế bào tăng trưởng lớn dần Khi đạt kích thước định, bước vào giai đoạn tổng hợp DNA  Pha S: pha DNA chép  Pha G2 pha phát triển thứ hai pha tế bào kiểm tra hồn tất nhân đơi DNA chuẩn bị cho tế bào phân chia  Pha M gọi phân bào (mitosis) trạng thái hoạt động tế bào (cytokinesis) Trong pha này, phân chia tế bào thực diễn để tạo thành hai tế bào giống Hình 2.2: Diễn tiến chu trình tế bào khác loại tế bào khác Ở hầu hết tế bào động vật có vú, chu trình tế bào dao động 10 30 đồng hồ Những tế bào pha G1 ln ln khơng tiếp tục chu trình Thay vào đó, chúng khỏi chu trình tế bào bước vào giai đoạn nghỉ (G0) 2.2.2 Các yếu tố tham gia điều hịa chu trình tế bào Điều hịa chu trình tế bào: có hai chế chủ yếu hướng dẫn chu trình tế bào, bao gồm chế bên xuất chu trình tế bào chế bên ngồi hoạt động có khiếm khuyết tìm Dịng hóa từ tế bào phôi thai (Embryo cloning) kỹ thuật sử dụng tế bào cho nhân tế bào vạn (tế bào giai đoạn phôi nang phôi dâu) Cả hai kỹ thuật có chung quy trình Chuẩn bị, xử lý tế bào cho nhân trứng nhận Đồng pha tế bào Tái kết cấu Nuôi cấy chuyển phơi Các giai đoạn dịng hóa tế bào Bước 1: chuẩn bị, xử lý tế bào nhận nhân Tế bào nhận nhân sử dụng tế bào nang noãn giai đoạn noãn bật II Việc thu thập noãn bật II thường tiến hành sở giết mổ hay lấy bò sống 13 phương pháp nội soi siêu âm Buồng trứng lấy từ lò mổ, bảo quản nước muối sinh lý có bổ sung kháng sinh, đưa phịng thí nghiệm trước tiếng đồng hồ Từ nang nỗn có xoang với đường kính - mm, phức hợp trứng - tế bào ổ (cymulus-oocyte) nguyên vẹn hút Chọn COC nguyên vẹn với vài lớp tế bào ổ dày nuôi cấy in vitro 22 – 24h môi trường nuôi trưởng thành TCM 199 có bổ sung huyết phơi bị, FSH, LH estradiol - 17β (là nhóm hormon estrogen gồm estradiol, estriol, estrol) nhằm tạo điều kiện cho nang trứng trưởng thành chín (Trần Thị Dân, 2006, Công nghệ sinh học chăn nuôi gia súc, Chương 10, Nhà xuất nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh) Bước 2: chuẩn bị, xử lý tế bào cho nhân Bước 3: chuyển nhân từ tế bào cho vào tế bào nhận tái cấu trúc Bước 4: nuôi hoạt hóa tế bào tái cấu trúc môi trường in vitro Bước 5: cấy phôi vào bò định mang thai Các tế bào thu từ thể khác nên chúng giai đoạn khác Do cần phải tác động để đưa chúng giai đoạn tạo phù hợp chu trình, góp phần tái tạo lại cấu trúc nhanh chóng, tránh việc loại thải nhân Sau tế bào hịa hợp thành cơng cần phải ni dưỡng đến giai đoạn phơi có khả làm tổ, định vị tử cung thú mang thai Đồng thời thú mang thai cần đưa giai đoạn mang thai để tạo điều kiện cho phơi làm tổ sừng tử cung Hình 3.2: Nhân hút vào micropipet 14 Hình 3.4: Tái kết cấu shock điện Hình 3.6: Phơi bắt đầu phân chia Hình 3.5: 30 phút sau hoạt hóa shock điện 15 3.2.1 Dịng hóa từ tế bào sinh dưỡng trưởng thành Hình 3.7: Q trình dịng hóa từ tế bào soma chuột (nguồn: Nguyễn Thanh Bình, 2009) Tế bào trưởng thành sử dụng tế bào cơ, tế bào tuyến vú, tế bào da, macrophage, tế bào sertoli, tế bào tổ chức nội quan, tế bào lympho; tế bào giai đoạn G0 tự nhiên Nhân tiêm trực tiếp vào tế bào noãn lấy nhân 16 giai đoạn phân bào II với máy vi thao tác piezo, khơng cần sử dụng sóng siêu âm giảm thiểu chấn thương cho nhân tế bào cho tế bào nhận Nếu quy trình công nghệ dùng kỹ người thực phịng thí nghiệm khơng có sai biệt việc dùng động vật cho nhân hay loại tế bào cho nhân Trong so sánh khả khác loại tế bào cho việc tái lập dịng hóa, Cindy Tian ctv (2003) so sánh thành cơng dịng hóa loại tế bào: tế bào trứng, tế bào tuyến vú, tế bào sợi (fibroblast) da Tuy khơng có khác biệt nhiều kết tế bào cho nhân tế bào cumulus có khả sinh sản cao Điều lý giải DNA loại tế bào bị ảnh hưởng chuyển nhân Cindy Tian ctv (2003) nhận thấy dùng tế bào thai sơ sinh có ảnh hưởng việc chuyển nhân Tuy nhiên, dùng tế bào động vật trưởng thành (2-16 năm tuổi) có khác biệt Theo trích dẫn Cindy Tian ctv (2003), Kato ctv (1999) cho tế bào động vật trưởng thành có tỷ lệ xảy thai cao có biến dị cao tế bào động vật non tế bào phơi Bảng 3.1: kỹ thuật dịng hóa từ tế bào soma Thời gian Ngày Các bước tiến hành Buồng trứng lấy từ lị mổ Hố chất, mơi trường Bảo quản vận chuyển nước muối sinh lý nhiệt độ 250C Thu TB trứng từ buồng trứng Trong Mt m–PBS + 3% CS Ni chín invitro TB trứng Mt TCM-199 + 5% CS (38.50C; 5% CO2; độ ẩm 98%) 20 Ngày 18-22 22-24 Loại bỏ tế bào cumulus Mt D-PBS + 5% Hyaluronidase Trích màng suốt Mt TCM – 199 + 5% CS Loại bỏ nhân m – PBS 5µg/ml CytochalasinB +20% CS Chuẩn bị TB cho Tách TB cho (Trypsin 0,5%) 17 Bơm TB soma vào khoảng trống màng noãn hoàng Mt TCM-199 + 5% CS (pervitelline space) TB trứng chín loại bỏ nhân Ngày 24-25 Xung điện Dịng DC 15-25V/ 150µm Cố định TB trứng bơm TB soma hai đầu điện cực Hoạt hố (Ca lonophore) m-PBS +5µM lonophore + 0,1% PVA Cycloheximide TCM-199 + 10µg/ml Cycloheximide +5% CS (38.50C; 5% CO2; độ ẩm 98% giờ) 30 Nuôi ống nghiệm CR1aa +5% CS (38.50C; 5% CO2; độ ẩm 98% 7-9 ngày) Ngày Kiểm tra phát triển phôi Tỷ lệ phôi tốt Ngày 6- Kiểm tra phát triển đến phôi Tỷ lệ phôi nang nang (nguồn: Nguyễn Thị Thoa, 2004) 18 3.2.2 Dòng hóa từ tế bào phơi thai Quy trình dịng hóa từ tế bào phơi gần giống quy trình dịng hóa từ tế bào trưởng thành Quy trình bao gồm giai đoạn chuẩn bị, xử lý tế bào nhận nhân; chuẩn bị, xử lý tế bào cho nhân; chuyển nhân từ tế bào cho vào tế bào nhận tái kết cấu; ni hoạt hóa tế bào tái kết cấu môi trường in vitro; cấy phơi vào bị định mang thai Sự khác biệt chủ yếu tế bào cho tế bào phôi Vào ngày thứ 6-8 kể từ thụ tinh, phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang phôi nang mở rộng (dãn nở) Căn vào giai đoạn phát triển, hình thái cấu trúc tế bào phôi để đánh giá phân loại chất lượng phôi theo quy định Những phôi tốt đảm bảo chất lượng chọn để làm tế bào cho nhân Tế bào phôi thường sử dụng giai đoạn phôi từ 16 đến 32 tế bào tốt Nếu sử dụng tế bào giai đoạn phân chia nhiều tỷ lệ thành công giảm xuống Ngay trước chuyển nhân, màng suốt bỏ cách xử lý với hóa chất phơi dâu ủ trong môi trường đặc biệt để dễ tách tế bào Nếu khơng tách đủ tế bào phơi, tách phương pháp học với pipet nhỏ dễ gây tổn thương cho tế bào phôi 19 Bảng 3.2: Kỹ thuật dịng hóa từ tế bào phơi Thời gian Ngày Các bước tiến hành Buồng trứng bò lấy từ lò mổ Hố chất, mơi trường Bảo quản vận chuyển nước muối sinh lý nhiệt độ 250C Lấy TB trứng từ buồng trứng Mt D –PBS + 3% CS Ni chín tế bào trứng invitro Mt TCM-199 + 5% CS (38.50C; 5% CO2; độ ẩm 98%) 20 Ngày 18-22 Loại bỏ TB cumulus D-PBS+5% Hyaluronidase Trích màng suốt Mt TCM – 199 + 5% CS Loại bỏ nhân m – PBS 5µg/ml CytochalasinB +20% CS 24 Hoạt hoá (Ca lonophore) Ngày m-PBS +5µM lonophore + 0,1% PVA 24-25 Hoạt hố xung điện Dòng DC 45V/mm, 10 phút, lần Cycloheximide Mt TCM-199 + 10µg/ml Cycloheximide + 5% CS (38.50C; 5% CO2; độ ẩm 98% giờ) Chuẩn bị TB cho (TB phôi) Phôi giai đoạn 16-32 TB Tách riêng TB 28-30 Bơm tế bào phôi vào trứng loại bỏ nhân Mt TCM-199 + 10µg/ml Cycloheximide + 5% CS 30 Xung điện: cố định TB trứng (đã Dòng DC 68V/mm; khoảng 10 phút, bơm TB soma) hai lần đầu điện cực Nuôi phôi ống nghiệm TCM-199+5%CS (38.50C; 5% CO2; độ ẩm 98% 12 giờ) CR1aa + 5%CS (38,50C; 5% CO2; độ ẩm 98%; 7-9 ngày) 20 Ngày Quan sát hình thái học phơi Tỷ lệ phơi tốt Kiểm tra phát triển đến phôi Tỷ lệ phôi nang Ngày 6-9 nang (nguồn: Nguyễn Thị Thoa, 2004) So sánh hiệu qui trình Embryo cloning Tế bào giai đoạn Tế bào cho phôi dâu phôi nang 21 Somatic cloning Tế bào giai đoạn túi phơi/ tế bào biệt hóa Ni cấy tế bào cho Khơng Có Đồng pha tế bào Hoạt hóa trứng Cảm ứng tế bào cho Số lượng tế bào cho Ít, giới hạn Nhiều, đa dạng Khả thành công Cao Thấp Kiểu hình clone Khơng biết Biết 3.3 Tiêu chuẩn chọn thú cho phôi, thú nhận phôi khả áp dụng dịng hóa Chọn cho phơi  Bị chọn có giá trị di truyền cao hay bị vơ sinh  Phải tháng từ sinh bê lần cuối  Nó phải có cấu trúc chức sinh sản bình thưịng  Nó phải khỏe mạnh, thể trạng thể tốt tăng trọng Chọn nhận phơi  Bị hậu bị bị cịn tuổi  Nó phải có cấu trúc chức sinh sản bình thưịng  Nó phải đẻ tháng trước  Nó phải trưởng thành kích thước thể đủ lớn, cần phải biết giống loại phơi cấy, có khả mang thai đến lúc đẻ đẻ bình thường 22  Nó phải khơng có bệnh tật tăng trọng bình thường Khả áp dụng dịng hóa bị Trong cơng tác giống:  Tạo đời bò đực ưu việt  Tạo bò xuất sắc để cải thiện di truyền  Dịng hóa áp dụng bị thịt  Tăng số đời bị có tiềm di truyền siêu trội  Tăng tốc độ kiểm tra đời sau  Giảm khoảng cách hệ cách gây rụng trứng nhiều bò hậu bị trước lúc thành thục tính cấy phôi cho nhận trưởng thành Điều làm tăng tốc độ chọn lọc di truyền  Bảo tồn thú quý Trong công tác nghiên cứu  Nghiên cứu bệnh lý  Nghiên cứu hành vi cung cấp loại thức ăn khác cho thú 3.4 Các sản phẩm dòng hóa bị Ngày 26 tháng 11 năm 2010, Cơ quan Tiêu chuẩn Thực phẩm vương quốc Anh xác định sản phẩm từ động vật nhân bản, chẳng hạn thịt, sữa, an toàn (http://www.digitaljournal.com/article/300722) Cơ quan An toàn thực phẩm châu Âu EFSA (European Food Safety Authority) đưa đánh giá động vật nhân bản, dựa đời vật để đánh giá sức khỏe vật tiêu thụ (EFSA, 2008) Mặc dù 1/3 bê SCNT chết thời kỳ bụng mẹ chết lưu chết non, tỉ lệ chết bệnh tật bò 23 SCNT cịn sống sót 200 ngày sau sinh tương đồng với bị ni thơng thường Con cháu bị SCNT có tỉ lệ chết giống bị thơng thường ni suốt đời Kết cho thấy bò SCNT sống đến tuổi trưởng thành khỏe mạnh, bình thường cháu tương tự (Shinya WATANABE, Takashi NAGAI, Animal Science Journal Volume 80, Issue 3, pages 233– 238, June 2009) Một số ứng dụng yêu cầu nuôi cấy tế bào cho số lượng lớn để sản xuất dòng chuyển đổi gen Ví dụ sản xuất protein dược protein q khác sữa ( ß casein ƙ - casein)  Ức chế tạo beta lactoglobulin sữa bò  Tăng lượng casein sữa  Thay đổi thành phần béo sữa  Giảm lactose sữa  Nâng cao lượng lactoferrin lysozyme Hiện người ta đưa ADN ngoại lai vào bao noãn thụ tinh để tạo vật chuyển gen Ví dụ gien người mã hóa cho yếu tố đơng máu VIII, gắn vào vùng sản xuất protein tạo sữa cừu Gen tái tổ hợp tiêm vào phôi cừu, kết cừu chuyển gien có khả sản xuật nhân tố đông máu cho người sữa Đã tạo hai bị cho sản lượng sữa 70.000 kg năm Tạo dịng gia súc chuyển đổi gen có sức đề kháng bệnh, tạo sản phẩm đặc trưng mai thơm ngon, chất nhân tạo, thịt có hương vị thơm ngon protein công nghiệp 24 Phần KẾT LUẬN 4.1 Qui trình thực Quy trình dịng hóa bao gồm giai đoạn: chuẩn bị, xử lý tế bào nhận nhân, chuẩn bị, xử lý tế bào cho nhân, chuyển nhân từ tế bào cho vào tế bào nhận tái kết cấu, ni hoạt hóa tế bào tái kết cấu môi trường in vitro, cấy phơi vào bị định mang thai Sự khác dịng hóa từ tế bào trưởng thành tế bào phôi chủ yếu nguồn gốc tế bào cho nhân Hiệu qui trình phụ thuộc vào khác quy trình phịng thí nghiệm, ni cấy, chuyển nhân, vi công cụ kỹ thao tác Hiệu sử dụng tế bào trưởng thành có phần cao dùng tế bào phơi 4.2 Các yếu tố ảnh hưởng Sự thành công kỹ thuật dịng hóa hay chuyển cấy phơi (NT) phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm phương pháp cung cấp mơi trường cho nỗn bào trích xuất (Galli cộng sự, 2002; Ideta cộng sự, 2005), thời gian kích hoạt nỗn (Akagi cộng sự, 2003.),phương pháp nuôi cấy phôi NT (Mastromonaco et al, 2004.) giai đoạn chu kỳ tế bào tế bào trứng thú cho thời điểm trích phơi (Kasinathan cộng sự, 2001; Tani cộng sự, năm 2001; Wells et al, 2003; Urakawa et al, 2004) Các giai đoạn chu trình tế bào tế bào thú cho phôi đặc biệt quan trọng cho thành công NT (Campbell Wilmut, 1998) Serum đói thường sử dụng để đồng hóa chu trình tế bào tế bào thú cho phôi giai đoạn (G0/G1) Serum đói thời gian dài làm giảm khả sống sót tế bào apoptosis tăng (Kues cộng sự, 2000; Lanza cộng sự, 2000) Tuy nhiên, để phát triển đầy đủ phải cải thiện tế bào giai đoạn G1 bò thay tế bào giai đoạn G0/G1 sử dụng tế bào thú cho phôi gia súc (Kasinathan cộng sự, 2001; Urakawa et al.2004), lý cho việc cải 25 tiến không rõ ràng Tỷ lệ phá thai cao thai phát triển bất thường giai đoạn phôi thai NT cách sử dụng tế bào G0/G1 có liên quan đến tỷ lệ hình thành đĩa phơi thai thấp, phát triển bất thường trophectoderm tử cung ngày 14 tuổi thai (Ideta cộng sự, 2007a.) Ngồi ra, phơi G1-NT dẫn đến tỷ lệ mang thai cao xác suất đẻ cao (Urakawa et al, 2004.) Kết Ideta cộng năm 2010 cho phôi NT tái tạo tế bào giai đoạn G1 có khả phát triển cao từ thời điểm chuyển phôi ngày 50 tuổi thai 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thanh Bình, 2006, chương II: Germ cell, fertilization and practical applications of micro-insemination Đại học Nông Lâm TP.HCM, Trần Thị Dân Dương Nguyên Khang, 2006 Sinh lý vật nuôi Nhà xuất nông nghiệp, trang 302-308, TP Hồ Chí Minh Trần Thị Dân, 2006, Công nghệ sinh học chăn nuôi gia súc, Chương 10, Nhà xuất nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh Chung Anh Dũng, 2011, Nhân động vật lợi ích, http://www.iascnsh.org/TrangCh%E1%BB%A7/tabid/36/EntryID/220/Default.aspx Nguyễn Thị Loan, 2004 Một số kỹ thuật cấy truyền phơi bị Nhật Bản, www.vcn.vnn.vn/Post/khoahoc/Nam2004/kh_5_9_2004_9.doc Web viện chăn nuôi http://www.vcn.vnn.vn/PrintPreview.aspx?ID=4153 http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Gi%E1%BA%A3i_Nobel_sinh_l%C3%BD_h% E1%BB%8Dc_hay_y_h%E1%BB%8Dc_2001 Cindy Tian X , Chikara Kubota, Brian Enright, Xiangzhong Yang “Reproductive Biology and Endocrinology Cloning animals by somatic cell nuclear transfer – biological factors” Center for Regenerative Biology/Department of Animal Science, University of Connecticut, Storrs, Connecticut 06269-4243, USA, 13 November 2003 Ideta cộng sự, 2010, comparision of early development in utero of cloned fetuses derived from bovine fetal fibroblasts at the G1 and G0/G1 phases 10 Shinya WATANABE, Takashi NAGAI, Animal Science Journal Volume 80, Issue 3, pages 233–238, June 2009 27