Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α glucosidase từ chủng aspergillus niger

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÙI HỒNG SƠN u iệ il Tà NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT ỨC CHẾ -GLUCOSIDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER U VN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÙI HỒNG SƠN u iệ il Tà NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER VN U KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: TS ĐỖ THỊ TUYÊN ThS ĐỖ THỊ QUỲNH HÀ NỘI - 2021 LỜI CẢM ƠN Trước tiên em xin cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Trưởng phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy truyền cảm hứng, tận tình hướng dẫn, đưa góp ý tạo điều kiện thuận lợi kinh phí để thực đề tài khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tới ThS Đỗ Thị Quỳnh, Bộ môn Y Dược học sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đưa lời khuyên quý báu, kinh nghiệm nghiên cứu giúp đỡ em tận tình thời gian làm khóa luận Tiếp đến em xin cảm ơn tập thể anh chị, cán Phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học hướng dẫn, giúp đỡ tận tình cho em trình thực nghiệm vừa qua, chia sẻ kinh nghiệm đáng quý, có ứng dụng thực tế cao thí nghiệm Tà iệ il Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô chủ nhiệm thầy cô môn Y Dược học sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội suốt u khoảng thời gian năm vừa cung cấp cho thân em nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu, quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập U VN Đồng thời em xin cảm ơn tới người thân gia đình bạn bè ln động viên tiếp thêm sức mạnh cho tơi lúc khó khăn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2021 Sinh viên Bùi Hồng Sơn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ AGIs Các chất ức chế α-glucosidase DC Đối chứng DNJ 1-deoxynojirimycin ĐTĐ Đái tháo đường HPLC Sắc lý lỏng hiệu cao IC50 Nồng độ ức chế 50% IDF Hiệp hội Đái tháo đường giới LC/MS Sắc ký lỏng khối phổi Sắc ký lớp mỏng u VN UV iệ TLC Mật độ quang học mẫu bước sóng 405nm il OD405 Tà ADA Tia tử ngoại U DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số hoạt chất ức chế α-glucosidase từ vi sinh vật 15 Bảng 2.1 Thiết bị thí nghiệm 22 Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng 23 Bảng 2.3 Thành phần loại đệm dung dịch 24 Bảng 2.4 Tính chất đặc trưng đầu dò hấp thụ UV đầu dò khối phổ 31 Bảng 3.1 Quá trình tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase dung môi .33 Bảng 3.2 Tóm tắt trình tinh thu nhận hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A niger VTCC 031 37 u iệ il Tà Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính nồng độ khác dịch chiết n-butanol 40 Bảng 3.4 Kết thử hoạt tính nồng độ khác mẫu tinh cuối .42 U VN DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế tác dụng thuốc điều trị ĐTĐ tuýp Hình 1.2 Lược đồ lựa chọn thuốc phương pháp điều trị ĐTĐ tuýp Hình 1.3 Cấu trúc không gian 3D enzyme α-glucosidase GH13 10 Hình 1.4 Cấu trúc khơng gian 3D enzyme α-glucosidase GH31 11 Hình 1.5 Cơ chế hoạt động chất ức chế enzyme α-glucosidase ruột non 12 Hình 1.6 Cấu trúc acarbose, miglitol, voglibose DNJ 13 Hình 1.7 Cấu trúc dẫn xuất monosaccharide 14 Hình 1.8 Đặc điểm hình thái bào tử sau nuôi cấy ngày chủng A niger VTCC 031 đĩa thạch 18 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 25 Tà Hình 2.2 Các bước tiến hành tinh hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A niger VTCC 031 27 iệ il Hình 3.1 Thu hoạch bình ni cấy chủng A niger 32 u Hình 3.2 Khả tách chất mẫu dịch chiết sử dụng hệ dung môi khác 34 VN U Hình 3.3 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh phân đoạn qua cột silica gel lần thứ 35 Hình 3.4 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh phân đoạn từ 17 đến 21 sau qua cột silica gel lần thứ 36 Hình 3.5 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh phân đoạn qua cột silica gel lần thứ hai 37 Hình 3.6 Kiểm tra độ tinh trình TLC 38 Hình 3.7 Kiểm tra độ tinh HPLC LC/MS 39 Hình 3.8 Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase dịch chiết nbutanol 41 Hình 3.9 Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase acarbose tinh khiết (Sigma) 41 Hình 3.10 Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu tinh cuối 42 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đái tháo đường 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh biến chứng 1.1.4 Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường 1.2 Enzyme α-glucosidase 1.2.1 Giới thiệu chung -glucosidase 1.2.2 Cấu trúc -glucosidase 10 1.2.3 Cơ chế hoạt động enzyme thể 11 Tà 1.3 Chất ức chế α-glucosidase 12 iệ il 1.3.1 Giới thiệu chế hoạt động chất ức chế enzyme α-glucosidase 12 1.3.2 Phân loại chất ức chế enzyme α-glucosidase 14 u VN 1.3.3 Nguồn gốc chất ức chế enzyme α-glucosidase 15 U 1.4 Giới thiệu chủng nấm sợi Aspergillus niger 18 1.5 Tình hình nghiên cứu hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus nước quốc tế 20 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 2.3 Thiết bị phòng thí nghiệm hóa chất 22 2.4 Môi trường nuôi cấy 24 2.5 Quy trình tiến hành nghiên cứu 24 2.6 Phương pháp nghiên cứu 25 2.6.1 Xác định hoạt tính chất ức chế α-glucosidase 25 2.6.2 Tách chiết, tinh hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ dịch nuôi cấy 26 2.6.3 Xác định giá trị IC50 30 2.6.4 Kiểm tra độ tinh sắc ký lỏng hiệu cao sắc ký lỏng khối phổ 30 2.6.5 Phương pháp xử lý số liệu 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32 3.1 Kết tinh hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng A niger VTCC 031 32 3.1.1 Kết trình tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase với dung môi 32 3.1.2 Nghiên cứu chọn lựa hệ dung môi pha động chạy sắc ký cột 34 3.1.3 Kết tinh cột sắc ký silica gel 60 35 3.2 Xác định IC50 dịch chiết n-butanol mẫu tinh cuối 40 KẾT LUẬN 44 Tà ĐỀ XUẤT 45 u iệ il TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 U VN ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh đái tháo đường coi vấn đề sức khỏe toàn cầu Theo báo cáo Liên đoàn Đái tháo đường quốc tế (IDF), số lượng bệnh nhân đái tháo đường tồn giới dự kiến gần 700 triệu người vào năm 2045 Tại Việt Nam, theo ước tính Bộ Y tế, người tuổi từ 20 - 79, bệnh đái tháo đường tăng khoảng 78,5% giai đoạn 2017 - 2045 (từ 3,53 triệu bệnh nhân năm 2017 tăng lên 6,3 triệu người mắc đái tháo đường vào năm 2045) Không thế, ảnh hưởng nghiêm trọng đại dịch toàn cầu COVID-19, trình điều trị cho bệnh nhân đái tháo đường trở nên khó khăn Các nghiên cứu gần cho thấy bệnh nhân đái tháo đường kiểm soát đường huyết mắc COVID-19 có tỷ lệ tử vong cao khoảng lần thời gian nằm viện lâu so với bệnh nhân không bị đái tháo đường [14, 64] Một nhóm thuốc sử dụng để điều trị đái tháo đường nhóm chất ức chế α-glucosidase, sử dụng phổ biến lâm sàng điển hình như: il Tà acarbose, voglibose, miglitol Nhóm thuốc thường sử dụng phối hợp với thuốc đầu tay khác metformine, nhóm đồng vận thụ thể GLP-1 ,… cho kết điều trị tốt nhiên chúng ghi nhận tác dụng không mong muốn u iệ như: đau đầu, ngủ, buồn nôn, đầy tiêu chảy [15] Vì việc tìm kiếm hợp chất an toàn thuận tiện cho việc sản xuất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Hiện nay, nguồn nguyên liệu phong phú nguồn từ chủng vi sinh vật chúng có quần thể vơ rộng lớn, phát triển mạnh không gây ô nhiễm môi trường xung quanh Đặc biệt chủng nấm Aspergillus với nhiều nghiên cứu gần cho thấy ứng dụng chúng việc tổng hợp hoạt chất thứ cấp hoạt tính sinh học dùng để điều trị bệnh [16, 31, 39] Chính vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với đề tài: “Nghiên cứu điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger” với U VN mục tiêu sau: - Mô tả kết tách chiết, tinh hoạt chất chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger; Xác định độ tinh giá trị IC50 dịch chiết sản phẩm cuối tinh chứa hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đái tháo đường 1.1.1 Khái niệm Đái tháo đường (ĐTĐ) hội chứng rối loạn chuyển hóa mãn tính, phức tạp đặc trưng tăng glucose máu tụy không sản xuất đủ insulin thể sử dụng insulin không hiệu hai [43] Bệnh lý gây tổn thương lâu dài nhiều hệ quan như: tổn thương võng mạc, tim, thận, não hệ thống mạch máu với bệnh điển bệnh thận tiểu đường, bệnh võng mạc đái tháo đường, suy gan, tổn thương hệ thần kinh bệnh nhân không phát hiện, điều trị tuân thủ điều trị nghiêm ngặt [15] 1.1.2 Phân loại Theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) năm 2021, ĐTĐ có loại sau: ĐTĐ tuýp 1, ĐTĐ tuýp 2, ĐTĐ thai kỳ, ĐTĐ nguyên nhân khác [11] Tà Đái tháo đường tuýp il ĐTĐ tuýp 1, trước gọi ĐTĐ tuổi vị thành niên, gây u iệ trình tự miễn làm tổn thương tế bào beta (β) đảo tụy dẫn đến tình trạng giảm sản xuất tuyệt đối insulin Về mặt dịch tễ học, chiếm 5-10% số người mắc ĐTĐ U VN Đái tháo đường tuýp ĐTĐ 2, hay cịn gọi ĐTĐ khơng phụ thuộc insulin, ĐTĐ người lớn, chiếm khoảng 90-95% số người mắc ĐTĐ Bệnh gây tảng thể giảm tiết insulin tương đối tế bào β tuyến tụy hình thành kháng insulin tế bào Hầu bệnh nhân không cần điều trị liệu pháp insulin đời Đái tháo đường nguyên nhân khác ĐTĐ nguyên nhân khác, hay gọi đái tháo đường thứ cấp, gồm: hội chứng đái tháo đường đơn gen (gồm đái tháo đường khởi phát trẻ nhỏ đái tháo đường sơ sinh), bệnh tụy ngoại tiết, bệnh nội tiết, cảm ứng thuốc, đái tháo đường qua trung gian miễn dịch đái tháo đường hội chứng di truyền Đái tháo đường thai kỳ ĐTĐ thai kỳ - loại rối loạn chuyển hóa phổ biến phụ nữ mang thai - định nghĩa tượng rối loạn dung nạp glucose, phát vào giai glucosidase Vì vậy, cần kiểm tra lại lần độ tinh phân đoạn từ 17 đến 21, tiếp tục tiến hành chạy sắc ký mỏng với hàm lượng mẫu 20 µl Kết chạy TLC trình bày hình 3.4 Nhận thấy cịn lượng tạp nhỏ phân đoạn tiến hành gộp phân đoạn từ 17 đến 21 cho chạy cột sắc ký silica gel 60 lần thứ Tà iệ il Hình 3.4 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh phân đoạn từ 17 đến 21 sau qua cột silica gel lần thứ u ( DLC L1: mẫu trước lên cột lần thứ nhất; 17-21: phân đoạn sau tinh qua cột silica gel lần 1) U VN Gộp phân đoạn từ 17 đến 21 (5 ml) đưa lên cột lần thứ hai, với việc sử dụng hệ dung môi n-butanol : ethyl acetat : acid acetic : H2O với tỉ lệ 3:1:1:1 nhằm làm mẫu phân đoạn Kết thu 30 phân đoạn Các phân đoạn chạy TLC để xác định phân đoạn có độ cao, đồng thời thử hoạt tính phân đoạn tìm Kết chạy TLC trình bày hình 3.5 36 Hình 3.5 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh phân đoạn qua cột silica gel lần hai (DLC L2: mẫu trước lên cột lần hai; 1-29: phân đoạn sau tinh qua cột silica gel lần 2) il Tà Sau kiểm tra phân đoạn qua cột lần 2, nhận thấy có phân đoạn từ 2530 sạch, kết chạy TLC xuất vết chất có hoạt tính chất tương đối rõ Từ tiến hành gộp phân đoạn để thử hoạt tính ức chế α-glucosidase u iệ quay thu cặn chiết để xác định IC50 bước đầu xác định cấu trúc hoạt chất quan tâm Kết tổng quát hiệu suất thu hồi hoạt tính ức chế enzyme α- U VN glucosidase mẫu từ dịch nuôi cấy đến sản phẩm tinh cuối trình bày bảng 3.1 Bảng 3.2 Tóm tắt trình tinh thu nhận hoạt chất ức chế αglucosidase từ chủng A niger VTCC 031 Mẫu Khối lượng cắn khô (g) Hiệu suất thu hồi (%) Hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 3,8 100 85,19 Dịch chiết n-butanol 1,362 35,84 42,9 Dịch chiết CHCl3 - MeOH 1,04 27,36 28,8 0,0044 0,116 45,75 Dịch lên men Mẫu tinh cuối sau qua cột silica gel 37 Hình 3.6 Kiểm tra độ tinh trình TLC (1-dịch lên men, 2- dịch chiết n-butanol, 3-dịch chiết CHCl3-MeOH, 4-phân đoạn 25 lần 1, 5-phân đoạn 30 lần 2) u iệ il Tà Như vậy, mẫu tinh thu sau dịch lên men từ chủng A niger VTCC 031 chiết hai bước dung môi với n-butanol chiết CHCl3: MeOH (1:1), cặn chiết hòa tan DMSO đưa qua cột silicagel lần sử dụng hệ dung môi n-butanol: ethyl acetat: acid acetic: H2O với tỉ lệ 3:1:1:1, cho vết hoạt chất đậm nét với giá trị Rf = 0,52 với hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase đạt 45,75%, với hiệu suất 0,116% VN U Kết thử hoạt tính ức chế α-glucosidase dịch ni cấy, dịch chiết nbutanol tương đồng với báo cáo Phạm Minh Hồng năm 2020 nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng A niger tổng hợp hoạt chất ức chế αglucosidase [7] Tuy nhiên vị trí vết hoạt chất băng TLC có khác biệt chúng tơi xác định Rf = 0,52 Phạm Minh Hồng xác định Rf = 0,82 sử dụng hệ dung môi n- butanol: axit axetic: H2O theo tỉ lệ (3:1:1) Sự chênh lệch hai giá trị Rf khác hệ dung môi chọn làm pha động thực TLC Kiểm tra độ sản phẩm tinh cuối đầu dị UV HPLC kết cho thấy mẫu thử đến chất thời gian lưu tương ứng từ 20,273 phút, 21,368 phút 22,975 phút (vẫn tạp bên cạnh hoạt chất cần tinh sạch) phổ khối LC/MS cho khối lượng chất tương ứng 299,0 m/z, 447,1 m/z 512,4 m/z (Hình 3.7) 38 A u iệ il Tà U VN B Hình 3.7 Kiểm tra độ tinh HPLC (A) LC/MS (B) Lý giải thích ba chất có độ tương đồng lớn độ phân cực dẫn đến chúng di chuyển sát trình lên cột sắc tác động dung mơi pha động (nhìn rõ kết HPLC) Điều cho thấy khả hệ dung môi sử dụng chưa phải hệ dung môi lý tưởng để tách chất dịch chiết để thu hồi hoạt chất tinh Ngoài chất cịn tạp nhỏ, cần xem xét tinh tiếp tục hạn chế tác nhân nhiễm tạp từ mơi trường q trình tinh Đề xuất giải pháp để tiếp tục tinh tiếp tục sắc ký cột silica gel với hệ dung mơi pha động thích hợp 39 3.2 Xác định IC50 dịch chiết n-butanol mẫu tinh cuối 3.2.1 IC50 dịch chiết n-butanol Từ 100 mg cắn khô sau cất cô quay dịch chiết n-butanol pha thành mẫu S1 đến S10 với nồng độ khác 10, 20, 30, …, 100 mg/ml dung môi methanol Các mẫu xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase Kết thể Bảng 3.2 Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính nồng độ khác dịch chiết n-butanol Nồng độ (mg/ml) S1 10 6,98 S2 20 6,98 S3 30 10,47 S4 40 18,60 S5 50 29,07 S6 29,07 S7 70 32,56 S8 80 S9 90 10 S10 100 il Tà Mẫu iệ Hoạt tính ức chế STT 60 α-glucosidase (%) u U VN 40,70 43,02 53,49 40 60.00 y = 0.5236x - 1.7054 R² = 0.9703 Hoạt tính ức chế (%) 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 20 40 60 80 100 120 Nồng độ (mg/ml) Hình 3.8 Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase dịch chiết n-butanol Tà y = 0.6537x + 29.629 R² = 0.9848 il 80 u iệ 60 VN 40 U Hoạt tính ức chế (%) 100 20 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.9 Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase acarbose tinh khiết (Sigma) 3.2.2 IC50 sản phẩm tinh cuối Các phân đoạn có hoạt tính ức chế α-glucosidase sau qua cột silica gel lần gộp lại cất cô quay thu cặn Từ cắn khô sau cất cô quay sản phẩm tinh cuối cùng, tiến hành pha thành mẫu S1 đến S5 với nồng độ tương ứng 500, 1000, 1500, 2000, 2500 µg/ml methanol Các mẫu xác 41 định hoạt tính ức chế α-glucosidase Kết xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase thể Bảng 3.3 Bảng 3.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase nồng độ khác mẫu tinh cuối Hoạt tính ức chế STT Mẫu Nồng độ (µg/ml) S1 500 2,3 S2 1000 6,40 S3 1500 9,15 S4 2000 13,95 S5 2500 14,90 α-glucosidase (%) Từ kết trên, tiến hành dựng đường chuẩn thể cho hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase mẫu tinh cuối (Hình 3.10) xác 31,16 g/ml (Hình 3.9) iệ il Tà định giá trị IC50 = 7649 g/ml so IC50 acarbose tinh khiết (Sigma) 18 u y = 0.0066x - 0.485 R² = 0.9715 VN 16 U Hoạt tính ức chế (%) 14 12 10 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.10 Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu tinh cuối Mẫu tinh cuối hoạt chất ức chế α-glucosidase từ dịch nuôi cấy chủng A niger VTCC 031 có giá trị IC50 7649 g/ml, cao lớn so với đối chứng dương acarbose tinh khiết Điều cho thấy, khả ức chế α-glucosidase 42 mẫu tinh chưa cao, dịch nuôi cấy ban đầu tiềm hoạt tính ban đầu đặt đến 85,19% Điều mơ hình tinh có hiệu suất chưa cao, khả tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase thấp, bị thất q trình tinh Bên cạnh đó, mẫu cịn chứa vài chất tạp điều ảnh hưởng đến giá trị IC50 Kết phù hợp với số nghiên cứu giới Các chất ức chế αglucosidase khác tinh từ chủng khác có giá trị IC50 khác giá trị IC50 phụ thuộc vào độ mẫu chứa hoạt chất ức chế Các mẫu có độ tinh hoạt chất ức chế α-glucosidase cao giá trị IC50 nhỏ Thật vậy, hoạt chất ức chế α-glucosidase cao chiết ethyl acetate từ chủng Streptomyces sp IPBCC.b.15.1539 có giá trị IC50 đạt 0,047 μg/mL [34], hoạt chất ức chế AGIs từ chủng Streptomyces sp S2A đạt giá trị IC50 21,17 g/mL [36] Kang cộng (2013) báo cáo giá trị IC50 peptide tinh từ u iệ il Tà chủng A oryzae N159-1 đạt 3,1 mg/mL [36] Dewi cộng (2016) phân lập rubrofusarin, hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ môi trường nuôi cấy chủng Aspergillus aculeatus, chất tiềm điều trị ĐTĐ thể qua hoạt tính ức chế α-glucosidase động vật có vú với IC50 đạt 92,70 µg/mL [16] Ngồi cịn có chất thể vượt trội acarbose, nghiên cứu xác định cấu trúc hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus flavus QQSG-3, có chất đạt hoạt tính sinh học ức chế α-glucosidase với IC50 tương ứng VN U 4,5 – 3,1– 1,5 – 2.3 µM IC50 acarbose 840,2 µM [59] 43 KẾT LUẬN Từ kết quả, số liệu thu được, đưa kết luận sau: - Chủng A niger VTCC 031 có khả sinh tổng hợp chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase cao đạt 85,19% đo dịch lên men Đã lựa chọn hệ dung môi pha động lên cột tốt n-butanol : acid acetic : ethyl acetate : H2O với tỉ lệ 3:1:1:1 - Bước đầu xây dựng quy trình tinh với bước chính: chiết với dung mơi n-butanol sau chiết với hệ dung mơi chloroform: methanol tỉ lệ 1:1 (v/v); dịch chiết tinh qua cột silica gel 60 Sản phẩm tinh sơ có hệ số Rf = 0,52 sắc ký lớp mỏng, hoạt tính ức chế α-glucosidase đạt 45,75% với hiệu suất thu hồi 0,116% Qua TLC, độ mẫu tinh cuối tăng lên đáng kể so với dịch lên men ban đầu nhiên chút chất tạp kiểm tra HPLC LC/MS - Xác định giá trị IC50 dịch chiết n-butanol mẫu sơ tương ứng 98,74 mg/ml 7,648 mg/ml so với hoạt chất acarbose (Sigma) 31,16 µg/ml u iệ il Tà U VN 44 ĐỀ XUẤT - Nghiên cứu lựa chọn hệ dung môi pha động tối ưu để chạy cột sắc ký silica gel nhằm thu hoạt chất tinh khiết - Xác định cấu trúc hoạt chất ức chế α-glucosidase tạo tiền đề cho bào chế tạo sản phẩm cho trình thử nghiệm tiền lâm sàng, với mục tiêu nghiên cứu thuốc điều trị bệnh đái tháo đường u iệ il Tà U VN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt u iệ il Tà Châu Mỹ Chi (2021), "Nghiên cứu biến chứng mắt bệnh nhân đái tháo đường Bệnh viện Đa khoa Trung tâm Tiền Giang", Vietnam Journal of Diabetes and Endocrinology, 43, 11-19 Đinh Thị Minh Hảo and Trần Thị Anh Thư (2020), "Bệnh thận đái tháo đường: vấn đề cần quan tâm", Vietnam Journal of Diabetes and Endocrinology, (38), 12-17 Đỗ Q Hải (2006), Giáo trình cơng nghệ sinh học enzyme, Đại học Khoa học - Đại học Huế, Việt Nam Đỗ Thị Tuyên, Vũ Văn Hạnh, Vũ Thị Thu Hằng, Đinh Kha Trình, and Đinh Thị Quyên (2013), Tách chiết, tinh hoạt chất DNJ (1-Deoxynojirimycin) ức chế αglucosidase từ chủng B subtilis VN9 phân lập Việt Nam., Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Hà Nội Hội Nội tiết - Đái tháo đường Việt Nam (2020), "Hướng dẫn chẩn đoán điều trị Đái tháo đường Hội nội tiết - Đái tháo đường Việt Nam" Mai Văn Hiên (2020), Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp, tinh bước đầu xác định cấu trúc hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp phân lập Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam Phạm Minh Hồng (2020), Sàng lọc nghiên cứu điều kiện để nâng cao khả sinh tổng hợp hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A niger Graduation thesis of Vietnam National University, Việt Nam Phạm Thị Trân Châu and Phan Tuấn Nghĩa (2009), Enzym ứng dụng, Education Publisher, Vietnam Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, Việt Nam 11 12 13 14 15 16 U 10 VN Tài liệu tiếng anh Ali R B., Atangwho I J., Kuar N., Ahmad M., Mahmud R., and Asmawi M Z (2013), "In vitro and in vivo effects of standardized extract and fractions of Phaleria macrocarpa fruits pericarp on lead carbohydrate digesting enzymes", BMC Complement Altern Med, 13, 39 American Diabetes A (2021), "2 Classification and Diagnosis of Diabetes: Standards of Medical Care in Diabetes-2021", Diabetes Care, 44(Suppl 1), S15-S33 Bellamy L., Casas J.-P., Hingorani A D., and Williams D (2009), "Type diabetes mellitus after gestational diabetes: a systematic review and meta-analysis", The Lancet, 373(9677), 1773-1779 Bian X., Fan X., Ke C., Luan Y., Zhao G., and Zeng A (2013), "Synthesis and alphaglucosidase inhibitory activity evaluation of N-substituted aminomethyl-beta-dglucopyranosides", Bioorg Med Chem, 21(17), 5442-5450 Bloomgarden Z T (2020), "Diabetes and COVID‐19", Journal of Diabetes, 12(4), 347-348 Dabhi A S., Bhatt N R., and Shah M J (2013), "Voglibose: an alpha glucosidase inhibitor", J Clin Diagn Res, 7(12), 3023-3027 Dewi R T., Suparman A., Mulyani H., and Lotulung P D N (2016), "Identification of a New Compound as α-Glucosidase Inhibitor from Aspergillus aculeatus", ANNALES BOGORIENSES, 20(1), 19-23 46 17 18 19 20 21 22 23 24 u 26 iệ 25 il Tà Dewi R T., Tachibana S., and Darmawan A (2014), "Effect on α-glucosidase inhibition and antioxidant activities of butyrolactone derivatives from Aspergillus terreus MC751", Medicinal Chemistry Research, 23(1), 454-460 Frisvad J C., Moller L L H., Larsen T O., Kumar R., and Arnau J (2018), "Safety of the fungal workhorses of industrial biotechnology: update on the mycotoxin and secondary metabolite potential of Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, and Trichoderma reesei", Appl Microbiol Biotechnol, 102(22), 9481-9515 G M F and D A M (1987), "Production of enzymes by fermentation", In: Rehm HJ, Reed G (eds) Biotechnology, vol 7a VCH, Weinheim, , 65-102 Group H S C R (2002), "The Hyperglycemia and Adverse Pregnancy Outcome (HAPO) Study", Int J Gynaecol Obstet, 78(1), 69-77 Group H S C R., Metzger B E., Lowe L P., Dyer A R., Trimble E R., Chaovarindr U., Coustan D R., Hadden D R., McCance D R., Hod M., McIntyre H D., Oats J J., Persson B., Rogers M S., and Sacks D A (2008), "Hyperglycemia and adverse pregnancy outcomes", N Engl J Med, 358(19), 1991-2002 Gupta R., Gigras P., Mohapatra H., Goswami V K., and Chauhan B (2003), "Microbial α-amylases: a biotechnological perspective", Process Biochemistry, 38(11), 1599-1616 Helman A and Melton D A (2021), "A Stem Cell Approach to Cure Type Diabetes", Cold Spring Harb Perspect Biol, 13(1) Hemker M., Stratmann A., Goeke K., Schroder W., Lenz J., Piepersberg W., and Pape H (2001), "Identification, cloning, expression, and characterization of the extracellular acarbose-modifying glycosyltransferase, AcbD, from Actinoplanes sp strain SE50", J Bacteriol, 183(15), 4484-4492 Henrissat B (1991), "A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities", Biochem J, 280 ( Pt 2), 309-316 Henrissat B and Bairoch A (1993), "New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities", Biochem J, 293 ( Pt 3), 781788 Ilonen J., Lempainen J., and Veijola R (2019), "The heterogeneous pathogenesis of type diabetes mellitus", Nat Rev Endocrinol, 15(11), 635-650 Jo S.-H., Ka E H., Lee H S., Apostolidis E., Jang H D., and Kwon Y I (2009), "Comparison of Antioxidant Potential and Rat intestinal a-Glucosidases inhibitory Activities of Quercetin, Rutin, and Isoquercetin", International Journal of Applied Research in Natural Products, Jones K., Sim L., Mohan S., Kumarasamy J., Liu H., Avery S., Naim H Y., QuezadaCalvillo R., Nichols B L., Pinto B M., and Rose D R (2011), "Mapping the intestinal alpha-glucogenic enzyme specificities of starch digesting maltaseglucoamylase and sucrase-isomaltase", Bioorg Med Chem, 19(13), 3929-3934 Kameda Y., Asano N., Yoshikawa M., Takeuchi M., Yamaguchi T., Matsui K., Horii S., and Fukase H (1984), "Valiolamine, a new alpha-glucosidase inhibiting aminocyclitol produced by Streptomyces hygroscopicus", J Antibiot (Tokyo), 37(11), 1301-1307 Kang M G., Yi S H., and Lee J S (2013), "Production and Characterization of a New alpha-Glucosidase Inhibitory Peptide from Aspergillus oryzae N159-1", Mycobiology, 41(3), 149-154 Kim N R., Jeong D W., Ko D S., and Shim J H (2017), "Characterization of novel thermophilic alpha-glucosidase from Bifidobacterium longum", Int J Biol Macromol, 99, 594-599 28 29 30 31 32 U VN 27 47 33 34 35 36 37 38 39 U VN 42 u 41 iệ il Tà 40 Lee A., Patrick P., Wishart J., Horowitz M., and Morley J E (2002), "The effects of miglitol on glucagon-like peptide-1 secretion and appetite sensations in obese type diabetics", Diabetes Obes Metab, 4(5), 329-335 Lestari Y., Velina Y., and Rahminiwati M (2015), "Metabolites activity of endophytic Streptomyces sp IPBCC b 15.1539 from Tinospora crispa l miers: αglucosidase inhibitor and anti-hyperglycemic in mice", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, 7, 235-239 Li C., Zhou J., Du G., Chen J., Takahashi S., and Liu S (2020), "Developing Aspergillus niger as a cell factory for food enzyme production", Biotechnol Adv, 44, 107630 Ling L., Han X., Li X., Zhang X., Wang H., Zhang L., Cao P., Wu Y., Wang X., and Zhao J (2020), "A Streptomyces sp NEAU-HV9: Isolation, identification, and potential as a biocontrol agent against Ralstonia solanacearum of tomato plants", Microorganisms, 8(3), 351 Liu Z and Ma S (2017), "Recent Advances in Synthetic alpha-Glucosidase Inhibitors", ChemMedChem, 12(11), 819-829 Martinov T and Fife B T (2020), "Type diabetes pathogenesis and the role of inhibitory receptors in islet tolerance", Ann N Y Acad Sci, 1461(1), 73-103 Munasaroh S., Tamat S R., and Dewi R T (2018), "Isolation and Identification of α-Glucosidase Inhibitor From Aspergillus Terreus F38", Indonesian Journal of Pharmacy, 29(2) Nguyen T C., Le T H., Mai V H., Hoang T Y., Nguyen T T., Dao T M A., Nguyen M C., and Do T T (2021), "Optimization and Purification of α-glucosidase inhibitor from Bacillus subtilis YT20 isolated in vietnam", Vietnam Journal of Science and Technology, 59(2), 179-188 Okuyama M., Saburi W., Mori H., and Kimura A (2016), "alpha-Glucosidases and alpha-1,4-glucan lyases: structures, functions, and physiological actions", Cell Mol Life Sci, 73(14), 2727-2751 Onose S., Ikeda R., Nakagawa K., Kimura T., Yamagishi K., Higuchi O., and Miyazawa T (2013), "Production of the alpha-glycosidase inhibitor 1deoxynojirimycin from Bacillus species", Food Chem, 138(1), 516-523 Organization W H (2019), "Classification of diabetes mellitus", [cited 2021 11 May]; Available from: https://www.who.int/westernpacific/health-topics/diabetes Qiu P., Liu Z., Chen Y., Cai R., Chen G., and She Z (2019), "Secondary Metabolites with alpha-Glucosidase Inhibitory Activity from the Mangrove Fungus Mycosphaerella sp SYSU-DZG01", Mar Drugs, 17(8) Ren L., Qin X., Cao X., Wang L., Bai F., Bai G., and Shen Y (2011), "Structural insight into substrate specificity of human intestinal maltase-glucoamylase", Protein Cell, 2(10), 827-836 Rose D R., Chaudet M M., and Jones K (2018), "Structural Studies of the Intestinal alpha-Glucosidases, Maltase-glucoamylase and Sucrase-isomaltase", J Pediatr Gastroenterol Nutr, 66 Suppl 3, S11-S13 Santiago M and Strobel S (2013), "Thin layer chromatography", Methods Enzymol, 533, 303-324 Sanzana M and Sanhueza L (2019), "Pathogenesis of Type Diabetes Mellitus", Type Diabetes - From Pathophysiology to Modern Management Schuster E., Dunn-Coleman N., Frisvad J C., and Van Dijck P W (2002), "On the safety of Aspergillus niger a review", Appl Microbiol Biotechnol, 59(4-5), 426-435 43 44 45 46 47 48 49 48 50 51 52 53 54 55 56 57 u 59 iệ il Tà 58 Sikorskaya K., Zarzecka I., Ejikeme U., and Russell J (2021), "The use of metformin as an add-on therapy to insulin in the treatment of poorly controlled type diabetes mellitus in adolescents", Metabol Open, 9, 100080 Sim L., Willemsma C., Mohan S., Naim H Y., Pinto B M., and Rose D R (2010), "Structural basis for substrate selectivity in human maltase-glucoamylase and sucrase-isomaltase N-terminal domains", J Biol Chem, 285(23), 17763-17770 Singh B and Kaur A (2016), "Antidiabetic potential of a peptide isolated from an endophytic Aspergillus awamori", J Appl Microbiol, 120(2), 301-311 Sullivan S D., Umans J G., and Ratner R (2012), "Gestational diabetes: implications for cardiovascular health", Curr Diab Rep, 12(1), 43-52 Tabussum A., Riaz N., Saleem M., Ashraf M., Ahmad M., Alam U., Jabeen B., Malik A., and Jabbar A (2013), "α-Glucosidase inhibitory constituents from Chrozophora plicata", Phytochemistry Letters, 6(4), 614-619 Takei I., Miyamoto K., Funae O., Ohashi N., Meguro S., Tokui M., and Saruta T (2001), "Secretion of GIP in responders to acarbose in obese Type 2(NIDDM) patients", Journal of Diabetes and its Complications, 15(5), 245-249 Thrasher J (2017), "Pharmacologic Management of Type Diabetes Mellitus: Available Therapies", Am J Cardiol, 120(1S), S4-S16 Truscheit E., Hillebrand I., Junge B., Müller L., Puls W., and Schmidt D Microbial α-Glucosidase Inhibitors: Chemistry, Biochemistry, and Therapeutic Potential in Drug Concentration Monitoring Microbial Alpha-Glucosidase Inhibitors Plasminogen Activators 1988 Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg van der Maarel M J E C., van der Veen B., Uitdehaag J C M., Leemhuis H., and Dijkhuizen L (2002), "Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family", Journal of Biotechnology, 94(2), 137-155 Wu Y., Chen Y., Huang X., Pan Y., Liu Z., Yan T., Cao W., and She Z (2018), "alpha-Glucosidase Inhibitors: Diphenyl Ethers and Phenolic Bisabolane Sesquiterpenoids from the Mangrove Endophytic Fungus Aspergillus flavus QQSG3", Mar Drugs, 16(9) Yagi M., Kouno T., Aoyagi Y., and Murai H (1976), "The Structure of Moranoline, a Piperidine Alkaloid from Morus Species", Journal of the agricultural chemical society of Japan, 50(11), 571-572 Yang J B., Tian J Y., Dai Z., Ye F., Ma S C., and Wang A G (2017), "aGlucosidase inhibitors extracted from the roots of Polygonum multiflorum Thunb", Fitoterapia, 117, 65-70 Yin Z., Zhang W., Feng F., Zhang Y., and Kang W (2014), "α-Glucosidase inhibitors isolated from medicinal plants", Food Science and Human Wellness, 3(3-4), 136174 Yip V L and Withers S G (2004), "Nature's many mechanisms for the degradation of oligosaccharides", Org Biomol Chem, 2(19), 2707-2713 Zhou F., Yu T., Du R., Fan G., Liu Y., Liu Z., Xiang J., Wang Y., Song B., and Gu X (2020), "Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study", The Lancet, 395(10229), 1054-1062 Zhu Y and Zhang C (2016), "Prevalence of Gestational Diabetes and Risk of Progression to Type Diabetes: a Global Perspective", Curr Diab Rep, 16(1), Zhu Y P., Yamaki K., Yoshihashi T., Ohnishi Kameyama M., Li X T., Cheng Y Q., Mori Y., and Li L T (2010), "Purification and identification of 1- 61 62 63 64 65 66 U VN 60 49 deoxynojirimycin (DNJ) in okara fermented by Bacillus subtilis B2 from Chinese traditional food (Meitaoza)", J Agric Food Chem, 58(7), 4097-4103 u iệ il Tà U VN 50