Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tác dụng của thạch tùng răng cưa (huperzia serrata (thunb ) trevis) trên mô hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến rugose

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC *** TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG Tà u iệ il NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM TỰ KỶ VN U MANG GEN ĐỘT BIẾN RUGOSE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI-2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG u iệ il Tà NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS) TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM TỰ KỶ MANG GEN ĐỘT BIẾN RUGOSE U VN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: PGS TS PHẠM THỊ NGUYỆT HẰNG THS ĐỖ THỊ QUỲNH HÀ NỘI-2021 LỜI CẢM ƠN Em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, trưởng khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Trung ương, người thầy truyền cảm hứng, trực tiếp hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi kinh phí để em thực đề tài khóa luận Em muốn gửi lời cảm ơn tới ThS Đỗ Thị Quỳnh, Bộ môn Y Dược học sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội Cô cho em hội nghiên cứu khoa học môi trường chuyên nghiệp, đưa lời khuyên quý báu, giúp đỡ em suốt q trình thực khố luận tốt nghiệp Em muốn gửi lời cảm ơn tới thầy cô môn Y Dược học sở, cô chủ nhiệm thầy cô môn khác Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, suốt khoảng thời gian năm qua, cung cấp cho thân em nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu, quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập u iệ il Tà Em xin cảm ơn tập thể anh chị, cán khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Trung ương hướng dẫn, giúp đỡ tận tình cho em trình thực nghiệm, chia sẻ kinh nghiệm quý giá ứng dụng thực tế U VN Cuối cùng, em xin cảm ơn tới người thân gia đình bạn bè động viên chỗ dựa tinh thần vững em gặp khó khăn học tập sống Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận cịn có nhiều thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy bạn bè để khóa luận hồn thiện Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2021 Sinh viên Trương Thị Hoài Phương MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hội chứng tự kỷ 1.1.1 Khái niệm hội chứng tự kỷ 1.1.2 Dịch tễ học hội chứng tự kỷ 1.1.3 Các yếu tố nguy rối loạn phổ tự kỷ 1.1.3.1 Yếu tố di truyền học Tà 1.1.3.2 Yếu tố nguy từ môi trường il u iệ 1.1.4 Triệu chứng lâm sàng chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ 1.1.5 Các phương pháp điều trị rối loạn phổ tự kỷ VN 1.1.6 Một số mơ hình nghiên cứu rối loạn phổ tự kỷ U 1.2 Tổng quan ruồi giấm 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu, hình thành phát triển 1.2.2 Đặc điểm sinh học phát triển ruồi giấm 1.2.2.1 Đặc điểm bên ruồi giấm 1.2.2.2 Hệ gen ruồi giấm 1.2.2.3 Chu kỳ vòng đời ruồi giấm 1.2.3 Mơ hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ 10 1.3 Tổng quan dược liệu nghiên cứu: Thạch tùng cưa 11 1.3.1 Tên gọi – vị trí phân loại 11 1.3.2 Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng 12 1.3.3 Thành phần hoá học tác dụng sinh học 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Dược liệu nghiên cứu 15 2.2 Đối tượng nghiên cứu 15 2.3 Hoá chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 15 2.3.1 Hoá chất 15 2.3.2 Dụng cụ, thiết bị 16 2.4 Thiết kế thí nghiệm 16 2.4.1 Căn để chọn mức liều mg/ml mg/ml 16 2.4.2 Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ hoang dại phục vụ nghiên cứu 16 2.4.3 Thu ấu trùng ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu 18 2.4.4.Chia lơ thí nghiệm 18 2.5 Phương pháp nghiên cứu 18 Tà iệ il 2.5.1 Đánh giá tác dụng cao chiết cồn Thạch tùng cưa mơ hình ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ thử nghiệm hành vi 18 u 2.5.1.1 Thử nghiệm đánh giá khả di chuyển ấu trùng ruồi VN giấm 18 U 2.5.1.2 Thử nghiệm đánh giá khả vận động ruồi giấm trưởng thành 19 2.5.1.3 Thử nghiệm đánh giá hành vi tương tác cộng đồng ruồi giấm trưởng thành 20 2.3.1.4 Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học ruồi giấm trưởng thành 21 2.5.2 Thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng cao chiết cồn từ Thạch tùng cưa khả sống sót ruồi giấm Rugose trưởng thành 22 2.6 Phân tích kết 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Kết đánh giá tác dụng cao chiết cồn Thạch tùng cưa ruồi giấm Rugose đột biến gen mang hội chứng tự kỷ thử nghiệm hành vi 24 3.1.1 Đánh giá ảnh hưởng cao chiết cồn Thạch tùng cưa khả di chuyển ấu trùng ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 24 3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng cao chiết cồn Thạch tùng cưa ảnh khả trèo ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 26 3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng cao chiết cồn Thạch tùng cưa tới khả cải thiện mức độ tương tác cộng đồng ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 28 3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng cao chiết cồn Thạch tùng cưa ảnh tới thay đổi nhịp sinh học ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 30 3.2 Kết đánh giá ảnh hưởng cao chiết cồn từ Thạch tùng cưa tới khả sống sót ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 32 Tà KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 il Kết luận 35 U VN TÀI LIỆU THAM KHẢO u iệ Đề xuất 35 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ABA Applied Behavioral Analysis Phân tích hành vi ứng dụng ADHD Attention deficit hyperactivity disorder Rối loạn tăng động giảm ý ASD Autism Spectrum Disorder Hội chứng rối loạn phổ tự kỷ DSM-5 Diagnostic and statistical Cẩm nang thống kê chẩn manual of mental disorders đoán rối loạn tâm thần FRM1 Fragile X Mental Retardation NBEA Neurobeachin TSC Tuberous Sclerosis Complex TTRC Gen Fragile X Mental Retardation Gen Neurobeachin il Tà Hội chứng xơ cứng củ u iệ Thạch tùng cưa U VN DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ người (ASD) Hình 1.2: Ruồi giấm đực Hình 1.3: Chu kỳ vịng đời ruồi giấm 10 Hình 1.4: Cây Thạch tùng cưa 12 Hình 2.1: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả di chuyển ấu trùng 19 Hình 2.2: Thiết kế thí nghiệm đánh giá hành vi cộng đồng ruồi giấm 21 Hình 2.3: Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor 22 Hình 2.4: Mơ hình đánh giá mức độ cải thiện khả sống sót 23 Hình 3.1: Ảnh hưởng cao chiết cồn Thạch tùng cưa khả vận động ấu trùng ruồi giấm tự kỷ 24 Tà Hình 3.2: Kết đánh giá khả vận động ruồi giấm trưởng nghiệm leo trèo thời điểm 3, 7, 10 ngày tuổi 26 u iệ il Hình 3.3: Khả tương tác cộng đồng ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 28 U VN Hình 3.4: Ảnh hưởng cao chiết cồn Thạch tùng cưa khả hoạt động ruồi giấm Rugose 30 Hình 3.5: Kết phân tích mức độ vận động thời điểm buổi sáng ruồi giấm ngày 31 Hình 3.6: Đồ thị phân tích khả sống sót 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder- ASD) rối loạn thần kinh phức tạp với rối loạn hành vi thường xuất năm đầu đời trẻ, đặc trưng suy giảm khả giao tiếp, tương tác xã hội kết hợp với hành vi, sở thích hoạt động hạn chế lặp lặp lại [34] Gần đây, có nhiều thay đổi nhận thức tiêu chuẩn chẩn đoán kết hợp với yếu tố sinh học môi trường, tỷ lệ tự kỷ gia tăng cách nhanh chóng tất quốc gia [24] Nguyên nhân tự kỷ đến chưa xác định xác chưa có phương pháp hay thuốc điều trị đặc hiệu [11] Trong đó, thuốc tân dược sử dụng giúp cải thiện triệu chứng, nhiên, lại gây nhiều tác dụng khơng mong muốn nguy hiểm [32] Do đó, nhu cầu nghiên cứu phát triển loại thuốc có nguồn gốc từ dược liệu khơng có tác dụng không mong muốn để hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ cần thiết giới quan tâm Thạch tùng cưa có tên khoa học Huperzia serrata (Thunb.) Trevis họ Tà Thạch tùng (Thông đất) (Lycopodiaceae) Ở Việt Nam, mọc hoang dã số vùng núi cao từ 1000 m trở lên, Lào Cai, Cao Bằng,… Theo kinh nghiệm dân iệ il gian, toàn Thạch tùng cưa sử dụng để điều trị suy nhược thần kinh, trương lực cơ, cầm máu [70] nhờ có thành phần hố học alkaloid Huperzin A, u Triterpen, Flavoles, acid Phenoliques…[21] VN U Tại Việt Nam, việc nghiên cứu thuốc từ dược liệu nói chung Thạch tùng cưa nói riêng nhằm hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ hạn chế Do đó, chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu tác dụng Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) mơ hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến Rugose” với hai mục tiêu cụ thể sau: Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ cao chiết cồn từ Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) mô hình ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ Đánh giá tác dụng cải thiện khả sống sót ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ cao chiết cồn từ Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hội chứng tự kỷ 1.1.1 Khái niệm hội chứng tự kỷ Tự kỷ - “Autism” tên gọi chứng rối loạn phát triển, đặc trưng khiếm khuyết mặt thiết lập mối quan hệ, tương tác với xã hội, nhà tâm lý học Leo Kanner đặt vào năm 1943 [49] Chi tiết hành vi nhóm trẻ mắc bệnh mô tả bao gồm: "Thiếu quan hệ tiếp xúc mặt tình cảm với người khác; thói quen thường ngày giống tính cách kỳ dị tỉ mỉ; khơng có ngơn ngữ nói ngơn ngữ nói khác thường; thích xoay đồ vật hình trịn; có kỹ mức cao nhìn nhận khơng gian giỏi trí nhớ "vẹt", hình thức bên ngồi hấp dẫn, nhanh nhẹn, thông minh" [34, 35, 40, 55, 59] Năm 1979, Lorna Wing đưa thuật ngữ “Rối loạn phổ tự kỷ” (tên tiếng anh “Autism Spectrum Disorder (ASD)”), đa dạng triệu chứng biểu [66] u iệ il Tà Ngày nay, thuật ngữ khác gọi để nhóm rối loạn phức tạp “Hội chứng tự kỷ” Người ta chia rối loạn phổ tự kỷ thành phân loại bao gồm: rối loạn tự kỷ, rối loạn Asperger, rối loạn Rett, rối loạn Disintegrative rối loạn phát triển lan toả không định khác [8, 34] Năm 2008, Liên hiệp quốc đưa khái niệm: “Tự kỷ dạng khuyết tật phát VN U triển tồn suốt đời, thường xuất năm đầu đời Tự kỷ rối loạn thần kinh, gây ảnh hưởng đến chức hoạt động não Tự kỷ xảy cá nhân nào, khơng phân biệt giới tính, chủng tộc điều kiện kinh tế - xã hội Đặc điểm tự kỷ khiếm khuyết tương tác xã hội, giao tiếp ngơn ngữ, phi ngơn ngữ có hành vi, sở thích, hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp lặp lại” Đây coi khái niệm tương đối đầy đủ đưa vào sử dụng phổ biến Những khiếm khuyết liên quan đến ASD diện suốt đời coi có tác động đáng kể mặt chức năng, xã hội tài cá nhân bị ảnh hưởng, gia đình xã hội [23] 1.1.2 Dịch tễ học hội chứng tự kỷ Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới WHO (2021), người ta ước tính tồn giới 270 người có người mắc ASD Ước tính đại diện cho số trung bình tỷ lệ mắc báo cáo khác đáng kể nghiên cứu Tuy nhiên, số nghiên cứu kiểm soát tốt báo cáo số cao đáng kể Tỷ lệ mắc ASD nhiều quốc gia có thu nhập thấp trung bình chưa biết rõ [65] Ấu trùng ruồi giấm đột biến gen Rugose sau sử dụng cao chiết cồn TTRC với liều mg/ml (TTRC4) có tốc độ di chuyển cao gần 20% so với lô chứng bệnh lý, khác biệt đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Trong đó, với liều mg/ml (TTRC2), tốc độ di chuyển ấu trùng có tăng lên so với lơ chứng bệnh lý không đạt ý nghĩa thống kê p > 0,05 Như vậy, cao chiết cồn TTRC có tác dụng cải thiện suy giảm vận động ấu trùng ruồi giấm mang đột biến gen tự kỷ Liên hệ với số nghiên cứu trước dựa phân tích cấu trúc thần kinh (Neuromuscular junction-NMJ) nhóm số ấu trùng ruồi giấm bậc phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang, chúng tơi nhận thấy có mối liên quan [4] Trong nghiên cứu này, ruồi giấm chủng Rugose điều trị cao chiết, có thay đổi cấu trúc thần kinh cơ, cụ thể số lượng, diện tích nút thần kinh, chiều dài sợi thần kinh Nhờ đó, có thay đổi khả vận động Do đó, đích tác dụng cao chiết cồn TTRC ấu trùng ruồi giấm bậc 3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng cao chiết cồn Thạch tùng cưa ảnh khả trèo ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ Tà Hành vi leo trèo tiêu chí đánh giá tác dụng tăng khả vận động iệ il ruồi giấm trưởng thành Thí nghiệm tiến hành ruồi đạt 3, 10 ngày tuổi Thực cách cho ruồi đực trưởng thành leo tự ống có chia vạch u vịng 30 giây Lặp lại q trình lần (tổng lần) Đếm số vạch, qua đó, tính điểm số trung bình ống qua lần tiến hành so sánh lô Kết thể Hình 3.2 U VN Hình 3.2: Kết đánh giá khả vận động ruồi giấm trưởng nghiệm leo trèo thời điểm 3, 7, 10 ngày tuổi 26 Ghi chú: Canton-S (lô chứng sinh lý): lô ruồi giấm chủng hoang dại; Rugose (lô chứng bệnh lý): lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; TTRC2, TTRC4: lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ điều trị cao chiết cồn TTRC nồng độ tương ứng mg/ml mg/ml; * p < 0,05 so sánh với lô chứng bệnh lý Qua q trình làm thí nghiệm, nhận thấy việc đánh giá hành vi leo trèo ruồi giấm mang gen tự kỷ Rugose thử nghiệm hành vi khó Kết Hình 3.2 cho thấy khả leo trèo ruồi giấm trưởng thành có thay đổi theo thời gian Ở nhóm cho thấy giảm chức vận động theo thời gian từ ngày đến ngày 10 Khả leo trèo lô sinh lý (Canton-S) lô chứng bệnh lý (Rugose) thấy khác biệt ngày 10 Lô sử dụng cao chiết TTRC liều mg/ml bắt đầu thay đổi khả leo trèo ruồi giấm vào ngày (p < 0,05) đến ngày 10 khơng cịn trì thay đổi Với lô sử dụng cao chiết TTRC liều mg/ml thấy thay đổi ngày không quan sát thay đổi ngày lại (p > 0,05) Tà Rugose chủng giấm đột biến có chứa trình tự tương đồng gen Neurobeachin(NBEA) người, đóng vai trị quan trọng đóng gói tạo bóng xuất iệ il bào liên quan tới dẫn truyền thần kinh/truyền dẫn tế bào synap thần kinh Nghiên cứu chuột nhắt cho thấy, chức protein NBEA, đường dẫn truyền u thần kinh thần kinh bị khố hồn tồn sợi thần kinh, cấu trúc thần kinh yếu tố dẫn truyền thần bình thường [67] Điều dẫn tới hành vi khác thường ấu trùng ruồi giấm Kết thu nghiên cứu góp phần cho thấy ruồi giấm trưởng thành có ảnh hưởng đột biến ruồi giấm Rugose Mơ hình đánh giá khả leo trèo ruồi giấm mơ hình quan trọng giúp đánh giá thay đổi hành vi liên quan tới giai đoạn tuổi Cao chiết TTRC cho thấy mức liều mg/ml mg/ml thể khả cải thiện hành vi leo trèo ruồi giấm đột biết Rugose, nhiên, cải thiện lại phụ thuộc vào giai đoạn ruồi giấm Điều cho thấy hiệu tác dụng thử nghiệm hành vi phụ thuộc vào liều dùng liên quan tới thời điểm, thời gian sử dụng cao đối tượng ruồi giấm trưởng thành, thời gian hiệu tác dụng Có nhiều đột biến cấu trúc gen tạo ruồi giấm Drosophila nghiên cứu để giúp kéo dài tuổi thọ ruồi giấm làm chậm q trình suy giảm chức lão hố Ví dụ, đột biến làm tăng cường biểu enzyme peptide methionine sulfoxide reductase A giúp kéo dài tuổi thọ làm chậm q trình lão hố vận động thể chất sinh sản ruồi giấm [53] Ở nghiên cứu khác đột biến gen Methuselah [38] giúp kéo dài tuổi thọ ruồi giấm lại khơng cho thấy thay đổi q trình lão hố vận động U VN 27 cảm nhận khứu giác [20] Vì cần có nghiên cứu sâu để làm sáng tỏ tác dụng mẫu cao chiết TTRC cải thiện triệu chứng liên quan tới rối loạn phổ tự kỷ 3.1.3 Đánh giá ảnh hưởng cao chiết cồn Thạch tùng cưa tới khả cải thiện mức độ tương tác cộng đồng ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ Suy giảm khả hoạt động cộng đồng yếu tố đặc trưng nhận biết hội chứng tự kỷ Do đó, chúng tơi sử dụng mơ hình tương tác cộng đồng ruồi giấm tự kỷ để đánh giá tác dụng điều trị cao chiết cồn TTRC Xem xét nghiên cứu tỷ lệ mắc ASD trước đây, nhận thấy tỷ lệ mắc bệnh tự kỷ trẻ em nam cao so với nữ [48] Bởi vậy, chúng tơi tiến hành thí nghiệm ruồi đực ruồi Tiến hành thí nghiệm, ruồi phân đực riêng chuyển vào buồng tam giác ruồi tự vận động 30 phút Sau đó, chụp lại xác định khoảng cách đến gần Kết thể Hình 3.3 (A) u iệ il Tà U VN 28 (B) il Tà u iệ Hình 3.3: Khả tương tác cộng đồng ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ VN U Ghi chú: (A): Hình ảnh phân bố không gian quần thể ruồi giấm lơ; (B): Kết phân tích khoảng cách tương tác không gian ruồi giấm lô Canton-S (lô chứng sinh lý): lô ruồi giấm chủng hoang dại; Rugose (lô chứng bệnh lý): lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; TTRC mg/ml, TTRC mg/ml: lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ sử diều trị cao chiết cồn TTRC nồng độ tương ứng mg/ml mg/ml; ** p < 0,01, *** p < 0,001 so sánh với lô chứng bệnh lý Kết Hình 3.3 cho thấy ruồi giấm chủng Rugose (chứng bệnh lý) gây nên loạt thay đổi tương tác cộng đồng so với ruồi giấm chủng hoang dại (chứng sinh lý) Các cá thể nhóm đứng riêng lẻ rải rác không gian, khơng có xu hướng giao tiếp hay di chuyển thành đám Bằng chứng khoảng cách tới gần quần thể ruồi giấm chủng Rugose tăng lên cách rõ rệt (p < 0,001) phân bố chúng ngẫu nhiên, ruồi giấm biểu hành vi thể khơng có ruồi khác buồng thí nghiệm Kết tương đồng với nghiên cứu tác giả Simon cộng (2012) Như vậy, triển khai mơ hình đánh giá tương tác cộng đồng ruồi giấm trưởng thành phù hợp để đánh giá tác dụng cao chiết cồn TTRC 29 Các lô ruồi giấm điều trị cao chiết cồn TTRC cho thấy có tác dụng cải thiện khả tương tác công đồng so với lô chứng bệnh lý Trong đó, nhóm ruồi đột biến gen Rugose sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ mg/ml cho thấy cải thiện rõ rệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01) Với nồng độ mg/ml có làm giảm khoảng cách gần hai cá thể khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 3.1.4 Đánh giá ảnh hưởng cao chiết cồn Thạch tùng cưa ảnh tới thay đổi nhịp sinh học ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ Rối loạn giấc ngủ thay đổi nhịp sinh học thường báo cáo trẻ mắc ASD [45] Do đó, tiến hành theo dõi hoạt động thức ngủ ruồi giấm trưởng thành để đánh giá tác dụng cao chiết cồn TTRC triệu chứng bệnh tự kỷ Tuy nhiên, thử nghiệm tiến hành ruồi đực thay ruồi hoạt động đẻ trứng báo cáo có ảnh hưởng đến việc đo lường hoạt động vận động thực chúng [15] Ruồi đực trưởng thành chia thành lơ, sau đó, theo dõi nhịp sinh học Tà ngày máy theo dõi hoạt động thức ngủ Trikinetics có gắn cảm biến kết nối với máy tính, thu số lần ruồi di chuyển qua đèn laze cảm biến 30 phút Kết u iệ il thể Hình 3.4 Hình 3.5 U VN Hình 3.4: Ảnh hưởng cao chiết cồn Thạch tùng cưa khả hoạt động ruồi giấm Rugose, N=8/lơ thí nghiệm Ghi chú: Canton-S (lô chứng sinh lý): lô ruồi giấm chủng hoang dại; Rugose (lô chứng bệnh lý): lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; TTRC2, TTRC4: lô ruồi giấm đột biến 30 gen mang hội chứng tự kỷ điều trị cao chiết cồn TTRC nồng độ tương ứng mg/ml mg/ml; * p < 0,05 so sánh với lô chứng bệnh lý Kết Hình 3.4 cho thấy trung bình tổng số lần hoạt động ngày ruồi giấm chủng hoang dại (Canton-S) nhiều so với lô chứng bệnh lý (Rugose), khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Lô ruồi giấm TTRC2 điều trị với cao chiết cồn TTRC nồng độ mg/ml có số lần hoạt động trung bình nhiều so với nhóm bệnh lý, nhiên, khác biệt khơng có có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Với lô ruồi giấm sử dụng TTRC nồng độ mg/ml, trung bình tổng số lần hoạt động thấp lô chứng bệnh lý, đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) u iệ il Tà U VN Hình 3.5: Kết phân tích mức độ vận động thời điểm buổi sáng ruồi giấm ngày, N=8/lơ thí nghiệm Ghi chú: Canton-S (lơ chứng sinh lý): lô ruồi giấm chủng hoang dại; Rugose (lô chứng bệnh lý): lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; TTRC2, TTRC4: lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ điều trị cao chiết cồn TTRC nồng độ tương ứng mg/ml mg/ml Ngoài ra, kết phân tích mức độ vận động thời điểm buổi sáng (từ 8h đến 10h) ruồi giấm ngày Hình 3.5 cho thấy lơ chứng sinh lý (Canton-S) lô TTRC2 cao lô chứng bệnh lý (Rugose) tất ngày, nhiên không 31 đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Lô ruồi giấm đột biến gen Rugose sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ mg/ml làm tăng mức độ vận động thời điểm buổi sáng so với lơ bệnh lý vào ngày 2, sau giảm không vượt lô bệnh lý Sự khác biệt không đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Như vậy, từ kết Hình 3.4 Hình 3.5 thấy đột biến gen Rugose gây thay đổi cường độ hoạt động ruồi giấm Ruồi tự kỷ có xu hướng giảm hoạt động ngày, đồng thời tần suất hoạt động buổi sáng giảm nhiều so với ruồi giấm lô chứng sinh lý Canton-S Xét trẻ tự kỷ cho thấy kết tương đồng mà tổng thời gian ngủ trẻ tự kỷ nhiều so với trẻ bình thường nghiên cứu trước [51] Với ruồi giấm đột biến gen Rugose sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ mg/ml, nhịp sinh học ruồi giấm cải thiện so với lô bệnh lý, đặc biệt vào thời gian buổi sáng Tuy nhiên, khác biệt chưa đạt ý nghĩa thống kê số liệu nghiên cứu cỡ mẫu nhỏ (n=8/lơ thí nghiệm), cần thiết phải tăng cỡ Tà mẫu nghiên cứu để khẳng định xác kết il iệ Mặc dù vậy, kết thu nghiên cứu cho thấy tiềm u việc sử dụng cao chiết cồn TTRC để cải thiện triệu chứng rối loạn tự kỷ trẻ em VN U 3.2 Kết đánh giá ảnh hưởng cao chiết cồn từ Thạch tùng cưa tới khả sống sót ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ Hiện nay, tỷ lệ mắc rối loạn phổ tự kỷ ngày tăng nhiều quốc gia người mắc hội chứng có tuổi thọ giảm so với tuổi thọ dân số chung [12] Do đó, giới, nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu để tìm phương pháp cải thiện tình trạng Trong nghiên cứu này, mơ hình ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ lựa chọn thử nghiệm để đánh giá tác dụng kéo dài khả sống sót cao chiết cồn TTRC Thử nghiệm thực ruồi đực Kết thử Hình 3.6 32 Tà iệ il Hình 3.6: Đồ thị phân tích khả sống sót ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ u U VN Ghi chú: Canton-S (lô chứng sinh lý): lô ruồi giấm chủng hoang dại; Rugose (lô chứng bệnh lý): lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; TTRC2, TTRC4: lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ tương ứng mg/ml mg/ml; *** p < 0,001, ** p < 0,01 so sánh với lô chứng bệnh lý Kết Hình 3.6 cho thấy tỷ lệ sống sót ruồi giấm chủng hoang dại (CantonS) có khác biệt so với lô chứng bệnh lý (Rugose) kể từ ngày thứ Trong ruồi giấm chủng Canton-S trì tỷ lệ sống sót suốt 12 ngày đầu, tỷ lệ sống sót ruồi giấm chủng Rugose lại có suy giảm vào ngày 2, 6, 10 Tuy nhiên, khác biệt chưa đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Như vậy, thấy, ảnh hưởng hội chứng tự kỷ mơ hình ruồi giấm đột biến gen có xu hướng tương đồng với ảnh hưởng người Tuổi thọ ruồi giấm mang hội chứng tự kỷ có giảm so với ruồi giấm khoẻ mạnh chủng Canton-S Bên cạnh đó, lơ ruồi giấm TTRC2 điều trị với cao chiết cồn TTRC nồng độ mg/ml cho thấy tỷ lệ sống sót ln cao tỷ lệ sống sót ruồi giấm nhóm bệnh lý kể từ ngày Đồng thời, tỷ lệ ln trì ổn định suốt 22 ngày quan sát Sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Mặt khác, ruồi giấm lô TTRC4 lại cho thấy tỷ lệ sống sót cao ruồi giấm chủng Rugose liên tiếp từ ngày 33 ngày cuối thu kết Tuy nhiên, có suy giảm tỷ lệ ngày ngày 16, ngày 22 suy giảm rõ rệt Sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,001) Nhìn chung, với 22 ngày quan sát, chúng tơi nhận thấy có xu hướng cải thiện khả sống sót nhóm ruồi giấm đột biến gen sử dụng dược liệu Thạch tùng cửa với nồng độ mg/ml Trong đó, nồng độ mg/ml thể xu hướng có độc tính Đây tiền đề quan trọng để tiếp tục theo dõi, đánh nghiên cứu thêm tác dụng TTRC khía cạnh cải thiện khả kéo dài tuổi thọ cho người mắc rối loạn phổ tự kỷ u iệ il Tà U VN 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, kết luận sau: - Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) có tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ mơ hình ruồi giấm đột biến gen Rugose, đánh giá thơng qua mơ hình hành vi vận động, tương tác cộng đồng nhịp sinh học Khả cải thiện cao chiết cồn Thạch tùng cưa phụ thuộc vào nồng độ + Ruồi giấm đột biến gen sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ mg/ml có tác dụng cải thiện khả vận động ấu trùng ruồi giấm so với lô chứng bệnh lý với p < 0,05 + Khả trèo ruồi giấm trưởng thành điều trị với cao chiết cồn TTRC nồng độ mg/ml cải thiện dựa vào số vận động so với lô chứng bệnh lý với p < 0,05 Tà + Khả tương tác cộng đồng ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự il kỷ sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ mg/ml cải thiện so với lô u iệ chứng bệnh lý với p < 0,01 VN + Có xu hướng tăng tần suất hoạt động thời điểm buổi sáng lô ruồi giấm - U sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ mg/ml so với lô bệnh lý Thạch tùng cưa với mức liều mg/ml sau 22 ngày điều trị có tác dụng cải thiện khả sống sót ruồi giấm trưởng thành đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ Đề xuất - Thực đánh giá thêm thông số liên quan đến cấu trúc thần kinh ấu trùng ruồi giấm tự kỷ (chiều dài nhánh, số lượng nhánh,…) - Tiến hành nghiên cứu sử dụng cao chiết cồn phân đoạn với thành phần hóa học cụ thể Thạch tùng cưa để nâng cao hiệu cải thiện hội chứng tự kỷ với mức liều thấp - Triển khai đánh giá tác dụng điều trị hội chứng tự kỷ cao chiết cồn Thạch tùng cưa mơ hình chuột thực nghiệm - Đánh giá độ an toàn Thạch tùng cưa động vật thực nghiệm 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Lao động - Thương binh Xã hội (2018), Tọa đàm "Vấn đề trẻ em tự kỷ Việt Nam" Trần Thị Minh Huế (2014), Giáo dục hòa nhập trẻ tự kỷ Nguyễn Thanh Tùng Nguyễn Quang Hiệu, Vũ Thu Thuỷ, Nguyễn Viết Thân (2017), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật hai lồi huperzia, họ thơng đất (Lycopodiaceae)” Phạm Thị Bích Phượng (2020), Nghiên cứu tác dụng sinh học bước đầu tìm hiểu chế hóa sinh Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilisstylus w.w smith) 10 11 12 13 14 U Rajawat et al (2021), “Cinderella of genetics (Drosophila melanogaster): Population genetics to genomics” B Tick, et al (2016), “Heritability of autism spectrum disorders: a meta-analysis of twin studies”, J Child Psychol Psychiatry, 57(5), 585-595 M D Adams, et al (2000), “The genome sequence of Drosophila melanogaster”, Science, 287(5461), 2185-2195 American Psychiatric Association (2013), Diagnostic and statistical manual of mental disorders (DSM-5®) American Psychiatric D Q Beversdorf and Consortium Missouri Autism Summit (2016), “Phenotyping, Etiological Factors, and Biomarkers: Toward Precision Medicine in Autism Spectrum Disorders”, J Dev Behav Pediatr, 37(8), 659-673 L Bishop-Fitzpatrick and A J H Kind (2017), “A Scoping Review of Health Disparities in Autism Spectrum Disorder”, J Autism Dev Disord, 47(11), 3380-3391 D Castermans, et al (2003), “The neurobeachin gene is disrupted by a translocation in a patient with idiopathic autism”, J Med Genet, 40(5), 352-356 P Chaste, & Leboyer, M (2012), “Autism risk factors: genes, environment, and gene-environment interactions”, Dialogues in Clinical Neuroscience, 14(3), 281292 VN u Tài liệu Tiếng Anh iệ il Tà Đỗ Huy Bích Đặng Quang Trung cộng (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, vol NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Phạm Thị Hạnh Vũ Thị Ngọc, Lê Thị Lan Anh, Nguyễn Tiến Đạt, Lê Thị Bích Thủy (2016), “Định tính định lượng Huperzine A Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 14(3), 473-478 15 16 17 18 19 20 21 Ana Ferreira, et al (2014), “Huperzine A from Huperzia serrata: a review of its sources, chemistry, pharmacology and toxicology”, Phytochemistry Reviews, 15(1), 51-85 T Flatt (2020), “Life-History Evolution and the Genetics of Fitness Components in Drosophila melanogaster”, Genetics, 214(1), 3-48 E Fombonne (2009), “Epidemiology of pervasive developmental disorders”, Pediatr Res, 65(6), 591-598 E Fombonne (2018), “Editorial: The rising prevalence of autism”, J Child Psychol Psychiatry, 59(7), 717-720 C M Freitag, et al (2010), “Genetics of autistic disorders: review and clinical implications”, Eur Child Adolesc Psychiatry, 19(3), 169-178 H Gardener, D Spiegelman, and S L Buka (2009), “Prenatal risk factors for autism: comprehensive meta-analysis”, Br J Psychiatry, 195(1), 7-14 J W Gargano, et al (2005), “Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila”, Exp Gerontol, 40(5), 386-395 J Gerhardt, et al (2014), “The DNA replication program is altered at the FMR1 locus in fragile X embryonic stem cells”, Mol Cell, 53(1), 19-31 Jame H.Sang, Drosophila melanogaster: The fruit fly, in Bách khoa toàn thư Di truyền học, E.C.R Reeve, Editor 2009, Fitzroy Dearborn I Hadjkacem, et al (2016), “Prenatal, perinatal and postnatal factors associated with autism spectrum disorder”, J Pediatr (Rio J), 92(6), 595-601 23 u iệ il Tà 22 J C Chiu, et al (2010), “Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila”, J Vis Exp, (43) J Christensen, et al (2013), “Prenatal valproate exposure and risk of autism spectrum disorders and childhood autism”, JAMA, 309(16), 1696-1703 A L Christianson, N Chesler, and J G Kromberg (1994), “Fetal valproate syndrome: clinical and neuro-developmental features in two sibling pairs”, Dev Med Child Neurol, 36(4), 361-369 S Chyb, & Gompel, N (2013) D melanogaster subgroup species Atlas of Drosophila Morphology, 209–220 M S Durkin, et al (2008), “Advanced parental age and the risk of autism spectrum disorder”, Am J Epidemiol, 168(11), 1268-1276 Michael S Grotewiel Eric Cook-Wiens (2002), “Dissociation between functional senescence and oxidative stress resistance in Drosophila”, Experimental Gerontology, 37(12), 1347-1357 26 27 28 29 30 U 25 VN 24 31 32 33 34 35 36 37 serratum”, J Nat Prod, 70(6), 1024-1028 M C Lai, et al (2015), “Sex/gender differences and autism: setting the scene for future research”, J Am Acad Child Adolesc Psychiatry, 54(1), 11-24 Y J Lin, L Seroude, and S Benzer (1998), “Extended life-span and stress resistance in the Drosophila mutant methuselah”, Science, 282(5390), 943-946 Q F Liu, et al (2015), “In Vivo Screening of Traditional Medicinal Plants for Neuroprotective Activity against Abeta42 Cytotoxicity by Using Drosophila Models of Alzheimer's Disease”, Biol Pharm Bull, 38(12), 1891-1901 Catherine Lord, et al (2018), “Autism spectrum disorder”, The Lancet, 392(10146), 508-520 S E Manning, et al (2011), “Early diagnoses of autism spectrum disorders in Massachusetts birth cohorts, 2001-2005”, Pediatrics, 127(6), 1043-1051 T A Markow (2015), “The secret lives of Drosophila flies”, Elife, X Ming, M Brimacombe, and G C Wagner (2007), “Prevalence of motor impairment in autism spectrum disorders”, Brain Dev, 29(9), 565-570 S J Moore, et al (2000), “A clinical study of 57 children with fetal anticonvulsant syndromes”, J Med Genet, 37(7), 489-497 S H Mostofsky, et al (2000), “Evidence for a deficit in procedural learning in children and adolescents with autism: implications for cerebellar contribution”, J Int Neuropsychol Soc, 6(7), 752-759 C J Newschaffer, et al (2007), “The epidemiology of autism spectrum disorders”, Annu Rev Public Health, 28, 235-258 C D Nichols, J Becnel, and U B Pandey (2012), “Methods to assay Drosophila behavior”, J Vis Exp, (61) 39 u iệ il Tà 38 V M Hoang, et al (2019), “Prevalence of autism spectrum disorders and their relation to selected socio-demographic factors among children aged 18-30 months in northern Vietnam, 2017”, Int J Ment Health Syst, 13, 29 J Hofer, et al (2019), “Complementary and alternative medicine use in adults with autism spectrum disorder in Germany: results from a multi-center survey”, BMC Psychiatry, 19(1), 53 O D Howes, et al (2018), “Autism spectrum disorder: Consensus guidelines on assessment, treatment and research from the British Association for Psychopharmacology”, J Psychopharmacol, 32(1), 3-29 H Y Ivanov, et al (2015), “Autism Spectrum Disorder - A Complex Genetic Disorder”, Folia Med (Plovdiv), 57(1), 19-28 L (1943) Kanner “Autistic disturbances of affective contact”, Nervous child, (2(3)), 217-250 K Katakawa, et al (2007), “Fawcettimine-related alkaloids from Lycopodium 42 43 44 45 46 47 U 41 VN 40 48 49 50 51 52 53 54 55 T Schneider and R Przewlocki (2005), “Behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid: animal model of autism”, Neuropsychopharmacology, 30(1), 80-89 A F Simon, et al (2012), “A simple assay to study social behavior in Drosophila: measurement of social space within a group”, Genes Brain Behav, 11(2), 243-252 Hiromitsu Takayama, et al (2002), “Seven new Lycopodium alkaloids, lycoposerramines-C, -D, -E, -P, -Q, -S, and -U, from Lycopodium serratum Thunb”, Tetrahedron Letters, 43(46), 8307-8311 Chang-Heng Tan, Shan-Hao Jiang, and Da-Yuan Zhu (2000), “Huperzine P, a novel Lycopodium alkaloid from Huperzia serrata”, Tetrahedron Letters, 41(30), 57335736 K E Towbin, et al (2005), “Autism spectrum traits in children with mood and anxiety disorders”, J Child Adolesc Psychopharmacol, 15(3), 452-464 L Tsuda and Y M Lim (2018), “Alzheimer's Disease Model System Using Drosophila”, Adv Exp Med Biol, 1076, 25-40 I Ueoka, et al (2019), “Autism Spectrum Disorder-Related Syndromes: Modeling with Drosophila and Rodents”, Int J Mol Sci, 20(17) K Volders, K Nuytens, and J W Creemers (2011), “The autism candidate gene Neurobeachin encodes a scaffolding protein implicated in membrane trafficking and signaling”, Curr Mol Med, 11(3), 204-217 F Volkmar, et al (2014), “Practice parameter for the assessment and treatment of children and adolescents with autism spectrum disorder”, J Am Acad Child Adolesc Psychiatry, 53(2), 237-257 57 u iệ il Tà 56 J O'Neal, et al (2009), “Neurobeachin (NBEA) is a target of recurrent interstitial deletions at 13q13 in patients with MGUS and multiple myeloma”, Exp Hematol, 37(2), 234-244 Mark Osteen (2007), Autism and Representation New York :Routledge Farzana Khan Perveen (2018), “Introduction to Drosophila, Drosophila melanogaster - Model for Recent Advances in Genetics and Therapeutics”, IntechOpen L Pinato, et al (2019), “Dysregulation of Circadian Rhythms in Autism Spectrum Disorders”, Curr Pharm Des, 25(41), 4379-4393 M D Piper and L Partridge (2016), “Protocols to Study Aging in Drosophila”, Methods Mol Biol, 1478, 291-302 H Ruan, et al (2002), “High-quality life extension by the enzyme peptide methionine sulfoxide reductase”, Proc Natl Acad Sci U S A, 99(5), 2748-2753 G M Rubin (1988), “Drosophila melanogaster as an experimental organism”, Science, 240(4858), 1453-1459 60 61 62 63 U 59 VN 58 64 65 66 67 68 C Wang, et al (2017), “Prenatal, perinatal, and postnatal factors associated with autism: A meta-analysis”, Medicine (Baltimore), 96(18), e6696 WHO (2021), Autism spectrum disorders L Wing and J Gould (1979), “Severe impairments of social interaction and associated abnormalities in children: epidemiology and classification”, J Autism Dev Disord, 9(1), 11-29 A Wise, et al (2015), “Drosophila mutants of the autism candidate gene neurobeachin (rugose) exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, and impaired adult social behavior and activity patterns”, J Neurogenet, 29(2-3), 135-143 B Wisniowiecka-Kowalnik and B A Nowakowska (2019), “Genetics and epigenetics of autism spectrum disorder-current evidence in the field”, J Appl Genet, 60(1), 37-47 Website 69 u iệ 70 il Tà Cơ sở liệu Thực vật Việt Nam: http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Lycopodiaceae&list=familia truy cập ngày 27/05/2021 Trung tâm liệu Thực vật Việt Nam: http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Huperzia%20serrata&list=species truy cập ngày 27/05/2021 https://www.cdc.gov/ncbddd/autism/facts.html truy cập ngày 27/05/2021 U VN 71